使用氧载体组合物增强血液动力稳定性的方法

专利名称：使用氧载体组合物增强血液动力稳定性的方法
技术领域：
本发明涉及增强接受手术的个体的血液动力稳定性的方法，该方法为向个体施用一种包括以血红蛋白为基础的氧载体的组合物。在一种具体实施方式
中，本发明涉及使用聚烯烃氧化物修饰的血红蛋白用于减少协同效应和高度的氧亲和力以增加氧气的卸载量，以此作为避免手术期间引起血液动力稳定性相关并发症的预防措施。
背景技术：
血液是运输氧气和营养物质以及从组织清除废物的途径。血液由血浆组成，在血浆中混悬有红细胞(RBCs或红血球)、白细胞(WBCs)和血小板。红细胞占血液细胞总数的大约99％，其主要功能是将氧气运输到组织中并从组织中移除二氧化碳。
心脏的左心室将血液泵出至循环系统的动脉和小动脉。然后血液进入毛细血管，在那里完成了大部分的氧气递送、营养物质交换以及取出细胞废物(例如参见A.C.Guyton，″Human Physiology AndMechanisms Of Disease″(3rd.ed.；W.B.Saunders Co.，Philadelphia.Pa.)，pp.228-229(1982))。此后，血液流经小静脉和静脉直至流回心脏的右心房。虽然和从心脏泵出的血液相比，流回心脏的血液的含氧量较少，但是当处于休息状态时，流回的血液中仍然包含75％的原始氧含量。
RBCs的可逆氧合作用(即运输氧)是通过血红蛋白完成的。在哺乳动物中，血红蛋白的分子量(MW)约为64,000道尔顿，由大约6％的亚铁血红素和94％的球蛋白组成。在其天然形式中，它包括两对亚单元(即，它是一个四聚物)，每一对包含一个亚铁血红素基团和一个球蛋白多肽链。在水溶液中，血红蛋白处于四聚物(MW 64,000道尔顿)和二聚物(MW 32,000道尔顿)形式的平衡状态。在RBC之外，二聚物由肾(血浆半衰期大约为2-4小时)过早地分泌。和血红蛋白一致，RBCs包含红细胞基质(RBC膜)，其包括蛋白质、胆固醇和磷脂。
由于医院和其他机构对于血液制品的需要，很多研究者都已进行了血液代用品的开发研究。“血液代用品”是一种血液制品，其能够向组织运输和供应氧气。以血红蛋白为基础的氧载体(HBOCs)是包含血红蛋白的血液代用品。HBOCs具有很多用途，包括在手术过程中以及急性出血中替代损耗的血液，还可用于挫伤后的苏醒过程。基本上，HBOCs可应用于任何目的，其中积聚的血液可以立刻对患者使用(例如参见Bonson等人的U.S.Pat.Nos.4,001,401和Morris等人的4,061,736)。
基于目前人类血液供给受限的事实，HBOCs的发展特别重要。出于这个原因，人类血液通常只能在医学需要的情况下才能被使用。这通常意味着人类血液不能够用于预防性应用，例如“血液麻醉”(即为了通过增加血液携氧能力增强效果的目的给予全血)。因此，无论是全血还是HBOCs都不能广泛地用于预防疾病，而且在大多数情况下也被认为不能用于存在不可靠性的实验。
以前曾提出过在手术前，如有需要，或在手术后，与从患者(即急性血量正常性血液稀释或“ANH”)身上移除血液相结合地对患者使用HBOCs，所述取出的血液可以在手术后再返回患者体内。例如参见，PCT WO 98/37909。在本文中，这类患者在手术时不被认为是“血量正常的”。然而，这一步骤不是避免外科手术的损害性初级作用例如血液动力稳定性的预防措施，但只是与外科手术相关性失血的副作用的预防措施。
基于下面两个基本原因，在需要全身麻醉的外科手术期间增强血液动力稳定性是很重要的。首先，由失血或其他因素引起的血液动力不稳定性会造成组织损伤，甚至是死亡。例如，出血性低血压和过敏性休克是由显著性失血引起的，这两种情况会减少组织氧合。对于具有上述医学状况的患者而言，通过循环系统稳定血压和增加提供机体组织的氧数量是被期望和非常关键的。
其次，并且最重要的是，血液动力不稳定性即使是较轻微和短暂性的，都有可能影响患者的术后康复。这种不稳定性可能发生在身体的任何部位，并经常被认为是“低血压状态”，其通常为血压下降。上述情况是全身麻醉期间局部血液动力学变化的结果，甚至是在没有失血的情况下。这些情况可引起认知损伤以及其他并发症，这些会恶化手术后的康复。例如，进行了侵入性外科手术例如髋关节置换的年长患者将从能够在手术期间增强他们的血液动力稳定性的预防措施中受益。另外，这些患者通常不是ANH的适当候选人，增强其血液动力稳定性能够减少他们对于使用供体血液输血的需要。
血浆增容药和容积替换在保持血液动力稳定性的用途是非常普遍的。然而，这些非氧载体溶液甚至在没有ANH的情况下也只能稀释血液的氧容量，并且事实上在某些情况下可能会造成血液动力的不稳定性。除了血浆增容药和容积替换以外，晶体溶液也曾被建议用于保持血液动力稳定性。然而，使用这些溶液可能会引起过量水分保持和浮肿，其还可能造成血液动力性质的不稳定。
相应地，现在很需要一种增强血液动力稳定性的方法，其可造成暂时性的血压过低但不会减少血液的固有携氧能力。根据这一目标，本发明涉及一种增强血液动力稳定性的方法，具体为使用包括以血红蛋白为基础的氧载体例如特定结构的聚烯烃氧化物修饰性血红蛋白。
发明概述
本发明涉及组合物在治疗手术中血量正常的患者以增强血液动力稳定性的用途。在一种具体实施方式
中，本发明涉及一种用于增强接受手术的血量正常的个体血液动力稳定性的方法，包括a)与手术结合对个体使用包含以血红蛋白为基础的氧载体(HBOC)，所述氧载体比全血具有更高的氧亲和力；和b)监控个体的血液动力稳定性。这种给药可在手术之前、期间或之后，或者其任意组合。另外，在手术之前、期间或之后可以测量血液动力稳定性，或者其任意组合。另外，监控患者的血液动力稳定性可有很多形式，例如监测患者的血压。在一种具体实施方式
中，血液动力稳定性是通过大约90mm Hg的收缩压来判定的。
本发明的HBOC可有很多形式，例如聚烯烃氧化物修饰的血红蛋白，其可通过天然或合成来源，包括重组体来源获得。另外血红蛋白的来源可以是人类或者其他的非人类动物。
在本发明的另一个具体实施方式
中，HBOC的氧亲和力是全血的两倍多，全血可包括P50s为4-15的HBOCs。
另一方面，本发明包括以血红蛋白为基础的氧载体(HBOC)在生产用于增强血量正常的手术患者的血液动力稳定性方面的用途，其中HBOC的氧亲和力高于全血。这种用途还可进一步包括氧卸载的增强以避免与手术相关的血液动力不稳定性。例如，HBOCs的性质以及药物的使用如上文所述。
本发明的其他方面如说明书所述。
附图简述


图1描述了MalPEG-Hb和无基质血红蛋白(SFH)的FPLC色谱图。
图2为MalPEG-Hb、SFH和全血的氧平衡曲线。
图3描述了给予不同的试验溶液以后的小鼠存活率。
图4描述了患者在接受MalPEG-Hb或林格(氏)乳酸盐后的尿排出量。
图5描述了患者在麻醉前接受MalPEG-Hb的生命体征。
图6描述了接受MalPEG-Hb或安慰剂的患者在手术期间显示出血压过低的百分比。
发明详述
本发明涉及增强手术患者血液动力稳定性的方法，该方法为对患者使用一种包含以血红蛋白为基础的氧载体的组合物。在一种具体实施方式
