新的抗微生物剂的制作方法

专利名称：新的抗微生物剂的制作方法
技术领域：
和背景 本发明涉及新的抗微生物剂和，更特别地涉及新种类的聚合物，其被设计为发挥抗微生物活性，同时具有稳定、无毒和避免对其发生抗药性。本发明更进一步地涉及包含该聚合物的药物组合物、医疗装置和食品防腐剂和涉及利用其治疗致病微生物相关的医学疾病的方法。
抗生素，其在本文和本领域中也是指抗菌剂或抗微生物剂，根据分子式其为相对小容量的天然物质，一般由细菌或真菌释出。多年来使用这些天然物质以及其衍生物和/或其变体作为药物，用于治疗细菌引起的感染。
早在1928年，Alexander Fleming阁下观察到金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细菌集落能被点青霉菌(Penicillium notatum)霉菌所破坏。他的观察导致Fleming假定抗生物质的存在和其作用法则。在微观水平的化学战中已经建立了将真菌释放物质作为抑制其他生物体的手段。该法则后来被用于开发杀灭体内引起疾病的某些类细菌的药物。在二十世纪四十年代Howard Florey和Ernst Chain分离出活性成分青霉素并开发了这种药物的粉末形式。
将这些进步转化为医疗保健，引人注目地减少了感染性疾病的生病和死亡。然而，经过数十年，几乎所有引起显性感染的菌株对抗生素发生了抗药性。
抗生素抗药性可导致严重的不利后果，例如增加患者患普通感染的死亡率、发病率和医疗费用，而从前用抗生素可容易治疗(Am.J.Infect.Control 24(1996)，380-388；Am.J.Infect.Control 27(1999)，520-532；Acar，J.F.(1997)，Clin.Infect.Dis.24，Suppl 1，S17-S18；Cohen，M.L.(1992)，Science 257，1050-1055；Cosgrove，S.E.和Carmeli，Y.(2003)，Clin.Infect.Dis.36，1433-1437；Holmberg，S.D.等(1987)，Rev.Infect.Dis.9，1065-1078)，并因此成为当今政府、医学和药学研究最公认的临床问题之一(美国国会，技术评定部，Impacts ofAntibiotic-Resistant Bacteria，OTA-H-629，美国华盛顿特区，政府印刷部(1995)；英国国会上议院，Science and Technology 7th ReportResistance to Antibiotics and Other Antimicrobial Agents，HL Paper 81-II，session(1997-98)；和Interagency Task Force on AntimicrobialResistance，A Public Health Action Plan to Combat AntimicrobialResistance.Part 1Domestic issues)。
由于经典抗生素使用相关的限制，广泛的研究已集中在发现新的、有效的和不诱发抗药性的抗微生物剂/抗菌剂上。
在这些研究内，发现了新类型的短天然存在肽，其产生显著的抗微生物/抗细菌活性。
称作抗微生物肽(AMPs)的这些肽，来自动物源，组成大量不同的肽家族，可用作有效的抗微生物剂对抗耐抗生素的微生物(参见新近的综述，例如，Levy，O.(2000)Blood 96，2564-2572；Mor，A.(2000)DrugDevelopment Research 50，440-447；Zasloff，M.(2002)New EnglandJournal of Medicine 347，1199-1200；Zasloff，M.(2002)Nature 415，389-395；Zasloff，M.(2002)Lancet 360，1116-1117)。在过去20年中，已经从单细胞生物至哺乳动物包括人类的多种来源中鉴定出700多种AMPs(参见新近的综述，例如，Andreu，D.和Rivas，L.(1998)Bioploymers 47，415-433；Boman，H.G.(2003)J.Intern.Med.25 4，197-215；Devine，D.A.和Hancock，R.E.(2002)Curr.Pharm.Des.8，703-714；Hancock，R.E.和Lehrer，R.(1998)Trends Biotechnol.16，82-88；Hancock，R.E.(2001)Lancet Infect.Dis.1，156-164；Hancock，R.E.和Rozek，A.(2002)FEMS Microbiol.Lett.206，143-149；Hoffmann，J.A.和Reichhart，J.M.(2002)Nat.Immunol.3，121-126；Lehrer，R.I.和Ganz，T.(1999)Curr.Opin.Immunol.11，23-27；Nicolas，P.和Mor，A.(1995)Annu.Rev.Microbiol.49，277-304；Nizet，V.和Gallo，R.L.(2002)Trends Microbiol.10，358-359；Shai，Y.(2002)Curr.Pharm.Des.8，715-725；Simmaco，M.等.(1998)Bioploymers 47，435-450；Tossi，A.等.(2000)Bioploymers 55，4-30；Tossi，A.和Sandri，L.(2002)Curr.Pharm.Des.8，743-761；Vizioli，J.和Salzet，M.(2002)Trends Pharmacol.Sci.23，494-496；Brogden，K.等.(2003)Int.J.Antimicrob.Agents 22，465-478和Papagianni，M.(2003)Biotechnol.Adv.21，465-499)。
现在公认AMPs在宿主先天的防御中发挥重要作用。它们在一级结构和二级结构中显示出大量的异质性，但共有公共的特性例如两亲性特性和净正电荷。这些特征的出现形成它们溶细胞功能的基础。足够的资料表明AMPs通过动摇细胞膜的有序结构引起细胞死亡，尽管还不完全了解其详细的机理(参见新近的综述，例如，Epand，R.M.等.(1995)，Biopolymers 37，319-338；Epand，R.M.和Vogel，H.J.(1999)，Biochim.Biophys.Acta 1462，11-28；Gallo，R.L.和Huttner，K.M.(1998)，J.Invest Dermatol 111，739-743；Gennaro，R.等.(2002)，Curr.Pharm.Des.8，763-778；Hansen，J.N.(1994)，Crit Rev.Food Sci Nutr.34，69-93；Huang，H.W.(1999)，Novartis.Found.Symp.225，188-200；Hwang，P.M.和Vogel，H.J.(1998)，Biochem.Cell Biol.76，235-246；Lehrer，R.I.等.(1993)，Annu.Rev.Immunol.11，105-128；Matsuzaki，K.(1999)，Biochim.Biophys.Aeta 1462，1-10；Muller，F.M.等.(1999)，Mycoses 42 Suppl 2，77-82；Nissen-Meyer，J.和Nes，I.F.(1997)，Arch.Microbiol.167，67-77；Peschel，A.(2002)，Trends Microbiol.10，179-186；Sahl，H.G.和Bierbaum，G.(1998)，Annu.Rev.Microbiol.52，41-79；Shai，Y.(1995)，Trends Biochem.Sci.20，460-464；和Yeaman，M.R.和Yount，N.Y.(2003)，Pharmacol Rev.55，27-55)。据假定，膜结构紊乱导致小溶质(例如K+、氨基酸和ATP)渗漏，迅速地耗尽质子动力势，使细胞缺乏能量并引起某些生物合成过程的休止(Sahl，H.G.和Bierbaum，G.(1998)，Annu.Rev.Microbiol.52，41-79)。这种机理符合抗微生物活性不受手性中心相互作用介导的假说和，可因此通过防止发生多种已知诱导抗药性的机制显著地预防抗生素抗性。
除它们直接被充分证明的溶细胞(膜破裂)活性之外，AMPs在多种抗微生物领域也显示出多种有趣的生物活性。一些AMPs显示出激活天然免疫性细胞包括白细胞和单核细胞/巨噬细胞的杀微生物活性(Ammar，B.等.(1998)，Biochem.Biophys.Res.Commun.247，870-875；Salzet，M.(2002)Trends Immunol.23，283-284；Scott，M.G.等.(2000)，J.Immunol.165，3358-3365；和Scott，M.G.等.(2002)，J.Immunol.169，3883-3891)。多数阳离子肽赋予与脂多糖结合的活性，因此抑制炎性细胞因子产生和防御导致内毒素性休克的级联事件(Chappie，D.S.等.(1998)，Infect.Immun.66，2434-2440；Elsbach，P.和Weiss，J.(1998)，Curr.Opin.Immunol.10，45-49；Lee，W.J.等.(1998)，Infect.Immun.66，1421-1426；Giacometti，A.等.(2003)，J Chemother.15，129-133；Gough，M.等.(1996)，Infect.Immun.64，4922-4927；和Hancock，R.E.和Chapple，D.S.(1999)，Antimicrob.Agents Chemother.43，1317-1323)。将抗微生物基因引入植物染色体，通过表达肽使植物能抵抗病原体(Alan，A.R.等.(2004)，Plant Cell Rep.22，388-396；DeGray，G.等.(2001)，Plant Physiol 127，852-862；Fritig，B.，Heitz，T.和Legrand，M.(1998)，Curr.Opin.Immunol.10，16-22；Osusky，M.等.(2000)，Nat.Biotechnol.18，1162-1166；Osusky，M.等.(2004)，Transgenic Res.13，181-190；和Powell，W.A.等.(2000)，Lett.Appl.Microbiol.31，163-168)。
在最近20年内鉴定和研究的核糖体合成的抗微生物肽的基础上，开发了数千个重新设计的AMPs(Tossi，A.等.(2000)，Bioploymers 55，4-30)。这些重新设计的肽包含人工设计的序列，通过遗传工程或化学上的肽合成生产。发现不同的抗微生物肽(具有可变长度和序列)均以相似的浓度产生活性，这暗示其抗菌活性是一般机理而不是要求优选活性结构的特定机理(Shai，Y.(2002)，Bioploymers 66，236-248)。天然存在的肽和具有人工设计序列的新形成肽(或者通过人合成或者通过遗传工程在生物体表达)显示多种水平的抗菌和抗真菌活性以及溶解哺乳动物细胞的活性。作为结果，AMPs为引人注目地对准仿生学和拟肽(peptidomimetic)开发的靶子，因为在非自然特异序列的低聚物中将生物物理学特性的关键肽再生，在设法避开肽药物相关的限制时，推测上应该充分赋予其抗菌功效(Latham，P.W.(1999)，Nat.Biotechnol.17，755-757)。
设计新抗微生物肽的挑战之一取决于开发拟肽，其对细菌或真菌细胞将具有高度特异性，因而，将允许更好地理解肽溶解特异性(即细胞膜之间的差别)的机理。对AMPs的构效关系(SAR)研究一般涉及天然存在分子的系统修饰或重新设计的模型拟肽，可预期形成两亲性α-螺旋或β-折叠，并由多种方法测定结构和活性(Tossi，A.等.(2000)，Bioploymers 55，4-30)，如下 设计新肽最低限度(Minimalist)的方法是基于两亲性、α-螺旋或β-折叠结构的要求。使用的残基类型通常限于碱性、正电荷的氨基酸赖氨酸或精氨酸，和一种至三种疏水残基的丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸或色氨酸(Blazyk，J.等.(2001)，J.Biol.Chem.276，27899-27906；Epand，R.F.等.(2003)，Bioploymers 71，2-16；Hong，J.等.(1999)，Biochemistry 38，16963-16973；Jing，W.等.(2003)，J.Pept.Res.61，219-229；Ono，S.等.(1990)，Biochim.Biophys.Acta 1022，237-244；和Stark，M.等.(2002)，Antimicrob.AgentsChemother.46，3585-3590)。当这些方法可通向设计有效的抗微生物剂时，没有考虑可由进化选择AMPs序列的微妙，缺失它们可导致丧失特异性。
设计和合成两亲性AMPs序列模板方法一般包括在对照大量系列的天然相似物后提取序列模式。与常规的序列修饰方法相比，这种方法的优点是减少了为了获得有用的结果所需要合成肽的总数，而维持至少一些基于信息的序列。如同上文所述，在最低限度的方法中会遗失序列(Tiozzo，E.等.(1998)，Biochem.Biophys.Res.Commun.249，202-206)。
