专利名称：载基因或药物的超声微泡造影剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种能高效携带基因或药物的超声微泡造影剂及其制备方法，为基因或药物靶向治疗提供一种可通过静脉注入的新型高效传输载体，不仅适于超声破裂微泡靶向传输基因和药物治疗心血管系统的疾病，亦可为实质脏器疾病的靶向治疗提供一个有效的运载工具。
背景技术：
1、超声造影剂研制现状声学造影剂是由类似红细胞大小的含气微泡，注入静脉后能到达红细胞所能到达的部位，在超声波的作用下，具有线性散射和非线性散射特性，因而能使血流丰富的实质器官如心肌、肝脏、肾脏等在二维超声仪检测时产生较强对比显影。与X线等其它造影技术比较，具有无创、适时、床旁和价廉等优点。超声造影剂研制成功，对于心血管疾病及肿瘤的无创诊断具有广阔的应用前景。
美国FDA批准的临床应用的超声造影剂，如Albunex和Optison均系声振白蛋白。在欧洲批准临床应用的Levovist，属于第1和第2代产品。近年正在研制脂质、高分子多聚体成膜材料和有弹性外壳的第3代超声造影剂，对心肌及肝脏显影良好，通过实验和临床期的研究，已显示出良好的应用前景。而国内上市的Sonovue，是唯一被我国卫生部批准临床应用的超声造影剂，但因其价格昂贵，导致其不易推广使用。南方医科大学南方医院超声科，正在研制的声振白蛋白氟碳气体超声造影剂，属于第2代产品，目前仍未投入市场使用。至今，尚无国产超声造影剂临床应用的报告。因此，研制一种稳定、可靠、价廉的国产超声造影剂，是我国医学和相关技术领域面临的迫切任务。
2、兼基因或药物靶向载体的超声造影剂研制现状(1)基因载体研制现状随着人类基因组计划的完成和致病基因的不断发现，事实证明人类的很多疾病都与基因有关，相关的基因治疗研究的也得到了长足的发展，目前，心脑血管病和肿瘤的基因治疗已成为基因治疗研究中最活跃的领域之一。
基因治疗的载体主要包括非病毒载体和病毒载体。在非病毒载体中，裸基因的应用占有重要的地位，但其缺点是转染率较低、缺乏靶向性，只能局部作用，有时可能还需进行外科手术以暴露靶器官，导致其临床应用受到一定限制。在肯定裸质粒载体的地位的同时，也要认识到病毒载体在基因治疗中仍然占有优势。转染率高是病毒载体的显著特点，但由于病毒基因整合入宿主细胞后，有引起插位性基因突变的危险，也可能激活癌基因，因此其安全性是一个尚未解决的问题。脂质体亦是一种基因治疗常用的载体，虽然其包裹DNA后，直接注射安全、无免疫原性，但是脂质体存在着无靶向性和特异性、体内基因转移效率低等缺点。虽然有许多新的靶向特异性基因治疗，但是成功的基因治疗仍然具有挑战性，其中最主要的障碍是缺乏无创、有效、具有靶向性的载体释放系统。
(2)药物载体的研制现状在肿瘤药物治疗中，目前仍然没有特异性的、靶向的药物载体释放系统。抗癌药不但杀死癌细胞，而且也破坏正常的组织细胞。对免疫脂质体的研究，给肿瘤靶向药物治疗带来新的希望，但是抗体用于肿瘤的靶向治疗得益于两个关键性技术的突破，①实体瘤的细胞被致密的基质包裹，抗体难以穿透这一屏障；②大多数实体瘤都存在淋巴回流障碍，导致间质内压力升高，阻碍了抗体进入肿瘤实质，而小部分进入实体瘤内部的抗体，首先遇到的是血管周围的肿瘤细胞而被结合，使得抗体无法到达距离血管较远的肿瘤细胞。因此，目前应用抗体药物治疗大体积实体瘤的效果仍不理想。近年来，随着纳米技术和医用高分子材料的研究，磁性纳米粒子成了该领域的热门研究方向，但其稳定性差，操作复杂仍是尚未解决的难题。
研究发现，一定能量的超声波可使载基因或药物的微泡破坏，使所携带基因或药物被释放在特定组织部位。但目前国内外尚无作为专门化传输基因或药物的载基因微泡。对于载基因微泡来说，现阶段多利用白蛋白的粘附性或脂质微泡表面电荷特性，简单地将基因粘附于微泡表面而制备基因黏附微泡，不但其携带基因的数量有限，而且变异性大，可重复性及稳定性差，严重影响基因转染效率。更为重要的是，由于基因裸露在微泡表面，基因在体内应用时，不能防止血液中核酸酶对基因的降解，所以微泡无法保证将大量的基因输送至靶组织。因而如何在保证基因的性能和微泡的稳定性不受影响的前提下，通过简单有效的工艺，将基因或药物整合至微泡壁上而增加基因的携带量，并将载基因或药物微泡作为新的传输载体是一个有待解决的关键问题。
因此，研究一种新型的超声造影剂，并可作为携带多种基因或药物的载体，通过超声介导在特定组织部位实现基因转染或者药物释放，填补基因导入和药物靶向性释放的空白。无疑它必将有广阔的应用前景和巨大的经济效益。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的是提供一种性质稳定且能将大量基因或药物输送至靶组织的载基因或药物的超声微泡造影剂。