中，本发明涉及聚烯烃氧化物修饰的血红蛋白在增强氧卸载量并以此作为一种避免手术期间发生与血液动力稳定性相关的并发症的预防措施的用途，所述聚烯烃氧化物修饰的血红蛋白能够降低协同效应以及高氧亲和力。
为了更容易地理解本发明的下述说明书部分，对一些术语进行如下解释。
定义
术语“血红蛋白”通常是指包含在红细胞内能够运输氧气的蛋白质。血红蛋白的每个分子有4个亚单元，2个α链和2个β链，其分布于一个四聚体结构中。每一个亚单元还包括一个亚铁血红素基团，其是连接氧的含铁中心。因此，每一个血红蛋白分子可以连接4个氧原子。
术语“修饰的血红蛋白”包括但不限于被化学反应改变的血红蛋白，所述化学反应例如分子内或分子间交联、基因操作、聚合作用、和/或与其他化学基团轭合(例如聚烯烃氧化物，例如聚乙二醇、或其他的加合物如蛋白质、肽、碳水化合物、合成聚合物等等)。基本上，如果血红蛋白的结构或功能相对于其原始状态有任何改变，则其就是“修饰的”。在本文中，术语“血红蛋白”本身既包括天然未修饰的血红蛋白，也包括修饰的血红蛋白。
术语“表面修饰的血红蛋白”是指上文所述的血红蛋白，其连接有化学基团例如葡聚糖或聚烯烃氧化物，所述化学基团大多数是共价基团。术语“表面修饰的氧合血红蛋白”是指当血红蛋白表面被修饰时其处于“R”状态。
术语“无基质血红蛋白”指的是其中所有的红细胞膜都被移除的血红蛋白。
术语“高铁血红蛋白”指的是含有三价铁离子但不具有氧运载能力的血红蛋白的氧化形式。
术语“MalPEG-Hb”指的是与具有malemidyl活性的PEG相轭合的血红蛋白。这种MalPEG还可以是指下述结构Hb-(S-Y-R-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]n-O-CH3)m式I其中Hb指的是四聚体血红蛋白，S是表面巯基基团，Y是连接Hb和Mal-PEG的琥铂酰亚胺基共价键，R是不存在的或者是烷基、酰胺、氨基甲酸酯或苯基基团(取决于原材料的来源和化学合成方法)，[O-CH2-CH2]n是氧乙烯基单元组成的PEG聚合物主链，其中n定义了聚合物的长度(例如，MW＝5000)，O-CH3是末端甲氧基。
术语“血浆增容药”指的是可以增加客体血浆溶剂的任何试剂。
术语血液代用品的“携氧能力”或者只是“氧容量”指的是其运输氧气的能力，但不必然和其传递氧气的能力相关。因为已知每克血红蛋白能够结合1.34ml氧气，所以包含血红蛋白的血液代用品的携氧能力通常根据血红蛋白浓度计算。因此g/dl浓度的血红蛋白乘1.34得到ml/dl的氧容量。血红蛋白的浓度可以根据任何已知方法进行测量，例如采用β-Hemoglobin光度计(HemoCue，Inc.，Angelholm，Sweden)。同样地，氧容量可以根据从血红蛋白或血液样本中释放出的氧气量进行计算，例如使用燃料电池设备(如Lex-O2-Con，LexingtonInstruments，Waltham，Massachusetts)。
术语“氧亲和力”指的是氧载体例如血红蛋白结合分子氧的亲和能力。这一性质根据氧平衡曲线进行确定，其和血红蛋白分子对于氧气的饱和度(Y轴)以及氧分压(X轴)相关。曲线上的点表示的是数值、P50和氧分压，在某一点上氧载体对于氧气是半饱和状态，并且和氧亲和力相反。因此P50越低，氧亲和力越高。全血(以及全血的组分例如红细胞和血红蛋白)的氧亲和力，以及任何氧载体的氧亲和力，都可通过现有技术中已知的多种方法进行测量(例如参见Winslow et at，J.Biol.Chem.252(7)2331-37(1977))。氧亲和力还可以使用商业上可获得的HEMOXTM分析器(TCS ScientificCorporation，New Hope，Pennsylvania)进行测量(例如参见Vandegriff and Shrager in″Methods in Emzymology″(Everse et al.，Eds.)232460(1994))。
术语“氧运输组份”广义上是指能够在循环系统运输氧气并且能够将至少一部分氧气释放至组织中的物质。在优选的具体实施方式
中，氧运输组份是天然的或修饰的血红蛋白，在本文中也指“以血红蛋白为基础的氧载体”或者“HBOC”。
术语“血液动力参数”广义上指的是用于指示血压、血流和血液容量状态的测量结果，包括直接测量值例如血压、心输出量、右心房压、左心室舒张末期压，以及对于心动过速、局部缺血、心动过缓、传导障碍、体液平衡、重量、ICU时间和肾功能的间接测量值。
术语“类晶体”指的是小分子(通常小于10)例如盐、糖和缓冲液。和胶体不同的是，类晶体不包括任何膨胀的活性成分，并能够在循环系统和间质空间之间很快地达到平衡。
术语“胶体”(和“类晶体”相反)指的是较大的分子(通常大于10)，其依赖他们的大小和电荷能够穿过生物膜保持平衡，“胶体”包括蛋白质例如白蛋白和明胶，以及淀粉例如喷他淀粉和羟乙基淀粉。
术语“胶体渗透压”指的是胶体穿过生物膜保持体液平衡时表现出的压力。
术语“稳定自氧化作用”是指HBOC在保持低自氧化率方面的能力。在室温(大约24℃)下，如果高铁血红蛋白/总血红蛋白的比例在10小时后增加不超过2％的话，则认为HBOC在24℃是稳定的。例如，如果自氧化率为0.2hr-1，那么如果高铁血红蛋白最初的百分率为5％并且在10小时内未增加超过7％的话，则认为HBOC在室温下是稳定的。
术语“高铁血红蛋白/总血红蛋白比率”指的是氧化的血红蛋白和总血红蛋白的比率。
术语“混合物”指的是两种或更多的物质混合在一起而不发生会降低它们各自性质的反应；术语“溶液”指的是一种液体混合物；术语“水溶液”是指包含部分水的溶液，并且还可以包含一种或多种其它液体物质以及水，形成多组分溶液；术语“大约”是指在某一范围内的实际数值，例如指示值为10％。
术语“聚乙二醇”或“PEG”指的是化学结构H(OCH2CH2)nOH的液体或固体聚合物及其变体，其中n大于等于4，例如PEG是活性的、取代或未取代的。
术语“灌注”是指液体通过动脉和毛细血管流进组织和器官。
术语“血液动力稳定性”指的是在循环机械学中的稳定功能，即任何血液动力参数在一定时间内都是稳定的。
术语“低血压事件”表现为或者原因为局部或全身性的低血压，即血压下降，其在数量上还被定义为收缩压小于90mmHg或者血压低于基线值的75％。
本领域技术人员可以简单地理解本文中其他术语的含义。
氧运输和消耗的性质
虽然本发明组合物和方法的成功应用不需要理解氧运输和消耗的根本机制，但有关这些假定机理的某些基本知识可以帮助理解下文的讨论。现有技术通常假定毛细血管是将氧气运送到组织的最基本单元。然而目前的研究表明，当组织处于休息状态时，大约有同样数量的小动脉和毛细血管释放氧气。也就是说，动脉系统中的血红蛋白被认为是在小动脉网状结构中运输大约三分之一的氧含量，在毛细血管中运输三分之一的氧含量，其余的氧气则通过静脉系统脱离微循环。
