专利名称：β－抑制蛋白在制备治疗表观遗传相关疾病的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体涉及人β-抑制蛋白在制备用于与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病的药物中的应用。
背景技术：
最近的研究发现，人类许多疾病都与表观遗传调节紊乱有关，表观遗传治疗将成为解决这些疾病的有效手段。而且，目前已经有许多这样的制剂在进行临床前期研究(Egger等.Nature 2004；429457-463)。组蛋白乙酰化修饰在表观遗传调节中作用重大，被誉为真核生物基因转录的早期开关(Grewal等.Science 2003；301798-802；Fry等.Science 2002；2951847-1848)。
近来的研究发现，组蛋白乙酰化水平降低是细胞癌变及许多神经系统疾病的重要病因，能促进组蛋白乙酰化水平升高的制剂已经被认为是治疗这些疾病的新型制剂(Archer等.Curr Opin Genet Develop 1999；9171-174；Egger等.Nature 2004；429457-463)。体内有两种酶调控着组蛋白的乙酰化水平，分别为组蛋白乙酰化酶及组蛋白去乙酰化酶。体内调节组蛋白乙酰化水平的方式有两种，一种是通过影响组蛋白乙酰化酶或组蛋白去乙酰化酶的活性，另一种是通过影响二者和组蛋白的接触。值得注意的是，目前用于临床试验的影响组蛋白乙酰化的制剂都是组蛋白去乙酰化酶的抑制剂，虽然这些制剂有明确的抗癌作用，但它们几乎抑制了体内全部组蛋白去乙酰化酶的活性。无庸置疑，这样的制剂对正常细胞组蛋白乙酰化水平造成很大影响，做成药以后会产生很大的副作用。实际上，这些制剂作用的非特异性是限制其成药的关键。
因此，迫切需要寻找一种理想的组蛋白乙酰化促进剂。这种新型制剂不会影响体内整体组蛋白乙酰化酶或组蛋白去乙酰化酶的活性，但可以区域特异地促进组蛋白乙酰化水平，尤其是影响疾病相关基因所在区域的组蛋白乙酰化水平，从而达到理想的治病效果。
发明内容
为解决上述问题，本发明者进行了深入的研究，结果发现β-抑制蛋白1可以解决上述问题。
本发明第一方面涉及β-抑制蛋白1、其核酸序列、含有该核酸序列的构建物在制备用于治疗与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病中的应用。在较佳的实施方案中，所述与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病是癌症、神经系统疾病或表观遗传疾病。
本发明第二方面涉及DOR受体激动剂或KOR受体激动剂在制备用于治疗与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病中的应用。在较佳的实施方案中，所述与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病是癌症、神经系统疾病或表观遗传疾病。在另一较佳的实施方案中，所述DOR受体激动剂选自[D-Pen2，D-Pen5]脑啡肽(DPDPE)、(D-Ala2，D-Leu5)脑啡肽(DADLE)或δ啡肽-I。
本发明还有一个方面涉及一种用于治疗与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病药物组合物，所述组合物包含有效量的至少一种选自β-抑制蛋白1、β-抑制蛋白1的核酸序列、含有所述核酸序列的构建物、δ阿片受体激动剂或κ阿片受体激动剂的物质作为活性组分，以及药学上可接受的载体。
本发明另一方面还提供了一种从候选物质中筛选出治疗与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病的药物的方法，该方法包括a)使所述候选物质与表达β-抑制蛋白1的细胞接触；b)鉴定β-抑制蛋白1在所述细胞的细胞核内的表达水平，并将该表达水平与未接触所述候选物质的细胞的细胞核内β-抑制蛋白1表达水平相比较；c)选出使细胞核内β-抑制蛋白1表达水平提高的物质作为所述治疗与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病的药物。
经过研究，本发明者发现β-抑制蛋白1(β-arrestin1)可以很好地促进体内组蛋白乙酰化的水平，但不会影响整体组蛋白乙酰化酶或组蛋白去乙酰化酶的活性。它影响组蛋白乙酰化的方式是通过影响某些组蛋白乙酰化酶在特定染色质区域(例如可以抑制癌细胞增殖的p27基因)的富集来实现的，因此对组蛋白乙酰化水平的影响比组蛋白去乙酰化酶抑制剂要小得多，且有一定的基因特异性。可见，β-抑制蛋白1是一种新颖的靶向性组蛋白乙酰化促进者，在癌症及其他表观遗传疾病的治疗方面极有前途。本发明的其它目的和优点可以通过下文的详细描述和具体实施例来获知。
图1显示了胞核βarr1促进了组蛋白H4乙酰化。图A显示了从HeLa细胞分离出组蛋白；βarrs+/+，βarrs-/-，或βarrs-/-MEF细胞瞬时表达所示质粒(图B)；用不同的乙酰化(Ac)组蛋白抗体对等份样品(6微克)进行Western印迹。另外还测定组蛋白H4的量，以确认每个泳道中有等量的组蛋白。对Western结果进行定量，标准化成组蛋白H4蛋白，图中显示了三个独立试验的H4、H4K12和H4K16乙酰化平均值。*P＜0.05，**P＜0.01(相对于对照组)。
图2显示了βarr1的核聚集促进了p27和c-fos启动子处组蛋白H4的乙酰化。用抗乙酰化H4(H4Ac)、H3(H3Ac)、βarr1和人或小鼠IgG(作为阴性对照)的抗体进行ChIp实验。经qPCR分析，输入的DNA以及抗体结合染色质区段的回收物中存在p27、c-fos和c-jun启动子序列。将获得的数据归一化成对应的输入对照。采用了相同启动子的不同区域的引物组，获得了类似的结果。所示数据是每组引物的三个独立实验的平均值。图A表达所示质粒的HeLa(左)和βarrs-/-MEF(右)细胞。NSD表示未检测到信号。图B在1μM DP中培育所示时间的单表达DOR的HeLa细胞。图C用或不用100nM Na1处理表达DOR或DOR和βarr1 siRNA的HeLa细胞5分钟，然后用1μM DP培育60分钟。图D染色质-蛋白结合试验。对全细胞裂解液(WCE)离心，沉淀(Crude Pel)用微球菌核酸酶(Mnase)处理，再次离心。所得上清(Mnase Sup)进行超离心，获得沉淀(Ultra Pel)和上清(Ultra Sup)。用所示抗体对样品进行Western分析。染色质结合蛋白H4和p300和胞液蛋白微管蛋白和βarr1 Q394L作为对照。图E，在HeLa细胞中瞬时表达的野生型和突变型βarr1的核分布及其对H4乙酰化和基因转录的效果。在共聚焦显微镜下观察到βarr1-HA转核。用ChIP试验测得p27启动子区域内H4乙酰化。用RT-qPCR分析p27的转录。数据取自三个独立试验，*p＜0.05，**p＜0.01(对应于对照)。
图3显示了βarr1对HAT、HDAC和CREB活性的影响。图A测定纯化的βarr1、免疫沉淀的3′HA-βarr1和5′HA-βarr1蛋白的潜在HAT活性。组蛋白乙酰转移酶PCAF(0.1μg)作为阳性对照。图B、C从HeLa细胞的全细胞匀浆物提取HAT和HDAC粗制物，测定不同量的GST-βarr1和免疫沉淀的3′HA-和5′-HA βarr1蛋白存在下的体外组蛋白乙酰化(B)和去乙酰化(C)。分别用600μM NiCl2和100nM TSA作为对照。图D在100nMTSA和25μM sirtinol(STN)存在或不存在下，分析βarrs-/-MEF中βarr1对p27和c-fos启动子区域中的组蛋白H4乙酰化的影响。对p27和c-fos启动子中的H4乙酰化水平进行定量，根据对应的输入值标准化。图E用GAL4-CREB报道质粒(左)和CREB-荧光素酶报道质粒(右)单独或与不同量的所示βarr1质粒一起转染6孔板中的细胞，数据表示成相对于对照的诱导倍数。用10μM福斯高林作(FK)作为阳性对照。数据来自三个独立实验。**p＜0.01(相对于对应的对照)。