序列修饰的方法包括所有已知的和可接受的修饰天然肽的方法，例如通过除去、增加、或替换一个或多个残基、在N-或C-末端切去肽、或从不同的天然肽片段组合嵌合体的肽。这些修饰已被广泛地用于尤其在树蛙抗菌肽(dermaseptins)、蛾血素、爪蟾抗菌肽和蜂毒素的研究中(Scott，M.G.等.(2000)，J.Immunol.165，3358-3365；Balaban，N.等.(2004)，Antimicrob.Agents Chemother.48，2544-2550；Coote，P.J.等.(1998)，Antimicrob.Agents Chemother.42，2160-2170；Feder，R.等.(2000)，J.Biol.Chem.275，4230-4238；Gaidukov，L.等.(2003)，Biochemistry 42，12866-12874；Kustanovich，I.等.(2002)，J.Biol.Chem.277，16941-16951；Mor，A.和Nicolas，P.(1994)J.Biol.Chem.269，1934-1939；Mor，A.等.(1994)，J.Biol.Chem.269，31635-31641；Oh，D.等.(2000)，Biochemistry 39，11855-11864；Patrzykat，A.等.(2002)，Antimicrob.Agents Chemother.46，605-614；Piers，K.L.和Hancock，R.E.(1994)Mol.Microbiol.12，951-958；和Shepherd，C.M.等.(2003)，Biochemistry 370，233-243)。
上面所述的方法已经用于许多针对新AMPs的设计研究中。在这些研究中，使用α螺旋和/或β折叠诱导构造决(building blocks)、使用更柔韧的β氨基酸构造块、使用混合的D-和L-氨基酸序列和使用表面两性分子的芳香胺聚合物，均证明了诱导两亲性构象对AMPs生物活性的重要性。
抗微生物肽能与经典的抗生素产生协同作用，或许是通过使抗生素进入细菌细胞(Darveau，R.P.等.(1991)，Antimicrob.AgentsChemother.35，1153-1159；和Giacometti，A.等.(2000)，Diagn.Microbiol.Infect.Dis.38，115-118)。其它潜在的用途包括食物防腐(Brul，S.和Coote，P.(1999)，Int.J.Food Microbiol.50，1-17；Yaron，S.，Rydlo，T.等.(2003)，Peptides 24，1815-1821；Appending P.和Hotchkiss，J.H.(2000)，J.Food Prot.63，889-893；和Johnsen，L.等.(2000)，Appl.Environ.Microbiol.66，4798-4802)、用于探测细菌或真菌感染位置的成像探针(Welling，M.M.等.(2000)，Eur.J.Nucl.Med.27，292-301；Knight，L.C.(2003)，Q.J.Nucl.Med.47，279-291；和Lupetti，A.等.(2003)，Lancet Infect.Dis.3，223-229)、抗肿瘤活性(Baker，M.A.等.(1993)，Cancer Res.53，3052-3057；Jacob，L.和Zasloff，M.(1994)，Ciba Found.Symp.186，197-216；Johnstone，S.A.等.(2000)，Anticancer Drug Des 15，151-160；Moore，A.J.等.(1994)，Pept.Res.7，265-269；和Papo，N.和Shai，Y.(2003)，Biochemistry 42，9346-9354)、促有丝分裂活性(Aarbiou，J.等.(2002)，J.Leukoc.Biol.72，167-174；Murphy，C.J.等.(1993)，J.Cell Physiol 155，408-413；和Gudmundsson，G.H.和Agerberth，B.(1999)，J.Immunol.Methods232，45-54)和医学/外科装置的衬料(Haynie，S.L.等.(1995)，Antimicrob.Agents Chemother.39，301-307)。
然而，当潜在的AMPs作为新的治疗剂被众所公认时，目前已知的AMPs的使用受到缺乏足够的特异性和任意的系统毒性的限制(英国国会上议院，Science and Technology 7th ReportResistance toAntibiotics and Other Antimicrobial Agents，HL Paper 81-II，session(1997-98)；和Alan，A.R.等.(2004)，Plant Cell Rep.22，388-396)。因此，明确地存在开发新的具有改良的特异性和毒性性质的抗微生物肽的需要。此外，虽然肽被公认是有希望的治疗和抗微生物剂，它们的使用受到它们在体内和体外不稳定性和不好的药代动力学性质的严格限制。肽和多肽在氧化的和酸性的环境中容易被降解，因此，一般要求静脉注射给药(为了避免例如胃肠道中降解)。肽在血液系统中被蛋白水解酶进一步降解并迅速地被循环清除。而且，特别地由于肽相对的高分子量和/或缺乏特异转运系统，肽口服后通常具有吸收差的特征。此外，肽具有高度可溶性的特征并因此不能越过生物学屏障例如细胞膜和血脑屏障，但却显示出经肝和肾的快速排泄。肽的疗效进一步地受到其高度柔性的限制，这是由于结合引起熵大量减少和相当的热力学能量消耗抵消它们的受体亲和力。此外，肽为热和湿度敏感的物质，因此它们的维持要求昂贵的管理、给药复合物和不便的模式、和高成本的生产和维护。上述缺点妨碍肽和多肽作为有效药物的使用，并激励寻找时常涉及拟肽化合物的替代物。
拟肽化合物为改良的多肽，当与母体肽相比时，其被设计为在体内和体外均具有优良的稳定性，和仍有至少同样的受体亲和力。为了设计有效的拟肽，因此要求最大详细限度三维地了解与预期靶点的相互作用。
试图实现上述目标的一个方法为利用合成组合文库(SCLs)，其是一种已知快速获得最佳类型活性化合物的强大工具。因此，许多从短肽至小杂环分子的新抗微生物化合物已经由SCLs鉴定出(Blondelle，S.E.和Lohner，K.(2000)，Biopolymers 55，74-87)。
在许多生物体中发现了一些天然存在的改良肽家族，其显示出抗微生物强大的活性。已经提议这些化合物和其有效的化学变体，作为领向普遍地解决创立没有天然AMPs相关缺点的抗微生物化合物的挑战。
因此，例如，在多种微生物中发现了在N端具有亲脂酰基链特征的天然存在的短抗微生物肽(Bassarello，C.等.(2004)，J.Nat.Prod.61，811-816；Peggion，C，等(2003)，J.Pept.Sci.9，679-689；和Toniolo，C.等.(2001)，Cell Mol.Life Sci.58，1179-1188)。因此，大量应用AMPs酰化技术以赋予AMPs具有改良的抗微生物特性(Avrahami，D.等.(2001)，Biochemistry 40，12591-12603；Avrahami，D.和Shai，Y.(2002)，Biochemistry 41，2254-2263；Chicharro，C.等.(2001)，Antimicrob.Agents Chemother.45，2441-2449；Chu-Kung，A.F.等.(2004)，Bioconjug.Chem.15，530-535；Efron，L.等.(2002)，J.Biol.Chem.277，24067-24072；Lockwood，N.A.等.(2004)，Biochem.J.378，93-103；Mak，P.等.(2003)，Int.J.Antimicrob.Agents 21，13-19；和Wakabayashi，H.等.(1999)，Antimicrob.Agents Chemother.43，1267-1269)。然而，一些研究指出将烃链连至肽上仅导致末端增加该脂肽对膜的亲和力(Epand，R.M.(1997)，Biopolymers 43，15-24)。
一个能暗指主要目标的AMPs家族为dermaseptins家族。Dermaseptins是从叶水蛙(Phyllomedusa)种类的多种树蛙皮肤中分离出的肽(Brand，G.D.等.(2002)，J.Biol.Chem.277，49332-49340；Charpentier，S.等.(1998)，J.Biol.Chem.273，14690-14697；Mor，A.等.(1991)，Biochemistry 30，8824-8830；Mor，A.等.(1994)，Biochemistry 33，6642-6650；Mor，A.和Nicolas，P.(1994)，Eur.J.Biochem.219，145-154；和 Wechselberger，C.(1998)，Biochim.Biophys.Aeta 1388，279-283)。这些在结构上和机能上地相关的阳离子肽，一般具有24-34氨基酸残基。据发现，Dermaseptins在体外从数秒至数分钟内产生快速溶细胞的活性，对抗多种微生物包括病毒、细菌、原生动物、酵母和丝状真菌(Coote，P.J.等.(1998)，Antimicrob.Agents Chemother.42，2160-2170；Mor，A.和Nicolas，P.(1994)，J.Biol.Chem.269，1934-1939；Mor，A.等.(1994J，J.Biol.Chem.269，31635-31641；Mor，A.和Nicolas，P.(1994)，Eur.J.Biochem.219，145-154；Belaid，A.等.(2002)，J.Med.Virol.66，229-234；De Lucca，A.J.等.(1998)，Med.Mycol.36，291-298；Hernandez，C.等.(1992)，Eur.J.Cell Biol.59，414-424；和Mor，A.等.(1991)，J.Mycol.Med 1，5-10)以及相对难接近的病原体例如细胞内寄生物(Efron，L.等.(2002)，J.Biol.Chem.277，24067-24072；Dagan，A.等.(2002)，Antimicrob.Agents Chemother.46，1059-1066；Ghosh，J.K.等.(1997)，J.Biol.Chem.272，31609-31616；和Krugliak，M.等.(2000)，Antimicrob.Agents Chemother.44，2442-2451)。
因为以结构和生物学性质的观点，蛙皮抗菌肽显示的生物多样性存在于非常大组的抗微生物肽中，它们用作一般的模型系统，用于了解阳离子抗微生物肽的功能。
已知28-残基肽dermaseptin S4热切地结合生物膜，发挥快速溶细胞活性，对抗多种病原体以及对抗红细胞(Mor，A.等.(1994)，J.Biol.Chem.269(50)31635-41)。
在寻找S4的活性衍生物(拟肽)中，制备了其中第四和第二十位置的氨基酸残基被赖氨酸残基取代的28个-残基衍生物(称作K4K20-S4)、和其中第四位置的氨基酸残基被赖氨酸残基取代的16和13个-残基的两种短衍生物(分别称作K4-S4(1-16)和K4-S4(1-13))，并测试了它们的抑制效果(Feder，R.等(2000)，J.Biol.Chem.275，4230-4238)。对于66个临床分离试验中90％的这些衍生物的最小抑菌浓度(MICs)(即金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和大肠杆菌的MIC90)，随着种类不同在2至8μg/ml之间变化，凭此发现了13部分的衍生物K4-S4(1-13)与相似活性衍生物的两种被证实为抗微生物肽家族的爪蟾抗菌肽和内源性抗微生物多肽(protegrin)相比，在与人红细胞一起孵化时具有显著更少的溶血作用(Fahrner，R.L.等.(1996)，Chem.Biol.3(7)543-50；Zasloff，M.等.(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(3)910-3；Yang L.等.(2000)，Biophys.J.，79 2002-2009)。另外的研究进一步证实短的赖氨酸富集的S4衍生物为有希望的抗微生物剂，具有减少毒性的特征并在其预先接触受试者后也显示有效。
将切去C末端的13部分的衍S4生物K4-S4(1-13)的N末端酰化也导致减少的溶血活性，凭此有几个衍生物，例如它的氨基庚酰衍生物，对细胞内寄生物显示出有效的和选择性的活性，即增加抗寄生物的效力和减少溶血性。这些研究表明增加抗微生物肽的疏水性能提高其特异性，假定是通过允许这样的AMPs特别地作用于细胞内寄生物的膜并因此支持根据脂肽越过宿主细胞膜和选择性地破坏寄生物膜所提出的机理。
全部地，从体外和体内试验收集的资料表明一些蛙皮抗菌肽衍生物能用于治疗多种微生物相关的疾病包括多重耐药的病原体所引起的感染。据发现这些药剂高度有效，并在其给药中不发展抗药性。然而，这些药剂的治疗用途仍然受到如上文中所讨论的其体内和体外不稳定性、不好的药代动力学性质、和肽的其它不利特性的限制。
总之，大多数目前已知的抗微生物肽和拟肽作为治疗药剂受到实用性限制，尽管其具有有希望的抗微生物活性。依然存在对具有AMP特性但没有AMPs相关局限性的化合物的需要，为了实现增强特异性并因此增强临床选择性而提供化学和代谢稳定的活性化合物的概念已得到广泛的公认。
因此广泛公认地需要(将具有非常有益的优点)新的、代谢稳定的、无毒的和低本高效的、没有上述局限性的抗微生物剂。
发明概述 本发明现已设计并成功地制备了新种类的聚合化合物，其以正电荷氨基酸残基和疏水部分为基础。发现了这些新的聚合物作为选择性的抗微生物剂高度有效，而没有毒性和诱导的抗药性。
因此，根据本发明的一个方面提供聚合物，其包括两个或更多个氨基酸残基和一个或多个疏水部分残基，其中一个或多个疏水部分残基与至少两个氨基酸残基经由一个氨基酸残基的N-α和另一个氨基酸残基的C-α以共价键连接。