本发明的另一个目的是提供一种制备载基因或药物的超声微泡造影剂的方法。
为实现上述目的，本发明一种载基因或药物的超声微泡造影剂，包括微泡、氟碳气体、基因或药物；该微泡的微泡壁由脂质双分子层构成，微泡内包裹氟碳气体，基因或药物包埋在微泡包膜内。
进一步，所述氟碳气体为全氟丙烷气体；进一步，所述氟碳气体为六氟丙烷气体；为实现上述目的，本发明一种载基因或药物的超声微泡造影剂的方法，包括以下步骤1、按重量百分比称取下列原料二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC 0.8-1.2％二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE0.2-0.5％司盘-60span60 0.18-0.24％甘油8-15％基因或药物 0.2-0.5％磷酸盐缓冲液PBS 82.56-90.62％；2、将上述原料采用常规方法进行混合后，置于内含纯度不小于99％的氟碳气体的容器内，该容器的容积与原料体积之和之间的比例为1∶3；3、将容器置于37-40℃的水中水浴20-30分钟；4、将容器固定在银汞调合器内振荡30-35秒，银汞调合器的工作频率为4500次/分钟；5、静置3-5分钟，再加入与原料同样体积的磷酸盐缓冲液PBS稀释，即可得到所述的载基因或药物的超声微泡造影剂。
其中，上述的优选方案中，步骤2中的所述容器为管形瓶，所述步骤3中该容器置于40℃的水中水浴30分钟；步骤4中的银汞调合器为牙科振荡仪，振荡时间为35秒；步骤5中静置的时间为5分钟。
进一步，上述步骤1中原料的优选的重量百分比为二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC 1％二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE0.4％司盘-60 0.2％甘油10％基因0.2％
磷酸盐缓冲液PBS 88.2％。
进一步，上述所述基因为血管内皮生长因子VEGF或碱性成纤维细胞生长因子bFGF或肝细胞生长因子HGF或P53其中任意一种。
其中，上述原料的优选的重量百分比为二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC 1％二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE0.4％司盘-60 0.2％甘油10％药物0.4％磷酸盐缓冲液PBS 88％。
进一步，所述药物为脂溶性药物。
与现有技术相比，本发明的载基因或药物的超声微泡造影剂，将基因或药物稳定整合在微泡壁上，这种新型载基因微泡不但性质稳定，且能提高基因转染时，基因——微泡在时间与空间上的协同性；而且由于基因或药物包埋在微泡包膜内，在体内使用时能防止血液对基因或药物的冲刷和稀释，还能保护基因或药物免受循环中核酸酶的降解，保证将大量基因或药物输送至靶组织；同时这种新型载基因或药物微泡携带基因量或药物量明显优于粘附于微泡的方式，且在一定范围内随基因或药物投入量的增加而呈线性增加。这种新型载基因或药物微泡的性质亦很稳定，粒径分布均匀，通过超声破坏微泡的作用可明显提高局部组织的药物浓度，增加疗效，减少副作用。
图1为光镜下超声微泡造影剂的粒径分布图；图2为光镜下本发明载基因的超声微泡造影剂的粒径分布图；图3为载药物的超声微泡造影剂的微气泡细微结构示意图；图4为质粒结合于微泡的量效关系图；图5显示造影前小鼠肝脏的回声示意图；图6显示造影后小鼠肝脏的回声示意图。
具体实施例方式
本发明是采用机械振荡法而非声振的方法来制备可静脉注射的超声微泡造影剂的。该微气泡的泡壁是由脂质组成，微气泡中空，内含氟碳气体，在表面活性剂的参与下，调节气相与液相之表面张力，通过采用机械震荡的方法，使气相进入微泡中。采用这种方法制备出的超声微泡造影剂，其浓度直径分布范围为0.8～6μm，90％以上的微泡直径为2～6μm，微泡的半衰期为32.1～33.2min。如图1所示，在光镜下可见超声微泡造影剂粒径分布均匀，分散度好，符合理想造影剂的特性1、其浓度、直径分布范围及稳定性完全达到体内应用的血液流变学和声学特性要求；2、其合成原料均为药理学可接受材料，安全无毒；3、其可用于心脏和心肌超声造影和实质器官的显影1)可用于急性心肌梗死的早期诊断，梗死范围及再灌注疗效损伤评价；以及慢性缺血心肌的诊断；2)用于心肌再灌注损伤评分；3)增强了心内膜界面的清晰度，提高了超声心动图评价心功能的准确性；4)可探查到的大血管腔内如颈和股动静脉等、心腔内特别是经胸超声心动图不易探查到的心耳内血栓诊断；5)可用于肝脏、肾脏、脾脏、前列腺、乳腺等实质性脏器及肿瘤的显影。
