专利名称：唾液酸衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及唾液酸化合物的衍生物，优选为具有末端或链内唾液酸单元的多糖。优选地，多糖只由唾液酸单元组成，例如通过α-2，8、2，9彼此连接的唾液酸单元。该产物可用于缀合连接底物，例如肽、蛋白质、药物、药物递送系统、病毒、细胞、微生物、合成聚合物等。反应包括使含有NHS基团的反应试剂与具有氨基或酰肼官能团的唾液酸衍生物缀合连接。
聚唾液酸(PSA)是唾液酸的天然存在的非支链聚合物形式，由某些细菌菌株和哺乳动物的某些细胞产生[Roth等，1993]。产生的PSA可为多种聚合度从n＝约80或更多唾液酸残基低至n＝2，可由有限的酸水解、神经氨酸酶的消化作用或由来源于细胞或细菌的天然形式的聚合物分级而产生。不同的PSA的组成也彼此存在差异。存在均聚物形式，即α-2，8连接的PSA，包括大肠杆菌菌株K1和B组脑膜炎球菌的荚膜多糖，该形式也存在于神经细胞黏附分子(N-CAM)的胚胎形式中。也存在杂聚物形式，例如大肠杆菌菌株K92的交替α-2，8α-2，9PSA和脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)的C组多糖。此外，唾液酸也可存在于具有不同于唾液酸的其它单体的交替共聚物中，例如脑膜炎奈瑟菌的W135组或Y组。PSA具有重要的生物学功能，包括使免疫系统和补体系统避免致病细菌，以及调节胎儿发育过程中未成熟神经元的神经胶质的黏着性(其中该聚合物具有抗黏着作用)[Muhlenhoff等，1998；Rutishauser，1989；Troy，1990，1992；Cho和Troy，1994]，但哺乳动物体内没有已知的PSA受体。大肠杆菌菌株K1的α-2，8连接的PSA也被称为“多聚乙酰神经氨酸”，并用来(为各种长度)示例性说明本发明。
α-2，8连接形式的PSA在细菌多糖中是唯一非免疫原性的(不引起哺乳动物个体内的T细胞或抗体应答)，即使与免疫原性载体蛋白缀合连接时也是如此，这可以表现为其作为哺乳动物(以及细菌)聚合物存在。在广泛分布于体内的细胞表面神经节苷脂中发现了较短的聚合物(n最高为4)，并认为该较短聚合物可有效地导致并保持对PSA的免疫耐受性。近些年来，已利用了PSA的生物学特性，特别是α-2，8连接的均聚PSA的生物学特性，以改变蛋白质和低分子量药物分子的药物代谢动力学性质[Gregoriadis，2001；Jain等，2003；US-A-5,846,951；WO-A-0187922]。包括过氧化氢酶和天冬酰胺酶在内的一些治疗性蛋白的PSA衍生物[Fernandes和Gregoriadis，1996和1997]使得循环半衰期及其稳定性大幅度提高，并使得这些蛋白可用于应对预存抗体，所述预存抗体是由于之前暴露于治疗性蛋白而不期望(有时是不可避免)产生的[Fernandes和Gregoriadis，2001]。在很多方面，聚唾液酸化蛋白质的改进的性质与用聚乙二醇(PEG)衍生的蛋白质相当。例如均提高了半衰期，并且蛋白质和肽在蛋白水解消化中更稳定，但采用PSA时生物活性的保持力似乎比PEG更强[Hreczuk-Hirst等，2002]。在采用需要长期给药的治疗剂时使用PEG也存在问题，因为PEG只能非常缓慢地生物降解[Beranova等，2000]并且高分子量形式和低分子量形式均易于在组织中积累[Bendele等，1998；Convers等，1997]。发现PEG化的蛋白质能产生抗PEG的抗体，该抗PEG的抗体也会影响缀合物在血液循环中的停留时间[Cheng等，1990]。尽管PEG作为与治疗物缀合连接的肠胃外给药聚合物已有一定历史，但仍需对其免疫毒理学、药理学和代谢进行更深入的了解[Hunter和Moghimi，2002；Brocchini，2003]。同样也对PEG在需要大剂量使用的治疗剂中的应用(因此最终导致大剂量的PEG)有所担忧，因为PEG的积累可产生毒性。因此α-2，8连接的PSA成为一种引人关注的PEG替代物，其作为免疫上“不可见”的可生物降解的聚合物自然成为人体的一部分，并且可通过组织神经氨酸酶降解为无毒的糖类——唾液酸。
我们小组在之前的科学论文和授权专利中记载了天然PSA在提高蛋白质治疗物的药物代谢动力学性质中的用途[Gregoriadis，2001；Fernandes和Gregoriadis，1996，1997，2001；Gregoriadis等，1993，1998，2000；Hreczuk-Hirst等，2002；Mital，2004；Jain等，2003，2004；US-A-05846,951；WO-A-0187922]。这里，我们记载了新的PSA衍生物，该衍生物产生新的组合物和制造PSA衍生蛋白质(以及其它形式的治疗剂)的方法。这些新材料和方法特别适用于生产拟用于人类和动物的PSA衍生治疗剂，由于医学道德准则和管理机构(例如FDA、EMEA)的安全要求，在该治疗剂中对药物体的化学和分子上的限定非常重要。
之前已经对将多糖连接在治疗剂例如蛋白质上的方法有报导[Jennings和Lugowski，1981；US-A-5,846,951；WO-A-0187922]。这些方法中的某些方法依靠对聚合物的“非还原”端的化学衍生以生成对蛋白质有活性的醛部分(
