专利名称：能增强溶菌酶溶菌活性的蛋白质和小分子多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够与溶菌酶结合并促进溶菌酶活性的TRAP蛋白和一组同源多肽分子。
背景技术：
众所周知，溶菌酶能够通过破坏细菌表面的细胞壁而杀死细胞。已经有多种来源的溶菌酶被应用于临床研究。但是目前还没有有关其功能激活剂的研究报道。TRAP蛋白是金葡菌表面蛋白，其主要生物学功能是参与金葡菌毒素调控，随着TRAP蛋白磷酸化水平的升高，金葡菌的外毒素水平上调(Balaban，N.et alAutoinducer of virulence as a target for vaccine and theraphy against Staphylococcusaureus.Science 280，438-440(1995)；Balaban，N.，Goldkorn，T.，Gov，Y.，Hirshberg，M.，Koyfman，N.，Matthews，H.R.，Nhan，R.T.，Singh，B.，and Uziel，O.(2001)J.Biol.Chem.276，2658-2667；Novick RP，Ross HF，Projan SJ，Kornblum J，Kreiswirth B，andMoghazeh S.(1993)EMBO J.12，3967-3975；Gov Y，Borovok I，Korem M，SinghVK，Jayaswal RK，Wilkinson BJ，RichSM，and Balaban N.(2004)J Biol Chem.27914665-72)。研究表明阻断RAP和TRAP这一信号传导通路可以降低金葡菌外毒素的分泌，同时我们在实验中发现TRAP蛋白的C末端可以成为有效的肽疫苗来保护机体抵抗金葡菌引起的感染(Yang，G.，Cheng，H.C.，Liu，C.，Xue，Y.N.，Gao，Y.P.，Liu，N.L，Gao，B.，Wang，D.P.，Li，S.R.，Shen，B.F.and Shao，N.S(2003)Peptides 24，1823-1828；Yang G，Gao YP，Dong J，Liu C，Xue NN，Fan M，Shen BF，Shao NS.(2005)J Biol Chem.28027431-27435)。目前尚未关于TRAP蛋白其它功能的研究报道。我们研究发现，TRAP蛋白及其C末端同源小分子多肽能够与溶菌酶结合并促进溶菌酶溶菌活性。
发明内容
1.TRAP蛋白能够与溶菌酶结合并促进溶菌酶溶菌活性我们通过ELISA的实验方法发现TRAP蛋白能够与溶菌酶相互结合，并通过溶菌酶体外活性测定试剂盒证明TRAP蛋白与溶菌酶一起孵育能够增强溶菌酶的溶菌活性。
2.一组能够与溶菌酶结合并增强溶菌酶溶菌活性的TRAP蛋白C末端同源小分子多肽我们选择三个序列高度保守能够模拟TRAP蛋白抗原表位的活性短肽(邵宁生等(2003)中国专利申请号03150203.2)，通过溶菌酶体外活性测定试剂盒检测TRAP蛋白对溶菌酶活性激活作用，结果发现该三种小分子多肽能够增强溶菌酶的溶菌活性。
附图1a包被TRAP蛋白，用溶菌酶抗体检测溶菌酶和TRAP蛋白的结合。
其中1为包被TRAP蛋白孔的测定结果；2为未包被TRAP蛋白孔的测定结果。
图1b包被溶菌酶，用TRAP蛋白抗体检测溶菌酶和TRAP蛋白的结合。
其中1为包被溶菌酶孔的测定结果；2为未包被溶菌酶蛋白孔的测定结果。
图2不同浓度的TRAP蛋白对溶菌酶溶菌活性的增强作用。纵坐标为细菌溶液的透光度。
图3不同浓度的合成肽对溶菌酶溶菌活性的增强作用。纵坐标为细菌溶液的透光度。
具体实施例1.TRAP蛋白与溶菌酶的结合并激活溶菌酶活性1.1材料TRAP蛋白由本实验室表达并纯化，溶菌酶购自SIGMA公司。TRAP和溶菌酶的多克隆抗体由本实验室制备。HRP标记的抗兔二抗和溶菌酶活性试剂盒购自莱博公司。
1.2方法1.2.1ELISA方法检测TRAP蛋白与溶菌酶的结合①以TRAP蛋白包被酶标板，包被浓度为(2μg/孔)，4℃过夜，PBST洗涤一遍，10％胎牛血清37℃封闭1小时，PBST洗涤三遍，加入溶菌酶(5μg/孔)，37℃孵育1小时，PBST洗涤三遍，加入溶菌酶抗体(1∶1000)，37℃孵育1小时，PBST洗涤三遍，加入HRP标记的抗兔二抗(1∶10000)，TMB底物显色液，室温显色10分钟，每孔加入50μl 2N H2SO4，450nm波长下测OD值。
