专利名称：预防病毒性和衣原体起源的性传播疾病的个人卫生剂的制作方法
技术领域：
本发明属于医药学领域。本发明可用于开发和制造各种可用于卫生清洁和疾病预防的制剂。
背景技术：
疱疹病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒和其他一些病毒能够引起人们熟知的性传播疾病。某些衣原体(Chlamydia spp.)具有同样的侵入人类组织的途径，并且和所有病毒一样显示细胞内寄生现象。
已知的用于预防由性接触传播的HIV感染的个人卫生试剂包括萘磺酸盐聚合物(Profy A.T.，Sonderfan A.J.，Bernstein D.I.，Chancellor T.，Kern E.R.，Stanberry L.R.，1998.PRO 2000gel，用于预防HIV的潜在局部杀菌剂，其可以阻断其它性传播疾病病原体的感染(a potential topical microbicide for HIVprevention，can block infection by other sexually transmitted disease pathogens)//第12届国际艾滋病研讨会(12thWorld AIDS Conference)(日内瓦，瑞士，1998年6月28日～7月3日)摘要N 33146.P.620-621)、壬苯醇醚-9、苯扎氯铵、胆酸钠(Colin P.，Thibodeau L.，Tremblay C.，Sauriol C.，1998.一种预防STD疾病的潜在新型阴道杀菌剂F-5胶体外抗HIV-1和HIV-2的杀病毒性能(In vitro anti-HIV-1 and HIV-2 virucidal properties of the F-5 gel，a potentiallynew vaginal microbicide for STD prevention)//同上，摘要N 60370，P.1067)以及C14-烷胺氧化物与C16-烷基甜菜碱的混合物(Malamud D.，Howett M.K.，Wigdahl B，.Christensen N.，Krebs F.，Weisz J.，Kreider J.模式体系中杀菌剂的抗病毒活性(Anti-viral activity of microbicides in model systems)//同上，摘要N 33149.P.621)。
发明内容
关于可用作防御通过性接触传播的病毒和衣原体属(Chlamydia spp.)的个人卫生药剂，还没有可供利用的信息。
据提议，这类试剂可能会是肉豆蔻酰胺丙基二甲基苄胺氯化物(Myramistin)和上述Myramistin溶于药学溶剂-纯水或纤维素衍生物的浓缩水溶液而形成的0.01到0.5％(重量)的溶液。
早些时候，Myramistin是作为预防传统性病如梅毒、淋病和滴虫病(USSRAuthorship Certificate No 1832496，1978)而为人所知。
被提议的试剂(分子式1)可以扩大卫生剂预防性传播疾病的范围如疱疹、衣原体病和威胁生命的AIDS。
肉豆蔻酰胺丙基二甲基苄胺氯化物(分子式1)可以通过下面的实施例来说明肉豆蔻酰胺丙基二甲基苄胺氯化物(Myramistin)抗HIV的活性。
具体实施例方式
实施例1.Myramistin对被HIV-1细胞培养物感染的培养细胞和它们生长状况影响的研究。
本试验使用的是淋巴细胞MT-4和Jurkat-tat细胞。培养组织在下述生长培养基中培养补充了10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(Flow Labs，Scotland)，谷氨酰胺2mmol/L(Sigma Chem.Comp.，USA)，以及抗生素青霉素100μg/mL和链霉素100IU/mL(或庆大霉素50IU/mL)。细胞培养在37℃含有5％二氧化碳的空气中进行。
病毒人类免疫缺陷病毒株(HIV-1 IIIB和HIV-1 BRU)是从两个俄罗斯收藏单位得到的，即，俄罗斯医学科学院病毒制品研究所和俄罗斯医学科学院病毒学Ivanovsky学院(莫斯科，俄罗斯)。HIV LAI株是从瑞士传染控制学院病毒学系(斯德哥尔摩，瑞典)得到的。
