一种UreG蛋白及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：一种UreG蛋白及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域，尤其涉及一种UreG蛋白及其制备方法和用途。
背景技术：
避孕原理，就是用科学的方法来阻止和破坏正常受孕过程中的某些环节，以避免怀孕，防止生育。目前所采用的避孕方法很多，国内外用于免疫节育的现有技术有①抗促性腺激素释放激素(GnRH)、卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)疫苗GnRH可刺激垂体分泌促性腺激素，因而免疫中和GnRH将阻止内源性GnRH与其受体的结合，延缓青春期动物的性成熟和引起成年性腺萎缩，同时配子发生受到抑制、性欲丧失。应用GnRH疫苗免疫狗和大鼠产生的效应是可逆的。FSH疫苗主要用于男性避孕，其最大的优点是不影响睾酮水平，因此不影响性欲。由于在鼠和bonnet猴取得了很好的抗生育效果，目前正在人类中进行I期临床试验。这种FSH疫苗以明矾为佐剂，由羊垂体中纯化的FSHαβ异二聚体或以单独的FSHβ链构成，在所有免疫个体均可诱导FSH特异性抗体的生成。FSH对于刺激精子的发生是必须的。应用人FSH与霍乱内毒素、白介素相结合可产生有效抗体，在非人类灵长类动物中，这些抗体可与放射性标记的人FSH结合。应用人FSH免疫雄猴可导致精子计数减少75～100％，同时精子丧失穿透仓鼠卵的能力，其生育力明显降低。LH可刺激睾丸和卵巢的内分泌功能和配子的发生。应用从牛黄体中分离的LH受体免疫雌狒狒和用源于杆状病毒的猪LH受体外区免疫小鼠，其生育力明显受抑。
②抗卵透明带(ZP)蛋白疫苗ZP蛋白围绕在卵母细胞外，在受精过程中起着重要作用。ZP3蛋白是卵透明带蛋白家族中的重要成员，在功能上，ZP3作为初级精子受体，起始精卵结合和顶体反应。由于ZP3在受精中的重要作用，它成为免疫避孕的有效靶点。ZP3蛋白疫苗和DNA疫苗可以诱导机体产生较强的免疫反应，导致生育降低。
③抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)疫苗hCG是由孕体滋养层细胞产生的。早在胚泡阶段着床前即可在滋养外胚层发现。hCG是一种38KDa的糖蛋白，糖类占30％。由α、β两个共价键相连的不同亚基组成。应用β-hCG的独特C末端多肽部分作为抗原制备的疫苗已用于兔、猴和人类临床试验，结果显示80％女性产生了抗体而且阻止了受孕。
④抗精子表面抗原疫苗免疫性不育是由T、B细胞介导而产生的，能够刺激T细胞效应器反应的精子或生殖细胞抗原可导致睾丸炎和其它病理反应，而能够激活体液免疫的抗原主要在配体水平选择性地干扰受精，没有其它副效应。能激发体液免疫的精子靶分子是精子通过生殖道过程中起作用的外在成分或组成精子质膜的固有成分，另外包括首先出现于精子内部而后由于顶体反应而暴露于精子表面的顶体抗原。针对表面靶位的抗体介导的免疫反应可以非特异性方式如精子凝集、制动或阻止受精中的某个特异性细胞活动而发挥作用。精子抗原性在避孕疫苗开发上的应用或许在于它本身的特异性，以及在于生殖管道局部能产生足以终止受精的抗体应答的免疫原性。现有技术有以下不足①由于抗体中和GnRH而产生的性激素水平降低，GnRH疫苗可能导致生殖器官功能的减退，造成雌性骨质疏松和雄性体重下降，显然不适合人类。另外，足够数量的FSH来源受限。因此，FSH疫苗还有待于进一步研究。LH受体抗体浓度的提高伴随着卵巢功能衰竭、生殖腺萎缩。针对GnRH、垂体FSH和LH、性激素和其他下丘脑-垂体-性腺轴中的生理性分子的免疫可抑制生育，但常具有两种危险性第一类固醇激素对其生殖靶器官的维持和功能是必须的，且在其他多种靶组织中发挥作用，这些功能性因子的丧失或反馈机制的紊乱可危及内分泌平衡和性功能；第二免疫反应导致持续免疫复合物的形成可造成对组织危害。
②尽管在灵长目动物中利用ZP抗原免疫可以产生抗体，进而抑制精卵结合，使生育力下降；但在大多数研究中，运用完整的ZP抗原免疫伴有自身免疫性卵巢炎和卵巢功能下降等病理性损伤。在用天然ZP蛋白直接免疫达到避孕目的的同时，被免疫动物出现了较为严重的卵巢炎。表现为卵巢功能紊乱，原始卵泡衰竭。产生这种副作用的原因可能是当用同源性较大的ZP3免疫时，在免疫原上存在着一些表位，被抗原提呈细胞提呈后，引起了针对动物体自身的T细胞反应而发生了自身免疫性疾病。