根据本发明下述优选实施方案中的进一步特征，该聚合物具有抗微生物活性。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该聚合物能够有选择地破坏至少一部分致病微生物。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该病原微生物选自原核生物、真细菌(eubacterium)、古细菌(archaebacterium)、真核生物、醇母、真菌、藻类、原生生物(protozon)和寄生虫。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该聚合物包括至少两个疏水部分残基，其中一个或多个疏水部分残基在一个氨基酸残基的N端与氨基酸残基的N-α和/或在C端与另一个氨基酸残基的C-α连接。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该聚合物包括两个或更多个疏水部分残基，其中一个或多个疏水部分残基与该聚合物氨基酸残基的侧链相连接。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，一个或多个氨基酸残基为正电荷氨基酸残基。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，正电荷氨基酸残基选自组氨酸残基、赖氨酸残基、鸟氨酸残基和精氨酸残基。
根据本发明还进一步的特征，一个或多个疏水部分残基与一个或多个氨基酸残基经由肽键连接。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，一个或多个疏水部分残基与两个氨基酸残基经由肽键连接。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，一个或多个疏水部分残基与各自的氨基酸残基经由肽键连接。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，一个或多个疏水部分残基与氨基酸残基的N-α经由肽键连接。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，一个或多个疏水部分残基与氨基酸残基的C-α经由肽键连接。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，一个或多个疏水部分在其一个末端具有羧基基团和在其另一个末端具有胺基团(aminegroup)。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该聚合物包括2至50个氨基酸残基，优选地2至12个氨基酸残基和更优选地2至8个氨基酸残基。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该聚合物包括1至50个疏水部分残基，优选地1至12个疏水部分残基和更优选1至8个疏水部分残基。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该疏水部分残基包括一个或多个具有4至30个碳原子的烃链。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该疏水部分残基包括一个或多个脂肪酸残基，其选自未分支的饱和脂肪酸残基、分支的饱和脂肪酸残基、未分支的不饱和脂肪酸残基、分支的不饱和脂肪酸残基和它们的任何组合，脂肪酸残基具有4至30个碳原子。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该脂肪酸残基选自丁酸残基、辛酸残基和月桂酸残基。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，一个或多个疏水部分是ω氨基脂肪酸残基。该ω氨基脂肪酸残基选自4-氨基丁酸、6-氨基已酸、8-氨基辛酸、10-氨基癸酸、12-氨基月桂酸、14-氨基肉豆蔻酸、16-氨基棕榈酸、18-氨基硬脂酸、18-氨基油酸、16-氨基棕榈油酸、18-氨基亚油酸、18-氨基亚麻酸和20-氨基花生四烯酸。优选地，ω氨基脂肪酸残基选自4-氨基丁酸、8-氨基辛酸和12-氨基月桂酸。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该聚合物所有的氨基酸残基为正电荷氨基酸残基，例如赖氨酸残基、组氨酸残基、鸟氨酸残基、精氨酸残基和它们的任何组合。
根据本发明下述优选实施方案中再进一步的特征，该聚合物进一步包括一种或多种与其连接的活性剂。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该活性剂或者在N端经由氨基酸残基的N-α和/或在C端经由氨基酸残基的C-α与氨基酸残基的侧链相连，和/或与一个或多个该聚合物疏水部分的残基相连。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该活性剂为标记试剂，其选自荧光试剂、放射性试剂、磁性试剂、发色团、磷光性试剂和重金属簇。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该活性剂包括至少一种治疗活性剂，其选自激动剂残基(agonist residue)、氨基酸残基、止痛剂残基、拮抗剂残基、抗生素残基、抗体残基、抗抑郁剂、抗原残基、抗组胺残基、抗高血压剂、抗炎药物残基、抗代谢剂残基、抗微生物剂残基、抗氧化剂残基、抗增殖药物残基、反义(antisense)残基、化疗药物残基、辅助因子残基、细胞因子残基、药物残基、酶残基、生长因子残基、肝素残基、激素残基、免疫球蛋白残基、抑制剂残基、配体残基、核苷酸残基、寡聚核苷酸残基、肽残基、磷脂残基、前列腺素残基、蛋白质残基、毒素残基、维生素残基和它们的任何组合。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该聚合物能够将一种或多种活性剂(例如标记试剂或治疗活性剂)递送给至少一部分如本文所述的致病微生物细胞。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，本文所述的聚合物能够由通式I表示 X-W0-[A1-Z1-D1]-W1-[A2-Z2-D2]-W2-...[An-Zn-Dn]-Wn-Y 式I 其中 n为2至50、优选为2至12和更优选为2至8的整数； A1，A2，...，An各自独立地为氨基酸残基，优选为正电荷氨基酸残基，和更优选所有的A1，A2，...，An为如上文所述的正电荷氨基酸残基，例如组氨酸残基、赖氨酸残基、鸟氨酸残基和精氨酸残基； D1，D2，...，Dn各自独立地为疏水部分残基(如本文所述)或缺失，提供至少一个这样的疏水部分残基存在于该聚合物中，和优选至少一个该疏水部分残基为ω氨基脂肪酸残基； Z1，Z2，...，Zn和W0，W1，W2，...，Wn各自独立地为连接氨基酸残基与疏水部分残基的连接部分或缺失，优选至少一个连接部分为肽键和最优选所有的连接部分为肽键； X和Y可以各自独立地为氢、氨基酸残基、疏水部分残基或具有通式I结构的其它聚合物。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该聚合物进一步包括如本文所述的一种或多种活性剂，其与一个或多个X、Y、W0、A1、An和/或者Wn连接。
根据本发明的另一个方面提供结合物，其包括氨基酸残基和与氨基酸残基的N-α或C-α连接的疏水部分残基，所设计的疏水部分残基能够与另外氨基酸残基的N-α或C-α形成键。
根据本发明下述优选实施方案中的进一步特征，该疏水部分残基经肽键与氨基酸残基的N-α或C-α连接。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该疏水部分在其一个末端具有羧基基团和在其另一个末端具有胺基团和还包括如本文所述的烃链。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该疏水部分包括如本文所述的脂肪酸残基。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该疏水部分为如本文所述的ω-氨基脂肪酸残基。
根据本发明的再一个方面提供制备上文所述的结合物的方法，该方法包含提供氨基酸；提供疏水部分，其具有能够与氨基酸残基的N-α起反应的第一功能团和/或能够与氨基酸残基的C-α起反应的第二功能团；将该疏水部分的第一功能团经由所述氨基酸残基的N-α与该氨基酸连接；或将该疏水部分的第二功能团经由氨基酸残基的C-α与该氨基酸连接。优选地该疏水部分经由肽键与该氨基酸连接。
根据如下所述的发明优选实施方案中的进一步的特征，氨基酸为正电荷氨基的例如组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该疏水部分在其一个末端具有羧基基团，在其另一个末端具有胺基团和烃链，如同本文所述。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该疏水部分包括如本文所述的脂肪酸残基。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该疏水部分为如本文所述的ω-氨基脂肪酸残基。
根据本发明的还一个方面提供药物组合物，其包括作为活性成分的本文所述的本发明聚合物和药学上可接受的载体。
根据本发明下述优选实施方案中的进一步特征，药物组合物包装在包装材料中并经印刷标识(在所述包装材料中或上)，用于治疗致病微生物相关的医学疾病，致病微生物例如原核生物、真细菌、古细菌、真核生物、醇母、真菌、藻类、原生生物和寄生虫。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，药物组合物进一步包括一种或多种另外的如本文所述的治疗活性剂，由此优选地，治疗活性剂包括抗生素。
根据本发明的另一个方面，提供治疗如本文所述致病微生物相关的医学疾病的方法，该方法包括给需要它的受治疗者施用治疗有效量的本文所述的聚合物。
根据本发明下述优选实施方案中的进一步特征，施用是经口服、直肠、静脉内、局部、鼻内、皮内、经皮肤、皮下、肌内、腹膜内(intrperitoneally)或鞘内导管(intrathecal catheter)实现。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该方法进一步包括给该受治疗者使用一种或多种如本文所述的治疗活性剂，优选抗生素。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，本发明聚合物以本身或作为药物组合物的一部分施用；药物组合物进一步包括如本文所述的药学上可接受的载体。
根据本发明的又一个方面，提供本文所述的聚合物在治疗致病微生物相关的医学疾病的用途。该聚合物可任选地与另外的治疗活性剂组合使用。
根据本发明的再一个方面，提供本文所述的聚合物用于制备治疗致病微生物相关医学疾病的药物的用途。
根据本发明的另外一个方面，提供医学装置，其包括本发明的聚合物和配置用于递送聚合物至受治疗者身体部位的递送系统。
根据本发明下述优选实施方案中再进一步的特征，该聚合物组成药物组合物的一部分，和药物组合物进一步包括药学上可接受的载体。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，递送是经吸入实现的，和递送系统选自定量吸入器、呼吸器、喷雾吸入器、干粉吸入装置、电加热器、蒸发器、喷雾器和烟雾发生器。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，递送是经皮肤实现的，和递送系统选自橡皮膏和皮肤贴剂。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，递送是经局部实现的，和递送系统选自橡皮膏条、绷带、橡皮膏、伤口敷料和皮肤贴剂。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，递送是经身体器官内植入医学装置实现的。优选地，递送系统进一步包括生物相容的基质，其又包括生物可降解的聚合物和进一步包括缓释载体。
根据本发明的又另外一个方面，提供食品防腐剂，其包括有效量的本发明聚合物，和优选地进一步包括可食用的载体。
根据本发明的还一个方面，提供用于探测如本文所述致病微生物的成像探针(imaging probe)，其包括如本文所述的聚合物，和与其连接的一种或多种如本文所述的标记试剂。
根据本发明下述优选实施方案中进一步的特征，该标记试剂与氨基酸残基侧链、该聚合物的C端和/或N端和/或本发明聚合物的一个疏水残基连接。
本发明通过新种类的抗微生物聚合物成功地解决了目前已知结构的缺陷，其组合了治疗活性抗微生物肽的优点，例如高效和特异性，而不具有肽的缺点。
除非另外规定，本文所用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常了解的同样意义。虽然与本文所述的相似或相同方法和材料能用于实践或试验本发明，以下描述了适当的方法和材料。万一冲突，将参照专利说明书包括定义。另外，材料、方法、和实例只用作说明，而不打算受其限制。
附图简述 此处仅以实施例的方式，参照附图来描述本发明。对于具体参照详细附图，应强调所显示的细节是以实施例的方式和仅用于说明性讨论本发明优选实施方案的目的，并假定相信这是描述本发明原理和概念方面最有益和容易了解的原因来展示细节。在这点上，不打算安排比必需基本了解本发明更详细的方式，来显示本发明结构的细节，采用附图描述使本领域技术人员显而易见本发明的数个形式可以具体实施。
本附图中