图1)。在缀合连接过程中为保持蛋白质的构象和PSA的化学完整性需要温和的条件，而PSA(以及其它多糖)还原端在这种温和条件下只具有微弱的与蛋白质反应的活性。PSA非还原端的唾液酸单元含有邻位二醇，能够容易地(和选择性地)被高碘酸盐氧化生成单醛衍生物。该衍生物对蛋白质的活性高得多，并且包含可通过还原性胺化和其他化学作用连接到蛋白质上的适合的活性部分。我们之前已在US-A-5,846,951和WO-A-0187922中对此有所记载。该反应在图1中进行了示例说明，其中a)显示了使用高碘酸钠氧化CA(来自大肠杆菌的α-2，8连接的PSA)以在末端唾液酸的非还原端生成对蛋白质有反应活性的醛，并且b)显示了醛与蛋白质伯胺基反应，然后使用氰基硼氢化钠(NaCNBH3)进行席夫(Schiff)碱的选择性还原以与蛋白质氨基基团形成稳定的、不可逆的共价键。
在PCT/GB04/03488中我们记载了一种多糖衍生物，其具有通过末端唾液酸单元引入的巯基反应活性基团。该单元通常由多糖的非还原端的唾液酸单元衍生而引入。巯基反应活性基团优选为马来酰亚胺基团。引入此基团的反应可包括下述杂二官能(heterobifunctional)反应试剂与多糖的唾液酸衍生末端单元上的醛或胺基反应，所述杂二官能反应试剂在一端具有巯基反应活性基团，在另一端具有诸如酰肼或酯的基团。产物可用于蛋白质的位点专一性衍生，例如在半胱氨酸单元或引入的巯基上衍生。
尽管许多所记载的将PSA连接到治疗剂上的方法[US-A-5,846,951；WO-A-0187922]理论上可行，但通过蛋白质与PSA的非还原端(醛形式)的反应获得使人满意的缀合物收率需要在高温下进行一定的反应时间，这不利于蛋白质的稳定(例如干扰素α-2b)。其次，所需的反应物浓度(即聚合物过量)可能是无法实现的或不经济的。
本发明提供了一种生成唾液酸化合物衍生物的新方法，其中使一种含有末端唾液酸单元的起始化合物进行预先的中间体形成步骤，在该步骤中在末端唾液酸单元上形成选自伯胺基团、仲胺基团和肼的基团，然后进行该中间体与以下二官能反应试剂反应的反应步骤， 其中R为H或磺酰基；R1为连接基团；并且X为官能团，反应中酯基被分割，并且中间体的胺基或肼基被-CO-R1-X酰化形成衍生物。
在第一种实施方案中，起始化合物具有通过2-碳原子连接到其他部分的末端唾液酸单元，即作为非还原末端单元，并且在该实施方案中预先步骤包括将唾液酸的C-7、C-8二醇基团氧化形成醛基，然后通过使用H2NR4或其酸加成盐进行还原性胺化以形成中间体，所述H2NR4中R4为H或低级烷基。该预先步骤如图3所示。
在此第一种实施方案中，起始化合物具有如下结构式 其中R2为所述的其他部分，选自单糖、二糖、低聚糖或多糖基团、蛋白质或肽、脂类、药物和药物递送系统(例如脂质体)，并且其中酰胺衍生产物具有以下结构式 其中X、R1和R4与各自的起始化合物中相同，R3与R2相同或者为R2在氧化、还原性胺化和与试剂I的反应步骤中的产物。根据此实施方案，化合物的形成如图6所示，其中试剂I为二-NHS交联剂。
在第二种实施方案中，起始化合物具有通过8-碳原子连接到其他部分的还原性末端唾液酸，并且在该实施方案中预先步骤包括缩酮开环还原步骤以形成具有邻位二醇的基团，然后在选择性氧化步骤中将邻位二醇基团氧化为醛基，然后通过使用H2NR4或酸加成盐进行还原性胺化以形成中间体。
在此实施方案中，起始化合物具有如下结构式 其中R5为所述的其他部分，选自糖类基团、低聚糖或多糖基团、烷基、酰基、脂类、药物递送系统，并且其中酰胺产物具有以下结构式 其中R1、X和R4与各自的起始化合物中相同，R6与R5相同或者为R5在还原、氧化、胺化和与试剂I的反应步骤中的产物。化合物V的形成如图2所示。
在第三种实施方案中，起始化合物具有通过2-碳原子连接到其他部分的末端唾液酸单元(即作为非还原末端单元)，并且在该实施方案中预先步骤包括将唾液酸的C-7、C-8二醇基团氧化形成醛基，然后通过与肼反应并还原生成中间体。
在此实施方案中，起始化合物具有如下结构式
其中R2为所述的其他部分，选自单糖、二糖、低聚糖或多糖基团、蛋白质或肽、脂类、药物或药物递送系统，并且其中衍生产物具有以下结构式 其中X和R1与各自的起始化合物中相同，R3与R2相同或者为R2在氧化、与肼反应、还原和与试剂I的反应步骤中的产物。
在第四种实施方案中，起始化合物具有通过8-碳原子连接到其他部分的还原性末端唾液酸，并且在该实施方案中预先步骤包括缩酮开环还原步骤以形成具有邻位二醇的基团，然后在选择性氧化步骤中将邻位二醇基团氧化为醛基，然后通过与肼反应并还原生成中间体。
在此实施方案中，起始化合物具有如下结构式 其中R5为所述的其他部分，选自单糖、二糖、低聚糖或多糖基团、烷基、酰基、脂类和药物递送系统，并且其中衍生产物具有以下结构式 其中X、R1与各自的起始化合物中相同，R6与R5相同或者为R5在还原、氧化、与肼反应、还原和与试剂I的反应步骤中的产物。图5中显示了生成式IX化合物的反应路线的一个实例，其中二官能试剂I为二-NHS。
在本方法中，在中间体与试剂I接触之前将其基本上与预先步骤的混合产物分离一般是很重要的。这是由于在预先步骤中使用的试剂可能会使式I试剂失活。此外，在预先步骤中包括依次的氧化和还原步骤或其逆序过程的情况下，应当使第一步中的氧化剂或还原剂失活，然后再加入后续步骤的反应试剂。