步骤以MT-4细胞为研究对象。将带有病毒的培养液(接种体)加入到密度约为500,000个细胞/mL的细胞悬液中。将新鲜配制的接种体与相同体积适当浓度的Myramistin混合。将被感染的细胞与上述试剂在室温振荡孵育10分钟。用生长培养基将细胞清洗3遍后，将其密度调整到500,000个细胞/mL。将清洗后的细胞以同样浓度和未被感染的细胞混合。被感染的细胞和未被感染的细胞的最终比例是1∶2到1∶3。将细胞混合物在上述生长培养基中孵育30天。
用台盼蓝染色试验区分活细胞和死细胞。通过ELISA试验确定培养液中HIV相关抗原的水平。此处使用改良的ELISA试验(ELISA/s)，可以确定HIV-1抗原复合物(Marennikova S.S.，Matsevich G.R.，Sheluhina E.M.等，1989。Voprosy virusologii，No 3.P.305-308)。采用间接免疫荧光试验(间接荧光抗体试验，IFA)来计算带有这种抗原的细胞的数量。
Myramistin对被感染细胞影响的试验结果10μg/mL的Myramistin显示了对MT-4细胞内携带的HIV-1的显著影响在孵育第4天，活细胞不足20％，通过ELISA/s确定的培养液中的HIV-1相关抗原的平均滴度为1∶81到1∶243；阳性对照(未用Myramistin处理)中出现了闭合滴度(closed titre)水平。30μg/mL的Myramistin促进了组织培养物延迟的HIV-特异性改变和培养液中抗原滴度的增加，尽管IFA-阳性细胞的浓度在第4天最高。虽然病毒抗原后来出现在培养液中，但是活细胞和IFA-阳性细胞的浓度却随之下降。在用50μg/mL的Myramistin处理后，上述变化至少延迟了2个星期。
实施例2.Myramistin对细胞外HIV-1颗粒的影响的研究这些试验中使用了集中在培养液中的T细胞(Jurkat-tat细胞)和HIV-1LAI。在以递增剂量的Myramistin处理后，评估HIV-1的失活状况。用100μg/mL的Myramistin处理的结果是，长达30天都没有发生组织培养物的HIV-特异性改变(观察期间)。
在用50μg/mL的Myramistin处理2星期后，将培养液中的病毒悬液稀释后加入到未被感染的培养细胞中。根据表1中的数据，该浓度下的Myramistin水溶液促进细胞外HIV-1感染活性降低了1000倍。
表1Myramistin水溶液(50μg/mL)对细胞外的HIV-1处理后，对该病毒在Jurkat-tat细胞内增值的影响
实施例3.Myramistin和其他常用杀菌剂抗-HIV活性比较各种消毒剂能够使HIV失活的最小浓度示于表2表2根据文献数据，一些消毒剂的抗-HIV活性
注释1.Martin L.S.，Mc Dougal J.S.，Laskoski J.L.对HIV的灭菌和失活(Desinfection and inactivation of HIV)//J.Infect.Dis.1985 Vol.152.P.400-403。
2.Harbison M.A.，Hammer S.M.聚维酮碘和双氯苯双胍己烷引起的HIV失活(Inactivation of HIV by betadine products and chlorhexidin)//J.AIDS.1989 Vol.2.P.16-20。
3.Polsky B.，Baron P.A.，Gold J.W.M.，Smith J.L.，Jensen R.H.，ArmstrongD.含壬苯醇醚-9的避孕海绵所引起的HIV-1的体外失活(In vitro inactivationof HIV-1 by contraceptive sponge containing nonoxynol-9)//Lancet.1988.Vol.1.P.1456。
根据这些数据，Myramistin以最低的浓度使HIV失活。而且，大部分上述试剂在应用后对生殖器粘膜产生刺激，因而不能作为个人卫生剂。
由此，Myramistin具有显著的抗-HIV活性，被认为是预防性接触传播的HIV感染的个人卫生剂。