动脉和小动脉自身是氧气利用的场所。例如，动脉壁需要能量通过收缩对抗血管阻力以调节血流。因此，动脉壁通常是氧气从血液中扩散出来的重要位置。然而，现在的氧运输组份(例如HBOCs)可以在动脉系统中释放更多的氧气，从而在毛细管灌注中诱导自动调整性减少。相应地，如果有太多的氧气或氧亲和力过低，也可能阻碍血液代用品的氧运输效率。
血管壁耗氧量的比率，即机械工作需要的氧气和生化合成需要的氧气的和，可以通过测量血管壁的梯度加以确定。例如参见Winslow，et al.，in″Advances in Blood Substitutes″(1997)，Birkhauser，Ed.，Boston，MA，pages 167-188。现有技术可以在各种血管中测量精确的氧分压。测得的梯度和测量区域内的组织对于氧气利用的比率成直接比例关系。这种测量结果显示出血管壁具有氧气利用基线，其随着炎症和收缩的增加而有所增加，并且随着舒张而有所降低。
血管壁梯度和组织氧合作用呈负性相关。血管收缩增加了氧梯度(组织新陈代谢)，血管舒张降低了梯度。较高的梯度表明有更多的氧气被血管壁使用，而供给组织的氧气较少。同样的现象被确认也存在于微循环中。
血管收缩和氧亲和力之间的关系
发展具有高氧亲和力的HBOC的理论在某些程度上建立在以前研究的基础上，以前的研究是利用无细胞血红蛋白作为红细胞运输的替代品。这些溶液的某些生理效应还没有被完全了解。其中，最有争议的可能是引起血管收缩的自然倾向，其可以作为动物和人类高血压的表征(Amberson，W.，″Clinical experience with血红蛋白-saline solutions，″.Science 106117-117(1947))(Keipert，P.，A.Gonzales，C.Gomez，V.Macdonald，J.Hess，and R.Winslow，″Acute changes in systemic blood pressure and urine output ofconscious rats following exchange transfusion withdiaspirin-crosslinked hemoglobin solution，″Transfusion 33701-708，(1993))。在α链和二-二溴水杨酰基-延胡索酸盐(ααHb)之间交叉连接的人类血红蛋白曾被美国军队研究作为红细胞替代品的模型，但由于后来被证明会严重地增加肺和体循环血管阻力而被军队放弃(Hess，J.，V.Macdonald，A.Murray，V.Coppes，and C.Gomez，″Pulmonary and systemic hypertension after hemoglobinadministratio，″Blood 78356A(1991))。这一产品的商业模型在经过令人失望的三期临床后同样也被放弃(Winslow，R.M.″αα-Crosslinked hemoglobinWas failure predicted bypreclinical testing？″Vox sang 791-20(2000)。
关于由无细胞血红蛋白引起的血管收缩的最常见的先进解释是无细胞血红蛋白很容易与内皮细胞衍生舒张因子一氧化氮(NO)结合。事实上，已经生产出了与NO亲和力有所下降的重组体血红蛋白，在高负荷小鼠实验中其显示出较少的高血压(Doherty，D.H.，M.P.Doyle，S.R.Curry，R.J.Vali，T.J.Fattor，J.S.Olson，andD.D.Lemon，″Rate of reaction with nitric oxide determines thehypertensive effect of cell-free hemoglobin，″NatureBiotechnology 16672-676(1998))(Lemon，D.D.，D.H.Doherty，S.R.Curry，A.J.Mathews，M.P.Doyle，T.J.Fattor，and J.S.Olson，″Control of the nitric oxide-scavenging activity ofhemoglobin，″Art Cells，Blood Subs.，and Immob.Biotech 24378(1996))。
然而，研究表明血红蛋白与NO结合并不是其血管效应的唯一解释。已发现某些大血红蛋白分子，例如被聚乙二醇(PEG)修饰的血红蛋白，事实上与高血压效应无关，即使它们与NO的结合率和那些具有严重高血压的ααHb相同(Rohlfs，R.J.，E.Bruner，A.Chiu，A.Gonzales，M.L.Gonzales，D.Magde，M.D.Magde，K.D.Vandegriff，and R.M.Winslow，″Arterial blood pressure responses tocell-free hemoglobin solutions and the reaction with nitricoxide，″J BioI Chem 27312128-12134(1998))。此外，还发现在出血前使用PEG-血红蛋白作为交换输血时，其在预防出血后果方面格外地有效(Winslow，R.M.，A.Gonzales，M.Gonzales，M.Magde，M.McCarthy，R.J.Rohlfs，and K.D.Vandegriff″Vascularresistance and the efficacy of red cell substitutes，″J ApplPhysiol 85993-1003(1998))。
保护效应与无高血压相关联，迄今为止，研究表明血管收缩对于很多以血红蛋白为基础的产品所产生的令人失望的性能负有主要责任。根据上述结论，一种假说被用于解释血管收缩，作为NO结合效应的替代或可能补充。虽然不希望被任何特定理论所束缚，但仍然相信血红蛋白血管效应的实质原因是无细胞区域内血红蛋白扩散的相反应答。在体外毛细管系统中验证上述假说，其被证明PEG-血红蛋白运输氧气的方式和自然红细胞非常相似，其中PEG-血红蛋白扩散常数较低(McCarthy，M.R.，K.D.Vandegriff，and R.M.Winslow，″Therole of facilitated diffusion in oxygen transport by cell-freehemoglobinImplications for the design of hemoglobin-basedoxygen carriers，″Biophysical Chemistry 92103-117(2001))。由于从血红蛋白至血管壁的饱和状态的改变是血红蛋白自身扩散梯度的决定因素，因此氧亲和力被期望在血浆区域内由血红蛋白促进扩散中具有一定作用。