图4显示了βarr1将p300募集到p27和c-fos启动子区域。图A和B用抗p300、CBP、Tip60和人或小鼠IgG(作为阴性对照)进行ChIP实验。经qPCR分析，输入的DNA以及抗体结合染色质区段的回收物中存在p27、c-fos和c-jun启动子序列。将获得的数据归一化成对应的输入值。所示数据是每组引物的三个独立实验的平均值。*p＜0.05，**p＜0.01(对应于对照)。图A表达所示质粒的HeLa(左)和βarrs-/-MEF(右)细胞。图B在1μM DP中培育所示时间的表达DOR的HeLa细胞(上图)。用或不用100nM Nal处理表达DOR或DOR和βarr1 siRNA的HeLa细胞5分钟，然后用1μM DP培育60分钟(中图和下图)。图C使HeLa胞核提取物和p300或βarr抗体免疫沉淀，然后用抗p300或βarr的抗体对免疫复合物进行Western分析。5％总胞核提取物作为对照。
图5显示了βarr1-介导的人成神经细胞瘤细胞中基因转录的调节。图A用1μMDP、1μM DADLE(DA)或1μMδ-啡肽-I(DEL)培育内源表达DOR和βarr1的SK细胞所示时间。在右图中，细胞预先用或未用100nM Na1处理5分钟，然后用1μM DP培育20分钟。用Western分析胞核提取物中的βarr1含量并定量。图B，在用或未用100nM Na1处理5分钟后，使转染或未转染βarr1 siRNA的SK细胞在1μM DP中培育所示时间(左)或60分钟(中和右)。用ChIP和RT-qPCR分析p27和c-jun启动子处的H4Ac水平，以及p27和c-jun的转录水平。*p＜0.05，**p＜0.01(对应于对照)。图C用1μM DA或1μM DEL培育SK细胞指定时间，然后用ChIP和RT-qPCR分析p27和c-jun启动子处的H4Ac水平(左)，以及p27和c-jun的转录水平(右)。*p＜0.05，**p＜0.01(相对于对应组中的0分钟对照)。图DSK细胞经βga1，βarr1，βarr1Q394L，NSsiRNA，βarr1 siRNA，p27 siRNA或指定组合转染，在有或没有1μM DP和DA下培育60分钟或在1μM DEL下培育30分钟。测定[3H]胸苷掺入，图中所示为来自三个独立实验的数据。**p＜0.01(相对于对应的对照)。
具体实施例方式
β-抑制蛋白1(基因号NM-004041)是GPCRs的重要调节蛋白，在细胞质与细胞核中都有分布。现在所知的β-抑制蛋白1的功能都是发生于细胞质或细胞质膜，其在细胞核内的功能尚无报道。本发明者研究发现激活δ阿片受体(DOR)导致β-抑制蛋白1向细胞核内转移，导致β-抑制蛋白1在p27和c-fos基因启动子区富集，导致这些启动子区组蛋白H4乙酰化增加，最终促进了这些基因的转录。进一步研究发现，β-抑制蛋白1介导了组蛋白乙酰化酶p300在目标基因启动子区的招募，而且这种招募是受体激活导致组蛋白乙酰化及特异基因转录增加所必需的。这些结果不仅展示了GPCR信号从膜到核传递的表观遗传机制，而且揭示了β-抑制蛋白1作为胞质和核间传递GPCR信号信使物质的核内功能。
本发明者首先用转基因和RNA干扰的方法影响细胞核内β-抑制蛋白1的水平，发现β-抑制蛋白1显著提高细胞内整体组蛋白乙酰化的水平。进一步研究发现，β-抑制蛋白1对组蛋白乙酰化的调节具有基因特异性，例如它能显著促进和细胞增殖关系极为密切的基因p27和c-fos启动子区组蛋白H4的乙酰化，但不影响c-jun，cyclin A，及cyclin D1启动子区组蛋白H4的乙酰化。采用GST-β抑制蛋白1和在真核细胞系中免疫沉淀得到的HA-β抑制蛋白1体外进行的组蛋白乙酰化和组蛋白去乙酰化分析表明，β抑制蛋白1既不是组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶，也不影响组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶的整体活性。用蛋白质--染色质结合实验和染色质免疫共沉淀实验发现1，β-抑制蛋白1能和染色质结合；2，在G蛋白偶联受体如DOR，KOR等的激动剂刺激下，β-抑制蛋白1能进核Fig.1和特异染色质区结合。进一步免疫共沉淀实验和质谱分析发现β-抑制蛋白1能结合组蛋白乙酰化酶P300。综合这些结果说明无论何种因素引起β-抑制蛋白1在细胞核内增加，都能促进染色质特异区域的组蛋白乙酰化的水平。
因此，本发明第一方面涉及涉及β-抑制蛋白1、其核酸序列、含有该核酸序列的构建物在制备用于治疗与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病中的应用。
本文所用的术语“β-抑制蛋白1”的含义中不仅包括了β-抑制蛋白1的全长序列，而且还包括了所述蛋白多肽的具有相同或相似生物活性或功能的变异形式、片段、衍生物。这些变异形式包括(但并不限于)相对于所述多肽的氨基酸序列有若干个(较佳地1-10个，更佳为1-5个，最佳为1-3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代。上述变异形式还包括上述蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异和/或不影响序列的修饰形式上的差异。本发明的术语“β-抑制蛋白1”还包括与其相同(同源)或基本上相同(同源)且有相同或相似生物活性或功能的多肽，例如，有至少60％、更佳70％、还要佳80％、90％、甚至95％以上的同源性或相同性的多肽。同样，术语“β-抑制蛋白1的核酸序列”也涵盖了能编码所述蛋白多肽的具有相同或相似生物活性或功能的变异形式、片段、衍生物的核酸序列。包含所述核酸序列的构建物也可用于本发明。
本文所用的术语“组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病”表示可从经处理获益的与组蛋白乙酰化水平降低相关的任何病征，例如包括癌症、神经系统疾病或表观遗传疾病。“癌症”是指哺乳动物中以无控制性细胞生长为典型特征的生理性症状。可从本发明获益的癌症例子包括，但不局限于，鳞状细胞癌、肺癌、肠胃癌、胰癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳房癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌等。
本发明者还进行了基因芯片、RT-PCR、免疫印迹和染色质免疫共沉淀的实验，结果发现引起细胞核内β-抑制蛋白1增加的因素，可以通过影响组蛋白乙酰化这种表观遗传修饰调节一些与细胞病变相关的重要基因如p27，c-fos的转录及表达。提示β-抑制蛋白1，可以引起β-抑制蛋白1核内增加的G蛋白偶联受体如DOR，KOR(阿片受体是G蛋白偶连受体的一种，目前发现的阿片受体有三种亚型δ、μ、κ)等都有可能作为表观遗传疾病治疗的重要分子或靶点。
本发明者还在人神经瘤细胞系SK-N-SH的试验验证了这种可能性。发现过表达β-抑制蛋白1或促进β-抑制蛋白1进核的刺激(DOR激动剂处理)都抑制SK-N-SH神经瘤的增殖Fig.7。提示β-抑制蛋白1，以及可以引起β-抑制蛋白1核内增加的G蛋白偶联受体如DOR，KOR等在表观遗传疾病治疗方面的良好前景。
因此，本发明另一方面还涉及δ阿片受体激动剂或κ阿片受体激动剂在制备用于治疗与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病中的应用。