在本发明的方法中，中间体与式I试剂之间的反应在非质子溶剂中进行是有利的，所述溶剂中优选含有少量的质子溶剂。尽可能减少反应中存在的质子溶剂可避免式I试剂的NHS基团早期失活。通常认为非质子溶剂可破坏生物分子。令人惊讶的是，使用二甲基亚砜DMSO，特别是使用DMSO使PSA溶解，可获得与NHS试剂的良好的缀合连接程度，而不会使NHS基团在反应前过度地钝化，并使得可以从混合产物中回收衍生物。因此优选非质子溶剂为DMSO。
式I试剂用量通常比与中间体反应的化学计量用量过量，并且优选为与中间体反应的化学计量用量的至少两倍，更优选为至少五倍。
在式I试剂的一种实施方案中，X为以下基团 其中R定义如上。
在替代的实施方案中X选自以下基团乙烯基砜、N-马来酰亚胺基、N-碘代乙酰氨基、邻位吡啶基二硫基、受保护的羟基、受保护的氨基和叠氮基。
式I试剂优选选自N-(α-马来酰亚胺基乙酸基)琥珀酰亚胺酯(AMAS)、N-(β-马来酰亚胺基丙氧基)琥珀酰亚胺酯(BMPS)、N-(ξ-马来酰亚胺基辛酸基)琥珀酰亚胺酯(EMCS)或其磺基类似物、N-(γ-马来酰亚胺基丁酸基)琥珀酰亚胺酯(GMBS)或其磺基类似物、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(LC-SMCC)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)或其磺基类似物、
琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)或其磺基类似物、琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)或其磺基类似物、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基-丙酰氨基)己酸酯(SMPH)、N-(k-马来酰亚胺基十一酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-KMUS)、琥珀酰亚胺基6-[3-2(2-吡啶基二硫基)-丙酰氨基]己酸酯(LC-SPDP)或其磺基类似物、4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯(SMPT)或其磺基-LC类似物、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基[4-乙烯基磺酰基]苯甲酸酯(SVSB)、琥珀酰亚胺基3-(溴代乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)以及N-琥珀酰亚胺基碘代乙酸酯(SIA)和N-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)或其磺基类似物。
另一类式I的杂二官能试剂具有光活性基团X，例如叠氮基团。此类反应试剂的实例有N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰基氧基琥珀酰亚胺(不溶于水)(ANB-NOS)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸(不溶于水，不可分割)(NHS-ASA)、N-琥珀酰亚胺基(4-叠氮基苯基)-1，3’-二硫代丙酸酯(SADP)、磺基琥珀酰亚胺基2-(7-叠氮基-4-甲基-香豆素-3-乙酰氨基)乙基-1，3’-二硫代丙酸酯(SAED)、磺基琥珀酰亚胺基2-(间-叠氮基-邻-硝基-苯甲酰氨基)乙基-1，3’-二硫代丙酸酯(SAND)、N-琥珀酰亚胺基6-(4’-叠氮基-2’-硝基-苯基氨基)己酸酯(SANPAH)、磺基琥珀酰亚胺基2-(对-叠氮基-邻-水杨酰氨基)乙基-1，3’-二硫代丙酸酯(SASD)、
磺基琥珀酰亚胺基-(全氟叠氮基苯甲酰氨基)乙基-1，3’-二硫代丙酸酯(SFAD)以及N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(Sulfo-HSAB)。
式I试剂可选自二[2-琥珀酰亚胺基氧基羰基-氧基)乙基]砜(BSOCOES)及其磺基类似物、二(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯(DSG)、二硫代二(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯(DST)或其磺基类似物、3，3’-二硫代二(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)以及乙二醇二(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)及其磺基类似物。
基团R1为二官能有机基团。优选地，R1选自烷二基、亚芳基、亚烷芳基、亚杂芳基和亚烷杂芳基，上述基团均可被羰基、酯、硫、醚、酰胺和/或胺取代和/或间断。特别优选R1为C3-C6烷二基。最优选地，R1对应上述优选的试剂I之一中的适当部分。取代基可选自以上列出的R1的取代基，或可为氨基酸侧链。
本方法中衍生产物优选基本上完全地与过量的反应试剂相分离。