实施例4.Myramistin对小鼠实验性阴道疱疹感染的预防作用的研究使用人类疱疹病毒2(HSV2)在成年白鼠(雌性)内再现实验性疱疹感染将0.1ml病毒培养液悬液(约2.5×107个颗粒/mL)用结核菌素注射器导入阴道。结果产生了特异性脑炎，所有动物在接种后第6到10天都死亡。两类Myramistin制剂被用于预防实验性疱疹，即，Myramistin 0.2％胶体和Myramistin 0.5％栓剂。胶体形成物是硫代纤维素(thilose)，其是纤维素衍生物。对照组1小鼠接种前5分钟阴道内被导入0.1ml不含Myramistin的thilose溶液。实验组1和组2小鼠被以相同方式分别导入Myramistin 0.2％胶体或Myramistin 0.5％栓剂。实验结果示于表3。
表3Myramistin对小鼠实验性阴道疱疹感染的预防作用
注释本部分研究工作在瑞典感染控制学院(斯德哥尔摩)进行，其受到国际基金(project INTAS UA 95-55)的支持。
根据表3所示数据，对照组1中有8只小鼠死亡，两个实验组均未见小鼠死亡。因此，测试的Myramistin制剂在这些实验条件下显示了很高的预防作用。
实施例5.对Myramistin抗衣原体活性的实验研究根据许多研究人员的数据，接种组织培养物是用来测试抗衣原体试剂的最好的衣原体感染实验模型，尽管缺少和临床数据的强有力的相关性，并且对该模型进行测试有些技术复杂性。
首先应该评估Myramistin对培养细胞(鸡胚胎成纤维细胞)的毒性。为此，用各种剂量的Myramistin处理1-2天的培养细胞10到30分钟。这些实验的总结结果示于表4。
表4.Myramistin对鸡胚胎成纤维细胞原代组织培养的毒性确定
因此，Myramistin浓度为0.00025％时，对鸡胚胎成纤维细胞培养没有毒性，该浓度可用于抗衣原体活性研究。
使用两个细胞株来评估Myramistin的抗衣原体活性在卵黄囊中经过几次传代培养的细胞株C.psittaci B，和细胞株C.psittaci K(在组织培养中生长的)。两个细胞株的接种体都相当于大鼠的LD50的4-6倍。
步骤1.接种前30分钟，将Myramistin加入到单层鸡胚胎成纤维细胞，其终浓度为0.00025％。加入悬浮在卵黄物质内的衣原体后，组织培养物在37℃孵育2小时后，清洗单层细胞，再将不含抗生素的新鲜“199”培养基加入到清洗后的细胞中。
步骤2.Myramistin分别和“组织”株K和“卵黄”株B混合，其终浓度为0.00025％，然后在37℃分别孵育1和2小时。接着清洗单层细胞，用新鲜培养基覆盖后，再在相同条件下进行孵育。24到120小时后，固定带有单层细胞的盖玻片，再用抗衣原体的荧光抗体(结合有丫啶橙)处理。在UV光下进行观察染色后的载玻片用荧光显微镜。使用两个不同的单层细胞作为对照1)未用Myramistin处理的接种的单层细胞，和2)经过Myramistin处理的未接种的单层细胞。用这种方式进行了10次实验。
已经发现，经两个株孵育72到120小时后，只有极个别细胞具有退化的衣原体性形态(L-形态)。在未处理(对照)的细胞中发现了典型的处于不同成熟阶段的衣原体；衣原体的数量因细胞株和接种浓度而异。因此，在所使用的浓度下，Myramistin具有抑制衣原体污染的作用。
这些实验连同已知的有关Myramistin的广谱抗菌活性的数据表明，Myramistin用作男女预防性传播的衣原体疾病的个人卫生剂是切实便利可行的。
权利要求
1.肉豆蔻酰胺丙基二甲基苄胺氯化物(Myramistin)作为用于预防病毒和衣原体引起的性传播疾病的个人卫生剂的用途。
2.一种用于预防性传播的病毒性或衣原体性疾病的个人卫生剂，其包括药学溶剂-纯水或纤维素衍生物的浓缩水溶液或固体药学基质(例如，栓剂)，以及浓度为0.01-0.5重量％的肉豆蔻酰胺丙基二甲基苄胺氯化物。
全文摘要
研究肉豆蔻酰胺丙基二甲基苄胺氯化物(Myramistin)对HIV的影响。已在组织培养实验中证明，浓度为100μg/mL或更高的Myramistin水溶液可抑制细胞外和细胞内HIV－1的感染能力。Myramistin的抗HIV活性比其他杀菌剂更高。将Myramistin水溶液(或胶体或栓剂)预防性地导入阴道产生了对实验性疱疹(HSV2)感染的100％防御效果。所提供的数据显示了使用浓度下的Myramistin对衣原体的抑制作用。Myramistin对人类组织是安全的。Myramistin制剂被提议用作预防性传播的病毒性和衣原体性疾病的个人卫生剂。
文档编号A61P33/00GK1954809SQ20051011682
公开日2007年5月2日 申请日期2005年10月27日 优先权日2005年10月27日
发明者维塔利, 斯维斯托夫 申请人:印发米得股份公司