②以溶菌酶包被酶标板，包被浓度为(2μg/孔)，4℃过夜，PBST洗涤一遍，10％胎牛血清37℃封闭1小时，PBST洗涤三遍，加入TRAP蛋白(5μg/孔)，37℃孵育1小时，PBST洗涤三遍，加入TRAP蛋白抗体(1∶1000)，37℃孵育1小时，PBST洗涤三遍，加入HRP标记的抗兔二抗(1∶10000)，TMB底物显色液，室温显色10分钟，每孔加入50μl 2N H2SO4，450nm波长下测OD值。
1.2.2TRAP蛋白增强溶菌酶溶菌活性的作用观察本实验是按照溶菌酶活性测定试剂盒的具体操作方法来检测TRAP蛋白对溶菌酶溶菌活性的增强作用。具体方法将溶菌酶标准品(4000unit/μl，200μl)与TRAP蛋白(0.5μg/μl，200μl)，(0.05μg/μl，200μl)混合，PBS(200μl)缓冲液为对照。37℃孵育1小时。稀释至250unit，冰上5分钟，与菌液37℃孵育15分钟，在530nm测定透光度。
1.3结果1.3.1TRAP蛋白与溶菌酶的特异结合通过ELISA的方法检测发现TRAP蛋白能够特异与溶菌酶结合(图1a，1b)。
1.3.2TRAP蛋白能够增强溶菌酶的溶菌活性通过活性测定发现TRAP蛋白能够增强溶菌酶溶菌活性(图2)。
2.TRAP蛋白C末端同源小分子多肽对溶菌酶活性促进作用2.1材料化学合成的短肽SYFDYLYPPRPA，纯度大于95％，其它材料同1.1。
2.2方法同1.2.2。具体将溶菌酶标准品(4000unit/μl，200μl)与短肽(0.1μg/μl，200μl)，(0.01μg/μl，200μl)混合，37℃孵育1小时，稀释至250unit，冰上5分钟，与菌液37℃孵育15分钟，在530nm测定透光度。
2.3结果通过活性测定发现不同浓度短肽能够增强进溶菌酶溶菌活性(图3)。
3.我们在实验中验证了多种同源的TRAP蛋白能够与不通来源的溶菌酶结合，得到相同结果。在附图中仅列出TRAP蛋白(GenBankTM接受号AFF202641)和溶菌酶(鸡蛋白来源SigmaL7651)相互作用的实验结果。
权利要求
1金黄色葡萄球菌中RAP蛋白的靶分子TRAP(target of RAP)蛋白能够与溶菌酶相互结合并能够增强溶菌酶的溶菌活性；
2权利要求1中的TRAP蛋白是指来源于各种不同葡萄球菌菌株的同源蛋白分子，其氨基酸序列同源性大于80％；
3权利要求1中的TRAP蛋白可以是任何制备方法来源的TRAP蛋白分子；
4权利要求1中的溶菌酶是指不同种属来源的溶菌酶；
5权利要求1中的溶菌酶可以是任何制备方法来源的溶菌酶分子；
6一组能够与溶菌酶相互结合并增强溶菌酶溶菌活性的TRAP蛋白C末端同源小分子多肽；
7权利要求6中小分子多肽性是指具有下列通式氨基酸组成的一组保守性多肽分子S/T-Y/W-F-E/D-X-X-L-Y-P/A-X-X-X。其中S代表丝氨酸残基，T代表苏氨酸残基，Y代表酪氨酸残基，W代表色氨酸残基，F代表苯丙氨酸残基，E代表谷氨酸残基，D代表天冬氨酸残基，L代表亮氨酸残基，P代表脯氨酸残基，A代表丙氨酸残基，X代表任何天然L-型氨基酸残基或D-型异构体。
8权利要求7中的多肽分子可以是任何制备方法来源的多肽分子；
9任何包含权利要求7中的多肽分子序列的蛋白或多肽分子，其特征在于能够与溶菌酶相互结合并增强溶菌酶溶菌活性；
10权利要求1-9中任一项所述蛋白或多肽分子在医药研究领域中的应用，其主要特征是增强溶菌酶溶菌活性。
11权利要求1-9中任一项所述蛋白或多肽分子在微生物发酵生产中的应用，其主要特征是增强溶菌酶溶菌活性。
全文摘要
本发明涉及能够与溶菌酶相互结合并促进溶菌酶活性的TRAP蛋白和一组能够与溶菌酶相互结合并增强溶菌酶溶菌活性的TRAP蛋白C末端同源小分子多肽，该组多肽具有下列通式氨基酸组成S/T－Y/W－F－E/D－X－X－L－Y－P/A－X－X－X。其中S代表丝氨酸残基，T代表苏氨酸残基，Y代表酪氨酸残基，W代表色氨酸残基，F代表苯丙氨酸残基，E代表谷氨酸残基，D代表天冬氨酸残基，L代表亮氨酸残基，P代表脯氨酸残基，A代表丙氨酸残基，X代表任何天然L－型氨基酸残基或D－型异构体。本发明的能够增强溶菌酶溶菌活性的TRAP蛋白和多肽可应用医药领域增强溶菌酶的溶菌活性或微生物发酵中增强溶菌酶的溶菌活性。
文档编号A61K38/48GK1944458SQ20051010787
公开日2007年4月11日 申请日期2005年10月8日 优先权日2005年10月8日
发明者杨光, 邵宁生, 高亚萍, 董洁, 李少华, 柳川, 沈倍奋, 范明 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所