图1展示累积的条线图，通过在反相HPLC柱上聚合物被洗脱时流动相乙腈百分数的标度上，标记对抗大肠杆菌(红色条)、绿脓假单胞菌(黄色条)、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(蓝色条)和蜡样芽胞杆菌(绿色条)显示显著的微生物活性(MIC值小于50μM)的聚合物，证明了根据本发明的示例性聚合物的抗微生物活性和疏水性之间高度相关； 图2展示累积的条线图，通过在代表从+9至+1净正电荷的列(bin)上，标记对抗大肠杆菌(红色条)、绿脓假单胞菌(黄色条)、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(蓝色条)和蜡样芽胞杆菌(绿色条)显示出显著的微生物活性(MIC值小于50μM)的聚合物，证明了根据本发明的示例性聚合物的抗微生物活性和净正电荷之间缺乏相关性； 图3展示比较的曲线图，通过在37℃下LB介质中指定的孵化期后，进行菌落形成单位(CFU)计数并比较零(对照)、3和6倍的最小抑菌浓度(MIC)值(3.1μM)的剂量依赖性，证明了根据本发明的示例性聚合物C12K(NC8K)5NH2对聚合物存在下孵化的大肠杆菌的动力学杀菌效果； 图4采用指定介质中的100μM的聚合物浓度(2mM的脂质体浓度)所表达的平均残基摩尔椭圆率，展示根据本发明的两个示例性抗微生物聚合物C12K(NC8K)5NH2和C12K(NC8K)7NH2，的圆二色光谱，并比较15-残基对照肽，酰化dermaseptin S4衍生物(数据代表三次单独记录值的平均值)； 图5(a-b)展示条线图，与暴露给经典抗生素四环素、庆大霉素和环丙沙星比较时，通过将连续10代细菌暴露给溶胞以下(sub-lytic)浓度的K(NC12K)3NH2和C12K(NC8K)5NH2，在大肠杆菌上测量MIC水平演变(图5a)，和在与暴露给两类抗生素利福平和四环素比较时，将连续15代暴露细菌给溶胞以下(sub-lytic)浓度的C12KKNC12KNH2，在耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌测量MIC水平演变(图5b)，证明了根据本发明的示例性聚合物不引起抗药性的结果(MIC的相对值为由指定次代培养物获得的MIC与同时从前代对照孔(没有抗微生物剂培养的孔)中采集细菌所得到测定的MIC的标准化比值； 图6展示通过表面等离子共振(SPR)测量得到的联合和解离曲线(结合率)，证明根据本发明的示例性聚合物C12K(NC8K)5NH2的多种剂量(0.21、0.42、0.84、1.67、3.35μg)对模型膜的膜结合性质(Kapp是假定为2步骤模型计算产生的结合常数)； 图7展示UV照亮的1％琼脂糖凝胶电泳的照片，将聚合物在室温下使用200纳克质粒以指定的DNA/聚合物比值(w∶w)孵化30分钟后，通过DNA迟缓测定法测量，证明根据本发明的示例性聚合物C12KKNC12KNH2、K(NC4K)7NH2和C12K(NC8K)5NH2的DNA结合性质(在聚合物缺失下的质粒pUC19的正常迁移显示在最左边的泳道)； 图8展示条线图，证明通过SPR测量的根据本发明的表示为KNC8KNH2、K(NC8K)2NH2、K(NC8K)3NH2、K(NC8K)6NH2、KNC12KNH2、K(NC12K)2NH2、和K(NC12K)3NH2的示例性聚合物对脂多糖的结合，其中在用LPS孵化后聚合物对脂质体的较弱结合证实了聚合物与LPS的结合； 图9展示比较的曲线图，当与已知抗微生物活性的肽IB-367(白色圆圈)和作为对照的载体缓冲液(白色三角形)比较时，以每ml的CFU的对数单位对孵化时间证明根据本发明的示例性聚合物C8K(NC8K)7NH2抗人唾液中的微生物群的抗微生物活性(黑色圆圈)； 图10展示比较的曲线图，通过在阶期依赖性效果上显示将引起疟疾的寄生虫暴露给聚合物的时间对镰状疟原虫寄生虫成活力(耐氯喹FCR3菌株对氯喹敏感NF54菌株)的效果，证明根据本发明的示例性聚合物C12K(NC12K)3NH2的抗疟活性；和 图11展示比较的曲线图，通过显示在寄生虫发育不同阶段用聚合物治疗时间对寄生虫成活的效果，证明根据本发明的示例性聚合物C12KNC8KNH2的抗疟活性。
优选实施方案的描述 本发明是新种类的聚合物抗微生物剂，其被设计为发挥抗微生物活性，同时具有稳定、无毒和避免对其发生抗药性，和因此能有益地用于治疗致病微生物相关的多种医学疾病。本发明还是包含它的药物组合物、医学装置和食品防腐剂。本发明的抗微生物聚合物优选地包括一个或多个正电荷氨基酸残基和一个或疏水部分残基，以一个对另一个的连接。
参照图形和附随的描述可以更好地了解本发明的原理和操作。
在详细地解释本发明的至少一个实施方案之前，应当了解本发明的应用不限于下述描述所提出的或实施例所举例说明的细节。本发明可以是其它的实施方案，或以多种途径实践或执行。也应当了解，本文应用的语词和术语是用于描述的目的，不应该被视为限制。
正如上述讨论，现代经典的抗生素例如四环素、庆大霉素、环丙沙星和甲氧西林的使用，数年来受到对其发生抗药性的严格限制。因此，已引导广泛的研究于寻找防止发生诱导抗药性的新抗微生物剂中。
正如上述进一步的讨论，天然存在的抗微生物肽(AMPs)是格外有效的抗微生物剂，但是作为药物用于治疗用途，却受到肽制品、维护和临床施用方式相关的限制。
基于数年对抗微生物肽性质累积的知识和其使用相关的限制，本发明者假定，为了实现新种类的抗微生物剂，没有经典抗生素诱导抗药性的缺点和那些AMPs的缺点，AMPs的三个关键属性必须维持柔韧的结构、两亲性特性和净正电荷。
构思本发明时，想像柔韧聚合的结构将用于避免在靶微生物中发生抗药性目的。进一步想像如下文所定义的氨基酸的使用，能用作聚合物以及净正电荷来源的主要成分。
进一步构思本发明时，猜测回避纯氨基酸多肽结构将不仅解决多肽作为药物用途的生产和维持的限制问题，而且减轻多肽作为药物施用隔开的限制缺陷。因此，想像该想像聚合物的预期两亲性特性可起于非氨基酸的疏水部分等，例如但不限于脂肪酸。
当将本发明回到实践时，如同随后实施例部分中所证明的，本发明者开发并成功生产了新种类的聚合物，其显示出呈现高度的抗微生物活性、低诱导抗药性、非溶血性、对血浆蛋白酶的抵抗性和对微生物膜的高度亲和力。
进一步构思本发明时，想像活性剂结合至聚合物结构，例如标记试剂和/或治疗活性剂，将组合本发明聚合物对微生物细胞的亲和力和另外活性剂的效用。在活性剂为标记试剂的情形中，该组合将协助定位和诊断宿主中微生物生长的浓度；在活性剂为治疗活性剂的情形中，起因于治疗活性剂和抗微生物聚合物结构的双重疗效，可以实现协同作用的疗效。此外，可以实现治疗试剂的定向递送。
因此，根据本发明的一个方面提供具有抗微生物活性聚合物，其包含多个(例如两个或更多个)氨基酸残基和一个或多个疏水部分残基，其中至少一个疏水部分残基以共价键经由一个氨基酸残基的N-α和/或另一个氨基酸残基的C-α与至少两个氨基酸残基连接。所以，该聚合物为被一个或多个疏水部分残基间断的氨基酸残基序列所形成的链。
可以理解本文自始至终使用的术语“氨基酸”或“氨基酸”包括20个遗传密码氨基酸；体内翻译后常修改的那些氨基酸包括例如羟基脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；和其它罕见的氨基酸包括但不限于2-氨基己二酸、羟基赖氨酸、异锁链素、正缬氨酸、正白氨酸和鸟氨酸。此外，术语“氨基酸”包括D-和L-氨基酸和其它非天然存在的氨基酸。
下表1和2列出可用于本发明的遗传编码氨基酸(表1)和非常规的/修改的氨基酸的非限制性实例(表2)。
表1 表2 当本文使用时，短语“疏水部分”是描述对水具有较小的或没有亲和力的化学部分，说得更精确些，其在水中具有低的或没有溶解性和在其它的极性溶剂中通常具有低的或没有溶解性。用于本发明上下文中适当的示例性疏水部分，包括但没有限于为主要由一个或多个烃链和/或芳环和一个或多个官能团组成的疏水部分，该官能团可以是非疏水性的，但不改变该疏水部分的整体疏水性。代表性的实例包括但没有限于为脂肪酸、疏水性氨基酸(具有疏水侧链的氨基酸)、烷烃、烯烃和芳基等(这些术语如同本文所定义)，和它们的任何组合。
当本文使用时，短语“化学部分”是描述化合物的残基，其通常具有某些官能度。如本领域众所公认，术语“残基”本文是指分子的主要部分，其与别的分子共价键连接。
当本文使用时，短语“官能团”是描述化学基团，其能够经历通常导致键形成的化学反应。根据本发明该键优选为共价键。导致键形成的化学反应包括，例如亲核和亲电子取代反应、亲核和亲电子加成反应、加成消除反应、环化加成反应、重排反应和任何其它已知的涉及官能团的有机反应。
根据本发明的聚合物可具有一个或多个疏水部分残基，凭此至少一个疏水部分残基在其一端与一个氨基酸和在其另一端与另一个氨基酸残基连接，和另一个疏水部分残基通过与任一个末端即末端氨基酸残基的N-α和/或末端氨基酸残基的C-α连接可以延长聚合物链。任选地，第二个疏水部分可以与该聚合物氨基酸残基的侧链连接。
根据本发明的聚合物，优选地包括2至50个氨基酸残基，更优选地该聚合物包括2至12个氨基酸残基和更优选地2至8个氨基酸残基。
通过聚合物中具有的一个或多个正电荷氨基酸残基提供聚合物的净正电荷，任选地除以自由形态存在时的正电荷N端胺以外。
本发明的一个优选实施方案中，聚合物的所有氨基酸残基为正电荷氨基酸残基。根据该实施方案的示例性聚合物包括多个赖氨酸残基。
当本文使用时，短语“正电荷氨基酸”是描述具有侧链pKa值大于7的亲水性氨基酸，即碱性氨基酸。碱性氨基酸在生理pH时由于水合氢离子的关系，通常具有正电荷的侧链。天然存在的(遗传学上编码的)碱性氨基酸包括赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)和组氨酸(His，H)，而非天然(非遗传学上编码的，或非标准的)碱性氨基酸包括，例如鸟氨酸、2，3，-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸、2，5，6-三氨基己酸、2-氨基-4-胍基丁酸、和高精氨酸。
本发明的一个实施方案中，根据该实施方案聚合物中的每个成分与其他成分优选通过肽键连接。
当本文使用时，术语“肽键”是指酰胺基，即-(C＝O)NH-基团，其通常是通过羧基和胺基(这些术语如同本文所定义)之间的缩合反应形成。
然而，该实施方案的聚合物可以有其它的键，连接聚合物结构中的多种成分。当在体内时，此非肽键可以使聚合物更稳定，或更能渗入细胞中。因此，聚合物内的肽键(-(C＝O)NH-)可以被替换，例如被N-甲基酰胺键(-(C＝O)NCH3-)、酯键(-C(R)H-C(＝O)-O-C(R)-N-)、酮亚甲基键(ketomethylen bonds)(-(C＝O)CH2-)、氮杂键(azabonds)(-NH-N(R)-C(＝O)-)，(其中R为任何烷基，例如甲基)，甲氨键(carba bonds)(-CH2-NH-)、羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯双键(-CH＝CH-)、逆酰胺键(-NH-(C＝O)-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-C(＝O)-)，其中R为天然存在碳原子上的“正常的”侧链。这些修饰沿着聚合物链以任何键发生，甚至同时发生若干(2-3)次。
在优选的实施方案中，聚合物中氨基酸残基和疏水部分残基相互连接的所有的键为肽键。例如在一个实施方案中，氨基酸残基通过肽键连接疏水部分残基，该疏水部分残基依次又与第二个氨基酸残基通过另一个肽键连接，从而形成聚合物。在另一个实例中，以前实例的聚合物通过第二个疏水部分残基延长，该残基经由肽键等与任何一个N-或C-端连接。
根据本发明的聚合物，优选地包括1至50个疏水部分残基。更优选地，该聚合物包括1至12个疏水部分残基和更优选1至8个疏水部分残基。
本发明上下文中此和其它方面使用的疏水部分优选具有一个或多个烃链，并能够与聚合物的一个或两个其它成分(例如，一个或两个氨基酸残基和另一个疏水部分)经由两个肽键连接。因此，这些部分优选在烃链末端具有羧基基团(用于连接自由胺基团)和在其另一端具有胺基(用于连接羧酸基团)。
在这样的疏水部分中连接羧基和胺基的烃链优选具有4至30个碳原子。
本发明优选的实施方案中，疏水部分残基为脂肪酸残基，其中烃链可以是未分支和饱和的、分支和饱和的、未分支和未饱和的、或分支和未饱和的。更优选地，脂肪酸残基的烃链是具有4至30个碳原子的未分支和饱和的链。此脂肪酸残基的非限制性实例为丁酸残基、辛酸残基和月桂酸残基。
更优选实施方案中，脂肪酸残基在烃链的末尾碳(就羧酸基团而论)上有胺。本文中此脂肪酸残基是指ω氨基脂肪酸残基。再之，ω氨基脂肪酸残基的烃链可以具有4至30个碳原子。
该ω氨基脂肪酸非限制的实例为4-氨基丁酸、6-氨基已酸、8-氨基辛酸、10-氨基癸酸、12-氨基月桂酸、14-氨基肉豆蔻酸、16-氨基棕榈酸、18-氨基硬脂酸、18-氨基油酸、16-氨基棕榈油酸、18-氨基亚油酸、18-氨基亚麻酸和20-氨基花生四烯酸。
根据本发明的优选实施方案，疏水部分选自4-氨基丁酸、8-氨基辛酸和12-氨基月桂酸。
本文所述的聚合物能够共同地由以下的通式I表示 X-W0-[A1-Z1-D1]-W1-[A2-Z2-D2]-W2-...[An-Zn-Dn]-Wn-Y 式I 其中 n为2至50、优选为2至12和更优选为2至8的整数； A1，A2，...，An各自独立地为氨基酸残基，优选为正电荷氨基酸残基，和更优选所有的A1，A2，...，An为如上文所述的正电荷氨基酸残基，例如组氨酸残基、赖氨酸残基、鸟氨酸残基和精氨酸残基，和最优选所有的正电荷氨基酸残基为赖氨酸残基； D1，D2，...，Dn各自独立地为疏水部分残基(如本文所定义和所述)或缺失，提供至少一个这样的疏水部分残基存在于该聚合物中，和优选至少一个该疏水部分残基为ω氨基脂肪酸残基； 连接各个单体的残基为连接部分，表示为Z1，Z2，...，Zn和W0，W1，W2，...，Wn，各自独立地连接氨基酸残基与疏水部分残基或缺失，优选至少一个连接部分为肽键和最优选所有的连接部分为肽键； 聚合物的端，表示为X和Y，可以各自独立地为氢、氨基酸残基、疏水部分残基或是通式I的其它聚合物。
如上述讨论，一个或多个疏水部分残基可以连接至聚合物的一个或多个氨基酸残基的侧链，即充当主聚合物的分支。
可以容易地合成根据本实施方案的聚合物。例如其中连接部分为肽键并因此在此方面类似于天然和合成肽的聚合物，能通过肽合成领域已知的经典方法制备。这样的方法包括，例如标准固相技术。该标准方法包括专用固相合成、部分固相合成方法、片段缩合、经典溶解合成、和甚至用重组DNA技术。参见，例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc，852149(1963)，在此引入作为参考。固相肽合成程序是本领域众所周知的，并由John Morrow Stewart和Janis Dillaha Young进一步描述Solid Phase Peptide Syntheses(2nd Ed.，Pierce ChemicalCompany，1984)。