因为O2向小动脉血管壁的释放会引起血管收缩，因此无细胞血红蛋白的氧亲和力在调节血管紧张度方面可能具有一定的作用(Lindbom，L.，R.Tuma，and K.Arfors，″Influence of oxygen onperfusion capillary density and capillary red cell velocity inrabbit skeletal muscle，″Microvasc Res 19197-208(1980))。在地鼠皮肤皱褶中，血管中的PO2为20-40托，正常红细胞氧平衡曲线坡度很陡(Intaglietta，M.，P.Johnson，and R.Winslow，″Microvascular and tissue oxygen distribution，″Cardiovasc Res32632-643(1996))。因此从理论上说，为了预防O2在小动脉中的释放会调节血管，无细胞血红蛋白的P50比红细胞(即氧亲合力较高)的低是很重要的。
氧气卸载
除了氧亲和力以外，氧气结合性质本身，即协同效应和别构效应，在HBOCs的氧卸载能力中也具有决定性作用。已经观察到和血红蛋白结合的聚烯烃氧化物引起了珠蛋白结构广泛性“紧固”。这对于具有亲水外壳包围的血红蛋白而言有助于其渗透效应，并且还可能取决于用于和聚烯烃氧化物相连接的连接基团的性质以及位置。常规知识为HBOCs的设计应当模仿天然血红蛋白的性质。然而，出乎意料地发现对血红蛋白四元结构的改造是有益的，特别是在氧卸载方面。
如果一个蛋白质和一种效应分子即一个配体在其变构部位结合并带来了其性质的改变，那么这个蛋白质则被认为是“变构”的。如果是血红蛋白，配体则是氧。血红蛋白四聚体的每一个亚单元都能够和一个氧分子结合。每一个亚单元也可以有两种构象——紧张的(T)或松弛的(R)。在R状态下，其能够比在T状态时更容易地与氧结合。
在结合氧的单个亚单元之中，血红蛋白显示出了协同效应或者协同性。氧对于一个亚单元的结合导致亚单元结构发生变化，造成剩余的活性位点显示出增强的氧亲和力。相应地，每一个连续的氧分子和血红蛋白分子的结合都比前一个更容易，直到血红蛋白分子完成R或者“配体”状态，连接有四个氧分子。
相反，天然血红蛋白以其释放氧的效率显示出预期效果。第一个分子较为牢固地连接并且带走较多能量以“卸载”，然后是下一个分子，等等。相应地，一旦与氧结合，对于血液代用品设计的常规教导对于其释放氧的能力可能会有不利的影响，所述常规教导为模仿天然血红蛋白的协同效应。
本发明涉及HBOCs在应用包括氧卸载方面出乎意料地更加有用的发现，所述HBOCs比天然血红蛋白具有更少、不会更多的协同效应。相应地，用于增强血液动力稳定性的组合物一旦到达其靶位点时，必须能够容易地释放氧气，但不必具有过多的氧气释放能力以避免血管收缩效应。简单地说，理想组合物是和手术操作相结合用于预防处理以达到必然增强血液动力稳定性的目的，其包括修饰的血红蛋白，相对于天然血红蛋白具有更少的协同效应，但与全血相比，其在组合物中具有更高的氧亲和力(少于P50的一半)氧运输组份
在优选的具体实施方式
中，氧载体(即氧运输组份)是以血红蛋白为基础的氧载体，或HBOC。血红蛋白可以是天然的(未修饰)；随后通过化学反应例如分子内或分子间交联、聚合作用或附加化学基团(例如聚烯烃氧化物或其他加成物)修饰的；或者其可以是重组体。人类α-和β-珠蛋白基因均被克隆并排序。Liebhaber，et al，P.N.A.S.777054-7058(1980)；Marotta，et al，J.Biol.Chem.3535040-5053(1977)(β-珠蛋白cDNA)。另外，很多重组产生的经修饰的血红蛋白现在利用定向诱变方法进行生产，虽然这些“突变体”血红蛋白种类被报道具有高氧亲和力。例如参见，Nagai，et al，P.N.A.S.，827252-7255(1985)。
本发明应用的HBOCs比常规的全血具有更高的氧亲和力(来源于相同的动物体，并不一定是人类)，其P50值也比全血低。通常认为全血的P50为大约28托。在一种具体实施方式
中，本发明HBOCs额P50比全血的一般还要低，其被认为是具有“高氧亲和力”。这种高氧亲和力的HBOCs的P50为4-15，例如10、7等等。
本发明并不限制血红蛋白的来源。例如，血红蛋白可以是从动物和人类获得的。用于特定用途的血红蛋白优选来源于人类、牛和猪，以及非哺乳动物例如环节动物、爬行类动物等等。另外，血红蛋白可以通过其他方法生产，包括化学合成和重组技术。可以将血红蛋白以游离形式加入到血产品组合物中，或者将其包裹在小囊中例如合成微粒、微球或脂质体。本发明优选的氧运输组份没有基质和内毒素。很多美国专利都公开了氧运输组份的代表性例子，包括Hsia的美国专利4,857,636，Walder的美国专利4,600,531，Morris等人的美国专利4,061,736，Mazur的美国专利3,925,344，Tye的美国专利4,529,719，Scannon的美国专利4,473,496，Bocci等人的4,584,130，Kluger等人的美国专利5,250,665，Hoffman等人的美国专利5,028,588以及Sehgal等人的美国专利4,826,811和美国专利5,194,590。
除了上述血红蛋白的来源以外，最近还发现了马血红蛋白作为本发明组合物中的氧运输组份具有特定的优点。一个优点是从商业上能够容易地获得大量的马血，其中可以纯化马血红蛋白。另一个预料不到的优点是马血红蛋白显示出可以增强其在本发明血液代用品中的用途的化学性质。
以前的报道表明马血红蛋白对高铁血红蛋白的自氧化作用快于人血红蛋白，其导致不太适用于作为血液代用品组份。例如参见，J.G.McLean and I.M.Lewis，Research in Vet.Sci，19259-262(1975)。为了使自氧化作用降至最低，McLean和Lewis在红细胞溶解后使用了一种还原剂谷胱甘肽。然而，用于制备本发明组合物的血红蛋白，无论其来源是否是人类或马，都不需要使用还原剂以预防红细胞溶解后的自氧化作用。
最近，有报道称马血红蛋白和人类血红蛋白的氧亲和力有所不同，例如参见M.Mellegrini，et al.Eur.J.Biochem.，2683313-3320(2001)。这种差别使得不可选择马血红蛋白用于制备可模仿人类血红蛋白的血液代用品。然而，当和本发明组合物混合时，在包含人类血红蛋白的共轭物和马血红蛋白的共轭物之间没有观察到关于氧亲和力的显著性差别(小于10％)。相应地，与这些表面上不被期望的性质相反，在本发明组合物种，马血红蛋白和人类血红蛋白可能是相当的。
在本发明中，当在相同条件下测量时，HBOC的氧亲和力高于全血，优选为全血的两倍，或者择一地，HBOC的氧亲和力高于无基质血红蛋白(SFH)。大多数情况下，这意味着血液代用品中HBOC的P50小于10，优选小于7。在游离状态下，SFH的P50为大约15托，然而全血的P50大约为28托。以前曾有建议称，提高氧亲和力，因而降低P50，可以提高氧气向组织的传递，虽然其隐含了P50不得低于SFH的P50的条件，参见Winslow，et al.，in″Advances in BloodSubstitutes″(1997)，Birkhauser，ed.，Boston，MA，at page 167，and U.S.Patent No.6,054,427。这一建议否决了广泛存在的一种认知，即用作血液代用品的修饰的血红蛋白应当具有较低的氧亲和力，并且P50应当与全血相当。由于吡啶氧基修饰的血红蛋白与SFH结合时更容易释放氧气，因此很多研究者使用吡啶氧基磷酸盐将SFH的P50由10提高至约20-22。