通常采用的上述反应的反应条件也可在本发明中采用，例如参见Hermanson，(1995)。
更优选地，产物酰胺衍生物基本上完全地与混合产物相分离。这种分离和回收可包括干燥步骤，所述干燥步骤优选在减压下进行，最优选为冻干步骤。
这样可获得稳定的、可用于后续与生物可用化合物反应的活性唾液酸衍生物。
结合随附的实施例和附图对本发明进行进一步示例说明。
以下为附图的简要说明图1a为现有技术活化非还原性唾液酸末端单元的反应路线；图1b为现有技术使用蛋白质胺基部分将反应路线1a中醛部分还原性胺化的反应路线；图2显示了还原端衍生的NHS多聚乙酰神经氨酸的制备(当非还原端没有邻位二醇时)；图3显示了还原端衍生的NH2-CA多聚乙酰神经氨酸的制备(在非还原端去除邻位二醇)；图4显示了制备CA-NHS-蛋白质缀合物的一般路线；图5显示了通过NHS在还原端制备CA-蛋白质缀合物；图6显示了非还原端衍生的CA的制备；图7显示了使用二(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)在非还原端制备CA-蛋白质缀合物；图8显示了使用交联剂DSG进行CA-蛋白质缀合的代表性示意图；图9显示了CA-GH缀合连接反应的HPLC；图10显示了CA-NHS-GH缀合物(CA 35kDa)的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)；图11显示了未反应的CA的非变性聚丙烯酰胺凝胶色谱(native-PAGE)；图12显示了CAM-β-gal和CAI-β-gal缀合物的SDS-PAGE；图13显示了CAH-NHS反应的SDS-PAGE分析；图14显示了CAH-NHS反应的体积排阻色谱分析。
实施例材料由英国Sigma Chemical Laboratory获得偏高碘酸钠和分子量标准参照物。所用的CA为线性α-(2，8)-连接的大肠杆菌K1 PSA(平均分子量22.7kDa，多分散系数(p.d.)1.34；39kDa，p.d.1.4；11kDa，p.d.1.27)，来自Camida，爱尔兰。其他材料包括2，4二硝基苯基肼(Aldrich Chemical Company，英国)、透析管(3.5kDa和10kDa截留范围；Medicell International Limited，英国)、琼脂糖SP HiTrap、PD-10柱(Pharmacia，英国)、XK50柱(Amersham Biosciences，英国)、琼脂糖Q FF(Amersham Biosciences)、Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(4-20％和16％)、Tris-甘氨酸十二烷基硫酸钠运行缓冲液和加样缓冲液(Novex，英国)。去离子水从Elgastat Option 4水净化设备(Elga Limited，英国)获得。所用的全部反应试剂为分析级。平板读取器(plate reader)(Dynex Technologies，英国)用于蛋白质或CA检测的光谱测定。
方法蛋白质和CA的测定CA作为唾液酸的定量测定通过别处[Gregoriadis等，1993；Fernandes和Gregoriadis，1996，1997]所述的间苯二酚方法[Svennerholm 1957]进行。GH通过双金鸡宁酸(bicinchoninic acid，BCA)比色法检测。
对照实施例1通过IEC对CA进行分级(CA，22.7kDa，pd1.34)用900ml琼脂糖Q FF填充XK50柱并用3个柱体积的缓冲冲洗液(20mM三乙醇胺；pH7.4)以50ml/min的流速进行平衡。通过注射器孔以50ml/min的流速将CA(25克溶于200ml缓冲冲洗液)上样到柱上。然后用1.5个柱体积(1350ml)的缓冲冲洗液对柱进行冲洗。
用1.5柱体积的不同缓冲洗脱液(三乙醇胺缓冲液，20mM，pH7.4，以级之间25mM NaCl的步长从0mM变化到475mM NaCl)将结合的CA洗脱，最终用溶有1000mM NaCl的相同缓冲液洗脱以移出所有残留的CA和其他残留物(如果存在)。
通过高压超滤使用5kDa的膜(Vivascience，英国)将样品浓缩到20ml。在4℃下通过重复超滤将这些样品从缓冲液中交换到去离子水中。通过GP和native-PAGE(用爱茜蓝染色)分析这些样品的平均分子量和其他参数。将通过上述方法获得的窄分散CA级分用高碘酸钠氧化，并用GPC和native-PAGE分析聚合物的总体变化。
对照实施例2CA的活化20℃下将新制备的0.02M偏高碘酸钠(NaIO4；相对于CA过量6倍摩尔数)溶液与CA混合，将反应混合物避光磁力搅拌15分钟(如图3中第一步所示)。用70％(最终浓度)的乙醇将氧化的CA沉淀并将混合物在3000g下离心20分钟。去除上清液，将颗粒物用最小量的去离子水溶解。再用70％的乙醇将CA沉淀，然后在12,000g下离心。将颗粒物用最小量的水溶解，冻干并在-20℃下储存直至下一步使用。