本发明聚合物可以被纯化，例如通过制备高效液相色谱仪[Creighton T.(1983)Proteins，structures and molecular principles.WHFreeman和Co.N.Y.]。
除具有有益的抗微生物活性的本身之外，如本文详述，本发明聚合物可以包括与其连接的另外的活性剂例如标记试剂和/或治疗活性剂。
活性剂与本发明聚合物的结合能提供双重效用的聚合物。当另外的活性剂为标记试剂时，其结合本发明抗微生物的聚合物(对微生物具有高亲和力)，可有助于定位、诊断和靶向作用宿主内微生物生长位置。当另外的活性剂为治疗活性剂时，其与本发明抗微生物的聚合物结合将发挥双重的和可能协同的抗微生物活性。
根据本发明的优选实施方案，一种或多种活性剂可以在任何可取代的位置与聚合物连接。该可取代位置的实例包括但没有限于聚合物的一个或多个氨基酸残基的侧链、聚合物的任何一个连接部分、聚合物的任何一个N-和C-端、和聚合物的任何一个或多个疏水部分残基。
因此，当本文使用时，短语“治疗活性剂”是描述化学物质，当给受治疗者施用时，其呈现治疗活性。
当本文使用时，短语“标记试剂”是指可探测的部分或探针，包括，例如发色团、荧光化合物、磷光化合物、重金属簇、和放射性标记化合物、以及任何其它已知的可探测的部分。
宿主内微生物生长位置的标记对于诊断和有效地靶向作用及治疗发光的(photogenic)微生物至关重要。
向聚合物添加治疗活性剂可提供解决方案，解决目前已知的治疗活性剂对抗发光的微生物的许多不足，例如发光的微生物对治疗活性剂的抗药性、治疗活性剂对发光的微生物的特异性和普遍效力的薄弱。本发明聚合物由于本身的结构和化学性质不仅显示抗微生物活性，而且作为递送目前已知治疗活性剂的载体可提供寻靶能力和，进一步为目前已知治疗活性剂提供膜渗透性，这是由于聚合物发挥扰乱发光的微生物的膜结构的能力。
治疗活性剂(可有益地用于本发明的此和其它上下文中)的非限制性实例包括但没有限于一种或多种激动剂残基、氨基酸残基、止痛剂残基、拮抗剂残基、抗生素残基、抗体残基、抗抑郁剂、抗原残基、抗组胺残基、抗高血压剂、抗炎药物残基、抗代谢剂残基、抗微生物剂残基、抗氧化剂残基、抗增殖药物残基、反义(antisense)残基、化疗药物残基、辅助因子残基、细胞因子残基、药物残基、酶残基、生长因子残基、肝素残基、激素残基、免疫球蛋白残基、抑制剂残基、配体残基、核苷酸残基、寡聚核苷酸残基、肽残基、磷脂残基、前列腺素残基、蛋白质残基、毒素残基、维生素残基和它们的任何组合。
当治疗活性剂为抗微生物剂或抗生素时，组合的治疗效果是特别有利的。本发明聚合物和另外的抗微生物剂/抗生素的组合活性可提供该抗微生物剂/抗生素克服这些药物已知缺陷(例如靶向作用、特异性、效力、耐药性等)的能力。协同作用也得以实现。
适合用于本发明上下文中的抗微生物剂和抗生素非限制的实例包括但没有限于为扁桃酸、2，4-二氯苯甲醇、4-[二(乙基硫)甲基]-2-甲氧基苯酚、4-差向四环素、4-己基雷琐辛、5，12-二氢-5，7，12，14-四氮杂并五苯(tetrazapentacen)、5-氯香芹酚、8-羟基喹啉、乙酰胂胺、乙酰吉他霉素、吖啶黄素、阿拉曲沙星、安巴腙、安福霉素、阿米卡星、硫酸阿米卡星、氨吖啶、氨基水杨酸钙、氨基水杨酸钠、氨基水杨酸、鱼石脂、阿莫罗芬、阿莫西林、阿莫西林钠、三水阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸钾联合物、两性霉素B、氨苄西林、氨苄青霉素钠、三水氨苄青霉素、氨苄西林·舒巴坦、阿帕西林、阿贝卡星、阿扑西林、阿司米星、硫酸阿司米星、阿扎硝唑、叠氮氯霉素、阿度西林、阿奇霉素、阿洛西林、氨曲南、巴氨西林、杆菌肽、杆菌肽锌、卡那霉素B、洁尔灭、苄索氯铵、苯佐氯铵、盐酸小檗碱、比阿培南、铋溴酚、双氯麝酚、联苯苄唑、碱式水杨酸铋、博来霉素抗生素复合物、盐酸博来霉素、硫酸博来霉素、溴莫普林、溴氯柳苯胺、溴硝丙二醇、溴羟喹啉、布替萘芬、盐酸布替萘芬、布康唑、十一碳烯酸钙、克念菌素抗生素复合物、卷曲霉素、羧苄青霉素、羧苄基青霉素双钠盐、卡非西林、卡茚西林、卡芦莫南、嗜癌霉素、醋酸卡泊芬净、头孢拉定、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢氨苄、盐酸头孢氨苄、头孢氨苄钠、头孢来星、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢噻吩钠、头孢孟多、头孢孟多酯钠、头孢孟多钠、头孢匹林、头孢匹林钠、头孢曲嗪、头孢曲嗪丙二醇、头孢吡酮、头孢吡酮钠盐、头孢唑林、头孢唑啉钠、头孢拉宗、头孢拉宗钠、头孢卡品、盐酸头孢卡品匹伏酯、头孢地尼、新戊酰氧基甲基头孢地托仑(cefditoren pivoxil)、头孢吡肟、盐酸头孢吡肟、头孢他美、头孢他美新戊酰氧甲酯(cefetamet pivoxil)、头孢克肟、头孢甲肟、头孢美唑、头孢美唑钠、头孢米诺、头孢米诺钠、cefmolexin、头孢地嗪、头孢地嗪钠、头孢尼西、头孢尼西钠、头孢哌酮、头孢哌酮钠、头孢雷特、硫酸头孢噻利、头孢噻肟、头孢噻肟钠、头孢替坦、头孢替坦二钠、头孢替安、盐酸海克西替头孢替安、盐酸头孢替安、头孢西丁、头孢西丁钠、盐酸头孢唑兰、头孢匹胺、头孢匹胺钠、头孢匹罗、硫酸头孢匹罗、头孢泊肟、头孢泊肟酯、头孢丙烯、头孢喹肟、头孢拉定、头孢沙定、头孢磺啶、头孢他啶、头孢特仑、头孢特仑新戊酰氧甲酯、头孢替唑、头孢布坦、头孢唑肟、头孢唑肟钠、头孢曲松、头孢曲松钠、头孢呋新、头孢呋新乙酰氧乙酯、头孢呋新钠、西他氯铵、溴化十六烷基三甲铵、十六烷基三甲铵(cetrimonium)、十六烷基吡啶、氯胺-T、氯霉素、棕榈酸氯霉素、琥珀酸钠氯霉素、氯己定、氯苄甲咪唑、盐酸氯苄甲咪唑、氯二甲酚、氯苯甘醚、氯喹那多、金霉素、盐酸金霉素、环己西林、环吡酮、西诺沙星、环丙沙星、盐酸环丙沙星、枸橼酸、克拉霉素、克拉维酸钾、克拉维酸钠、克拉维酸、克林霉素、盐酸克林霉素、盐酸克林霉素棕榈酸酯、克林霉素磷酸酯、氯碘羟喹、氯康唑、单盐酸氯康唑、氯法齐明、氯福克酚、氯甲西林、氯莫环素、克霉唑、氯唑西林、氯唑西林钠、多粘菌素E、多粘菌素E甲磺酸钠、硫酸多粘菌素E、环丝氨酸、更生霉素、达氟沙星、氨苯砜、达托霉素、柔红霉素、DDT、地美环素、地美环素盐酸盐、地喹胺(dequalinium)、地贝卡星、硫酸地贝卡星、双溴丙脒、双氯酚、双氯西林、双氯西林钠、二癸基二甲基氯化铵、双氢链霉素、硫酸双氢链霉素、双碘喹啉、地美硝唑、双吡硫翁、地红霉素、DL-薄荷脑、D-薄荷脑、溴化十二烷基三苯基磷、阿霉素、盐酸阿霉素、多西环素、盐酸多西环素、益康唑、硝酸益康唑、恩康唑、依诺沙星、恩氟沙星、曙红、依匹西林、尔他培南钠盐(ertapenem sodium)、红霉素、依托红霉素、红霉素琥珀酸乙酯、乳糖红霉素、红霉素硬脂酸脂、依沙吖啶、依沙吖啶乳酸盐、乙胺丁醇、冰醋酸、乙硫异烟胺、乙醇、丁香酚、依沙酰胺、法罗培南、芬替康唑、硝酸芬替康唑、非扎硫酮、氟罗沙星、氟氧头孢、氟氧头孢钠、氟氯青霉素、氟氯青霉素镁、氟氯青霉素钠、氟康唑、氟胞嘧啶、氟甲喹、氟红霉素、氟三唑、磷霉素、磷霉素钙、磷霉素钠、新霉素B、硫酸新霉素B、呋喃烯啶(furagin)、呋喃唑酮、夫沙芬净(fusafungin)、夫西地酸、夫西地酸钠盐、加替沙星、吉米沙星、庆大霉素抗生素复合物(gentamicinantibiotic complex)、庆大霉素、硫酸庆大霉素、戊二醛、短杆菌肽、格帕沙星、灰黄霉素、哈拉宗、卤丙炔氧苯(haloprogine)、海他西林、海他西林钾、六氯酚、己脒定、海克替啶、汞喹米特(hydrargaphene)、氢醌、均霉素、亚胺培南、异帕米星、硫酸异帕米星、异康唑、硝酸异康唑、异烟肼、异丙醇、伊曲康唑、交沙霉素、交沙霉素丙酯、卡那霉素、硫酸卡那霉素、酮康唑、吉他霉素、乳酸、拉诺康唑、仑氨西林、白霉素A1、白霉素A13、白霉素A4、白霉素A5、白霉素A6、白霉素A7、白霉素A8、白霉素A9、左氧氟沙星、林可霉素、盐酸林可霉素、利奈唑胺、利拉萘酯、1-薄荷脑、洛美沙星、盐酸洛美沙星、氯碳头孢(loracarbef)、赖甲环素、溶菌酶、醋酸甲磺灭脓、单过氧化酞酸镁六水合物(magnesium monoperoxophthalate hexahydrate)、乙硫酸美西铵、美西林、甲氯环素、磺基水杨酸甲氯环素、美帕曲星、汞溴红、美罗培南、美他氯铵、美坦西林、美他环素、乌洛托品、水杨酸甲酯、甲苄索氯铵、甲紫、甲氧苯青霉素、甲氧苯青霉素钠、甲硝唑、甲硝唑苯甲酸酯、美洛西林、美洛西林钠、咪康唑、硝酸咪康唑、小诺霉素、硫酸小诺霉素、麦迪霉素、米诺环素、盐酸米诺环素、美欧卡霉素、米他氯铵、丝裂霉素C、莫能星、莫能星钠、吗啉米特、羟羧氧酰胺菌素、羟羧氧酰胺菌素二钠、莫西沙星、莫匹罗星、莫匹罗星钙、那氟沙星、萘夫西林、萘夫西林钠、萘替芬、萘啶酸、那他霉素、新霉素A、新霉素抗生素复合物、新霉素C、硫酸新霉素、奈康唑、奈替米星、硫酸萘替米星、硝呋太尔、硝呋齐特、硝呋妥因醇、硝呋肼、尼莫唑、尼立达唑、呋喃妥因、呋喃西林、硝羟喹啉、诺氟沙星、新生霉素、制霉菌素抗生素复合物、奥替尼啶、氧氟沙星、竹桃霉素、奥莫康唑(omoconazol)、奥比沙星、奥硝唑、邻苯基苯酚、苯唑西林、苯唑西林钠、奥昔康唑、硝酸奥昔康唑、oxoferin、奥索利酸、奥昔氯生、土霉素、土霉素钙、盐酸土霉素、帕尼培南、巴龙霉素、硫酸巴龙霉素、帕珠沙星(pazufloxacine)、培氟沙星、甲磺酸培氟沙星、培那西林、青霉素G、青霉素G钾、青霉素G钠、青霉素V、青霉素V钙、青霉素V钾、喷他脒、喷他脒二羟乙磺酸盐、喷他脒甲磺酸盐、喷他霉素、非奈西林、苯酚、苯氧乙醇、苯汞基硼酸盐(phenylmercuriborat)、PHMB、酞磺胺噻唑、哌氯定(picloxydin)、吡哌酸、哌拉西林、哌拉西林钠-三唑巴坦钠、吡咯米酸、匹氨西林、pivcefalexin、匹美西林、盐酸匹美西林、聚甲酚磺醛、多粘菌素抗生素复合物、多粘菌素B、硫酸多粘菌素B、多粘菌素Bl、聚诺昔林、聚维酮碘、普罗帕脒(propamidin)、普罗硝唑、丙匹西林、丙匹西林钾、丙酸、丙硫异烟胺、丙噻酯、吡嗪酰胺、乙胺嘧啶、巯氧吡啶、吡咯尼群、喹啉、奎奴普丁-达福普汀、间苯二酚、核糖霉素、硫酸核糖霉素、利福布汀、利福平、利福霉素、利福喷汀、利福昔明、利硫美坦、罗他霉素、罗利环素、罗索沙星、罗红霉素、芦氟沙星、水杨酸、塞克硝唑、二硫化硒、舍他康唑、硝酸舍他康唑、西卡宁、西索米星、硫酸西索米星、硫代硫酸钠、司帕沙星、壮观霉素、盐酸壮观霉素、螺旋霉素抗生素复合物、螺旋霉素b、链霉素、硫酸链霉素、琥珀磺胺噻唑、舒巴克坦、舒巴克坦钠、磺苄西林钠、舒苯汀(sulbentin)、硫康唑、硝酸硫康唑、磺胺苯酰、磺胺脲、磺胺醋酰、磺胺醋酰钠、磺胺氯哒嗪、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶银、磺胺嘧啶钠、磺胺戊烯、磺胺地索辛、磺胺多辛、磺胺脒、磺胺林、磺胺马宗、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶钠、磺胺甲二唑、磺胺甲基异唑、磺胺甲基异唑-甲氧苄啶、磺胺甲氧嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺唑、磺胺、磺胺培林、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺胺喹沙啉、磺胺琥珀酸、磺胺噻唑、磺胺硫脲、磺胺托拉米、sulfatriazin、磺胺索嘧啶、磺胺异唑、磺胺乙酰异唑、磺胺类药物(sulfonamides)、舒他西林、舒他西林甲苯磺酸盐、他克莫司、酞氨西林盐酸盐、替考拉宁A2复合物、替考拉宁A2-1、替考拉宁A2-2、替考拉宁A2-3、替考拉宁A2-4、替考拉宁A2-5、替考拉宁A3、替考拉宁抗生素复合物、泰利霉素、替马沙星、替莫西林、tenoic acid、特比萘芬、特康唑、特立齐酮、四环素、盐酸四环素、四环素偏磷酸盐、四甲基秋蓝姆化一硫、四氧普林、噻苯达唑、甲砜霉素、盐酸硫代苯丙醇甘氨酸盐(thiaphenicolglycinatehydrochloride)、硫柳汞、塞仑、鹿香草酚、替贝碘铵、替卡西林、替卡西林-克拉维酸混合物、替卡西林二钠、替卡西林一钠、甲溴羟喹、替米考星、替硝唑、噻康唑、妥布霉素、硫酸妥布霉素、托西拉酯、托林达酯、托萘酯、甲硫托洛铵(toloconium metilsulfat)、托曲珠利、托氟沙星、三氯卡班、三氯生、甲氧苄啶、硫酸甲氧苄啶、三苯基锑硫化物(triphenylstibinsulfide)、醋竹桃霉素、曲伐沙星、泰洛星、tyrotliricin、氯烷吡啶、十一烯酸、万古霉素、盐酸万古霉素、紫霉素、维吉霉素抗生素复合物、伏立康唑、占托西林、希波酚和十一烯酸锌。
本实施方案的聚合物的主要部分是基于氨基酸和双官能的疏水部分之间的结合物组成的重复单元。该结合物在聚合物的序列中可重复数次和/或，被不同类型的结合物或被单个或重复的氨基酸残基和单个或重复的疏水部分残基所间断和/或侧面作用。
因此，根据本发明的另一个方面提供结合物，其包括氨基酸残基和疏水部分残基，如上文定义和描述，连接至该氨基酸残基的N-α或C-α。设计本发明结合物中的疏水部分残基，以便它能够与另外的氨基酸残基的N-α或C-α形成键。优选地，疏水部分残基与氨基酸残基经由肽键结合。
本发明结合物中的疏水部分具有双官能的设计，允许该结合物用作可聚合的结合物，形成本文所述和提出的聚合物的一部分。优选地，形成结合物部分的疏水部分具有双官能度，在其一个末端形式为羧基基团和在其另一个末端形式为胺基团。
因此，根据本发明的另一个方面提供制备上文所述的结合物的方法，其一般方法是基于提供氨基酸，优选地氨基酸为正电荷氨基酸，例如组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；提供如上文定义和描述的疏水部分，具有能够与氨基酸残基的N-α起反应的第一官能团和能够与氨基酸残基的C-α起反应的第二官能团；将疏水部分的第一官能团与氨基酸经由该氨基酸的N-α连接；或将疏水部分的第二官能团与氨基酸经由该氨基酸的C-α连接。
优选地，氨基酸的N-α或C-α和疏水部分之间是经由肽键连接。
为了形成连接氨基酸和疏水部分肽键，优选该疏水部分在其一个末端具有羧基基团和在其另一个末端具有为胺基团。