基于上述应用，本发明第三方面涉及一种用于治疗与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病药物组合物，其特征在于，所述组合物包含有效量的至少一种选自β-抑制蛋白1、β-抑制蛋白1的核酸序列、含有所述核酸序列的构建物、δ阿片受体激动剂或κ阿片受体激动剂的物质作为活性组分，以及药学上可接受的载体。本文所用的术语“有效量或治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的症状而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如多肽、基因或其它治疗剂)给药的载体或赋形剂，其应当与本发明的蛋白、核苷酸序列、构建物或细胞相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或赋形剂或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。另外，在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。
本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，通常可将药物组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬浮液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。本发明的药物组合物可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。为了提高用药效果，本发明的组合物也可以与其他药物共同使用。
本发明另一方面还提供了一种从候选物质中筛选出治疗与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病的药物的方法，该方法包括a)使所述候选物质与表达β-抑制蛋白1的细胞接触；b)鉴定β-抑制蛋白1在所述细胞的细胞核内的表达水平，并将该表达水平与未接触所述候选物质的所述细胞的细胞核内β-抑制蛋白1表达水平相比较；c)选出使细胞核内β-抑制蛋白1表达水平提高的物质作为所述治疗与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病的药物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)；《蛋白质纯化原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。
实施例1材料与方法1.1抗体与试剂β-抑制蛋白1鼠抗，p27及c-Jun抗体购自BD Biosciences(San Jose，CA)。β-抑制蛋白多克隆兔抗为Robert J.Lefkowitz(Duke University Medical Center，Durham)所赠。p300 CT，CBP，组蛋白H4，乙酰化组蛋白H4及H3抗体购自Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY)。针对HA-tag的鼠抗12CA5购自Roche Molecular Biochemicals(Indianapolis，IN)。Tip60抗体购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。CREB抗体购自Cell Signaling Technology(Beverly，MA)。德克萨斯红偶联山羊抗鼠IgG和FITC偶联山羊抗兔IgG购自Jackson Immunoresearch(West Grove，PA)。IRDyeTM800CW偶联的亲合纯化抗小鼠IgG和抗兔IgG购自Rockland Inc.(Gilbertsville，PA)。以下抗体均购自Sigma(Saint Louis，MO)HA兔抗，actin兔抗，Flag，tubulin鼠抗和SP-1兔抗。双荧光素酶报告基因系统试剂盒购自Promega(Madison，WI)。以下试剂购自Sigma(Saint Louis，MO)异丙(去甲)肾上腺素(isoproterenol)，[D-Pen2，D-Pen5]脑啡肽(DPDPE)，(D-Ala 2，D-Leu 5)脑啡肽(DADLE)，U69593，forskolin，naltrindole。Δ啡肽-I购自BACHEM California Inc(Torrance，CA)。
1.2细胞培养与转染HEK-293细胞，SK-N-SH细胞和HeLa细胞购自American Type Culture Collection(Rockville，MD)。用添加10％加热灭活胎牛血清的MEM培养基(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)培养。细胞培养在37℃，5％CO2培养箱中。在培养20小时后，HEK-293细胞用磷酸钙转染法转染，方法见(Kang，J.，等(2003).Toxicol Sci 74，279-286.)。对HeLa细胞用脂质体(Invitrogen，Carlsbad，CA)转染，方法见Invitrogen公司标准操作规程。野生型和βarr1/2双敲除(βarrs-/-)鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)由Dr.Robert J.Lefkowitz(Duke University Medical Center，Durham)馈赠，用DMEMmedium(Gibco-BRL)培养，脂质体2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)转染。
1.3质粒构建β-抑制蛋白1与β-抑制蛋白1的缺失突变体都装在pcDNA 3.0载体中，HA-tag位于3’端。p300质粒购自Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY)。
1.4激光共聚焦荧光显微镜观察细胞转染后44小时，换无血清的MEM培养液于37℃预孵育2小时。随后加入激动剂，在37℃预孵育5分钟，PBS洗涤。使用4％多聚甲醛室温固定15分钟，然后在1％BSA/PBS中室温封闭1小时。封闭结束后，细胞与12CA5(1μg/ml)在1％BSA/PBS中室温孵育1.5小时，用PBS洗涤，加入Texas-Red标记的二抗室温孵育1小时，PBS洗涤，最后加50％甘油将盖玻片置于载玻片上，封片后4℃避光保存。GFP的激发波长为488nm，测定波长515-540nm，Texas-Red的激发波长为543nm，测定波长590nm。TCS NT激光共聚焦显微镜记录扫描图像(Leica Microsystems，Bensheim，Germany)。在进行活细胞实时观察时，细胞转染后44小时，换无血清的MEM培养液于37℃预孵育2小时。在控温罩中使用激光共聚焦显微镜实时观察。首先扫描未刺激前的图象，加入激动剂后观测同一层面细胞的变化并实时扫描记录。然后，在扫描的图象中选取同一细胞的核、胞浆及胞膜的某一固定区域进行荧光强度分析。荧光强度分析软件由Leica公司提供。