如果将超声微泡造影剂所用成膜材料与脂溶性药物按一定比例混合搅拌，就可以制备成携带治疗性药物的含气微泡的超声造影剂，如图3载药脂质微气泡模拟图所示，微气泡的外层壁为脂质双分子层1，内部为全氟丙烷气体3，紫杉醇2溶于脂质层中；如果将超声微泡造影剂所用成膜材料与血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)或P53等质粒以一定比例混合搅拌，就可以制备成携带治疗基因的含气微泡的超声造影剂。兼药物或基因靶向载体的超声造影剂，该载基因微泡在不改变微泡的一般特性的基础上，其包封率可达15％，载脂溶性的药物包封率可达99.8％。是理想的药物和基因的载体1)该超声造影剂能高效结合基因；2)结合超声破坏微泡定位释放技术，可实现基因的实质器官和定向转移；3)携带特异性抗体或抗肿瘤药物，在超声作用下，在肝、肾等实质器官的肿瘤部位释放；4)携带VEGF、bFGF、HGF等多基因的超声造影剂，在超声的作用下，在心肌缺血坏死组织部位微气泡破裂，VEGF等多基因被靶向释放在缺血心肌局部，转染心肌内皮细胞，促进心肌微血管及侧枝血管再通，即无创转基因治疗，实现无创性心肌内微血管“分子搭桥”；5)携带特异性抗体或基因或特异性抗肿瘤药物，靶向实质器官的肿瘤，特异性治疗肝脏、肾脏、脾脏、前列腺、乳腺等实质器官肿瘤，避免全身用药的毒副作用；
6)微泡新的合成配方和表面活性剂的引入，避免超声声振对基因的破坏，同时增强了在载基因或药物微泡的稳定性和粒径分布的均匀性，使其更适于在超声破裂微泡靶向传输基因或药物系统中的应用。
以下结合具体实施例、实验和附图对本发明作进一步的详细描述[实施例1]制备超声微泡造影剂1、称取原料二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC 5mg二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE2mgspan60 1mg甘油50μl质粒PBS 450μl；2、将上述原料混合后，置于1.5ml的内含纯度为100％全氟丙烷的管形瓶内；3、将管形瓶置于40℃水中水浴30分钟；4、将管形瓶用牙科振荡仪振荡振荡35秒；5、静置5分钟，加0.5ml的PBS稀释，即可得到超声微泡造影剂。
制备载血管内皮生长因子VEGF的超声微泡造影剂1、称取原料二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC 5mg二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE2mgspan60 1mg甘油50μlPBS 450μl血管内皮生长因子VEGF1mg；2、将上述原料采用振荡方法进行混合后，置于一个1.5ml内含纯度为99.99％的全氟丙烷的管形瓶内；3、将管形瓶置于40℃水中水浴30分钟；4、将管形瓶用牙科振荡仪振荡振荡35秒；5、静置5分钟，加0.5ml PBS稀释，即可得到载基因的超声微泡造影剂。
制备载碱性成纤维细胞生长因子bFGF的超声微泡造影剂1、按重量百分比称取原料二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC 4mg二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE2.5mgspan60 0.9mg甘油40μlPBS 460μl
碱性成纤维细胞生长因子bFGF 2.5mg；2、将上述原料采用振荡的方法进行混合后，置于1.5ml的内含纯度为99％全氟丙烷的管形瓶内；3、将管形瓶置于40℃水中水浴30分钟；4、将管形瓶用牙科振荡仪振荡振荡35秒；5、静置5分钟，加0.5ml的PBS稀释，即可得到载基因的超声微泡造影剂。
制备载肝细胞生长因子HGF的超声微泡造影剂1、按重量百分比称取原料二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC 6mg二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 1mgspan60 1.2mg甘油 75μlPBS425μl肝细胞生长因子HGF 1mg；2、将上述原料采用振荡的方法进行混合后，置于1.5ml的内含纯度为99.9％全氟丙烷的管形瓶内；3、将管形瓶置于40℃水中水浴30分钟；4、将管形瓶用振荡仪振荡35秒；5、静置5分钟，加0.5ml的PBS稀释，即可得到载基因的超声微泡造影剂。