本文所述的抗微生物聚合物可有益地用于治疗致病微生物感染，这些如下文所定义。如同随后实施例部分所证明，此聚合物自身能够发挥抗微生物活性。因此，包括另外治疗活性剂的选择可协同地用作抗多种细菌、真菌和其它微生物的毒性药剂。
本文各处的短语“致病微生物”用于描述能够引起高等生物体(通常例如哺乳动物和尤其是人)疾病或病症的任何微生物。该致病微生物可属于生物体的任何家族，例如但不限于为原核生物、真细菌、古细菌、真核生物、醇母、真菌、藻类、原生生物和其它的寄生虫。致病微生物非限制性的实例为镰状疟原虫(Plasmodium falciparum)和相关的引起的疟疾原生动物寄生虫、棘阿米巴属(Acanthamoeba)和其它自由生活阿米巴、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、异尖属(Anisakis)和相关的蠕虫、蛔虫(Ascaris lumbricoides)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridiumperfringens)、小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、圆孢子虫(Cyclospora cayetanensis)、裂头属绦虫(Diphyllobothrium)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、真圆线虫属(Eustrongylides)、兰伯贾第虫(Giardia lamblia)、单核细胞增多性李司忒氏菌(Listeriamonocytogenes)、侏形吸虫属(Nanophyetus)、类志贺毗邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺菌(Shigella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、链球菌(Streptococcus)、鞭虫(Trichuris trichiura)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)和其它弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)和假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)。
因此，根据本发明的另一个方面，提供治疗致病微生物相关的医学疾病的方法，该方法包括给需要它的受治疗者施用治疗有效量的一种或多种聚合物，如上文所述。
当本文使用时，术语“治疗”和“治疗”包括去除、基本上抑制、减慢或反转疾病的进展、基本上改善疾病的临床或美学症状或基本上预防出现疾病的临床或美学症状。
当本文使用时，短语“治疗有效量”是描述所施用的组合物的量，其将在某种程度上缓解所治疗的疾病的一种或多种症状。
根据本发明实施方案的治疗方法可包括施用如上文所定义和讨论的另外的治疗活性剂。
如同以上叙述和随后的实施例部分所证明，可以设计和利用本发明的抗微生物聚合物(单用或与其它任何治疗活性剂连用)，消灭病态的微生物。通过有选择地破坏致病微生物细胞的一部分引起致病微生物的毁灭。虽然最有名的抗生素通过有选择地干扰细胞膜、蛋白质或核苷酸的一种或多种分子组分的生物合成起作用，本发明聚合物也通过与致病微生物的细胞外膜结合和破裂起作用。细胞外膜的破裂由于膜的去极化、代谢产物的泄漏和/或细胞完整性的总损失引起细胞死亡；因此本发明聚合物也通过破坏新陈代谢和/或致病微生物的增殖进程，直接用作有效的抗微生物剂。
如同随后的实施例部分所证明，本发明聚合物可与另外的抗生素或其它治疗活性剂通过透化致病微生物细胞起协同作用；由此又显示间接的抗微生物活性。下文给出的结果允许这样的结论本发明聚合物是有效的外膜分裂剂。聚合物的透化作用能增加其它治疗活性剂的摄取，因此能够增强其它药物和抗生素的显而易见的抗微生物活性。
治疗致病微生物相关的医学疾病包括通过致病微生物或致病微生物的感染、侵袭、污染和传播。一般而言感染引起的疾病是指致病微生物侵入植物或动物组织。寄生的蠕虫和其它更高的致病生物体侵入身体组织通常地是指侵袭。
侵入生物体例如细菌生产损害宿主组织和干扰正常代谢的毒素；一些毒素实际上是破坏宿主组织的酶。其它的细菌物质可通过对宿主吞噬细胞的破坏加予损害，致使身体对其它的致病微生物感染更为敏感。由许多侵入生物体生产的物质引起宿主内变应性致敏。感染可经由呼吸飞沫、直接接触、污染的食物或带菌者例如昆虫传播。也可以两性之间传播和母胎传播。
细菌感染引起的疾病通常包括，例如放线菌病、炭疽、曲菌病、菌血症、细菌性皮肤病、巴尔通体感染、肉毒杆菌中毒、普鲁斯病、伯克霍尔德氏菌(burkholderia)感染、弯曲杆菌感染、念珠菌病、猫抓病、衣原体属感染、霍乱、梭状芽孢杆菌感染、球孢子菌病、隐球菌病、皮肤真菌病、白喉、埃里希体病、流行虱传播斑疹伤寒、大肠杆菌感染、梭状杆菌感染、坏疽、全身感染、全身性霉菌病(generalmycoses)、淋病、革兰阴性细菌感染、革兰阳性细菌感染、组织胞浆菌病、脓疱病、克雷伯氏菌属感染、军团杆菌病、麻风病、钩端螺旋体病、李斯特菌感染、莱姆病、疟疾、足分支菌病、类鼻疽(melioidosis)、分枝杆菌感染、支原体感染、坏死性筋膜炎、诺卡氏菌感染、甲癣、鸟病、肺炎球菌感染、肺炎、假单胞菌属感染、Q热、鼠咬热、回归热、风湿热、立克次体感染、落矶山斑疹热、沙门菌感染、猩红热、丛林斑疹伤寒、脓毒病、性传播的细菌性病、葡萄球菌感染、链球菌感染、外科位置感染、破伤风、蜱传播疾病、结核病、兔热病(tularemia)、伤寒、泌尿道感染、弧菌感染、雅司病、耶尔森菌病、耶尔森菌虫害瘟疫、动物传染病和接合菌病。
因为本实施方案的聚合物通过主要是由特异性和选择性地针对致病微生物膜的亲和力所产生上述的一个机理，对致病微生物施加抗微生物效果和对哺乳动物细胞具有相对完整无损的效果(如同红细胞所证明和随后实施例部分所介绍)，因此它们可用于治疗致病微生物相关的医学疾病。这种亲和力可用于减弱、破裂、穿刺、熔化、融合和/或标记致病微生物膜。
如同随后实施例部分中系列细菌菌株证明和介绍，通过膜破裂，可直接破坏致病微生物；或减弱致病微生物，以让先天的免疫系统消灭它或减慢其新陈代谢和因此减慢其生殖以让先天的免疫系统战胜感染。
通过膜破裂可直接破坏致病微生物，以让治疗活性剂，例如抗生素更容易穿透微生物的细胞并在此发挥(afflict)活性。
本发明的抗微生物聚合物协助另外的治疗活性剂渗入致病微生物细胞的在后能力，可用于治疗许多感染性疾病例如，举例，疟疾。
疟疾，又称为丛林热、沼泽地热和湿地热，为传染性疾病，特征为循环性寒战、发热、和出汗，它是由原生动物寄生虫，疟原虫(一种Apicomplexa)，通过感染人疟原虫的带菌者，雌性疟蚊属(Anopheles)蚊子，的叮咬传染，使红细胞感染寄生虫引起的。四种类型的疟疾中，最威胁生命的类型为恶性(falciparum)疟。其它三种类型的疟疾间日疟、三日疟和卵型疟通常较少为严重的和不威胁生命。疟疾，仍然是致命的击败人类的传染性疾病，主要在热带和撒哈拉以南的非洲引起每年大约5亿感染和一至两百万死亡。寄生虫的镰状疟原虫品种计算占80％病例和90％死亡。镰状疟原虫疟疾中红细胞的粘性特别显著，这是发生疟疾出血性的并发症主要因素。
迄今为止对疟疾没有绝对治愈法。如果早期诊断则可以减轻疟疾，但预防仍然比治疗更有效，因此抑制寄生虫的物质广泛用于到热带的游客。自十七世纪以来，奎宁为疟疾的选择性预防剂。二十世纪中，奎纳克林、氯喹、和伯氨喹的开发减少了对奎宁依靠。这些抗疟药物可用于预防，并推荐给到侵袭区域的旅行者。
不幸地，早在二十世纪六十年代疟原虫的几种菌株对氯喹发生抗药性。抗药性的发生，加上蚊子对杀虫剂正生长的免疫，已经使疟疾成为一个世界性领引的再度出现的感染性疾病。甲氟喹可用于该疾病已变得高度耐氯喹的区域，但是一些菌株现在对其和其它的药物有抵抗力。现在，青蒿素(得自青蒿)与其它药物的联合在许多病例中是治疗抗性株的首选。马拉隆(Malarone)(阿托伐醌和氯胍)也用于抗性株。抗疟疾疫苗仍然实验性的。
当本发明回到实践时，本发明者已经制备和成功使用这些抗微生物聚合物作为抗疟剂，具有如随后实施例部分所证明的减少的溶血效果。本发明聚合物显示能够清楚地与溶解宿主细胞分开的方式杀死寄生虫。这些聚合物能够进入受感染细胞，仅有选择地透化寄生虫细胞膜。当与宿主和正常血细胞比较时，通过具有不同性质结构的肽样聚合物与红细胞内的疟原虫镰状疟原虫膜的组分之间不同的相互作用，最好地解释了这些结果。这些发现也确定本发明的膜活性聚合物可设计为特别地作用于胞内寄生物的膜以扰乱其功能。本发明聚合物通过例如弱化寄生虫膜和使抗疟剂能更快地穿透寄生虫膜，因此能克服对多种抗疟剂的寄生虫抗药性问题。
因此，本发明优选的实施方案是抗微生物聚合物以本身或与目前使用的抗疟药或任何其它的抗寄生物药联合作为抗疟药的用途，如同随后实施例部分中所举例说明。
本发明抗微生物聚合物能以本身或作为药物组合物的活性成分应用，可具有或没有另外的治疗活性剂和药学上可接受的载体。
因此，根据本发明再一个方面，提供药物组合物，其包括一种和多种如上所述具有抗微生物活性的本发明聚合物和药学上可接受的载体。
本文使用的“药物组合物”是指本文所述的抗微生物聚合物的制剂，具有其它的化学成分例如药学上可接受的和适当的载体和辅料。药物组合物的目的是为了使生物体容易施用化合物。
在下文中，术语“药学上可接受的载体”是指对生物体不会引起显著的刺激和不会取消所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。载体的实例为但没有限于丙二醇、盐水、有机溶剂与水的乳剂和混合物、以及固体(例如粉末)和气体载体。
本文的术语“辅料”是指加至药物组合物的以便更容易施用化合物的惰性物质。辅料的实例包括但没有限于碳酸钙、磷酸钙、多种糖和多类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
制剂的技术和药物的施用可参见“ Remington′s PharmaceuticalSciences”Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版，在此将其引入作为参考。
因此可以制造根据本发明使用的药物组合物，以常规方式使用一种和多种药学上可接受的载体包括辅料和辅件(auxiliaries)，其促进银覆盖的(silver-coated)酶进入药学上可使用的制剂中。适当的制剂依赖于所选择的给药途径。本文描述的银覆盖的(silver-coated)酶的毒性和治疗效果可通过标准的药学程序在实验动物中确定，例如通过测定受治疗者银覆盖的(silver-coated)酶的EC50、IC50和LD50(引起测试动物50％死亡的致死剂量)。由这些活性测定和动物实验获得的资料可用于确定人类所使用的剂量范围。
剂量可依赖所应用的剂型和所使用的给药途径改变。可由个人医师考虑患者的病情选择准确的制剂、给药途径和剂量。(参见，例如，Fingl等，1975，in“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，Ch.1p.l)。
施用组合物的量将，当然，取决于正治疗的受治疗者、难受的严重度、给药的方式、处方医师的判断等。
本发明的组合物，如果想要，可在包装或调剂装置中供应，例如FDA(美国食品与药品管理局)批准的可包含一或多个含活性成分的单元剂型药盒。包装可，例如，包括金属或塑料箔，例如但不限于起泡包装或加压容器(用于吸入)。包装或调剂装置可伴有施用的技术说明书。包装或调剂装置也可伴有容器相关的通知，该通知以政府机构调节制造商、使用者或药物制剂零售商的规定形式，反映了该机构批准此组合物形式可给人或兽医施用。这样的通知，例如，可以是美国食品与药品管理局批准的用于处方药物或批准产品插入物的标签。本发明包含银覆盖的(silver-coated)酶在可配伍的药学载体中制造的组合物，也可以制备、放置于适当的容器中，并标记治疗适应的疾病或诊断，如同上文详细。
因此，根据本发明的实施方案，依赖于所选择的聚合物和所存在的另外活性成分，本发明的药物组合物包装在包装材料中并在所述包装材料中或上印刷标识，用于治疗如上文所定义的致病微生物相关的医学疾病和寄生虫。
包含本发明聚合物的药物组合物可进一步包含至少一种如上文定义和提出的另外的治疗活性剂。
本发明的聚合物还可在多种医疗装置中有益地用作活性物质。
因此，根据本发明的还一个方面提供医学装置，其包括一种或多种上文所述的本发明聚合物，和配置用于递送该聚合物至受治疗者身体部位的递送系统。
因此应用根据本发明的医学装置，将本发明聚合物递送至或用于预期的身体部位。聚合物以本身或作为药物组合物的一部分掺入医学装置，如同上文所述。
当本文使用时，短语“身体部位”包括任何器官、组织、膜、腔、血管、道、生物学表面或肌肉，本发明聚合物递送至或用于这些身体部位是有益的。
示例性身体部位包括但不限于皮肤、真皮层、头皮、眼睛、耳朵、口、咽喉、胃、小肠组织、大肠组织、肾、胰脏、肝、消化系统、呼吸道、骨髓组织、粘膜、鼻膜、血液系统、血管、肌肉、肺空洞、动脉、静脉、毛细管、心脏、心腔、雄性或雌性生殖器官和任何内脏的器官或腔。
根据本发明该方面的医学装置可以是本领域已知的任何医学装置，包括依赖于例如所治疗的疾病和身体部位，例如由FDA所定义和分类的那些，和http://www.fda.gov/cdrh/devadvice/313.html(例如，I，II和III类)中指定的那些。
因此，例如在本发明该方面的一个实施方案中，医学装置包含为了以吸入递送该聚合物而配置的递送系统。这样的吸入装置有用于递送本发明聚合物至例如呼吸道。
此医学装置中的递送系统可以基于多种适合类型中的任意呼吸递送系统，其适合给受治疗者施用治疗有效量的本发明聚合物。可以配置吸入装置，优选地经由口腔和/或鼻途径，以递送在烟雾剂/喷雾剂、蒸汽和/或干燥粉末合剂的形式中的化合物至该受治疗者的呼吸道。普通技术人员广泛应用的和本领域文献中广泛描述的众多呼吸系统和方法，适合装配适当的吸入装置，掺入治疗剂例如本发明的聚合物(参见，例如美国专利编号6,566,324、6,571,790、6,637,430、和6,652,323；美国食品与药品管理局(USFDA)药品评价与研究中心(CDER)；http://www.mece.ualberta.ca/arla/tutorial.htm)。