1.5细胞核的制备制备核抽提物，根据已报道过的方法(Neves，S.R.，Ram，P.T.，和Iyengar，R.(2002).Science 296，1636-1639.)，略有改动，简述如下细胞无血清饥饿12小时后，与1μM DPDPE共孵育不同时间点；用4℃预冷的PBS(pH7.4)洗一遍，再用400μl缓冲液(含有10mM HEPES，pH7.9，10mM KCl，0.1mM EDTA，0.1mM EGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF)重悬；冰上孵育10分钟后，若为HEK293细胞或SK细胞，则加入3μl1％NP-40，若为HeLa细胞则加入3μl10％NP-40，轻轻混匀，冰上放置5分钟；13000g离心1分钟。所得上清为细胞质提取物，沉淀部分为细胞核；细胞核用低渗缓冲液洗3遍，然后加入高渗缓冲液(含有20mMHEPES，pH7.9，25％甘油，400mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，和100μg/ml PMSF)于4℃裂解1小时；13000g离心1分钟。所获上清即为核抽提物。用Bradford法测定蛋白浓度后，用SDS-PAGE胶分离。SP-1作为内参，表明所加不同时间点样品的核蛋白量一致；另外，也作为提核试验过程中核蛋白的指示蛋白，显示在抽提过程条件下核蛋白没有外泻。Tubulin也作为内参，表明所加不同时间点样品的胞质蛋白量一致；另外，也作为提核试验过程中胞质蛋白的指示蛋白，显示在抽提过程条件下所提出的核没有胞质蛋白污染。
1.6Western免疫印迹法核提取物或者细胞裂解液，超声5分钟，95℃水浴中变性10分钟，取约50μg蛋白样品于10％SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，电泳完毕取出凝胶，将蛋白质电泳转移至硝酸纤维素膜上，将膜置于用TBST缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris-HCl pH7.4，0.2％Tween-20)配制的10％脱脂牛奶中室温封闭1小时，之后与特异的一抗和二抗孵育(抗体用TBST缓冲液稀释，一抗与二抗反应之后用TBST缓冲液洗膜三次，每次10分钟)，并用ECL试剂盒检测。
1.7报告基因分析采用Promega公司试剂盒并按所提供的实验方法进行。以12孔培养板培养HEK293细胞，转染CREB-luc(0.1μg/孔)和RL-tk-luc(0.2μg/孔，作为对照)，共转或不共转βarr1(0.1，0.2，0.4，0.8μg/孔)，并用pcDNA3-βga1补齐质粒的量。转染44小时后换无血清的MEM培养液，继续在37℃孵育2小时。然后加入无血清的MEM配制的激动剂(Forsklin10μM)继续37℃孵育6小时。1×PBS洗涤细胞后，用Promega公司提供的双萤光素酶报告基因试剂盒中的passive lysis buffer 100μl室温裂解20分钟。取5μl细胞裂解液与同体积的底物(试剂盒提供)反应，使用光度计检测。剩余样品用Western免疫印迹法检测蛋白表达量。
1.8免疫沉淀法细胞用4℃预冷的PBS(pH7.4)洗一遍，再用裂解缓冲液(包含50mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，150mM NaCl，20mM NaF，1％Triton-X100，10％甘油，1mM苯甲基磺酰氯，1x蛋白酶抑制剂混合物(Roche Molecular Biochemicals)于4℃裂解2小时。13000g离心15分钟。取上清与p300抗体，CREB抗体，β抑制蛋白s抗体或HA抗体在4℃旋转孵育4小时。加入蛋白G(Amersham Biosciences)，再旋转孵育1小时。离心后，珠子用裂解缓冲液洗涤3次，加入SDS上样缓冲液，在50℃水浴20分钟。蛋白用SDS-PAGE胶分离。根据抗体说明书推荐的步骤及滴度用Western印记法检测。
1.9RT-PCR抽提HeLa、SK、D2P细胞及小鼠海马、大脑前额页皮层的总RNA。用定量RT-PCR的方法检测细胞中p27，c-fos，c-jun，cyclinA和cyclinD1 mRNA的表达水平。使用引物如下所列在HeLa及SK细胞中，HPRT-有义，5’-CCT GCT GGA TTA CAT CAA AGCACT G-3’(SEQ ID NO1)，反义，5’-TCC AAC ACT TCG TGG GGT CCT-3’(SEQ IDNO2)；p27-有义，5’-GTT AAC CCG GGA CTT GGA GA-3’(SEQ ID NO3)，反义，5’-CAC AGA ACC GGC ATT TGG GGA ACC-3’(SEQ ID NO4)；c-fos-有义，5’-CTCCAG TGC CAA CTT CAT TC-3’(SEQ ID NO5)，反义，5’-CAG CCA TCT TAT TCCTTT CC-3’(SEQ ID NO6)；c-jun-有义，5’-GCA TGA GGA ACC GCA TCG CTG CCTCCA AGT-3’(SEQ ID NO7)，反义，5’-GCG ACC AAG TCC TTC CCA CTC GTGCAC ACT-3’(SEQ ID NO8)；cyclin A-有义，5’-TTA GGG AAA TGG AGG TTA-3’(SEQ ID NO9)，反义，5’-TAG TTC ACA GCC AAA TGC-3’(SEQ ID NO10)；cyclinDl-有义，5’-GAA CAG AAG TGC GAG GAG GAG-3’(SEQ ID NO11)，反义，5’-AGG CGG TAG TAG GAC AGG AAG-3’(SEQ ID NO12)。在βarrs-/-MEFs及鼠脑组织中，HPRT-有义，5’-CCT GCT GGA TTA CAT TAA AGC ACT G-3’(SEQ ID NO13)，反义，5’-TTC AAC ACT TCG AGA GGT CCT-3’(SEQ ID NO14)；TBP-有义，5’-TGCACA GGA GCC AAG AGT GAA-3’(SEQ ID NO15)，反义，5’-CAC ATC ACA GCTCCC CAC CA-3’(SEQ ID NO16)，p27-有义，5’-CAG CTT GCC CGA GTT CTA C-3’(SEQ ID NO17)，反义，5’-CCG GGC TTC TTG GGC GTC TGC T-3’(SEQ ID NO18)；c-fos-有义，5’-CGA AGG GAA CGG AAT AAG-3’(SEQ ID NO19)，反义，5’-CTCTGG GAA GCC AAG GTC-3’(SEQ ID NO20)；c-jun-有义，5’-CTT CTA CGA CGATGC CCT CA-3’(SEQ ID NO21)，反义，5’-GAA GCG TGT TCT GGC TAT GC-3’(SEQ ID NO22)；cyclin A-有义，5’-CCG CCC GAC GTG GAT GAG-3’(SEQ ID NO23)，反义，5’-CTG CGG TCG ATG GGG GAT ACT-3’(SEQ ID NO24)；cyclin D1-有义，5’-TCC CGC TGG CCA TGA ACT ACC-3’(SEQ ID NO25)，反义，5’-GGC GCAGGC TTG ACT CCA GAA-3’(SEQ ID NO26)。
