专利名称：一种促进骨再生的微胶囊及其应用的制作方法
技术领域：
本发明关于一种微胶囊，特别关于一种促进骨再生的微胶囊。
背景技术：
目前骨再生的基因治疗利用自体干细胞作为基因转染干细胞，如利用腺病毒载体携带的骨形态发生蛋白-2基因，转染自体骨髓间充质干细胞，再植入骨缺损部位，促进骨再生。目前在大小动物身上均已取得成功。但现在的骨再生基因治疗还有以下缺点(1)均利用自体细胞作为基因转染的靶细胞，由于细胞的分离、培养、扩增需要较长时间，无法用于急诊病人；即使对于择期手术的病人，需要病人首先来院取骨髓，待细胞培养到所需数量(根据我们的经验，获得107细胞需要25天左右时间)后再来医院，难以为病人所接受。再者个体的的干细胞数量和质量存在较大差异，难以保证所培养的每个病人的细胞均有较好的活力。如老年人骨髓中干细胞的数量和质量都较年轻人差，患全身性疾病、代谢性疾病和化疗的病人也同样面临干细胞数量不足、质量下降的问题。(2)如采用腺病毒作为基因的载体，腺病毒本身会诱导排斥反应，限制了目的基因在体内的表达时间。(3)如利用异体或异种细胞作为转基因的靶细胞，需使用全身性免疫抑制剂，对人体的免疫功能有一定的损害。
发明内容
本发明的目的在于提供(1)一种促进骨再生的微胶囊；(2)微胶囊在制备治疗骨疾病药物中应用。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的(1)携带骨形态发生蛋白基因的重组腺病毒，将BMP-2cDNA片段(由ATCC提供)插入载体PAC-CMV中，构成重组质粒PAC-CMVBMP2，再将PAC-CMVBMP2经Xho I酶切后与5型腺病毒基因经Cla I酶切后的大片段在293细胞中同源重组，形成携带骨形态发生蛋白基因-2基因的重组腺病毒。
(2)大鼠骨髓间充质干细胞的培养及腺病毒转染，取体重120g左右SD大鼠，氯胺酮腹腔麻醉。在严格的无菌条件下分离出双侧股骨，用咬骨钳截除其远近端。用10ml alpha-MEM完全培养基冲洗出骨髓组织，接种于100mm培养皿，每皿10ml，置于37℃，5％CO2培养箱孵育。3天后半量换液，1周后完全换液，以后每周换液2次。约于14天，贴壁细胞几乎90％汇合，吸净培养基，以PBS冲洗2次，加入1ml 0.05胰蛋白酶(含0.02％EDTA)，置于37℃，5％CO2培养箱孵育5分钟，加入9ml低糖a-MEM完全培养基以中和胰蛋白酶的活性。用吸管轻轻吹打细胞使成为单细胞悬液，按1∶3进行传代培养，此时的细胞称第一传代细胞。同法进行第2传代细胞培养。第2传代细胞近90％汇合后，吸干培养基，每皿加入4ml病毒工作液过夜(MOI＝100)，或不加处理，孵化过夜。吸净病毒工作液，每皿加10ml alpha-MEM完全培养基(FCS经热灭活)继续培养。
(3)BMP-2基因转染的骨髓间充质干细胞的微囊化将BMP-2基因转染的骨髓间充质干细胞重新悬浮在过滤除菌的1.5％海藻酸钠溶液中，细胞浓度3×106/ml。海藻酸钠的细胞悬浮液通过注射器泵的7号钝头针滴出，通过大功率高压脉冲微胶囊制备仪(参见实用新型专利微胶囊成型装置(专利号00218100.2))，剪切注射器泵滴出的液滴，并控制其粒径。海藻酸钠细胞液滴在100mM氯化钙溶液中凝胶化，约5分钟后形成海藻酸钙细胞胶珠；用生理盐水清洗2次后，将海藻酸钙细胞胶珠悬浮在过滤除菌的0.05％-0.1％聚赖氨酸溶液中5分钟，聚赖氨酸与海藻酸钙发生聚电解质络合反应成膜，形成包埋骨髓间充质干细胞聚赖氨酸海藻酸盐微胶囊。再用生理盐水清洗2次，之后浸入0.15％海藻酸钠溶液约5分钟，形成又一层海藻酸钠外衣，用生理盐水清洗2次，然后用55mM柠檬酸钠溶液20ml反应6分钟，微胶囊的中心部分被液化。经生理盐水清洗后，加入培养基，37℃培养箱培养。
本发明运用微囊化技术的基本原理利用化学方法包埋移植用细胞，在细胞外形成完整的囊膜，即微胶囊。微胶囊具有选择通透性，膜上的孔隙允许营养物质等小分子物质自由进出，但抗体等大分子物质和免疫细胞被阻挡在囊外。微胶囊为其内部提供了一个免疫保护的微环境，使微囊内的细胞异体移植后，可以免受宿主排斥反应的攻击，而在异体存活并分泌治疗性重组蛋白(一般分子量小于100kD)。因此，在细胞移植中使用微囊化技术，不仅不需要使用免疫抑制剂，还扩大了移植供体的来源，同时也为治疗骨缺损节约了时间。