因此呼吸递药系统可以是例如，喷雾器或烟雾发生器例如喷雾吸入器、干粉吸入器(DPI)和计量吸入器(MDI)、蒸发器例如电加热器和汽化器、和呼吸器例如呼吸机、人体呼吸器(例如胸甲)、肺通气器和复苏器。
本发明该方面的又一个实施方案中，医学装置是经皮肤实现递送聚合物的医学装置。在此实施方案中，在受治疗者的皮肤上应用该医学装置，以经皮递送该聚合物至血液系统中。
经皮递送根据本发明的聚合物的示例性医学装置包括但没有限于橡皮膏和皮肤贴剂。经皮或经表皮递送该聚合物的医学装置一般还包括一种或多种渗透促进剂，用于促进它们渗透通过表皮并进入系统。
根据本发明该方面的再一个实施方案，医学装置是在受治疗者的生物学表面局部地应用该医学装置实现递送聚合物的医学装置。生物学表面可以是例如，皮肤、头皮、眼睛、耳朵和指甲。这样的医学装置可用于治疗多种皮肤疾病和损伤、眼睛和耳朵感染等。
局部应用的示例性医学装置包括但没有限于橡皮膏条、绷带、橡皮膏、伤口敷料和皮肤贴剂。
本发明该方面的还一个实施方案中，医学装置是经身体器官内植入医学装置实现递送聚合物的医学装置。当本文使用时，术语“器官”还包括体腔。
器官可以是例如，肺空洞、心脏或心腔、体腔、器官腔、细管、动脉、静脉、肌肉、骨、肾、毛细管、真皮层之间的空间、雌性或雄性生殖系统的器官、消化道的器官和任何其它内脏器官。
根据本发明实施方案的医学装置一般包括其中掺入根据本发明聚合物的装置结构。因此可将聚合物例如应用在、陷入于或连接至(化学地，静电学地或别的方式地)该装置结构。
装置结构可为例如金属的结构，因此可包含生物相容的金属或金属混合物(例如金、铂)。
替代选择地，装置结构可以包含其它生物相容的基质。这些可包括，例如塑料、硅、聚合物、树脂，和可以包含至少一种成分例如，举例，聚氨基甲酸乙酯、纤维素酯、聚乙二醇、聚醋酸乙烯酯、右旋糖酐、明胶、胶原、弹性蛋白(elastin)、层粘连蛋白、纤维结合蛋白、玻璃体结合蛋白、肝素、分段的聚氨基甲酸乙酯-尿素/肝素、聚-L-乳酸、纤维蛋白、纤维素和例如富勒烯(fullerenes)中的无定形碳或有结构的碳、和它们的任何组合。
在预期为生物可降解的植入装置的案例中，装置结构包括生物可降解的生物相容的基质。生物可降解的基质可包括例如，生物可降解的聚合物例如聚-L-乳酸。
任选地，装置结构可包括生物相容的金属，涂有其它生物相容的基质。
还任选地，在预期以控制方式释放本发明聚合物的装置的案例中，装置结构可包括或涂有生物相容的基质，该基质作为功能性缓释载体或包含缓释载体。生物相容的基质因此可以为预期位置或器官内植入物上溶解的、熔化的或液化的缓释载体。替代选择地，生物相容的基质可以为孔中陷入聚合物的预定多孔材料。当在预期位置植入时，聚合物从孔中扩散出来，因此扩散速率由孔径和化学性能确定。还替代选择地，生物相容基质包含生物可降解的基质，凭借其降解释放本发明的聚合物。
通过本领域已知的任何方法，基于装置结构所选择的性能，可将本发明的聚合物掺入装置结构中。例如，聚合物可陷入多孔的基质中、膨胀或浸泡在基质中、或与基质粘附。
非常类似于体内的抗微生物活性，本发明聚合物的抗微生物活性还可用于食品成分和制品的防腐。
因此，根据本发明的另一个方面，提供食品防腐剂，其包括有效量的如本文所述的本发明聚合物。
可以将聚合物掺入食物制品中，以本身或与可食用的载体一起作为其成分的一部分。
本发明聚合物对微生物膜已经显示具有高度的选择性亲和力，这如同随后实施例部分所证明。这种属性是促成聚合物(当用作抗微生物剂时)有效和灵验活性的主要要素之一。当聚合物与标记试剂偶联时，这种膜结合属性可进一步用于标记微生物的菌丛和增殖位置，尤其是在宿主体内的微生物生长场所。
因此，根据本发明的另一个方面，提供探测致病微生物的成像探针，该成像探针包括如上文定义和描述的聚合物，而聚合物又包括与其连接的至少一种如上文所定义的标记试剂。当向周围释放时，这些具有标记试剂与其连接的聚合物，将与微生物细胞膜结合并因此使标记试剂与微生物细胞连接。
当本文使用时，术语“发色团”是指化学部分，当其与另外的分子连接时，致使后者染色并因此在应用多种分光光度计测量中可见。
短语“荧光化合物”是指在暴露给外源射线期间在特定波长下发光的化合物。
短语“磷光化合物”是指在没有可感知的热或外部刺激如通过磷的慢氧化下发光的化合物。
重金属簇例如可为例如电子显微镜技术中用于标记的金原子簇。
根据本发明优选的实施方案，一种或多种标记试剂可以在任何可取代的位置与聚合物连接，如同上述讨论的活性剂的情形。该取代位置的实例为，但没有限于为，聚合物中任何一个或多个氨基酸残基的侧链、聚合物的任何一个结合部分、聚合物的任何一个N和C端、和聚合物中任何一个或多个疏水部分残基。
本发明的另外目的、优点、和新特征，对于本领域普通技术人员来说，在下述实施例的试验上将成为显而易见的，但不打算受下述实施例的限制。此外，如上文所描绘和权利要求部分所要求的本发明的每个不同的实施方案和方面均可在下述实施例中寻到实验的支持。
实施例 现按下述实施例与上述说明一起制成参照；以非限制方式举例说明本发明。
材料和实验方法 材料 在其主链胺基团上具有Fmoc((9H-芴-9-基)甲基碳酸酯)保护和在其侧链胺基团上具有Boc(碳酸叔丁酯)保护的赖氨酸购自AppliedBiosystems和NovaBiochem。
具有Fmoc保护胺基的ω-氨基脂肪酸例如4-氨基丁酸、8-氨基辛酸和12-氨基月桂酸购自Sigma-Aldrich/NovaBiochem。
所有其它使用的溶剂和试剂购自Sigma-Aldrich/NovaBiochem/Applied Biosystems/J.T.Baker，使用时没有进一步纯化。
制备抗微生物聚合物文库-一般程序 根据本发明的聚合物可通过固相法制备，并根据本领域描述的方法将其纯化成色谱均匀性(Feder，R.等.(2000)J.Biol.Chem.275，4230-4238)。简言之，在全自动的、程序控制的肽合成仪上通过应用Fmoc活性酯化学合成该聚合物(Applied Biosystems 433A)。从该树脂上分裂后，用30％乙腈水溶液提取该粗制聚合物并纯化，以获得HPLC测定(Alliance Waters)色谱均匀性大于95％的聚合物。
在Cl8柱(Vydak，250mm×4.6或10mm)上使用乙腈比水的线性梯度(每分钟1％)进行HPLC色谱，此两种溶剂均包含0.1％三氟醋酸。测定纯化后的聚合物质谱(ZQ Waters)以证实它们的组成，并在-20℃下以冻干粉贮存。进行试验前，用水制备新鲜的溶液，经涡旋混合，超声溶解，离心，然后稀释在适当的介质中。
为了评价每个聚合物的疏水性，在HPLC反相C18柱上用乙腈的线性梯度(每分钟1％)洗脱聚合物，该聚合物洗脱时乙腈的百分数用来评价疏水性(参见，下表3的“ACN(％)”)。
用于上述合成中的示例性构造单位在以下方案1中提出，其包括赖氨酸和具有m个碳原子的ω-氨基脂肪酸(化合物I)。
向根据常规肽固相合成实验方案的树脂中，分别连续地加入Fmoc/Boc-保护的赖氨酸和Fmoc-保护的化合物I，进行了根据本发明的示例性聚合物(其包含赖氨酸和化合物I)的合成。 方案1
赖氨酸 化合物I 菌株和样品制备 使用培养于LB介质(10克/升胰蛋白胨，5克/升酵母提取液，5克/升NaCl，pH 7.4)中的以下菌株测定抗菌活性大肠杆菌(ATCC 35218)；耐甲氧西林(methicilin)的金黄色葡萄球菌(CI15903)；蜡样芽胞杆菌(ATCC 11778)；和绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC9027)。
最小抑菌浓度(MIC)的测量 在96-孔板中使用每毫升106的细菌接种物，通过微稀释敏感试验法测定最小抑菌浓度(MICs)。通过在600nm测量光密度并用一套标准值标定其细胞数。以2倍的系列稀释法，将一百(100)μl的细菌混悬液加到100μl的培养基(对照)或100μl包含多种聚合物浓度的培养基中。在37℃孵育期24小时后，通过光密度测量确定增殖抑制。
物理参数(电荷和疏水性)对抗微生物活性的影响 制备聚合物文库以尝试增加电荷和疏水性对抗微生物活性的影响。通过将ω-氨基脂肪酸-赖氨酸结合物数目从1至7个递增，连续地尝试电荷。通过增加ω-氨基脂肪酸的碳原子数目(4、8和12)连续地尝试疏水性。如上文所述，测试每个系列的聚合物的抗微生物活性。
细菌中抗微生物剂的抗药性发生 当与已知引起抗药性的经典抗生素庆大霉素，四环素和环丙沙星(用作耐抗生素菌株的发生对照)相比时，研究了细菌对本发明聚合物抗微生物活性发生抗药性的可能性。将指数生长期的细菌样品暴露给抗微生物剂，用于上述的MIC测定。接着孵化过夜，从显示出近50％生长抑制的孔中采集细菌，洗涤并稀释在新鲜的介质中，生长过夜，使之接受MIC测定，直到高达10次反复。类似地，使用从前代对照孔(培养孔没有聚合物)中采集的细菌，将这些次培养物的MIC演化同时与各自的新生代比较。由指定次培养物所获得的MIC与第一次暴露所获得的MIC的比率计算每个实验的MIC相对值。
动力学研究 在试管中完成动力学研究，最终体积为1ml，如下将100μl包含在培养基中的细菌2-4×107菌落形成单位(CFUs)/ml的混悬液加入到0.9ml培养基或包含聚合物多种浓度(0、3和6倍的MIC值)的培养基中。在37℃摇动时暴露给聚合物0、30、60、90、120和360分钟后，通过将50μl的样品加入至450μl的盐水(0.9％NaCl)中，培养物受到系列的10倍稀释(直到10-6)。使用量滴平板法(3滴，每滴20μl，到LB-琼脂平板上，如Yaron，S.等.(2003)，Peptides 24，1815-1821所述)测定菌落形成单位(CFUs)。在37℃将平板孵化16-24小时后，计算CFUs。从至少两次重复进行的独立测定中获得这些实验的各自统计学数据。
提高外膜渗透性情况下的抗微生物活性 根据以下程序，通过用EDTA(乙二胺四醋酸)处理细菌培养物，提高革兰阴性菌(即大肠杆菌或绿脓假单胞菌)的外膜渗透性将1MEDTA水溶液(pH＝8.3)稀释在LB介质中，得到4mM浓度，该稀溶液用于溶解聚合物。细菌在LB介质中生长过夜，在96-孔板中将每毫升包含106细菌的100μl部分加到100μl EDTA培养基或加到包含多种聚合物浓度的EDTA培养基(2倍的系列稀释法)中。如上所述测定抗革兰阴性菌的生长抑制。
对血浆蛋白酶的敏感性 通过测定暴露给人血浆后的抗菌活性，评价本发明聚合物对蛋白水解消化的敏感性，如下37℃下，将250μl的聚合物盐水溶液(0.9％NaCl)以MIC值16倍的浓度在培养基用50％(v/v)人血浆预孵化。孵化期3、6、和18小时后，在96-孔板的LB介质中，聚合物溶液受到2倍的连续稀释。将根据本发明的四个示例性聚合物(C12K(NC8K)5NH2、K(NC12K)3NH2、C12KNC12KNH2、和C12KKNC12KNH2)和16-残基dermaseptin S4衍生物(S416，用作对照的示例性AMP)，在人血浆(50％)中预孵育不同的时间期限，评价本发明聚合物对酶裂解的敏感性。此后，如上所述测定抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性。类似地，在缺失血浆的培养基条件下(以下实验结果部分指的是0小时的预孵化)也测定了抗菌活性。从至少两次重复进行的独立测定中获得这些实验的各自统计学数据。
溶血测定 凭借磷酸盐缓冲溶液(PBS)的人红细胞(RBC)，确定聚合物的溶膜(membranolytic)潜在性。将人全血样品在PBS中以200xg2分钟离心清洗三次，再以5％血细胞比容混悬于PBS。将包含2.5×108RBC 50μl部分的混悬液加到包含200μl聚合物溶液(PBS中的2倍系列稀释液)、单独的PBS(用于基线值)、或蒸馏水(用于100％溶血)的试管中。在37℃搅动下孵化3小时后，将样品离心，通过在405nm测量上清液200μl部分的吸收度作为血色素泄漏的机能，确定溶血活性。
圆二色性(CD) 用Aviv型号202CD光谱仪(Aviv Associates，Lakewood，NJ)，使用0.01cm直角QS Hellma试管，在25℃(通过热电Peltier元件控制0.1℃的精确度)下以毫度(millidegrees)测量CD光谱。将聚合物样品溶解在PBS、20％(v/v)三氟代乙醇/水、或逐步滴加在包含3∶1比例和浓度最高达2mM的POPC(2-油酰基-1-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)和POPG(1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷-rac-(1-甘油))的PBS中，以便获得脂质体。使用每个聚合物已知浓度的标准曲线，在100μM的浓度下扫描聚合物的CD光谱作为UV测定。在同样的条件下测量一种示例性AMP即N端酰化的S4 dermaseptin衍生物N C12K4 S 4(1-14)(Mor，A.等.(1994)，J.Biol.Chem.269(50)31635-41)的CD，并作为参考化合物用于CD研究中。本文表示的CD数据代表三次单独记录值的平均数。
表面等离子共振测定 使用BIAcore 2000生物传感器系统，通过表面等离子共振(SPR)研究与模型双分子层膜的结合。将模仿细菌质膜的包含磷脂的脂质体(3∶1比例的POPC∶POPG)固定在传感器表面，然后将聚合物溶液连续流动地经过该膜。以共振信号作为时间函数的曲线展示所分析的聚合物与固定磷脂膜之间相互作用的发展。从分析所形成的曲线计算相互作用的亲和力，详细如同Gaidukov，L.等.(2003)，Biochemistry 42，12866-12874。简言之，在5个剂量(0.21、0.42、0.84、1.67、3.35μg)联合和解离曲线(结合率)，计算Kapp(作为结果的结合常数)(假定为2步骤模型)。
脂多糖结合测定 为了探讨本发明聚合物发挥抗菌活性的机理，测试了该聚合物对细菌膜的靶向作用。更具体地，测试了正电荷聚合物对革兰阴性菌膜上存在的负电荷脂多糖(LPS)的亲合力。