有很多不同的科学方法用于生产具有高氧亲和力的HBOCs(即它们的P50小于SFH)。例如，已有研究表明氨基酸残基在氧亲和力方面具有一定作用，例如β-93半胱氨酸，因此现在可容易地采用定向诱变使氧亲和力达到理想水平。例如参见美国专利5,661,124。美国专利6,054,427也公开了很多其他的方法。
血红蛋白的毒性
已知当血红蛋白可逆地从亚铁(Fe2+)变为高铁(Fe3+)或高铁血红蛋白形式时，其显示出自氧化作用。当这种情况发生时，分子氧从氧血红蛋白中分离为超氧负离子形式(O2-)。它还造成了亚铁血红素-珠蛋白复合物的脱稳定化作用，并最终导致珠蛋白链变性。氧自由基的生成和蛋白质变性均被认为是在HBOCs的体内毒性中具有一定作用(Vandegriff，K.D，Blood Substitutes，Physiological Basis ofEfficacy，pages 105-130，Winslow et al.，ed.，Birkhauser，Boston，MA(1995).)。
对于大多数HBOCs而言，氧亲和力和血红蛋白氧化作用之间呈负性相关，即氧亲和力越高，自氧化率越低。然而，不同血红蛋白变体对于氧亲和力的作用以及自氧化率并不总是可预测的。另外，氧亲和力和自氧化率之间的最佳平衡还没有被清楚地了解。
在一个具体实施方式
中，本发明组合物包括聚烯烃氧化物-Hb共轭物，例如聚乙二醇-Hb共轭物在室温下显示出非常低的自氧化率。当测量自氧化率时，数值应当尽可能地低(即，室温下在至少3小时内，更优选至少10小时，每小时0.2％总血红蛋白，优选每小时0.1％总血红蛋白)。因此，室温下本发明HBOCs在给药和/或储藏期间能够保持稳定。
氧运输组份的变体
在一个可模仿的具体实施方式
中，氧运输组份是聚烯烃氧化物(PAO)修饰的血红蛋白。适当的PAOs包括，尤其是，聚氧化乙烯((CH2CH2O)n)、聚氧化丙烯((CH(CH3)CH2O)n)或聚氧乙烯/聚氧化丙烯共聚物((CH2CH2O)n-(CH(CH3)CH2O)n)。适于本发明应用的其他直链、支链及任选的取代合成聚合物在医药领域都是已知的。
最常规地，连接到血红蛋白上的化学基团是聚乙二醇(PEG)，这是因为它是药学可接受并且是商业上可获得的。PEGs是化学式H(OCH2CH2)nOH的聚合物，其中n通常大于等于4。PEG化学式后面通常有一个数字，与其平均分子量相应。例如PEG-200的平均分子量为200，其分子量范围是190-210。PEGs在商业上可以以很多不同的形式获得，在很多情况下其具有预活性并且可以和蛋白质连接。
本发明可模仿的具体实施方式
的一个重要方面是当血红蛋白在氧合或“R”状态时，其可发生表面修饰。血红蛋白和大气在结合反应前进行平衡(或者，任选地，进行活性氧合作用)可以很容易完成表面修饰。通过完成氧合血红蛋白的轭合过程，得到的血红蛋白的氧亲和力有所增强。因为很多研究者描述在减小氧亲和力的结合过程之前会发生脱氧，因此这一步骤通常被认为是有所禁忌的。例如参见美国专利5,234.903。
虽然PAO修饰的血红蛋白的性质在很多方面都不依赖于血红蛋白和修饰物(例如PEG)的连接，但与具有不同的连接键例如变性性更强的连接模式相比，仍然相信连接物的类型例如更坚硬的不饱和脂肪族或芳香族C1至C6连接取代基可以改变共轭物的产生和/或性质。
根据PEG的大小，连接到血红蛋白分子上的PEGs的数量是可变化的。然而，合成的修饰血红蛋白的分子大小必须足够大以避免被肾清除，从而达到理想的半衰期。Blumenstein等人确定的大小为分子量大于84,000道尔顿(Blumenstein，et al.，in″BloodSubstitutes and Plasma Expanders，″Alan R.Liss，editors，NewYork，New York，pages 205-212(1978).)。因此，作者将血红蛋白和不同分子量的葡聚糖相轭合。他们报道称血红蛋白(分子量为64,000道尔顿)和葡聚糖(分子量为20,000道尔顿)的共轭物“从肾循环中被清除的速度很慢并且可以忽略不计”，但是增加分子量超过84,000道尔顿不会改变清除曲线。相应地，如Blumenstein等人所述，HBOC的优选分子量为至少84,000道尔顿。
在本发明的一个具体实施方式
中，HBOC是″MalPEG-Hb″，其含义是和malemidyl活性的PEG相连接的血红蛋白。这种MalPEG-Hb还指下述结构式Hb-(S-Y-R-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]n-O-CH3)m式I其中Hb指的是四聚体血红蛋白，S是表面巯基，Y是连接Hb和Mal-PEG的琥铂酰亚胺基共价键，R是不存在的或者是烷基、酰胺、氨基甲酸酯或苯基基团(取决于原材料的来源和化学合成方法)，[O-CH2-CH2]n是氧乙烯基单元组成的PEG聚合物主链，其中n定义了聚合物的长度(例如，MW＝5000)，O-CH3是末端甲氧基。
制剂
本发明HBOCs可通过混合HBOC和其他任选的辅料以及适当的水溶液或“稀释剂”(即适于静脉注射的药学可接受物质)制备成制剂。根据应用情况氧载体在稀释剂中的浓度会有所变化，尤其是根据期望的给药后稀释度变化，在优选的具体实施方式
中，由于本发明组合物的其他特征可用于增强氧运输和治疗效果，因此通常HBOC中血红蛋白的浓度无需高于6g/dl可以为0.1-4g/dl。
适当的稀释剂包括，尤其是，蛋白质、糖蛋白、多糖和其他胶体。所述的具体实施方式
并不限制于任何特定的稀释剂。因此，稀释剂包括白蛋白、其他胶体、或其他非氧载体组分的无细胞水性溶液。在某些具体实施方式
中，水性溶液的粘度为至少2.5cP。在另一个具体实施方式
中，水性溶液的粘度为2.5-4cP。
本文所述的组合物可以在“和手术相关”的任何时间使用，包括手术前、手术期间或手术后。
临床应用
本发明涉及HBOCs例如PAO修饰的血红蛋白共轭物，其相对于天然血红蛋白具有较小的协同效应，被制备成P50小于全血的组合物，在某些具体实施方式
中，其P50小于全血的一半。这些组合物用于在手术期间增强血量正常患者的血液动力稳定性，它们可以使用与本领域已知的血浆增容药、溶剂增强剂等相同的给药参数进行给药。在手术前、期间或之后，或者将这几个时期相结合，监测血液动力稳定性。因此，血液动力稳定性的增强并不限于在手术操作期间测量患者的血液动力性质，可以在给药后的任何时间进行观察。
能够从本发明方法得到最大获益的患者人群是“进行手术的血量正常患者”。因此，在一个具体实施方式