对照实施例3CA和衍生物的氧化级的测定用2，4二硝基苯基肼(2，4-DNPH)进行CA氧化程度的定量测量，2，4-DNPH通过与羰基化合物相互作用获得难溶的2，4二硝基苯基腙。将非氧化态(CA)和氧化态的CA(CAO)(每种5mg)加入至2，4-DNPH反应试剂(1.0ml)中，振荡溶液然后将其在37℃下静置直至观察到晶体沉淀[Shriner等，1980]。CA的氧化程度(定量)通过其原理基于碱溶液中的铁氰化物离子还原为亚铁氰化物(波斯蓝)的方法[Park和Johnson，1949]测量，然后在630nm下进行测量。在这种情况下，葡萄糖被用作标准物。
对照实施例4a氨基多聚乙酰神经氨酸(CA-NH2)的制备将10-100mg/ml对照实施例2制备的CAO以及300倍摩尔数过量的NH4Cl在50ml的试管中溶于2ml去离子水，然后将NaCNBH4(5M的母液溶于1N NaOH(水溶液)中)以5mg/ml的最终浓度加入(图4，第一步)。在室温下将混合物培育5天。用CA代替CAO进行对照反应。通过加入5ml冰冷的乙醇将产物多聚乙酰神经氨酸胺衍生物沉淀。在室温下在台式离心机中在4000rpm的转速下离心30分钟从而将沉淀回收。保留颗粒物并将其重新悬浮于2ml去离子水中，然后在10ml超速离心管中再次使用5ml冰冷的乙醇进行沉淀。在室温下在30,000rpm的转速下离心30分钟从而回收沉淀物。将颗粒物再次重新悬浮在2ml去离子水中并冻干。
对照实施例4b胺含量的检测采用TNBS(苦基磺酸，即2，4，6-三硝基苯磺酸)检测测定产物中存在的氨基基团的数量[Satake等，1960]。
在微量滴定板的孔中将TNBS(15mM的TNBS，0.5μl)加入至90μlpH为9.5的0.1M硼酸盐缓冲液中。向上述混合物中加入10μl 50mg/ml的CA-酰胺溶液，将板在室温下静置20分钟，然后在405nm下读取吸光度。使用甘氨酸作为标准物，浓度范围为0.1至1mM。TNBS将伯胺基团三硝基苯基化。可检测到胺的TNP加合物。
使用TNBS检测法对冷乙醇沉淀纯化过两次的产物进行检测，显示出接近90％的转化率。
实施例1CA-NHS的制备将上述对照实施例4a中合成的CA-NH2(35kDa)(15-20mg)溶于0.15M PBS(350μL，pH7.2)，然后加入50或75摩尔当量的溶于PBS(150μL，pH7.2)中的BS3。将混合物涡流搅拌5秒种，然后使其在20℃下反应30分钟。在图4中的第二步中一般性地显示了使用同二官能(homobifunctional)交联剂的情况，图7中更具体地显示了使用BS3的情况。使用PBS作为洗脱液(pH7.2)通过PD-10柱对CA-NHS产物进行纯化，并将纯化产物立刻用于与蛋白质和肽中的NH2基团的位点专一性缀合连接。通过间苯二酚检测分析唾液酸含量，从而确定PD10级分中的CA浓度。通过使用UV光谱在260nm处对CA和NHS反应溶液进行分析，并通过薄层色谱在254nm下显影，从而测量CA聚合物中的NHS含量。
将上述实施例1中合成的CA-NH2(35kDa)(15-20mg)溶于最少量的水(50-65μL)中并向其中加入DMSO(300-285μL)，或将所述CA-NH2溶于＞95％的DMSO(350μL)中并辅以加热(100-125)。将溶于DMSO(150L)中的75摩尔当量的DSG加入至CA-NH2溶液中，涡流搅拌5秒钟，然后使其在20℃下反应30分钟(图8)。通过二噁烷沉淀(×2)或通过PD-10柱使用PBS作为洗脱液(pH7.2)将CA-NHS产物纯化，并将纯化产物立刻用于与蛋白质和肽中的NH2基团的位点专一性缀合连接。如前所述，通过间苯二酚检测确定PD10级分中的CA浓度。通过使用UV光谱(260nm)和薄层色谱(254nm)测量CA聚合物中的NHS含量。
实施例2CA-NHS-蛋白质缀合物的制备(使用BS3和DSG)将溶于碳酸氢钠(pH7.4)的GH共价连接到CA-NHS(35kDa)上，所述CA-NHS根据对照实施例4b中所述的方法通过使用过量的BS3而制备。使用摩尔比为25∶1或50∶1的CA-NHS∶GH，在20℃下在0.15MPBS(pH7.2；1.5ml)中反应30分钟。通过SDS-PAGE对聚唾液酸化的GH进行表征，并通过FPLC-体积排阻色谱测定缀合连接收率。对照实验包括在不存在任何CA-NHS的条件下用BS3使天然蛋白质进行缀合连接步骤。同样在不存在天然GH的条件下，使用BS3使CA-NH2进行缀合连接步骤。
将溶于碳酸氢钠(pH7.4)的GH共价连接到CA-NHS(35kDa)上，所述CA-NHS根据实施例4b中所述的方法通过使用过量的DSG而制备。使用摩尔比为50∶1的CA-NHS∶GH，在20℃下在0.15M PBS(pH7.2；1.5ml)中反应30分钟。通过SDS-PAGE对聚唾液酸化的GH进行表征，并通过HPLC-体积排阻色谱测定缀合连接收率。对照实验包括在不存在任何CA-NHS的条件下用DSG使天然蛋白质进行缀合连接步骤。
将CA-GH缀合物溶解在碳酸氢铵缓冲液(0.2M；pH7)中，在superose6柱上进行色谱分析并使用UV index进行检测(Agilent，10/50 system，英国)。样品(1mg/ml)用0.45μm尼龙膜过滤，注入175μl，以碳酸氢铵缓冲液作为流动相以0.25cm/min的速度运行(图9)。