1.10染色质免疫沉淀(ChIP)染色质免疫沉淀按Upstate Biology公司提供的标准方法。用quantitative PCR的方法检测细胞中p27，c-fos，c-jun，cyclinA和cyclinD1基因启动子区βarr1，p300，CBP，Tip60，组蛋白H4，乙酰化组蛋H3及H4的富集程度。使用引物如下所列在HeLa及SK细胞中，p27启动子-有义，5’-GCT CCC GCC GCC GCA ACC AAT-3’(SEQ IDNO27)；反义，5’-CGA ACC CAG CCG CTC TCC AAA CC-3’(SEQ ID NO28)；c-fos启动子-有义，5’-ATT AGG ACA CGC GCC AAG GC-3’(SEQ ID NO29)，反义，5’-ACG GTC ACT GCT CGT TCG CT-3’(SEQ ID NO30)；c-jun启动子-有义，5’-GGGCGG GCC GGG AAA AAC-3’(SEQ ID NO31)，反义，5’-CAT TGG CTC GCG TCGCTC TCA GG-3’(SEQ ID NO32)；cyclin A启动子-有义，5’-GTG TTG TTC CGGACA CAT AGA AAG-3’(SEQ ID NO33)，反义，5’-CAG TGC ATT GCT TCA GACTCC AC-3’(SEQ ID NO34)；cyclin D1启动子-有义，5’-TGC CCC TGT AGT CCGGTT TTC ATA-3’(SEQ ID NO35)，反义，5’-GCG CCC CAG TCA CCC CTT CTC-3’(SEQ ID NO36)。在βarrs-/-MEFs及鼠脑组织中，p27启动子-有义，5’-TCC GAG GCCAGC CAG AGC AGG TTT-3’(SEQ ID NO37)，反义，5’-AGC GGG GAC AGG GGAGGG GGA GAA-3’(SEQ ID NO38)；c-fos启动子-有义，5’-CGT CAA TCC CTC CCTCCT-3’(SEQ ID NO39)，反义，5’-GGC GCT CTG TCG TCA ACT-3’(SEQ ID NO40)；c-jun启动子-有义，5’-CTA CCG GCC AGC AAC TTT C-3’(SEQ ID NO41)，反义，5’-CCG CCC GGC CTC CAA CAA-3’(SEQ ID NO42)；cyclin A启动子-有义，5’-CAG GGG AAG TGG GAT GGA TAG-3’(SEQ ID NO43)；反义，5’-CAG CGC TGGATA CCC CTT GAG-3’(SEQ ID NO44)；cyclin D1启动子-有义，5’-CCC CCA GCGAGG AGG AAT AGA TGA-3’(SEQ ID NO45)；反义，5’-GTA ACA CCC GAA GATGCC AGA CGA-3’(SEQ ID NO46)。
1.11体外组蛋白乙酰化和去乙酰化分析体外组蛋白乙酰化酶活性，体外组蛋白乙酰化和去乙酰化分析采用UpstateBiology的试剂盒进行。组蛋白乙酰化酶PCAF(0.1μg)，镍离子(600μM)以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA(100nM)分别被用作体外组蛋白乙酰化酶活性，体外组蛋白乙酰化和去乙酰化分析的阳性对照[Broday，L，等(2000).Cancer Res 60，238-241；Kang，J.，等(2003).Toxicol Sci 74，279-286；Koyama，Y.，等(2000).Blood 96，1490-1495]。
1.12蛋白-染色质结合实验蛋白-染色质结合实验参照以前发表的方法[Donovan，S.，等(1997).Proc NatlAcad Sci U S A 94，5611-5616；Liang，C.，等(1997)Genes Dev 11，3375-338618，19]。用提取缓冲液(EB；100mM KCl，50mM HEPES-KOH，pH7.5，2.5mM MgCl2，50mM NaF，5mM Na4P2O7，0.1mM NaVO3，0.5％Triton X-100，用前加蛋白酶抑制剂混合物(RocheMolecular Biochemicals))裂解约2×107细胞。在裂解液(WCE)下方放一半体积30％蔗糖溶液，10,000×g离心10min。沉淀(Crude Pel)用CaCl2(至1mM)和5单元微球菌核酸酶(MNase，Takara Biotechnology)消化20秒。用EGTA(至1mM)终止消化，10,000×g，4℃离心5分钟.上清(MNase Sup)500,000×g离心小时，收获沉淀(Ultra Pel)和上清(Ultra Sup)。把得到的所有样品用8％或15％SDS-PAGE凝胶分离，检测βarr1，p300，组蛋白H4，和微管蛋白的存在。
1.13[3H]胸苷掺入用βarrs或βarr1 siRNA质粒转染SK细胞42或90小时；或SK细胞用βarr1 siRNA或p27 siRNA质粒转染90小时，饥饿2小时，再用1μM of DPDPE或DADLE处理1小时，或1μM of DEL处理30min。不同处理细胞在含1μCi/ml of [3H]胸苷(24.0Ci/mmol；Amersham)的新鲜培液中培养6小时，用Beckman multipurpose scintillationS6500记数仪检测[3H]胸苷掺入情况。
1.14小鼠侧脑室注射用尿道麻醉三周龄C57小鼠(中科院上海实验动物中心)后，侧脑室(前囱-0.25mm；侧部，1mm；深度，2.25mm)注射2pmol DPDPE(DP，1.5μl/小鼠)。有些组在注射DPDPE前15分钟，侧脑室注射生理盐水或20fmol naltridole(1.5μl/mice).注射DPDPE后不同时间点取小鼠海马和大脑皮层，进行RT-PCR及ChIP分析。动物实验遵循国立卫生研究院关于实验室动物健康和使用的规定。
1.15数据统计实验数据以平均值±标准误表示，用SigmaPlot4.0作图软件进行曲线拟合，实验组间差异显著性采用Student t检验，或采用ANOVA并用Bonferroni post-hoc test做多组间差异比较。
2结果2.1 DOR激活导致β-抑制蛋白1转核本发明者首先在HEK293细胞中瞬时表达DOR受体和βarrs-GFP融合蛋白，采用激光共聚焦显微镜观察了βarrs在激动剂刺激下在细胞内分布的变化。在没有激动剂存在时，βarr1-GFP均匀地分布在细胞浆和细胞核。而βarr2-GFP只分布于细胞浆。在DOR的特异性激动剂DPDPE(1μM)处理5分钟后，βarr1-GFP和βarr2-GFP在胞浆中的荧光强度下降，而在细胞膜上的荧光强度增加。与βarr2-GFP不同的是，在阿片激动剂刺激后βarr1-GFP在细胞核内的荧光强度也明显增加。同野生型βarr2相似，βarr1Q394L主要分布于胞浆，在受体激活后也不发生核转位。为证实βarr1转核现象，本发明者又在表达DOR和βarr1-GFP的HEK293活细胞上对激动剂诱导的βarr1-GFP的重分布进行了实时观测。结果显示，在激动剂处理前，βarr1-GFP均匀地分布在细胞胞浆和核内。加入激动剂后1分钟，细胞膜和核内βarr1-GFP荧光强度就明显增加同时胞浆内的荧光强度降低，到3分钟时细胞膜和细胞核的荧光强度达到最大值而细胞浆内的荧光强度达到最低。这些结果提示在激动剂刺激下βarr1-GFP在向细胞膜转位的同时也向细胞核转位。为排除GFP对所观察到的βarr1转位的可能影响，本发明者在共表达了DOR和βarr1-HA的HEK293细胞和只表达了DOR的HeLa细胞中用1μM DPDPE刺激，然后采用western免疫印迹的方法来检测核提取物中βarr1-HA及内源βarr1含量的变化。结果表明无论是βarr1-HA还是βarr1在核内的含量都在激动剂处理后有明显增加。这些结果表明激活DOR的确诱导了βarr1向细胞核的转位。进一步研究发现，KOR的激活同DOR的激活一样，能引起βarr1向细胞核转位。但激活MOR或β2AR，不能引起βarr1向细胞核转位。