中，本发明方法涉及对患者使用组合物，所述患者尚未在急性等容性血液稀释(ANH)处理期间失血。本发明建立在一个发现的基础上，所述发现为个体在手术操作中结合上述组合物较可能不会在手术期间或手术后需要进行输血。因此，在一个方面，本发明方法是ANH的备选方案。
在另一个方面，本发明方法还会对接受手术的血量正常患者产生在手术期间使用较少的升压药物以提高血压的间接效应，这是因为他们在手术时预防性使用的HBOC能够在手术期间有效地稳定血压。
实施例
美国专利申请2003/0162693公开了和下述三个实施例相似的看法，该美国专利申请公开于2003年8月28日。对于所有的实施例，MalPEG-Hb被用作HBOC的模型。其他HBOCs的生产和有效性在科学文献中已知，然而应当仔细规定其在人类患者中进行临床试验的能力，并且不可能使用HBOCs的多种形式进行试验。因此，基于本文的教导，本领域技术人员应当理解本发明并不限于MalPEG-Hb的应用，具有相似性质的HBOCs(例如比天然血红蛋白的氧亲和力高，特别是PAO修饰的血红蛋白)也适于应用。
实施例1无基质血红蛋白的生产步骤1获得过时的红细胞
从商业途径获得过时的袋装红细胞，例如圣地亚哥血库或美国红十字会。优选，过时的材料不要超过采集时间45天。在4±2℃条件下储藏袋装红细胞(pRBCs)，直至进行下一步处理(1-7天)。在使用前隔离所有的物质以防止病毒感染，并且进行核苷酸测试。
步骤2混合过时的血液
在干净的设备中将袋装红细胞在无菌容器中混合。记录袋装红细胞体积，使用商业可获得的血氧计或其他本领域已知的方法测定血红蛋白浓度。
步骤3白细胞过滤
使用膜过滤装置进行白细胞过滤(即移除白细胞)。在开始和结束时计数白细胞数以监控这一操作的效率。
步骤4细胞分离和细胞洗涤
使用6体积的0.9％氯化钠溶液洗涤红细胞，该操作在4±2℃条件下完成。用分光光度计分析细胞清洗以检测血浆成分白蛋白的去除情况。
步骤5红细胞溶解和细胞碎片的移除
4±2℃条件下，经洗涤的红细胞在6体积水的搅拌下溶解至少4小时或者过夜。低温下处理溶胞产物以纯化血红蛋白。使用0.16μm的薄膜处理溶胞产物。将纯化的血红蛋白收集到无菌、去热源容器中。这一过程中的所有步骤都在4±2℃下进行。
步骤6除菌
4±2℃条件下，使用超滤法进行除菌。
步骤7浓缩和溶剂交换
由溶胞和超滤法纯化得到的血红蛋白利用10ID薄膜交换进入林格(氏)乳酸盐(RL)或磷酸盐缓冲生理盐水(PBS，pH7.4)。然后使用相同的薄膜浓缩血红蛋白达到最终浓度为1.1-1.5mM(四聚体)。10-12体积的RL或PBS用于溶剂交换。上述操作在4±2℃下进行，RL溶液的pH调节至7.0-7.6。
步骤8过滤除菌
使用0.45-或0.2-μm的一次性滤膜对PBS或林格(氏)乳酸盐(RL)中的血红蛋白过滤除菌，在进行化学修饰反应前于4±2℃条件下储存。
用于纯化血红蛋白的其他方法在本领域都是已知的。另外，通常不需要使用还原剂(例如谷胱甘肽或其他包含巯氢基的还原剂)以在细胞溶解后预防自氧化作用。
实施例2无基质血红蛋白的修饰步骤1硫醇化作用
在4±2℃温度下，使用多过血红蛋白10倍摩尔量的亚胺巯烷连续搅拌4小时，完成硫醇化反应。
反应条件●RL(pH7.0-7.5)或PBS(pH7.4)中的1mM血红蛋白(四聚体)●RL(pH7.0-7.5)或PBS(pH7.4)中的10mM亚胺巯烷
将SFH亚胺巯烷比例定为1∶10并选择最佳反应时间，以使PEG酯化的巯基基团最大化，使异质性产物最小化。
步骤2硫醇血红蛋白的PEG酯化
以多于起始四聚体血红蛋白浓度20倍摩尔量的Mal PEG(具有烷基或苯基连接物)对硫醇血红蛋白进行PEG酯化反应。首先使血红蛋白与大气平衡以氧化血红蛋白，反应在4±2℃温度连续搅拌2小时条件下进行。
反应条件●RL或PBS(pH7.4)中的1m硫醇化血红蛋白●RL或PBS(pH7.4)中的20mM Mal-PEG步骤3移除未反应试剂
使用70-kD薄膜处理PEG酯化的Hb，移除过量的未反应试剂或者血红蛋白。进行20体积的过滤以确保移除所有的未反应试剂，这一过程采用分子筛析色谱仪在540nm和280nm处进行监控，蛋白质浓度被稀释至4g/dl。使用1N NaOH调节pH至7.3±0.3。
步骤4过滤除菌
使用0.2μm无菌一次性被膜对MalPEG-Hb的终产品进行无菌过滤，并在4±2℃条件下将其收集至无菌去热原容器中。
步骤5MalPEG-Hb的制剂 将PEG酯化的Hb稀释至4g/dl RI，pH调节至7.4±0.2
步骤6无菌填充 无菌过滤(0.2μm)最终的血液代用品组合物，将其按重量等分放入无菌玻璃瓶中，用具有波纹的无菌橡皮塞密封，放入层流通风橱中，在-80℃下储藏直至使用。
实施例3MalPEG-Hb的物理化学分析物理化学分析的方法论 使用液相色谱法(LC)确定MalPEG-Hb血液代用品的同质性和分子大小。分析用LC被用于评价PEG酯化的血红蛋白的同质性，并且确定移除的未反应Mal-PEG的范围。根据在540nm处的吸光度评价血红蛋白，利用峰位将PEG酯化的血红蛋白从未反应血红蛋白中分辨出来。由于MalPEG中存在的环状结构在紫外线(UV)光谱中能够吸收，因此根据280nm处的吸光度将PEG酯化的血红蛋白从游离Mal-PEG中分辨出来。
利用快速扫描光电二极管阵列分光光度计(Milton Roy 2000或者Hewlett Packard Model 8453)在Soret和可见光区收集光谱用于血红蛋白浓度和高铁血红蛋白百分比的分析，所述分析采用的是多组分分析法(Vandegriff K.D.，and R.E.，Shrager.Evaluation ofoxygen equilibrium binding to Hemoglobin by rapid-scanningspcetrophotometry and singular value decomposition.Meth.Enzymol.232460-485(1994)。
利用共-血氧计确定MalPEG-Hb的浓度和高铁血红蛋白的百分比，利用流变仪确定粘度，利用胶体渗透压计测定胶体渗透压。根据氧气平衡曲线确定氧气结合参数。
表1列举了血液代用品组合物的示范性规格
表1

MalPEG-Hb上PEG酯化位点的数目 对于表面修饰而言，式I中的数字“m”是定义连接至血红蛋白表面的PEG聚合物的数目参数。
Hb-(S-Y-R-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]n-O-CH3)m式I 为了确定这一数字，利用二硫代吡啶比色测定法(AmpulskiR.，V.Ayers，and S.Morell.Determination of the reactivesulfhydryl groups in heme proteins with 4，4′-dipyridinesdisulde.Biocheim.Biophys.Acta 163-169，1969)测定硫醇化作用之前和之后Hb四聚体表面上有效的巯基基团数目，在Hb进行PEG酯化之后再测量一遍。人类血红蛋白在β93Cys残基处包含2个内在的活性巯基基团，利用二硫代吡啶反应对其加以确认。以SFH亚胺巯烷为1∶10的比例进行SFH的硫醇化反应以后，在二硫代吡啶反应的基础上活性巯基基团的数目由2增加到6。PEG酯化反应以后，活性巯基基团的数目下降为1.3。这表明在MaLPEG-Hb上有4-5个PEG酯化反应位点。