使用SDS-PAGE(MiniGel，Vertical Gel Unit，VGT 1型，电源为Consort E132；VWR，英国)检测聚唾液酸化后GH的分子大小变化。使用4-20％聚丙烯酰胺凝胶进行GH及其缀合物(与CA-NHS)——反应混合物中第0分钟(对照样品)和第30分钟的样品——以及方法对照样品(非氧化态的CA)的SDS-PAGE。通过多种分子量标准参照物对样品进行标定(图10和11)。
结果将CA及其衍生物(22.7kDa)成功地分级为多分散系数小于1.1的、平均分子量最高至46kDa并具有不同％量的各种窄分散种类。表2显示了该22.7kDa材料的分离结果。
表2CA22.7(pd1.3)的离子交换色谱
*未实施该方法可在1ml至900ml基质之间缩放，而每种规模的分级曲线几乎相同(未显示全部结果)。所有窄分散的级分均成功地被20mM高碘酸盐氧化，对制备过程中不同阶段取样并进行GPC分析和native-PAGE分析，结果显示在分子量和多分散性上没有变化。
通过将碱溶液中的铁氰化物离子还原为亚铁氰化物(波斯蓝)的方法[Park and Johnson，1949]并使用葡萄糖作为标准物，对CA的氧化级进行了定量测量。发现氧化态的CA与天然聚合物相比具有接近100摩尔％的表观醛含量。这种使用铁氰化物对氧化步骤中CA中间体进行定量检测的结果与使用2，4二硝基苯基肼进行的定性检测结果相一致，从而在室温下反应10分钟后获得深桔黄色沉淀；其中使用2，4二硝基苯基肼检测时与天然CA生成淡黄色沉淀，与含醛聚合物形式的CA反应获得深桔黄色沉淀。
测得聚合物的胺化程度为85％，CA-NHS为NHS阳性。此外，还测得聚合物中硫醇的含量为60％。
通过GPC分析高碘酸盐和硼氢化物处理后内部的α-2，8连接的Neu5Ac残基的完整性，将获得的氧化态(CAO)、氨基CA(CA-NH2)、CA-NHS物质的色谱图与天然CA的色谱图进行比较。发现(图9)所有CA显示出几乎相同的洗脱曲线，没有证据表明各步骤对聚合物链有显著的断裂或交联(对于CA-NHS)作用。小峰代表缓冲盐。
通过SEC-HPLC和SDS-PAGE分析CA-GH缀合物的生成。对于采用DSG时的缀合连接反应，SDS-PAGE表明没有残留游离的GH并且缀合连接反应已完成。这也由SEC-HPLC得到了证实，其中CA-GH缀合物在所预计的游离GH洗出时间之前被洗出(没有观察到游离GH的峰)。另一方面，对使用BS3进行的CA-NH2与GH的缀合连接反应的SDS-PAGE分析表明存在游离GH，这也由SEC-HPLC所证实，其中在SEC-HPLC中在70分钟左右出现了游离蛋白质的洗脱峰。此外，SEC-HPLC还测定了缀合连接的程度为53％。
结果(图10)表明在缀合物的泳道中谱带有偏移，这通常说明聚唾液酸化的GH与GH相比质量增加。此外，通过SEC-HPLC将GH缀合物分离为不同的种类。
实施例3CA的碘代乙酸酯衍生物(CAI)的制备 3.1合成向溶于1ml pH7.4的PBS的40mg多聚乙酰神经氨酸胺(85mol％胺)(如对照实施例2中所述)中加入5mg N-琥珀酰亚胺基碘代乙酸酯(SIA)。使混合物在25℃下避光反应1小时，然后通过在5ml的HightrapTMDesalting柱(AP Bioscience)上用PBS洗脱进行凝胶过滤，从而去除过量的SIA。从柱上按0.5ml收集级分，检测每个级分的样品中多聚乙酰神经氨酸的含量(间苯二酚检测)，并用与半胱氨酸的反应活性指示碘化物(Ellman检测)。将碘和CA都呈阳性的级分合并。
3.2 CAI与β-半乳糖苷酶的缀合连接向1ml PBS中的大肠杆菌β-半乳糖苷酶(5.0mg，4.3×10-8mol)中加入15mg CAI(6.59×10-7mol，15摩尔当量)。将试管密封用金属箔包裹，使反应在室温下进行1小时同时温和地混合。通过SDS-PAGE对所得缀合物进行分析，然后根据公认的方法进行纯化以去除游离CAI。按上述方法检测样品的聚合物和蛋白质含量。
用CA作为对照进行对照反应。按下述3.3节中的方法分析全部样品的β-gal活性。
3.3酶活性的检测在PBS中制备60μg/ml至3.75μg/ml的新鲜β-半乳糖苷酶的标准物。用相同缓冲液将CAM-β-gal样品稀释到60μg/ml。按以下方法测量缀合物的酶活性在微量滴定板中，向100μl样品或标准物中加入100μl多合一(All-in-One)β-gal底物(Pierce)。将板在37℃下培育30分钟，在405nm读取吸光度。通过标准物获得标定曲线，使用曲线的线性回归方程计算样品的活性。
3.4结论级分3-6对聚合物和碘代乙酸酯均呈正性，将其合并。SDS-PAGE(4-12％Bis/Tris凝胶；图12)显示出用碘代乙酰胺衍生物培育的样品的表观分子量升高，而使用对照聚合物没有此现象。在对蛋白质和聚合物的检测中，测定缀合比为1.63CAI∶1β-gal。计算出缀合物样品的β-gal活性与游离酶相比为100.9％。
实施例4多聚乙酰神经氨酸酰肼(CAH)的制备4.1合成25℃下使50mg氧化态的多聚乙酰神经氨酸(19kDa)与2.6mg酰肼(液态)在400μl pH为5.5的20mM乙酸钠缓冲液中反应2小时。然后使用70％的乙醇将多聚乙酰神经氨酸沉淀。将沉淀重新溶解在350μlpH7.4的磷酸盐缓冲盐水中，并加入NaCNBH4至浓度为5mg/ml。使混合物在25℃下反应4小时，然后冷冻过夜。通过使用填充有Sephadex G25的PD10柱、使用0.15M NH4HCO3作为流动相进行凝胶渗透色谱分离，以去除NaCNBH4和反应副产物。通过TNBS检测(对氨基具有特异性；如前所述)对各级分(每个0.5ml)进行分析。级分6、7、8和9(空体积级分)具有远高于背景信号的强信号。由于存在NH4+离子，因此背景信号较高。级分6、7、8和9也含有多聚乙酰神经氨酸。将这四种级分冻干以回收CA-酰肼(CAH)。