2.2DOR激活促进βarr1-介导的p27和c-fos转录结合基因芯片的初步结果，本发明者首先应用定量RT-PCR和Western印迹方法研究了βarr1对p27，c-fos，c-jun，cyclinA和cyclin D1这些与细胞增殖相关基因表达的影响。结果显示，与对照HeLa细胞相比，过表达βarr1(约内源βarr1的8倍)引起p27mRNA和蛋白水平的明显升高，而同样水平表达主要分布于胞浆的βarr2或βarr1Q394L则没有这种作用。与之对应，βarr1 siRNA和βarr2 siRNA的应用同样显著地降低了细胞中内源βarr1或βarr2的表达(约降低80％)，但只有βarr1 siRNA可以显著降低细胞中p27和c-fos的mRNA水平和p27的蛋白水平。由于c-Fos蛋白不稳定，本发明者没有检测到c-Fos蛋白。作为对照，βarr1及它的siRNA不影响细胞中c-jun，cyclin A，及cyclin D1的表达。βarr1对基因转录的这种影响在βarrs-/-MEF(βarr1和βarr2双敲除)细胞[Kohout，T.A.，等(2001).Proc Nat1 Acad Sci U S A 98，1601-1606]中也得到证实。这些结果证明βarr1确实调节了p27和c-fos基因的转录，而这种调节与βarr1在核内的分布相关。因此，本发明者研究了能引起βarr1转核的DOR激活对上述基因转录的影响。DPDPE处理引起p27mRNA和蛋白水平的明显升高，对c-jun则没有作用。DPDPE的这种作用可以被DOR的拮抗剂或βarr1 siRNA所阻断，但不受Gi/Go(百日咳毒素)，PI3K(渥曼青霉素)，p38(SB203580)，JNK(SP600125)，或ERK(PD98059)的抑制剂影响，显示DOR激活可以通过诱导βarr1的转核直接调节基因转录。
2.3βarr1核内浓度的升高促进了p27和c-fos启动子区组蛋白H4的乙酰化本发明者研究了βarr1对组蛋白乙酰化的影响。图1A的结果显示HeLa细胞中，表达βarr1和它的siRNA显著促进或抑制组蛋白H4乙酰化，不影响组蛋白H3乙酰化。进一步发现，在组蛋白H4氨基端可被乙酰化修饰的四个位点[Grunstein，M.(1997).Nature 389，349-352]中，βarr1主要影响Lys-12和Lys-16的乙酰化。同βarr1对基因转录的影响一样，βarr1对组蛋白乙酰化的这种调节作用同样可以在βarrs-/-MEF细胞中得到证实(图1B)。象本发明者预计的一样，βarr2，βarr1 Q394L和βarr2 siRNA都不影响组蛋白乙酰化(图1)。这些结果显示，核内的βarr1可以调节组蛋白H4的乙酰化，从而影响包括p27和c-fos在内的一些特定基因的转录。
组蛋白乙酰化变化对基因转录是否有调节作用取决于这种变化是否发生在特定基因附近，尤其是是否发生在该基因的启动子区。染色质免疫沉淀实验(ChIP)显示，无论在HeLa，还是βarrs-/-MEF细胞中，βarr1都显著促进p27和c-fos启动子区组蛋白H4的乙酰化，而βarr1 siRNA则显著抑制HeLa中这些区域组蛋白H4的乙酰化(图2A)。同上面一样，βarr2和βarr1Q394L没有这种作用(图2A)，提示βarr1在核内的富集是组蛋白H4乙酰化变化所需要的。βarr1不影响c-jun，cyclin A，及cyclin D1启动子区组蛋白H4的乙酰化，也不影响所有测定基因启动子区组蛋白H3的乙酰化(图2A，cyclin A，cyclin D1的数据未显示)，显示βarr1对组蛋白H4乙酰化的调节具有基因特异性。对应地，DPDPE处理βarr1-和受体激活依赖地促进p27(图2B，2C)和c-fos(数据未显示)启动子区组蛋白H4的乙酰化，说明受体激活诱导的βarr1转核基因特异性地促进了某些启动子区组蛋白H4的乙酰化。从不同的βarr1突变体得到的数据显示βarr1对p27启动子区组蛋白H4的乙酰化的促进与它对这些基因转录的调节正相关(图2E)。
为了研究βarr1调节组蛋白H4乙酰化的机制，本发明者首先研究了βarr1是否与染色质结合。七组分蛋白-染色质结合实验显示(图2D)，与染色质结合蛋白组蛋白H4和p300类似，外转和内源βarr1分布于初的染色质沉淀组分(泳道3)，微球菌核酸酶(MNase)消化后上清(泳道4)，以及MNase消化上清超速离心后的沉淀(泳道7)中，显示βarr1可以与染色质结合。ChIP实验进一步证实HeLa细胞中，βarr1特异性地富集在p27和c-fos启动子区，而不在c-jun(图2A)，cyclin A或cyclin D1(数据未显示)启动子区。象预计一样，βarr1抗体βarrs-/-MEFs中沉淀出任何DNA序列(图2A，cyclin A和cyclin D1的数据未显示)，证明了该抗体的特异性。与DOR激活对组蛋白H4乙酰化的调节一样，DOR激活也大大促进了βarr1在p27和c-fos启动子区的富集(图2B，c-fos的数据未显示)。这些结果显示βarr1在p27和c-fos启动子区的富集可能与它对这些区域组蛋白H4乙酰化的促进相关。
2.4βarr1招募p300到p27和c-fos启动子区体内组蛋白乙酰化的水平受组蛋白乙酰化酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)控制。本发明者采用GST-βarr1、免疫沉淀的HA-βarr1体外进行的组蛋白乙酰化和组蛋白去乙酰化分析表明，βarr1既不是组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶，体外也不影响组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶的活性(图3A-3C)。更重要的是，I、II、III类组蛋白去乙酰化酶抑制剂trichostatin A(TSA)和sirtinol(STN)，不影响βarr1对p27和c-fos启动子区组蛋白的乙酰化(图3D)。这些结果说明βarr1可能是通过在特定基因区域招募组蛋白乙酰化酶促进组蛋白乙酰化的。
p300，CBP和Tip60是很重要的组蛋白乙酰化酶。有报道发现p300和CBP与c-fos启动子区组蛋白乙酰化有关[Chan，H.M.，等(2001).J Cell Sci 114，2363-2373；Usenko，T.，等(2003).Oncogene 22，7661-7666.]，Tip60则可能与βarr1结合[Salwinski，L，Miller，(2004).Nucleic Acids Res 32，D449-451]。因此，本发明者研究了βarr1对这些酶在p27和c-fos启动子区富集的影响。研究显示，表达βarr1 siRNA或βarr1分别降低或促进p300在p27和c-fos启动子区富集，但不影响CBP和Tip60在这些区富集情况(图4A)，也不影响p300，CBP和Tip60在c-jun(图4A)，cyclin A和cyclin D1(数据未显示)启动子区的富集。与DPDPE刺激促进p27和c-fos启动子区βarr1富集及组蛋白乙酰化的结果一致，DPDPE刺激也促进了p300在p27和c-fos启动子区的富集(图2B，4B，c-fosβ数据未显示)。用HeLa细胞核提取物进行免疫共沉淀发现，核内的βarr1和p300间有相互作用。这些结果显示βarr1基因特异性地促进组蛋白乙酰化的机制可能是它把p300招募到了这些基因区域。
2.5p300在βarr1-介导的组蛋白乙酰化和基因转录中的作用无论在HeLa还是βarrs-/-MEF细胞中，p300过表达显著促进p27和c-fos启动子区组蛋白H4乙酰化，且p300的这种促进作用可以被βarr1或βarr1 siRNA促进或阻止。更重要的是，p300显性失活突变体(p300 DN)显著减小了βarr1对p27和c-fos启动子区组蛋白H4的。这些数据显示p300在βarr1-介导的组蛋白乙酰化中发挥重要作用。与之对应，过表达p300 DN也显著降低了βarr1对p27和c-fos的转录激活作用，提示βarr1-介导的基因特异性组蛋白乙酰化与它介导的转录激活有关。