MalPEG-Hb和SFH的Size-excluson色谱分析比较 FPLC用于分析最终的MaLPEG-Hb产品。具有代表性的色谱图如图1所示，是MaLPEG-Hb和未修饰性SFH的对比。SFH的滞留时间为约57mm，MaLPEG-Hb的滞留时间为约44分钟。
MalPEG-Hb的物理和化学性质 MalPEG-Hb的物理性质与血液和未修饰性人类血红蛋白(SFH)相比较如表2所示表2

1在15g/dl全血和大约4g/dl血红蛋白溶液中测定2利用COP测量方法和FPLC测定氧亲和力 在酶的氧耗量期间测定血红蛋白-氧平衡结合曲线(AnalBiochem.256107-116，1998)。MalPEG-Hb显示出高氧亲和力(P50＝5mmHg)和低协同效应(n50＝1.0-1.4)。图2是无基质血红蛋白(SFH)、MalPEG-Hb和血液相比较的代表性曲线。
粘度 MalPEG-Hb的溶液性质是由聚乙二醇链和溶剂水分子之间的强相互作用产生的。有两点原因认为这是MalPEG-Hb血液代用品一种重要的属性1)较高的粘度降低了PEG-Hb分子和气体配体分子在溶剂中的扩散常数；2)较高的粘度增加了溶液对内皮壁的剪切应力，诱导血管扩张成分释放以抵抗血管收缩。如表2所示，MalPEG-Hb溶液的粘度是2.5cPs。
胶体渗透压(COP) 已经测量了包含未修饰、分子内和分子间交联的血红蛋白或PEG-表面共轭的血红蛋白的COP，以确定它们的大分子溶液性质(Vandegriff，K.D.，R.J.Rohlfs，and R.M.Wislow.胶体osmoticeffects of hemoglobin-based oxygen carriers.In Winslow，R.M.，K.D.Vandegriff and M.Intaglia，eds，Advances in BloodSubstitutes Industrial Opportunities and Medical Challenges.Boston，Birkhauser，pp.207-232(1997)。四聚体血红蛋白显示了近乎完美的溶液性质，然而和PEG共轭的血红蛋白具有显著的高胶体渗透活性，为不甚理想的溶液(Vandegriff，K.D.，M.Mcarthy，R.J.Rohls and R.M.Winslow.Colloid osmotic properties of modifiedhemoglobinschemically cross-linked versus polyethyleneglycol surface conjugated.Biophys.Chem.6923-30(1997)。如表2所示，MalPEG-Hb溶液的COP为50。
稳定性 通过测定自氧化作用的比例来考察含有PEG-血红蛋白的血红蛋白溶液的稳定性。在室温下，10小时内MalPEG-Hb的自氧化从大约5％MetHb增加到5.5％MetHb。因此MalPEG-Hb的自氧化速率为0.05％每小时。
实施例4MalPEG-Hb的稳定性 此项研究的目的是为了确定MalPEG-Hb在模拟储藏和处理条件下的稳定性。对三个处理阶段期间的稳定性进行评价。第一阶段是指从生产设备中的冷冻储藏状态到移送到临床场所期间的温度条件的变化(冷冻储藏研究)；第二阶段是将MalPEG-Hb融化24小时至+4℃，然后在+4℃下储存5天(冷却研究)；第三阶段是将MalPEG-Hb融化24小时至+4℃，然后在患者用药之前将MalPEG-Hb在室温下储存几天(室温研究)。
试验方法 根据MalPEG-Hb试验材料氧化的比率可以确定其稳定性。利用共-血氧定量法测量样品中高铁血红蛋白的百分比(IL Co-Oximeter 682，GMI，Inc.，Ramsey，Minnesota.)。根据试验设计，在每个时间点进行两次测量。
使用温度计或温度图标记录器监测温度。冷冻储藏研究的温度范围为-21.0±3.0℃。冷却研究的温度范围为+4.0±0.2℃。室温研究的温度范围为+21.0±1.0℃。
在每一个指示性时间点记录温度、总血红蛋白和高铁血红蛋白的百分比。在冷冻和冷却研究中，在0时(完全融化)、1小时后、接下来五天内的每24小时对上述参数进行测定。在室温研究中，在0时(完全融化)和接下来10小时内的每1小时进行测定。
结果 -20℃条件下，在6天的储藏期间MalPEG-Hb在高铁血红蛋白百分比方面没有显著性变化。类似地，MalPEG-Hb在+4℃的5天储藏期间也没有可察觉的高铁血红蛋白百分比变化。在室温下的储藏期间，MalPEG-Hb在10小时内高铁血红蛋白增加不足1％。
实施例5Mal-PEG用于促进血液动力稳定的用途 如上文所述制备MalPEG-Hb。在对患者进行脊椎麻醉前，将与1000mL林格(氏)乳酸盐平衡的0(只有林格(氏)乳酸盐)、200(″A″)、400(″B″)或600mL(″C″)的MalPEG-Hb给予接受选择的矫形外科手术的患者。结果如图4所示。
图5描述了接受600mL MalPEG Hb的患者的生命体征。如图所示，与基线测量结果相比，没有观察到血压升高。相反，在接受200或400ml MalPEG-Hb的患者中，观察到可察觉但非常小的血压升高。
在患者中还监测到了血压过低情况，结果如表3所示表3
如上所示，证明了接受MalPEG-Hb的患者的低血压情况少于接受安慰剂的患者。
实施例6MalPEG-Hb在手术期间用于增强血液动力稳定性的用途的扩展性临床研究 曾经在健康志愿受试者中对MalPEG-Hb进行I期临床试验，结果是MalPEG-Hb无显著性危害，并且与非临床研究相一致，所述非临床研究表明MalPEG-Hb与无基质Hb相比具有降低的血管活性。以低血压来测量的血液动力不稳定性(例如心血管疾病)，特别是在患有心血管疾病的老年患者中，是接受手术的上述患者很关心的问题。大量的文献支持一种假说，该假说认为低血压会产生脑、心脏和肾局部缺血，进而导致显著的术后发病率。以Hb为基础的氧载体(HBOCs)的发展是本实验关注的焦点，所述HBOCs用于保护上述手术患者免于这些不良状况的影响。
在6家不同的医院进行MalPEG-Hb(250或500mL)随机双盲试验，对照组中只有林格(氏)乳酸盐，每组为30名患者。参加试验的患者为接受大的侵入性外科手术，大部分是髋关节置换术。在进行脊椎麻醉前对患者给药，安全评价包括生命体征和动态心电图监护仪(从输注至24小时)，以及临床化学、凝固作用、血液和体叶平衡。低血压的发病率是主要的效能检验点，在数量上定义为收缩压小于90mmHg或低于基线值的75％。效能的其他测量值对于稳定血压和体液平衡的药理介入而言是必需的，详细说明见下文。
研究人群 参与本试验研究的患者为正在接受外科手术的人，所述手术是对于骨关节炎患者的可选择性初期髋置换术。然而，对很多急性骨折以及一些二次置换也进行了研究。选择标准和淘汰标准列于表4。