4.2多聚乙酰神经氨酸NHS(CA-NHS)和多聚乙酰神经氨酸-蛋白质缀合物的制备室温下使10mg的19kDa CA-酰肼与9mg BS3在400μl PBS(pH 7.4)中反应30分钟。将反应混合物加入填充有Sephadex G25的PD10柱，按0.5ml收集级分。向5至9的每个级分中加入0.1mg BSA。室温下2小时后使各级分与BSA反应。通过SDS-PAGE和SEC-HPLC分析这些样品。
这些级分几乎不含多聚乙酰神经氨酸。富含多聚乙酰神经氨酸的级分(6和7)除了具有其他样品中所存在的谱带以及BSA谱带之外，还具有蛋白质谱带，这清楚地证明存在缀合(图13)。
级分6的HPLC色谱图表明缀合物的保留时间与游离蛋白质相比有很大偏移，证明存在缀合(图14a和b)。
所使用的BSA含有杂质。BSA峰出现在56分钟处(图14a)。
除了56分钟处的峰之外，还存在更大的缀合物种类。在80分钟处有一个大峰，该峰是CA-NHS与蛋白质反应时释放的NHS。这不会是游离BS3，因为CAH经过凝胶渗透色谱柱，色谱柱已将去除。这有力地说明了在CA分子上有NHS酯基团生成(图14b)。
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权利要求
1.一种形成唾液酸化合物衍生物的方法，其中使一种含有末端唾液酸单元的起始化合物进行预先的中间体形成步骤，在该步骤中在末端唾液酸单元上形成选自伯胺基团、仲胺基团和肼的基团，然后进行该中间体与式I二官能反应试剂反应的反应步骤， 其中R为H或磺酰基；R1为连接基团；并且X为官能团，在所述反应中酯基被分割，并且中间体的胺基或肼基被-CO-R1-X酰化形成衍生物。
2.权利要求1的方法，其中起始化合物具有通过2-碳原子连接到其他部分的末端唾液酸单元，并且其中预先步骤包括将唾液酸的6、7-二醇基团氧化形成醛基，然后通过使用H2NR4或其酸加成盐进行还原性胺化以形成中间体，所述H2NR4中R4为H或低级烷基。
3.权利要求2的方法，其中起始化合物具有如下结构式 其中R2为所述的其他部分，选自单糖、二糖、低聚糖或多糖基团、蛋白质或肽、脂类、药物或药物递送系统，并且其中酰胺衍生产物具有以下结构式 其中X、R1和R4与各自的起始化合物中相同，R3与R2相同或者为R2在氧化、还原性胺化和与试剂I的反应步骤中的产物。
4.权利要求1的方法，其中起始化合物具有通过8-碳原子连接到其他部分的还原性末端唾液酸，并且其中预先步骤包括缩酮开环还原步骤以形成具有邻位二醇的基团，然后在选择性氧化步骤中将邻位二醇基团氧化为醛基，然后通过使用H2NR4或酸加成盐进行还原性胺化以形成中间体，所述H2NR4中R4为H或低级烷基。
5.权利要求4的方法，其中起始化合物具有如下结构式 其中R5为所述的其他部分，选自糖类基团、低聚糖或多糖基团、烷基、酰基、脂类和药物递送系统，并且其中酰胺产物具有以下结构式 其中R1、X和R4与各自的起始化合物中相同，R6与R5相同或者为R5在还原、氧化、胺化和与试剂I的反应步骤中的产物。
6.权利要求1的方法，其中起始化合物具有通过2-碳原子连接到其他部分的末端唾液酸单元，并且其中预先步骤包括将唾液酸的6、7-二醇基团氧化形成醛基，然后通过与肼反应并还原生成中间体。
7.权利要求6的方法，其中起始化合物具有如下结构式 其中R2为所述的其他部分，选自单糖、二糖、低聚糖或多糖基团、蛋白质或肽、脂类、药物或药物递送系统，并且其中衍生产物具有以下结构式 其中X和R1与各自的起始化合物中相同，R3与R2相同或者为R2在氧化、与肼反应、还原和与试剂I的反应步骤中的产物。
8.权利要求1的方法，其中起始化合物具有通过8-碳原子连接到其他部分的还原性末端唾液酸，并且其中预先步骤包括缩酮开环还原步骤以形成具有邻位二醇的基团，然后在选择性氧化步骤中将邻位二醇基团氧化为醛基，然后通过与肼反应并还原生成中间体。
9.权利要求8的方法，其中起始化合物具有如下结构式 其中R5为所述的其他部分，选自单糖、二糖、低聚糖或多糖基团、烷基、酰基、脂类和药物递送系统，并且其中衍生产物具有以下结构式 其中X、R1与各自的起始化合物中相同，R6与R5相同或者为R5在还原、氧化、与肼反应、还原和与试剂I的反应步骤中的产物。
10.权利要求1至9中任意一项的方法，其中在中间体与式I试剂接触之前，将中间体基本上与预先步骤的混合产物分离。
11.权利要求1至10中任意一项的方法，其中中间体与通式I试剂之间的反应在非质子溶剂中进行，所述非质子溶剂优选含少量的质子溶剂。
12.权利要求11的方法，其中非质子溶剂为二甲基亚砜，质子溶剂为水。
13.权利要求1至12中任意一项的方法，其中式I试剂比与中间体反应的化学计量用量过量，并且优选为与中间体反应的化学计量用量的至少两倍，更优选为至少五倍。
14.权利要求12或13的方法，其中X为以下基团 其中R如权利要求1定义。