③多种不同形式的以完整hCGβ链为抗原的疫苗正在研发之中。目前，在芬兰、瑞典、智利、巴西和多米尼加共和国等国家正在进行以明矾为佐剂，hCGβ和TT结合抗原的I期临床剂，这种疫苗是迄今为止在人类唯一结束II期临床试验并证明有效的抗生育疫苗。但是，尽管实验组中148名妇女免疫后均产生hCG反应性抗体，仍有20％在最初三次注射后呈现低反应性，不能产生保护水平的抗体试验。以人hCGβ链和绵羊hCGα链构成的异种二聚体与TT或DT组成结合抗原，以明矾和脂多糖来源的钠酞作为佐剂，20％妇女对hCG不敏感，无节育效果。
④有数据显示，精子具有自身和异体抗原性的可能性，因而在男性和女性中能产生导致人类不孕症的免疫应答。然而完整的精子本身不能用于疫苗开发，因为存在于精子细胞表面的几种抗原可能为多种体细胞所共有。因此，只有那些精子特异性的抗原才能用于抗精子避孕疫苗的开发。寻找能用于避孕的精子特异性的抗原本身就是非常困难的工作，并且人精子蛋白来源有限。
在中国申请号CN03108565.2，公开了一种与分子佐剂交联的避孕疫苗，将起分子佐剂作用的3个拷贝C3d与hCGβ通过基因克隆构建入真核表达质粒pCMV4，该融合质粒可作为DNA避孕疫苗免疫动物或人。但多数妇女对该疫苗不敏感，无节育效果。

发明内容
本发明的目的在于(1)提供一种UreG蛋白；(2)提供UreG蛋白制备方法；(3)提供UreG蛋白用途。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的一、溶脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，UU)的培养、鉴定与纯化UU是从被UU感染的不育男性(血清和精液抗精子抗体阳性)精液中获得。分离、培养与纯化参照Thirkell方法(Thirkell方法如下取精液标本100μL接种于pH 5.5～6.5含有1％酚红和0.1％尿素的UU液体培养基中。37℃培养16～24h，观察颜色变化，指示剂由橘黄色变为橙红色表明UU生长。取100μLUU悬液转种于固体培养基中，95％空气和5％CO2，在37℃恒温箱内培养36～72h后，在低倍镜下观察菌落呈“油煎蛋”状。)根据UU菌落形态鉴定UU菌株，扩增10000ml UU菌液。采用Thirkell方法提取UU蛋白质。UU在固体培养基中呈现“油煎蛋”状外观，见图1
二、制备精子膜蛋白手淫获得健康供精者的精液标本，精液参数在正常范围。排除UU感染及抗精子抗体阳性的精液标本。精子膜蛋白的制备参照Snow的方法。(Snow方法如下选用无UU生长的正常生育者精液标本5份，37℃液化30min，2500r/min离心10min，弃去精浆，PBS洗三次，加入0.5％NP-40，4℃1h，14000r/min离心12min，取上清。)精子膜蛋白收集后用于电泳分析以及制备抗精子膜蛋白抗血清。
三、抗精子膜蛋白抗血清两只新西兰大白兔，年龄6个月(体重2.5kg左右)，由中国科学院动物中心提供，用人精子膜蛋白免疫兔子。第一和第三天，将抗原与福氏完全佐剂的混合物对兔子的背部及后肢肌肉多点注射。第二十八天，将抗原与福氏不完全佐剂的混合物按上述方法进行第二次加强免疫。每次注射抗原量为200-300μg。第三十五天时，ELISA方法检测血清效价。
四、间接免疫荧光方法经上游处理的人精子制备成精子涂片，1∶400稀释兔抗人精子膜蛋白抗血清作为一抗，4℃过夜；1∶200稀释的FITC标记的羊抗兔IgG作二抗，室温下孵育2小时。阴性对照组用兔免疫前血清替换第一抗体。激光共聚焦扫描显微镜(Carl Zeiss，LSM-510，德国)及其所属软件观察与拍照。兔抗人精子膜蛋白免疫荧光定位见图2A和图2B；图2C为对照。
五、SDS-PAGE和Western blot分析
将溶脲脲原体蛋白用不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，考马斯亮蓝染色。蛋白质条带转移到硝酸纤维素膜上后，兔抗人精子膜蛋白抗血清作为一抗进行Western blot检测。UU蛋白与人精子膜蛋白SDS-PAGE结果见图3。Western blot结果见图4。