表4

随机化和盲法 对于每部分患者的治疗都由计算机确定，有序数随机化码表。治疗组分为A，250mL MalPEG-Hb；B，500mL MalPEG-Hb；(A和B代表“试验组”)以及C，林格(氏)乳酸盐(代表“安慰剂组”)，在给药前所有组的给药体积都调至相同。由于MalPEG-Hb是红色的而安慰剂是透明的，因此要做一些工作以防止患者和“不知情(盲)”工作人员看到输注的溶液，即研究以“双盲”状态进行。
材料 MalPEG-Hb基本上根据实施例1-3所述的方法进行制备，仅有某些小的变化。在给药前约24小时，从冰箱(-20℃)中取出MalPEG-Hb的瓶子，将其放置在室温下逐渐融化。林格(氏)乳酸盐可以从商业途径购得(Fressenius Kabi AB，Uppsala，Sweden.)。
给药 通过一种标刻度体积的输液泵对MalPEG-Hb或安慰剂进行静脉注射给药。为了进行双盲试验，在诱导麻醉前注射总体积为1000mL的MalPEG-Hb和/或林格(氏)乳酸盐，注射后30分钟内产生麻醉效果。
试验组合物或安慰剂溶液的输注并不会影响患者的正常护理。接受试验或安慰剂溶液的患者也可以接受任何对于患者健康必须的其他治疗。所有的医学操作和处理都根据临床标准进行。在研究起始对所有连续性药物的给药以及研究过程中使用的药物都记录下来，用于解释结论。
药物代谢动力学测量结果和变量 在输注前、输注结束时、输注后6小时、输注后1、2和3和7-10天根据血浆血红蛋白和高铁血红蛋白水平确定MalPEG-Hb的血管内保留和血管内产物的稳定性。这些研究的结果未脱离普通教导，在本文中也不予以报道。
样品收集和分析 采用常规方法采集血液样品以使抽样期间溶血最小化，对于血液样品的处理要确保血液样品和血浆完全分离。由于血液样品中包含MalPEG-Hb的血浆部分是红色的，因此对于样品处理需要在“非盲”技术操作。样品分析要在“代码破坏”前进行。因此，进行分析的实验室可适当的进行“盲”分析。
效能测量和变量 利用下述终点对用于增强血液动力稳定性的MalPEG-Hb的效果进行研究，所述MalPEG-Hb可作为HBOC的代表性例子A.低血压 注射MalPEG-Hb/安慰剂后产生的低血压定义为收缩压(SBP)＜90mmHg，或者与注射前相比SBP下降≥25％。将符合上述定义的每一次SBP都记录下来，认为产生了低血压。
B.全部液体入量和出量(体液平衡) 在手术当天(从开始注射到开始注射后24小时)和手术后第1、2和3天进行测量，入量包括注射液体(MalPEG-Hb/安慰剂，胶体和类晶体)、输血和口服液体。出量包括手术期间的小便和估计失血量。
记录静脉内液的种类和数量(数据未给出)。在整个入院期间，类晶体和胶体输注的总量在三组之间无统计学差别。然而，手术期间确实具有了区别。与B(1299±183mL)、C(1281±144mL)组相比，A组接受的类晶体(913±106mL)量明显很少(P＜0.05)。另外，当MalPEG-Hb被包括在使用的胶体数量中时，B组(1389±169mL)与A(850±66mL)、C(666±69mL)组相比接受了显著多量的总胶体。B和C以及A和B的区别均具有统计学差异(P＜0.05)。研究的余下部分使用的类晶体、胶体或总静脉注射液体无显著的统计学差异。
C.心脏紊乱 作为血液动力不稳定性测量结果的心脏紊乱的数量和种类(心动过速、局部缺血、心动过缓和传导障碍)由不知情的心脏病学家进行评价。使用连续性动态心电图监护仪和ECG记录心律失常。
D.药物介入 从开始麻醉到输注开始后12个小时，也对支持心血管的药物(例如血压药物，利尿剂)介入数量和剂量进行记录。
E.输血 同样对手术期间(从开始麻醉到手术结束或以后)的输血(红细胞压积)进行记录。
F.氧气利用 手术当天和其后几天的输后附注供氧也进行记录。
结论 表现为不良状况的血压过低不稳定性例如低血压，以及给予加压的必要性如表5所示。从压力过低的百分比中得到的结论也在图6中进行了描述。
表5
上述实施例用于对本领域普通技术人员做到充分公开，并教导了如何制备和使用组合物的优选实施方案，但并不限于本发明实施例的范围。对于本领域技术人员而言任何显而易见的对于上述例子的改变(用于实施本发明)都在下述权利要求的范围内。本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请都作为本文的一部分用于参考，就象是每篇出版物、专利或专利申请都是特别地且单独地为本文的一部分以用作参考。
权利要求
1.一种用于增强接受手术的血量正常的个体血液动力稳定性的方法，包括a)与手术结合对个体使用包含以血红蛋白为基础的氧载体(HBOC)的组合物，所述氧载体比全血具有更高的氧亲和力；和b)监控个体的血液动力稳定性。
2.如权利要求1所述的方法，其中组合物在手术前使用。
3.如权利要求1所述的方法，其中组合物在手术期间使用。
4.如权利要求1所述的方法，其中组合物在手术后使用。
5.如权利要求1所述的方法，其中步骤b)在手术前进行。
6.如权利要求1所述的方法，其中步骤b)在手术期间进行。
7.如权利要求1所述的方法，其中步骤b)在手术后进行。
8.如权利要求1所述的方法，其中HBOC还包括聚烯烃氧化物修饰的天然血红蛋白。
9.如权利要求1所述的方法，其中HBOC还包括聚烯烃氧化物修饰的合成血红蛋白。
10.如权利要求1所述的方法，其中HBOC还包括重组体血红蛋白。
11.如权利要求1所述的方法，其中HBOC还包括人类血红蛋白。
12.如权利要求1所述的方法，其中HBOC还包括从非人类动物中获得的人类血红蛋白。
13.如权利要求1所述的方法，其中HBOC的氧亲和力是全血的两倍多。
14.如权利要求1所述的方法，其中HBOC具有4-15的P50。
15.如权利要求1所述的方法，其中HBOC还包括通过以共价键与malemidyl活化的聚乙二醇相连接而修饰的血红蛋白。
16.如权利要求1所述的方法，其中步骤b)还包括监测个体的血压。
17.如权利要求16所述的方法，其中血液动力稳定为患者保持收缩压大于90mmHg。
18.以血红蛋白为基础的氧载体(HBOC)在生产用于增强接受手术的血量正常个体血液动力稳定性的药物中的用途，其中HBOC的氧亲和力高于全血。
19.如权利要求18所述的用途，还包括氧卸载的增强，以作为避免与手术相关的血液动力不稳定的预防措施。
全文摘要
本发明涉及用于增强手术患者血液动力稳定性的方法，该方法为向患者施用一种包括以血红蛋白为基础的氧载体的组合物。在一种具体实施方式
中，本发明涉及使用聚烯烃氧化物修饰的血红蛋白用于减少协同效应和高度的氧亲和力以增加氧气的卸载量，以此作为避免手术期间引起血液动力稳定性相关并发症的预防措施。
文档编号A61K38/00GK101039684SQ200580034546
公开日2007年9月19日 申请日期2005年8月30日 优先权日2004年8月31日
发明者R·M·温斯洛, K·D·范德格里夫 申请人:桑格特公司