本发明一种促进骨再生的微胶囊，由以下方法制得(1)腺病毒载体携带骨形态发生蛋白基因；(2)骨髓间充质干细胞的培养；(3)携带成骨基因的腺病毒载体转染骨髓间充质干细胞；(4)骨形态发生蛋白基因转染的骨髓间充质干细胞的微囊化。
步骤(1)和步骤(4)中骨形态发生蛋白基因为骨形态发生蛋白基因2。
步骤(2)骨髓选自大鼠骨髓。
步骤(2)中用alpha-MEM完全培养基冲洗出骨髓组织。
步骤(4)中骨髓间充质干细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，经处理形成海藻酸钙细胞胶珠。将海藻酸钙细胞胶珠悬浮聚赖氨酸溶液中，经处理形成包埋骨髓基质干细胞聚赖氨酸海藻酸盐微胶囊。
本发明所公开一种促进骨再生的微胶囊，其优点表现在允许使用非自体(异体或异种)干细胞作为基因转染的靶细胞，这样减少取自体干细胞需扩增培养的时间，用于急诊病人，并可以先在体外筛选，能确保细胞的质量，扩大细胞和基因治疗的应用范围。
图1显示BMP-2基因转染的骨髓间充质干细胞的微囊化。
图2A显示微囊化第4天，体外X-gal染色确定微囊内转基因细胞的表达。
图2B显示微囊化第28天，体外X-gal染色确定微囊内转基因细胞的表达。
图3显示转染BMP-2的MSC微囊体外分泌情况。每点5组，取平均值。每组微囊内细胞总量约2.5×106/组，培养于15ml alpha-MEM(含15％小牛血清)。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1大鼠骨髓间充质干细胞的培养及腺病毒转染取体重120g左右SD大鼠，氯胺酮腹腔麻醉。在严格的无菌条件下分离出双侧股骨，用咬骨钳截除其远近端。用10ml alpha-MEM完全培养基冲洗出骨髓组织，接种于100mm培养皿，每皿10ml，置于37℃，5％CO2培养箱孵育。3天后半量换液，1周后完全换液，以后每周换液2次。约于14天，贴壁细胞几乎90％汇合，吸净培养基，以PBS冲洗2次，加入1ml0.05胰蛋白酶(含0.02％EDTA)，置于37℃，5％CO2培养箱孵育5分钟，加入9ml低糖a-MEM完全培养基以中和胰蛋白酶的活性。用吸管轻轻吹打细胞使成为单细胞悬液，按1∶3进行传代培养，此时的细胞称第一传代细胞。同法进行第2传代细胞培养。第2传代细胞近90％汇合后，吸干培养基，每皿加入4ml病毒工作液过夜(MOI＝100)，或不加处理，孵化过夜。吸净病毒工作液，每皿加10ml alpha-MEM完全培养基(FCS经热灭活)继续培养。
实施例2
BMP-2基因转染的骨髓间充质干细胞的微囊化(见图1)将BMP-2基因转染的骨髓间充质干细胞重新悬浮在过滤除菌的1.5％海藻酸钠溶液中，细胞浓度3×106/ml。海藻酸钠的细胞悬浮液通过注射器泵的7号钝头针滴出，通过大功率高压脉冲微胶囊制备仪(参见实用新型专利微胶囊成型装置(专利号00218100.2))，剪切注射器泵滴出的液滴，并控制其粒径。海藻酸钠细胞液滴在100mM氯化钙溶液中凝胶化，约5分钟后形成海藻酸钙细胞胶珠；用生理盐水清洗2次后，将海藻酸钙细胞胶珠悬浮在过滤除菌的0.05％-0.1％聚赖氨酸溶液中5分钟，聚赖氨酸与海藻酸钙发生聚电解质络合反应成膜，形成包埋骨髓间充质干细胞聚赖氨酸海藻酸盐微胶囊。再用生理盐水清洗2次，之后浸入0.15％海藻酸钠溶液约5分钟，形成又一层海藻酸钠外衣，用生理盐水清洗2次，然后用55mM柠檬酸钠溶液20ml反应6分钟，微胶囊的中心部分被液化。经生理盐水清洗后，加入培养基，37℃培养箱培养。
实施例3体外X-gal染色确定微囊内转基因细胞的表达(见图2A、图2B)为了在体外评估基因治疗的有效性，最首要的就是看所转染的基因是否表达。为此，我们先转染报告基因β-gal入MSC，再微囊化，观察微囊内细胞是否能持续分泌β-gal。转染β-gal的MSC经微囊化后7天，14，21，28天，分别运用X-gal进行组化染色。首先将微囊移入15ml离心管中，用0.5％戊二醛固定10分钟，PBS洗三遍，再加入X-gal染液37℃5％CO2培养箱过夜。X-gal染液含1mg/ml X-gal，35mM K3Fe(CN)6，35mMK3Fe(CN)6·3H2O，2mM MgCl2。次日放入10cm培养皿显微镜下观察拍照。结果显示，微囊内的转β-gal细胞能和未微囊的转β-gal细胞一样，分泌β-gal。并且至少能持续分泌28天。