制备载紫杉醇的超声微泡造影剂1、按重量百分比称取原料二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC 5mg二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE2mgspan60 1mg甘油50μlPBS 450μl紫杉醇 2mg；2、将上述原料采用振荡方法进行混合后，置于1.5ml的内含纯度为99.99％全氟丙烷的管形瓶内；3、将管形瓶置于40℃水中水浴30分钟；4、将管形瓶用牙科振荡仪振荡振荡35秒；5、静置5分钟，加0.5ml的PBS稀释，即可得到载药物的超声微泡造影剂。
制备载阿霉素的超声微泡造影剂1、按重量百分比称取原料
二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC 6mg二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE1mgspan60 1.2mg甘油40μlPBS 460μl阿霉素 1mg；2、将上述原料采用振荡的方法进行混合后，置于1.5ml的内含纯度为99％全氟丙烷的管形瓶内；3、将管形瓶置于40℃水中水浴30分钟；4、将管形瓶用牙科振荡仪振荡振荡35秒；5、静置5分钟，加0.5ml的PBS稀释，即可得到载药物的超声微泡造影剂。
制备载氟尿嘧啶的超声微泡造影剂1、按重量百分比称取原料二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC 4mg二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE2.5mgspan60 0.9mg甘油75μlPBS 425μl氟尿嘧啶2.5mg；2、将上述原料采用振荡方法进行混合后，置于1.5ml的内含纯度为99.99％全氟丙烷的管形瓶内；3、将管形瓶置于40℃水中水浴30分钟；4、将管形瓶用振荡仪振荡35秒；5、静置5分钟，加0.5ml的PBS稀释，即可得到载药物的超声微泡造影剂。
载基因的超声微泡造影剂的基因定位检测及量效关系的优化在实施例3中，在步骤1中还可以分别加入不同分量的pVEGF质粒DNA，例如pVEGF质粒DNA的分量分别为0.125、0.25、0.5、1、2、4、6和8mg，其余原料按照相关比例配取，然后按照实施例3中的同样的方法，分别制成八种载基因的超声微泡造影剂。然后将八种载基因的超声微泡造影剂，分别用PBS洗涤3次，去除未结合的DNA，用波长为260nm的紫外分光光度计，检测微泡溶液中DNA的含量。如图4所示，在一定范围内，脂质溶液DNA含量与微泡膜上的DNA含量成正相关，当DNA浓度为4mg/ml时，微泡内的DNA含量达到饱和，DNA嵌入微泡膜上量可达0.33pg/microbubble。吸取100μl微泡加入100μl、50μg/ml的碘化丙啶(PI)常温下染色30min，在荧光显微镜下进行检测，如图2所示，荧光显微镜下显示pVEGF质粒DNA被嵌入微泡的壁上，经碘化丙啶(PI)染色后发出绿色荧光且携基因微泡的粒径及分散度并无明显改变。图4为质粒结合于微泡的量效关系图，如图所示，在一定范围内，脂质溶液DNA含量与微泡膜上的DNA含量成正相关，大约有15％的质粒DNA结合于微泡膜上，当脂质溶液DNA含量为4000μg/ml时，微泡膜上的DNA含量可达到饱和。结果表明，微泡壁可发出红色荧光，证明质粒DNA被嵌入微泡的壁内。
超声微泡造影剂小鼠肝内显像观察使用GE Vivid7彩色超声诊断仪，12L线阵探头，二次谐波发射频率5.2MHz，接收频率10.5MHz，仪器所有条件设置为同一标准，二次谐波时机械指数(MI)设定为0.4，增益为-14dB，显像深度固定为4cm，TGC、聚焦范围等参数均调至最佳状态。用超声仪内部工作站存储动静态造影资料。用50mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉昆明小白鼠后，仰卧位固定，采用自身前后对照方法，造影前常规基波超声扫查获得小鼠肝切面声像图，如图5所示小鼠肝脏呈低回声。将显像模式改为二次谐波，用0.3ml生理盐水稀释0.05ml超声微泡造影剂，经尾静脉团注入小鼠体内，谐波状态下目测观察，注射微气泡3s后，肝血管内出现造影剂充填，5s后肝实质回声出现增强，1min后肝实质回声明显增强，30min后达到高峰，如图6所示，60min后仍逐渐减弱。