六、交叉反应抗原的纯化以及N-端氨基酸测序兔抗人精子膜蛋白的抗血清通过硫酸铵(40％)沉淀法进行初步纯化后，并按照Pharmacia公司操作规则结合到CNBr活化的Sepharose 4B亲和柱上。交叉反应抗原通过免疫亲和层析的方法进行纯化。可溶性的UU蛋白缓慢从柱上通过，没有结合的物质被去除，特异结合的抗原用0.2M Glycine-HCl缓冲液(pH2.5)进行洗涤。阳性部分用FPLC-MonoQ(Pharmacia)进一步纯化。目的蛋白通过SDS-PAGE和Western blot予以证实。纯化的蛋白通过SDS-PAGE后，转移到PVDF膜。膜上的蛋白用考马斯亮蓝进行染色，切下并使用蛋白测序仪(Genecore)对N-端氨基酸进行测序。
七、交叉反应抗原的克隆根据所测的交叉反应抗原的N-端氨基酸序列，在PubMed中搜索出对应的UreG基因(其基因序列如SEQ ID1所示)。为了克隆该基因，首先进行PCR扩增，PCR扩增使用引物的意义链5’-GCG GAT CCA TGA AAA GAC CAT TAA TTATTG G-3’，反意义链为5’-GCA AGC TTT TAT TCT TCT AGT AAA GCT AAT TGC-3’，PCR产物克隆入PMD-18-T载体，转化入E.coli(DH16B)菌株。序列的正确性经质粒测序鉴定。序列的分析和对比用DNAStar和DNAssist软件。
八、重组蛋白的表达和抗血清的制备交叉反应抗原的目的片段连接入经BamH I和Hind III双酶切后的His-tag PET-28(+)表达载体中，重组的PET-28a(+)质粒在E.coli BL21中扩增，编码的蛋白通过IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)诱导表达。重组蛋白的分子量通过SDS-PAGE进行检验。重组UreG(rUreG)通过切胶回收进行纯化，rUreG免疫2只新西兰大白兔以制备抗血清，抗血清用于rUreG在小鼠精子上的免疫荧光定位用。
九、交配试验用纯化的重组UreG蛋白免疫已经证实具备生殖能力的BALB/c雌性小鼠。25μg或50μg重组UreG蛋白溶于100μl磷酸缓冲盐(PBS)溶液中，用等体积弗氏佐剂完全乳化上述溶液。每只动物给予三次免疫，免疫途径为项背部皮下及后肢肌肉注射。在免疫过程中的第一天和第三天均注射完全弗氏佐剂乳化的重组UreG蛋白，第二十八天注射不完全弗氏佐剂乳化的重组UreG蛋白。对照组动物只注射PBS和弗氏佐剂，不含重组UreG蛋白。免疫途径和方式同实验组。第三十五天，将免疫后雌鼠以1∶2比例与已经证实具备生殖能力的BALB/c雄性小鼠合笼。合笼二十一天后，计数怀孕雌鼠的数目。重组UreG对雌性小鼠生育的影响见表1表1rUreG对BABL/c雌鼠生育的影响

十、配子的处理
8周龄的雌性BALB/c鼠注射10IU的孕马血清，48-56h后用10IU的hCG促排卵。15h后在输卵管膨大处收集卵子，用含0.1％透明质酸酶(含10％胎牛血清)消化颗粒细胞，透明带用酸性台氏液去除。卵子用M16洗5次。将雄性BALB/c鼠(8-10周)的附睾尾及输精管精子置于900μl台氏液中(含3％BSA)。精子上游10分钟后，去除组织部分，将精子悬液内加入Ca2+A23187，37℃孵育15分钟以促其获能。然后将不同稀释比(1∶102，1∶104，1∶106)的雌鼠抗rUreG抗血清与获能的精子37℃孵育1小时。
十一、体外受精试验处理好的精子以1.0×106/ml浓度与卵子在37℃，5％CO2温箱中孵育3h。卵子洗后置于载玻片上，在相差显微镜下进行，观察精子穿透卵子的情况。如果精子头部膨大，或出现2个原核或至少精子尾部在卵胞质中均认为精卵融合成功。体外受精试验结果见图6。
统计分析试验组和对照组的平均值以平均值±SD进行统计，结果通过StudentTest检验法分析，结果P＜0.05时，差异有显著性。
本发明一种UreG蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID2所示。
该UreG蛋白，制备方法如下(1)交叉反应抗原的克隆；(2)重组蛋白的表达。
步骤(1)中进行PCR，循环中使用的意义链5’-GCG GAT CCA TGA AAAGAC CAT TAA TTA TTG G-3’，反意义链为5’-GCAAGC TTT TAT TCT TCTAGT AAA GCT AAT TGC-3’。