15.权利要求14的方法，其中式I试剂选自二[2-琥珀酰亚胺基氧基羰基-氧基)乙基]砜(BSOCOES)及其磺基类似物、二(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯(DSG)、二硫代二(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯(DST)或其磺基类似物、3，3’-二硫代二(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)以及乙二醇二(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)及其磺基类似物。
16.权利要求12或13的方法，其中X是选自以下基团的官能团乙烯基砜、N-马来酰亚胺基、N-碘代乙酰氨基、邻位吡啶基二硫基、受保护的羟基、受保护的氨基和叠氮基。
17.权利要求16的方法，其中所述试剂选自N-(α-马来酰亚胺基乙酸基)琥珀酰亚胺酯(AMAS)、N-(β-马来酰亚胺基丙氧基)琥珀酰亚胺酯(BMPS)、N-(ξ-马来酰亚胺基辛酸基)琥珀酰亚胺酯(EMCS)或其磺基类似物、N-(γ-马来酰亚胺基丁酸基)琥珀酰亚胺酯(GMBS)或其磺基类似物、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(LC-SMCC)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)或其磺基类似物、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)或其磺基类似物、琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)或其磺基类似物、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰氨基)己酸酯(SMPH)、N-(k-马来酰亚胺基十一酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-KMUS)、琥珀酰亚胺基6-[3-2(2-吡啶基二硫基)-丙酰氨基]己酸酯(LC-SPDP)或其磺基类似物、
4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯(SMPT)或其磺基-LC类似物、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基[4-乙烯基磺酰基]苯甲酸酯(SVSB)、琥珀酰亚胺基3-(溴代乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)以及N-琥珀酰亚胺基碘代乙酸酯(SIA)和N-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)或其磺基类似物。
18.上述权利要求中任意一项的方法，其中R1选自烷二基、亚芳基、亚烷芳基、亚杂芳基和亚烷杂芳基，上述基团均可被羰基、酯、硫、醚、酰胺和/或胺取代和/或间断。
19.权利要求18的方法，其中R1为C3-C6烷二基。
20.上述权利要求中任意一项的方法，其中将衍生产物基本上完全地与过量的反应试剂相分离。
21.权利要求20的方法，其中将产物酰胺或酰肼衍生物基本上完全地与混合产物相分离。
22.权利要求21的方法，其中通过减压干燥去除溶剂的步骤完成产物回收，所述干燥步骤优选为冻干。
23.式III或式VIII化合物， 其中X是选自以下基团的官能团NHS-酯、乙烯基砜、N-马来酰亚胺基、N-碘代乙酰氨基、邻位吡啶基二硫基、羟基、受保护的羟基、氨基、受保护的氨基、羧基、受保护的羧基或叠氮基；R1为连接基团；R4为氢或C1-4烷基；并且R3为单糖、二糖、低聚糖或多糖、蛋白质、肽、脂类、药物或药物递送系统。
24.式V或式IX化合物， 其中X是选自以下基团的官能团NHS-酯、乙烯基砜、N-马来酰亚胺基、N-碘代乙酰氨基、邻位吡啶基二硫基、羟基、受保护的羟基、氨基、受保护的氨基、羧基、受保护的羧基或叠氮基；R1为连接基团；R4为氢或C1-4烷基；并且R6为单糖、二糖、低聚糖或多糖基团。
25.权利要求23或24的化合物，其中R1选自烷二基、亚芳基、亚烷芳基、亚杂芳基和亚烷杂芳基，上述基团均可被羰基、酯、硫、醚、酰胺和/或胺取代和/或间断。
26.权利要求25的化合物，其中R1为C3-C6烷二基。
27.权利要求23至26中任意一项的化合物，其中R3或R6可为低聚糖或多糖，优选为低聚唾液酸或聚唾液酸。
全文摘要
唾液酸单元的胺或酰肼衍生物——所述唾液酸单元例如为多糖中的唾液酸单元——与下述二官能试剂反应生成酰胺或酰肼产物，所述二官能试剂的至少一个官能团为N－羟基琥珀酰亚胺的酯。所述产物具有有用的官能团，该官能团使其可与例如蛋白质、药物、药物递送系统等进行缀合。本方法对聚唾液酸的唾液酸末端基团上引入的胺基的衍生特别有用。
文档编号A61K47/48GK101039965SQ200580034588
公开日2007年9月19日 申请日期2005年8月12日 优先权日2004年8月12日
发明者S·杰因, I·帕佩奥安诺, S·索伯翰尼 申请人:利普生技术有限公司