实施例4ELI SA测定分泌至囊外的基因重组产物BMP2的含量(见图3)转染BMP-2基因的骨髓间充质干细胞微囊化后每隔2天在换液时留取上清液，，用ELISA法测量BMP2的含量。取出ELISA专用孔板，每孔先加入100ul Assay Diluent RD-19，再加入标准品或样品，用封胶封住，室温下摇床2小时。用400ul Wash Buffer洗孔，洗完后用力拍板，重复洗板4次，再每孔痂200ulBMP-2Conjugate室温摇床2小时，再重复洗孔4次，再加200ul Substrate Solution，避光室温下30分钟后，加入50ul StopSolution，混匀后酶标仪下测OD450nm。同时以未转染BMP-2基因的MSC培养上清做空白对照。结果显示，在近一个月的时间内连续测BMP-2的含量。与空白组比较，差异明显。表明微囊内同样能持续分泌BMP-2。
实施例5微囊内转基因细胞分泌的BMP2活性测定(见表1)为了验证微囊内分泌的BMP-2的活性，我们把微囊(每孔微囊内细胞1×106)与骨髓间充质干细胞共培养，观察囊外MSC的转化情况。分组(1)未转染BMP-2的MSC微囊+MSC共培养(2)转rhBMP-2的MSC微囊+MSC共培养，8天后行碱性磷酸酶(ALP，为成骨细胞的标志蛋白)定量测定，培养基中加入VitC(50μg/ml)，每2天更换1/3培养基，于8天后吸净培养基，用Tris缓冲盐溶液冲洗三次，每皿加入0.5ml 50mmol/L的Tris，用细胞刮收集，放置于-20℃冻存备测。检测时，室温下解冻，细胞经超声裂解，用ALP定量检测试剂盒(Sigma)测定裂解液中ALP的浓度。各组的样本数均为5。结果显示，Adv-hBMP-2转染细胞微囊组内骨髓间充质干细胞的ALP活性明显高于未转染细胞微囊组，p＜0.05。
表1各组ALP活性(sigma unit/ml裂解液)(均数±标准差，IU)
p＜0.05两组差别有显著性
权利要求
1.一种促进骨再生的微胶囊，由以下方法制得(1)携带骨形态发生蛋白基因的腺病毒载体；(2)骨髓间充质干细胞的培养；(3)携带成骨基因的腺病毒载体转染骨髓间充质干细胞；(4)骨形态发生蛋白基因转染的骨髓间充质干细胞的微囊化。
2.根据权利要求1所述的微胶囊，其特征在于步骤(1)和步骤(4)中骨形态发生蛋白基因为骨形态发生蛋白-2基因。
3.根据权利要求1或2所述的微胶囊，其特征在于步骤(2)骨髓选自大鼠骨髓。
4.根据权利要求1或2所述的微胶囊，其特征在于步骤(2)中用alpha-MEM完全培养基冲洗出骨髓组织。
5.根据权利要求1或2所述的微胶囊，其特征在于步骤(4)中骨髓间充质干细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，经处理形成海藻酸钙细胞胶珠。
6.根据权利要求5所述的微胶囊，其特征在于将海藻酸钙细胞胶珠悬浮聚赖氨酸溶液中，经处理形成包埋骨髓间充质干细胞聚赖氨酸海藻酸盐微胶囊。
7.权利要求1所述的微胶囊在制备治疗骨疾病药物中应用。
全文摘要
本发明涉及一种促进骨再生的微胶囊，该微胶囊由以下方法制得(1)携带骨形态发生蛋白基因的重组腺病毒；(2)骨髓间充质干细胞的培养；(3)携带成骨基因的腺病毒载体转染骨髓间充质干细胞；(4)骨形态发生蛋白基因转染的骨髓间充质干细胞的微囊化。其优点表现在允许使用非自体干细胞作为基因转染的靶细胞，这样减少取自体干细胞需扩增培养的时间，用于急诊病人，并可以先在体外筛选，能确保细胞的质量，扩大细胞和基因治疗的应用范围。
文档编号A61K9/50GK1814303SQ200510110750
公开日2006年8月9日 申请日期2005年11月25日 优先权日2005年11月25日
发明者汤亭亭, 丁惠峰, 戴尅戎, 楼觉人 申请人:上海第二医科大学附属第九人民医院