有报道显示，转录因子cAMP响应元件结合蛋白(CREB)可以招募CBP和p300，并调节p27和c-fos的转录[Mayr，B.，等(2001).Nat Rev Mol Cell Biol 2，599-609；Garcia，C.，等(2004)J Neurosci Res 78，338-346]。最近的研究也显示组蛋白乙酰化在CREB-依赖的基因(如c-fos)转录中有重要作用[Johannessen，M.，等(2004).Cell Signal16，1211-1227]。本发明者免疫共沉淀实验显示内源βarr1和CREB间有相互作用。进一步研究显示CREB siRNA的表达显著降低了βarr1在p27和c-fos启动子区的富集，反过来，βarr1及βarr1 siRNA的表达不影响这些区域CREB的富集情况。加之βarr1过表达不影响CREB的转录活性，这些结果显示βarr1不是通过直接激活CREB的转录活性调节基因转录，GPCR信号刺激下，βarr1和CREB间的相互作用可能参与了βarr1在特异基因区域的富集，这些区域组蛋白乙酰化的变化以及这些基因的转录。
2.6激活神经细胞表面DOR促进βarr1-依赖的组蛋白乙酰化，p27转录及增殖抑制DOR表达于中枢神经系统的一个重要的神经递质受体。为了验证在一个更接近生理的条件下，DOR激活是否同样引起组蛋白H4乙酰化及p27转录，本发明者用1μM DPDPE刺激内源性表达DOR的人脑成神经细胞瘤SK细胞[Yu，V.C.，等(1986).JBiol Chem 261，1065-1070]。图5A和5B显示，DPDPE处理时间依赖性地促进βarr1转核，p27启动子区组蛋白H4乙酰化及p27转录。DPDPE的这些作用可以被naltridole及βarr1 siRNA所阻断。与之类似，侧脑室注射DPDPE也DOR-特异性地促进小鼠海马区和大脑皮层p27启动子区组蛋白H4乙酰化及p27转录，显示体内激活DOR同样引起组蛋白H4乙酰化及p27转录。由于p27主要参与细胞增殖抑制[Kiyokawa，H.，等(1996).Cell 85，721-732；Nakayama，K.，等(1996).Cell 85，707-720]，本发明者研究了βarr1和DOR激活是否能够p27-依赖地抑制SK细胞的增殖。图5D显示，βarr1或βarr1 siRNA的表达p27-依赖性地显著抑制或促进了SK细胞的增殖。与此相对应，DOR激活βarr1-和p27-依赖性地抑制了SK细胞的增殖。同时，DOR的其它激动剂如DADLE(与DPDPE结构相似)或δ啡肽-I(与DPDPE结构不同)也能引起βarr1转核(图5A)、组蛋白H4乙酰化、p27转录(图5C)，以及SK细胞的增殖抑制(图5D)。这些数据提示βarr1-介导的表观遗传机制在神经细胞DOR激活调节生理活动过程中发挥重要作用。
3.讨论βarrs是众所周知的胞质内信号的调节者和接头蛋白(scaffold protein)。受体激活介导的βarrs上膜在受体脱敏以及信号转导中都起了很重要的作用[Claing，A.，等(2002).Prog Neurobiol 66，61-79；Luttrell，L.M.，等(2002).J Cell Sci 115，455-465]。所有报道的βarr1功能都发生在细胞质或细胞膜上，对于βarr1在核内的功能从未有所涉及。本发明发现，DOR激活导致βarr1转核，促进βarr1-依赖的p27和c-fos转录，揭示了βarr1不仅可以在胞质中介导信号的转导，而且有可能把从受体来的信号传递到细胞核中。βarr1过表达和受体激活导致的βarr1转核促进了p27和c-fos启动子区的组蛋白乙酰化和p27和c-fos转录，显示通过改变表观遗传修饰调节基因转录是βarr1在核内的一个功能。概括地说，本研究证明染色质是GPCR-介导的信号转导的直接靶标，揭示了GPCR信号从膜到核的表观遗传机制。同时也是第一个关于βarr1核内功能的报道。
最近的研究表明，真核生物基因转录中，表观遗传修饰变化作用重大[Grewal，S.I.，等(2003).Science 301，798-802]。其中，核小体组蛋白的乙酰化修饰变化是染色质结构和基因转录活性的重要决定者[Cheung，W.L.，等(2000).Curr Opin Cell Biol 12，326-333；Grunstein，M.(1997).Nature 389，349-352]。本发明者发现核内βarr1的积累促进了p27和c-fos启动子区组蛋白H4的乙酰化和p27和c-fos转录，提示促进组蛋白乙酰化代表了βarr作为核内信使一个十分重要的新功能。进一步研究发现，βarr-介导的组蛋白乙酰化和基因转录受外界信号，如DOR和KOR激活调空，提示组蛋白的修饰可能是细胞整合GPCR-介导的外界信号并产生转录应答的表观遗传机制。
组蛋白乙酰化酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)是细胞中控制组蛋白乙酰化高低的酶蛋白。本发明者的结果显示HDAC不参与βarr1对组蛋白乙酰化的调节，βarr1也不具有或影响HAT的活性。因此本发明者推测βarr1是通过影响HAT蛋白在基因区域的募集调节组蛋白乙酰化的。本发明者的实验证实βarr1和βarr1 siRNA的表达分别显著提高或降低了p300在p27和c-fos启动子区的积累，而且，p300 DN抑制βarr-介导的组蛋白乙酰化和基因转录。结合p300和βarr1之间具有相互作用，本发明者的数据显示受体激活后，在特定基因区域，βarr通过募集HATs，如p300，促进这些区域组蛋白乙酰化。
有研究表明，基因转录起始之前，启动子区的转录因子需要协调性地招募大批包括染色质重建酶在内的蛋白。特定染色质重建酶通过与转录因子相互作用保证染色质重建可以在合适的时间合适的细胞正确的基因上发生。本发明者的研究显示，转录因子CREB中介了βarr1在p27和c-fos启动子区的积累，不过，尽管CREB也存在于c-jun启动子区，这里却没有βarr1的存在。越来越多的证据显示转录因子外，特定启动子区预先存在的核蛋白结构在该区域染色质重建中同样发挥重要作用[Urnov，F.D.，和(2001).Oncogene 20，2991-3006]。本发明者质谱分析的数据显示除p300和CREB外，βarr1复合物中尚存在多种核蛋白。因此，p27和c-fos启动子区可能还存在招募βarr1必需的其它因子，这正是βarr1特异性地调节基因转录的机制。
先前的研究显示βarrs的重要功能之一就是作为支架蛋白去增强GPCR信号的效应或/和特异性[Hall，R.A.，(2002).Circ Res 91，672-680]。如，GPCR激活后，βarrs在细胞质中顺次结合JNK3 cascade中起作用的激酶，导致JNK3的激活和在细胞质中的阻滞[McDonald，P.H.，等(2000).Science 290，1574-1577]。本发明者先前的研究也发现βarr2可以把Mdm2靶向到激活的GPCR受体，从而抑制Mdm2的自身泛素化及Mdm2介导的p53降解。与之类似，在核内βarr1可能也是作为支架分子和信号分子，通过与转录因子及其它核蛋白作用招募HAT到特定基因区域，从而调节基因转录。
本发明者的研究发现，βarr1过表达和DOR激活促进βarr1转核促进了p27和cfos启动子区的组蛋白乙酰化，提高了p27的表达，但没有显著提高c-fos的转录，提示对c-fos的正常转录而言，细胞内内源βarr1和/或基础组蛋白乙酰化是足够的。βarr1siRNA同时降低c-fos启动子区组蛋白乙酰化和c-fos转录支持上述观点。在检测的基因中，βarr1过表达和DOR激活引起的βarr1转核不影响c-jun，cyclin A和cyclin D1的转录和这些基因区域的组蛋白乙酰化。结合βarr1核内积累特异性作用于p27和c-fos启动子区，本发明者推测GPCR激活可以βarr依赖地诱导一系列特定基因区域的组蛋白修饰和基因转录。