权利要求
1.一种载基因或药物的超声微泡造影剂，其特征在于，包括微泡、氟碳气体、基因或药物；该微泡的微泡壁由脂质双分子层构成，微泡内包裹氟碳气体，基因或药物包埋在微泡包膜内。
2.根据权利要求1所述载基因或药物的超声微泡造影剂，其特征在于，所述氟碳气体为全氟丙烷。
3.根据权利要求1所述载基因或药物的超声微泡造影剂，其特征在于，所述氟碳气体为六氟丙烷。
4.一种制备权利要求1至3任一所述载基因或药物的超声微泡造影剂的方法，包括以下步骤(1)按重量百分比称取下列原料二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC 0.8-1.2％二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE0.2-0.5％司盘-60span60 0.18-0.24％甘油8-15％基因或药物 0.2-0.5％磷酸盐缓冲液PBS 82.56-90.62％；(2)将上述原料采用常规方法进行混合后，置于内含纯度不小于99％的氟碳气体的容器内，该容器的容积与原料体积之和之间的比例为1∶3；(3)将容器置于37-40℃的水中水浴20-30分钟；(4)将容器固定在银汞调合器内振荡30-35秒，银汞调合器的工作频率为4500次/分钟；(5)静置3-5分钟，再加入与原料同样体积的磷酸盐缓冲液PBS稀释，即可得到所述的载基因或药物的超声微泡造影剂。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中的容器为管形瓶，所述步骤(3)中该管形瓶置于40℃的水中水浴30分钟；所述步骤(4)中的银汞调合器为牙科振荡仪，振荡时间为35秒；所述步骤(5)中静置的时间为5分钟。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中原料为二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC 1％二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE0.4％司盘-60 0.2％甘油10％基因0.2％磷酸盐缓冲液PBS 88.2％。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中原料为二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC 1％二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 0.4％司盘-600.2％甘油 10％药物 0.4％磷酸盐缓冲液PBS88％。
8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述基因为血管内皮生长因子VEGF或碱性成纤维细胞生长因子bFGF或肝细胞生长因子HGF或P53其中任意一种。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述药物为紫杉醇或阿霉素或氟尿嘧啶其中任意一种。
全文摘要
本发明公开一种载基因或药物的超声微泡造影剂，包括微泡、氟碳气体、基因或药物；微泡壁由脂质双分子层构成，其内包裹氟碳气体，基因或药物包埋在微泡包膜内；本发明还公开其制备方法，按适当比例将二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、司盘－60、甘油、磷酸盐缓冲液和基因或药物，采用机械振荡方式制成；本发明的载基因或药物微泡的性质稳定，粒径分布均匀，通过超声破坏微泡的作用可明显提高局部组织的药物浓度，增加疗效，减少副作用；在体内使用时能防止血液对基因或药物的冲刷和稀释，还能保护基因或药物免受循环中核酸酶的降解，保证将大量基因或药物输送至靶组织；在一定范围内随基因或药物投入量的增加而呈线性增加。
文档编号A61K49/08GK1814305SQ20051012799
公开日2006年8月9日 申请日期2005年12月9日 优先权日2005年12月9日
发明者王志刚, 冉海涛, 李兴升, 任红, 凌智瑜, 张群霞, 郑元义, 许川山, 杨春江 申请人:重庆医科大学