步骤(1)中PCR产物克隆入PMD-18-T载体。
步骤(1)中PCR产物转化入E.coli DH16B菌株。
步骤(2)中重组的PET-28a(+)质粒在E.coli BL21中扩增。
步骤(2)中编码的蛋白通过IPTG诱导成为融合蛋白。
UreG蛋白可用于制备避孕疫苗。
本发明所公开一种UreG蛋白，其优点表现在①高度特异性UreG蛋白对精子是特异的，并不表达于其它类型细胞上。在女性中可避免自身免疫反应，.而在男性将被限制在男性生殖道组织。
②非种属特异性与UreG蛋白存在交叉反应的人细胞核自身抗原精子蛋白(human nuclear autoantigenic spem protein，hNASP)是非种属特异的，共同存在于人和动物的精子上，以便开始能在动物身上将它作为一种免疫原进行仔细测试。
③定位于精子表面与UreG蛋白存在交叉反应的hNASP存在于精子顶体后区表面，这种抗原的相应抗体在顶体反应和精-卵融合时可发生作用。作为女性避孕疫苗，表面蛋白的抗体阻断精子功能可通过两个作用部位精子穿透宫颈黏液和精-卵相互作用。


图1显示UU在固体培养基中呈现“油煎蛋”状外观(Bar＝20μm.)。
图2A显示兔抗人精子膜蛋白抗血清免疫荧光定位，兔抗人精子膜蛋白抗血清作一抗(Bar＝5μm.)。
图2B显示兔抗人精子膜蛋白抗血清免疫荧光定位，兔抗人精子膜蛋白抗血清作一抗(Bar＝5μm.)。
图2C显示兔抗人精子膜蛋白抗血清免疫荧光定位，免疫前血清作一抗(Bar＝5μm.)。
图3显示UU蛋白与人精子膜蛋白SDS-PAGE结果，1UU蛋白；2人精子膜蛋白。
图4显示Western blot结果，UU蛋白经SDS-PAGE，转移至硝酸纤维素膜上，用免疫前血清(1)或兔抗人精子膜蛋白抗血清(2)进行Western blot反应，证实UU与人精子膜蛋白在61kDa，50kDa和25kDa三处存在交叉反应抗原。
图5显示UU中UreG蛋白21-25氨基酸与人精子膜蛋白hNASP398-402五个氨基酸相同。
图6显示体外受精试验结果。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1制备UreG蛋白、人精子膜蛋白一、溶脲脲原体(UU)的培养、鉴定与纯化UU由感染UU的不育男性(血清抗精子抗体阳性)获得、分离、培养与纯化方法参照Thirkell方法根据UU菌落形态鉴定UU菌株，扩增10000ml UU菌液。采用Thirkell方法提取UU蛋白质。
二、制备精子膜蛋白手淫获得健康供精者的精液标本，精液参数在正常范围。排除UU感染及抗精子抗体阳性的精液标本。精子膜蛋白的制备参照Snow的方法。精子膜蛋白收集后用于电泳分析以及制备抗精子膜蛋白抗血清。
三、分析UreG蛋白、人精子膜蛋白搜索Swiss-Prot数据库，发现UU中UreG蛋白21-25氨基酸与人精子膜蛋白hNASP398-402五个氨基酸相同。见图5。
实施例2重组UreG对雌性小鼠生育的影响用纯化的重组UreG蛋白免疫已经证实具备生殖能力的BALB/c雌性小鼠。25μg或50μg重组UreG蛋白溶于100μl磷酸缓冲盐(PBS)溶液中，用等体积弗氏佐剂完全乳化上述溶液。每只动物给予三次免疫，免疫途径为项背部皮下及后肢肌肉注射。在免疫过程中的第一天和第三天均注射完全弗氏佐剂乳化的重组UreG蛋白，第二十八天注射不完全弗氏佐剂乳化的重组UreG蛋白。对照组动物只注射PBS和弗氏佐剂，不含重组UreG蛋白。免疫途径和方式同实验组。第三十五天，将免疫后雌鼠以1∶2比例与已经证实具备生殖能力的BALB/c雄性小鼠合笼。合笼二十一天后，计数怀孕雌鼠的数目。
序列表<110>上海第二医科大学<120>一种UreG蛋白及其制备方法和用途<130>/<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>621<212>DNA<213>UU<400>1atgaaaagac cattaattat tggtgtaggt ggacctgtag gagcaggtaa aacaatgcta 60atcgaaagat taacaagata cctttcaaca aaaggttata gtatggcagc aattactaat 120