Barrs是GPCR信号的重要调节者，有βarr1和βarr2两种亚型。尽管二者享有～80％的同源性，本发明者的研究发现，在激动剂刺激后，只有βarr1向核内转移。以往的研究显示这两种βarrs都可以在细胞质和细胞核间穿梭。但与βarr1不同的是，βarr2的C端带有一个强的出核信号[20，39]。βarr1的点突变βarr1 Q394L带有与βarr2同样的出核信号，本发明者发现刺激剂不能诱导βarr1 Q394L出核，显示βarrs的C端在调节不同亚型βarrs核内浓度方面具有重要的作用。这些结果同时提示在调节GPCR介导的核内信号中，βarr1亚型发挥更重要的作用。本研究还观察到，DOR和KOR刺激可以引起βarr1转核，而β2AR或MOR刺激却没有这种功能，显示一些特定的GPCR信号可能更偏好于这种βarr1介导的表观遗传通路。
GPCR信号可以通过细胞质内不同的传导级联通路由膜向核传递。GPCR激活引起的典型胞内通路包括与受体相连的三聚体G蛋白的激活、与Gα亚基结合的GTP的水解、cAMP生成的变化、不同信号分子如MAPKs和PKA的调节、最终导致目标基因的转录变化[Shaywitz，A.J.，等(1999).Annu Rev Biochem 68，821-861；Neves，S.R.，等(2002).Science 296，1636-1639.]。DOR激活可能引起的胞内通路包括Gi蛋白、ERK1/2、JNK、P38和PI3K等级联通路激活[Eisinger，D.A.，等(2004).J Pharmacol ExpTher 309，776-785；Persson，A.I.，等(2003).Mol Cell Neurosci 23，360-372；Shahabi，N.A.，等(2003).Cell Immunol 221，122-127；Zhang，Z.，等(1999).J Neurochem 73，1502-1509]。本发明者发现激动剂诱导的基因特异性组蛋白乙酰化和基因转录可以被DOR的拮抗剂或βarr1 siRNA所阻断，但不受Gi/Go、PI3K、p38、JNK、或ERK抑制剂的影响。结合p300介导的特异基因区域组蛋白乙酰化和基因转录需要βarr1的转核及在特定染色质区域积累，这些结果提示DOR激活引起的外界信号由膜到核的转导是由βarr1转核，而不是由上述已知胞内信号通路介导的。
以往的研究认为，内吞只是膜受体信号的负反馈调节机制。近来的研究显示接受刺激后，特定组成性在细胞质和细胞核间穿梭的内吞蛋白也直接参与外界信号由膜到核的传递[Benmerah，A.(2004).Curr Biol 14，R314-316]。如，在外界刺激下，内吞蛋白APPL1转核并通过与NuRD/MeCP1复合物相互作用传递信号[Miaczynska，M.，等(2004).Cell 116，445-456.]。本发明者的结果显示，DOR激活引起内吞蛋白βarr1转核、特定基因区域βarr1和HAT蛋白富集、从而促进了特异基因区域组蛋白的乙酰化和这些基因的转录。这些数据展示了βarr作为一个直接的信使和核内具信号作用的支架蛋白把GPCR信号由膜传递到核，并通过表观遗传修饰调节基因转录的新功能。从人神经瘤细胞和鼠海马得到的实验进一步证实，激活内源DOR同样引起βarr1转核、p27基因区域组蛋白的乙酰化和p27基因的转录。
表观遗传网络平衡对人正常发育有重要意义，破坏则引起包括癌症、染色体不稳定综合症和记忆障碍等多种病变[Egger，G.，等(2004).Nature 429，457-463；Sutherland，J.E.，等(2003).Ann N Y Acad Sci 983，151-160]。越来越多的研究认为表观遗传调节是细胞对环境刺激产生整体转录应答的重要通路[Levenson，J.M.，等(2005).Nat RevNeurosci 6，108-118]。本发明者的研究显示DOR激活诱导βarr1转核，导致组蛋白修饰变化，基因激活和细胞增殖抑制，揭示GPCR信号可以通过表观遗传修饰对细胞进行调节，在这一过程中，βarr再次扮演重要角色。深入研究将有助于揭示作为细胞膜和细胞核间信号支架蛋白，βarr调节基因转录的机制，也有助于揭示受体诱导的依赖βarr的表观遗传信号通路的分子机制。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院复旦大学<120>β-抑制蛋白在制备治疗表观遗传相关疾病的药物中的应用<130>058759<160>46<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>46gtaacacccg aagatgccag acga 2权利要求
1.β-抑制蛋白1、其核酸序列、含有该核酸序列的构建物在制备用于治疗与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病是癌症、神经系统疾病或表观遗传疾病。
3.δ阿片受体激动剂或k阿片受体激动剂在制备用于治疗与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病是癌症、神经系统疾病或表观遗传疾病。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述δ阿片受体激动剂选自[D-Pen2，D-Pen5]脑啡肽、(D-Ala2，D-Leu5)脑啡肽或δ啡肽-I。
6.一种用于治疗与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病药物组合物，其特征在于，所述组合物包含有效量的至少一种选自β-抑制蛋白1、β-抑制蛋白1的核酸序列、含有所述核酸序列的构建物、δ阿片受体激动剂或k阿片受体激动剂的物质作为活性组分，以及药学上可接受的载体。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病是癌症、神经系统疾病或表观遗传疾病。
8.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述δ阿片受体激动剂选自[D-Pen2，D-Pen5]脑啡肽、(D-Ala2，D-Leu5)脑啡肽或δ啡肽-I。
9.一种从候选物质中筛选出治疗与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病的药物的方法，该方法包括a)使所述候选物质与表达β-抑制蛋白1的细胞接触；b)鉴定β-抑制蛋白1在所述细胞的细胞核内的表达水平，并将该表达水平与未接触所述候选物质的细胞的细胞核内β-抑制蛋白1表达水平相比较；c)选出使细胞核内β-抑制蛋白1表达水平提高的物质作为所述治疗与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病的药物。
全文摘要
本发明涉及β－抑制蛋白1、其核酸序列、含有该核酸序列的构建物在制备用于治疗与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病中的应用。本发明还涉及δ阿片受体激动剂或κ阿片受体激动剂在制备用于治疗与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病中的应用。本发明还涉及一种从候选物质中筛选出治疗与组蛋白乙酰化水平降低相关的疾病的药物的方法。
文档编号A61P35/00GK1970074SQ20051011062
公开日2007年5月30日 申请日期2005年11月23日 优先权日2005年11月23日
发明者马兰, 裴钢, 康九红, 施裕丰, 向斌, 鲍国斌, 苏文娟 申请人:中国科学院上海生命科学研究院, 复旦大学