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Lys Thr Met Leu Leu Glu Arg Leu Thr Arg Tyr Leu Ser Thr Lys Gly20 25 30Tyr Ser Met Ala Ala Ile Thr Asn Asp Ile Tyr Thr Lys Glu Asp Ala35 40 45Arg Ile Leu Leu Asn Thr Ser Val Leu Pro Ala Asp Arg Ile Ala Gly50 55 60Val Glu Thr Gly Gly Cys Pro His Met Thr Ala Ile Arg Glu Asp Ala65 70 75 80Ser Asn Phe Ala Ala Ile Glu Glu Met Cys Asp Lys His Pro Asp Leu85 90 95Gln Leu Leu Phe Leu Glu Ser Gly Gly Asp Asn Leu Ser Ala Thr Phe100 105 110Ser Pro Asp Leu Val Asp Phe Ser Ile Tyr Ile Ile Asp Val Ala Gln115 120 125Gly Glu Lys Ile Pro Arg Lys Gly Gly Gln Gly Met Ile Lys Ser Asp130 135 140Leu Phe Ile Ile Asn Lys Val Asp Leu Ala Pro Tyr Val Gly Ala Asn145 150 155 160Val Glu Val Met Lys Ala Asp Thr Leu Lys Ser Arg Gly Asn Lys Asp165 170 175Phe Phe Val Thr Asn Leu Lys Thr Asp Glu Gly Leu Lys Ser Val Ala180 185 190Asp Trp Ile Glu Lys Arg Leu Gln Leu Ala Leu Leu Glu Glu195 200 20权利要求
1.一种UreG蛋白，其特征在于其氨基酸序列如序列表中SEQ ID2所示。
2.根据权利要求1所述的UreG蛋白，其制备方法有如下步骤(1)交叉反应抗原的克隆；(2)重组蛋白的表达。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(1)中进行PCR，循环中使用的意义链5’-GCG GAT CCA TGA AAA GAC CAT TAA TTA TTG G-3’，反意义链为5’-GCA AGC TTT TAT TCT TCT AGT AAA GCT AAT TGC-3’。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(1)中PCR产物克隆入PMD-18-T载体。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(1)中PCR产物转化入E.coli DH16B菌株。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中重组的PET-28a(+)质粒在E.coli BL21中扩增。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中编码的蛋白通过IPTG诱导成为融合蛋白。
8.权利要求1所述UreG蛋白的用途，其特征在于用于制备避孕疫苗。
全文摘要
本发明涉及一种UreG蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID2所示。UreG蛋白制备方法如下(1)交叉反应抗原的克隆；(2)重组蛋白的表达。UreG蛋白用于制备避孕疫苗。本发明适宜于女性的免疫性避孕疫苗，应用于人类和动物已具备现实可能性和光明前景。因其特异性高、经济、方便、安全、无副作用而将成为一种极为诱人的避孕措施。
文档编号A61P15/18GK1775804SQ20051011061
公开日2006年5月24日 申请日期2005年11月22日 优先权日2005年11月22日
发明者徐晨, 石建莉, 王旻 申请人:上海第二医科大学