因此，使用光学生物传感器系统BIAcore 2000(BIAcore)，通过SPR技术进行本发明聚合物对LPS的结合测定。将于PBS中的50μM聚合物样品和100μg/ml LPS的混合物在室温下孵化30分钟。25℃下，以每分钟10μl的流速将10μl该混合物注射地通过涂布在Ll传感器片上的POPC∶POPG(3∶1)双分子层，进行结合测定。注射不含聚合物样品的100μg/ml LPS作为LPS与膜结合的空白实验，注射50μM的聚合物样品，以确定没有LPS时聚合物与膜的结合。
DNA结合测定 在1％琼脂糖胶中的凝胶电泳期间，通过评价其延缓DNA质粒迁移的能力，研究了本发明聚合物与核苷酸的结合。将200纳克DNA质粒(pUC19，2683碱基对)与最终体积20μl双蒸馏水(DDW)中的渐增量的不同聚合物混合，进行DNA迟缓实验。将反应混合物在室温下孵化30分钟。接着，加入2μl负载染料(20％Ficoll 400，0.1M EDTA，0.25％溴酚蓝和1％十二烷基硫酸钠)，将可分量20μl用于1％琼脂糖凝胶电泳，该1％琼脂糖凝胶电泳于包含溴乙锭(0.25μg/ml)的TAE缓冲液(0.02M Tris碱，0.01M冰醋酸，0.5mM EDTA，pH＝8.5)中。本实验中使用的质粒通过WizardPlus SV Minipreps DNA PurificationSystem(Promega)分离。
唾液杀微生物测定 通过将新鲜的人唾液与聚合物或IB-367(两者都溶于pH 5的10mM醋酸钠缓冲液中，最终浓度100μM)以1∶1的比例混合，研究了本发明聚合物对抗健康人志愿者唾液中微生物混合物的抗微生物活性。没有用抗细菌剂的唾液溶液用作对照。IB-367为正电荷内源性抗微生物多肽，已知其具有在体外和体内抗人口腔粘膜炎相关的微生物群活性(Loury，D.等.，1999，Oral Surg Oral Med Oral Pathol OralRadiol Endod 87(5)544-51.)。将各种溶液涂布在LA板上，将涂板的唾液样品在37℃没有通气下孵化过夜。计数并计算菌落，以确定该药物的杀微生物的效果。如上所述确定能养活的菌落形成单位(CFU)值。
抗疟疾测定 通过筛选下文表3中所提出的聚合物部分文库对培养的哺乳动物细胞的抗疟疾和溶血活性及其毒性，进行了本发明聚合物的抗疟疾活性研究。
寄生虫培养按照Kutner和同事所述[Kutner，S.，Breuer，W.V.，Ginsburg，H.，Aley，S.B.，和Cabantchik，Z.I.(1985)J Cell.Physiol.125，521-527]，使用人红细胞(RBC)培养不同菌株的镰状疟原虫。用山梨醇方法[Lambros，C.J.，和Vanderberg，J.P.(1979)J.Parasitol.65，418-420]同步培养，然后通过Percoll-丙氨酸梯度离心法[Kutner，S.，Breuer，W.V.，Ginsburg，H.，Aley，S.B.，和Cabantchik，Z.I.(1985)J.Cell.Physiol.125，521-527]从培养基中富集受感染的细胞。
IC50的测定在1％血细胞比容和2％寄生虫血症时，存在渐增浓度的测试聚合物下，培养了环形阶期(ring stage)的同步培养物。孵育18小时后，通过[3H]次黄嘌呤(Hx)摄取(终浓度为2μ Ci/ml)，6小时期间测定寄生虫成活力并与对照(不含聚合物)比较。使用商品化软件套Sigmaplot对数据进行非线性回归拟合，确定50％抑制浓度(IC50)。
聚合物的时间和阶期依赖性作用已知抗疟药在寄生虫发育不同的阶期产生不同的作用。它们也需要与寄生虫相互作用的最小时间，以抑制其生长。因此，在24孔板中，1％血细胞比容，2％寄生虫血症板培养基(没有次黄嘌呤的生长培养基，10mM NaHCO3和7％热灭活的人血浆)中接种环形阶期培养物。以不同的浓度立刻加入测试聚合物，在6、24和48小时后移开。让没有聚合物的培养物发育成熟至滋养体阶期(trophozoite stage)，配用化合物作用6和24小时。从实验开始的30小时后向所有细胞每孔加入2μCi Hx，24小时后采集细胞。
聚合物对培养中的哺乳动物细胞的影响将MDCK(狗肾细胞系)上皮细胞生长融合(约培养3天)。类似的培养物在测试聚合物的不同浓度下生长。此后，加入10μl Alamar蓝，3.5小时后测量荧光。至于阳性对照，在培养开始时向对照样品中加入10μM环己酰亚胺。
实验结果 聚合物文库的制备 按照上述的一般程序，制备了根据本发明聚合物的数个代表性系列(其大体上包含多个赖氨酸残基和作为疏水部分的ω氨基脂肪酸残基和脂肪酸残基)，并在下表3中提出。
这些示例性的聚合物在本节中是指根据下式 T[NCiK]jG 该式中，NCi表示ω氨基脂肪酸残基(根据本发明的示例性疏水部分，在本文所述的通式I中由D1...Dn表示)，由此i表示脂肪酸残基中的碳原子数目；K表示赖氨酸残基(根据本发明的示例性氨基酸残基，在本文所述的通式I中由A1...An表示，所以[NCiK]表示ω氨基脂肪酸-赖氨酸结合物残基(在本文所述的通式I中表示为[A1-Z1-D1]...[An-Zn-Dn])；j表示聚合物中特定结合物的重复单位的数目(相应于本文所述的通式I中的n)；T和G各自独立地表示氢(没有符号)、赖氨酸残基(表示为K)、ω氨基脂肪酸残基(表示为NCi)、脂肪酸残基(表示为Ci)、ω氨基脂肪酸-赖氨酸结合物残基(表示为[NCiK])、芴甲氧羰基残基(表示为Fmoc)、苄基残基(表示为Bz)、胆盐残基(表示为Ch1)、胺基(通常在C端形成酰胺和表示为NH2)、和游离酸残基(C端，没有符号)、醇残基和它们的任何组合(全部相应于本文所述的通式I中的X和Y)。
因此，例如根据本发明的一个聚合物，此处是指NC12K(NC8K)7NH2，相应于上文所述的通式I的聚合物，其中X为具有12个碳原子的ω氨基脂肪酸(12-氨基月桂酸)与赖氨酸结合的残基；n为6；A1...A6各自为赖氨酸残基；D1...D7全部为具有8个碳原子的ω氨基脂肪酸(8-氨基辛酸)残基；Z1...Z7和W0-W7全部为肽键；和Y为胺。为了清楚，NC12K(NC8K)7NH2的化学结构在以下方案2中提出方案2
最小抑菌浓度的测量 按照上文所述，测试了各个系列聚合物多种抗微生物活性。所得结果在下表3中提出，其中 “Q”代表在生理pH时全部分子的电荷(表3中第3栏)； “ACN(％)”代表聚合物被洗脱时HPLC-RP梯度流动相中的乙腈百分数，其相应于所评价聚合物的疏水性(表3中第4栏)； “LC50”代表通过人红细胞溶血的溶膜潜在性测定实验，按照上文所述测量，得到的以μM为单位的各个测试聚合物溶膜的浓度(表3中第5栏)； “MIC E.c.”代表按照上文抗菌活性测定中所述一样测量，以μM为单位的各个测试聚合物对大肠杆菌的最小抑菌浓度(表3中第6栏)； “MIC EDTA E.c.”代表按照上文提高外膜渗透性测定中所述一样测量，以μM为单位的各个测试聚合物对2mM EDTA存在下大肠杆菌培养的最小抑菌浓度(表3中第7栏)； “MIC P.a.”代表按照上文抗菌活性测定中所述一样测量，以μM为单位的各个测试聚合物对绿脓假单胞菌的最小抑菌浓度(表3中第8栏)； “MIC MR S.a.”代表按照上文耐抗生素细菌的抗菌活性测定中所述一样测量，以μM为单位的各个测试聚合物对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(表3中第9栏)； “MIC B.c.”代表按照上文抗菌活性测定中所述一样测量，以μM为单位的各个测试聚合物对蜡样芽胞杆菌的最小抑菌浓度(表3中第10栏)；和 ND表示“没有测定”。
一些值用±标准离均差表示。
在第84和85个中的“Orn”和“Arg”分别表示鸟氨酸和精氨酸氨基酸残基。
表3 物理参数(电荷和疏水性)对抗微生物活性的影响 电荷和疏水性可以看作是分子的不一致的两个物理特性电荷通过与极性水分子相互作用使化合物在水性介质中容易溶解，而疏水性(一般相应于非极性的碳氢化合物部分的数目和长度)妨碍溶解。这些物理特性的最佳化在开发一般药物和具体抗微生物剂中至关重要，因为这些特性影响药物重要的特点例如在生物系统中和在跨生物系统的膜渗透性和转运。
因此，为研究系列增加电荷和疏水性性质的影响，制备了聚合物文库，测量了如下抗微生物活性抗两种革兰阴性菌大肠杆菌(结果表示在上文表3中第6栏)和绿脓假单胞菌(结果表示在上文表3中第8栏)；和抗两种革兰阳性菌耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(结果表示在上文表3中第9栏)和蜡样芽胞杆菌(结果表示在上文表3中第10栏)。
通过制备就赖氨酸残基数目而论具有系列延长链的聚合物，实现系列增加正电荷。通过制备具有系列增加脂肪酸残基(作为代表性疏水部分)的数目和/或具有系列增加各个脂肪酸残基中的碳原子数目的聚合物，实现系列增加疏水性。通过制备具有系列增加赖氨酸-氨基脂肪酸结合物数目的聚合物，实现系列增加正电荷和疏水性。
如表3中所示，发现了通过从4至12个，经由8个碳原子地增加脂肪酸残基中的碳原子数增加聚合物疏水性，会影响聚合物的抗微生物活性。将其中重复疏水部分为4-氨基丁酸的聚合物系列(参见，表3中第1-24条)与其中重复疏水部分为8-氨基辛酸的系列(参见，表3中第25-53条)和与其中重复疏水部分为12-氨基月桂酸的系列(参见，表3中第54-95条)比较。结果(表3中给出的)表明其中重复疏水部分为4-氨基丁酸(参见，表3中第1-14条)和8-氨基辛酸(参见，表3中第25-53条)的聚合物在一直到最高试验浓度50μM时一般没有出现显著的抗微生物活性。序列中没有12-氨基月桂酸残基但在较低浓度出现显著的抗微生物活性的聚合物仅有C8K(NC8K)5NH2、C8K(NC8K)6和C8K(NC8K)7NH2(参见，表3中第6栏的第29-31条)，然而，包含一个或多个更多疏水性的12-氨基月桂酸残基聚合物，(参见，表3中第54-95条)，在像1.6μM一样低的浓度下出现了显著的活性。
以聚合物被洗脱时HPLC流动相的乙腈百分数的方式评价的聚合物疏水性的影响，进一步证明聚合物的这种性质和抗微生物活性之间的相互关系。如表3第4栏中所给出的数据所示，对任何一种试验细菌均显示显著水平的抗微生物活性的所有聚合物都在乙腈浓度高于36％时被洗脱，凭此，在乙腈浓度低于36％时被洗脱的聚合物没有一个显示这样的活性。
图1表示在所进行的四种测定的任何一种中显示出显著的微生物活性(MIC值小于50μM)的聚合物分布。如图1中清楚看到的，对一种或多种试验细菌的具有抗微生物活性的聚合物只显示于在36％和以上的乙腈洗脱浓度中，此外，发现对抗所有试验细菌有活性的聚合物在51％和以上乙腈浓度时洗脱。
如表3中进一步所示，发现了通过增加聚合物中赖氨酸残基的数目增加聚合物的正电荷，只边缘地影响聚合物的抗微生物活性。因此，测试了每个系列中具有净电荷+1至+9的聚合物的抗微生物活性。结果(表3中给出的)表明，例如具有最高净正电荷+9的大多数聚合物，即K(NC4K)7NH2、NC12K(NC4K)7NH2、K(NC8K)7NH2、NC12K(NC8K)7NH2、K(NC12K)7NH2、(NC12K)8NH2，(分别参见，表3中第14，24，38，52，64和71条)，没有显示显著的活性，唯有一NC12K(NC8K)7NH2(参见，表3中第52条)显示显著的活性。
下表4以聚合物净正电荷和其抗微生物活性的作用方式，提出这些实验中所获得结果的概要。表4的第2排表示9列(bins)中的聚合物数，其中每列代表从+9开始至+1的净正电荷。表4的第3排表示在电荷列中所测量的活性测定总数，就是，该列中聚合物数乘以上述的四个细菌测定。表4的第4排表示各自列中发现有抗四种细菌的任何一种的活性聚合物数。表4的第5排表示根据电荷列中测量的测定总数的活性聚合物百分数。如表4中所见，(例如第4排)，倘若发现了聚合物的净正电荷和其抗微生物活性之间的任何相互关系，那也只有一点点相关。这些结果显示似乎影响测试聚合物的抗微生物活性的唯一特征为大于+1的净正电荷。 表4 图2表示在上述提及的四种测定的任何一种中显示出显著的微生物活性(MIC值小于50μM)的根据本发明的聚合物分布。如图2中清楚看到的，对四种细菌的任何一种显示抗微生物活性聚合物分散在除+1电荷以外的整个电荷值范围内，因此证明聚合物的净正电荷和其抗微生物活性之间缺乏相关性。
细菌中抗微生物剂的抗药性发生 如上文实验方法部分所述，按照细菌对根据本发明的示例性聚合物的多样暴露，经测量MIC水平，测试了对本发明聚合物发生抗药性的可能性。在这些实验中，测试的聚合物为K(NC12K)3NH2、C12K(NC8K)5NH2和C12KKNC12KNH2，由此比较了大肠杆菌对K(NC12K)3NH2和C12K(NC8K)5NH2的抗药性发生与对三类经典抗生素庆大霉素、四环素和环丙沙星的抗药性发生，和比较了耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌对C12KKNC12KNH2的抗药性发生与对两类经典抗生素利福平和四环素的抗药性发生。
这些实验中获得的数据展示在图5a和5b中。图5a提出从K(NC12K)3NH2和C12K(NC8K)5NH2获得的数据。图5b提出从C12KKNC12KNH2获得的数据。
如图5a中清楚看到的，K(NC12K)3NH2和C12K(NC8K)5NH2抗大肠杆菌的MIC相对值在随着初始暴露后的10个连续次培养代中维持稳定。鲜明的对比，在同样时间期间，对照抗生素所测试的MIC值基本上增加，反映耐抗生素细菌出现。因此，在第十代，四环素和庆大霉素的MIC值增加至4倍，而环丙沙星增加至16倍以上。这些结果证明将细菌暴露给抗微生物的本发明聚合物不会导致抗药性发生。
如图5b中清楚看到的，C12KKNC12KNH2抗耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的MIC相对值在随着初始暴露后的15个连续次培养代中维持稳定。鲜明的对比，在同样时间期间，对照抗生素所测试的MIC值基本上增加，反映耐抗生素细菌出现。因此，在第十代，利福平的MIC值增加230倍以上而环丙沙星以大，和四环素增加至4倍。这些结果证明将细菌暴露给抗微生物的本发明聚合物不会导致抗药性发生。
在交叉抗药性实验中进一步评价了随着暴露给本发明聚合物后的抗微生物剂的抗药性发生，其中耐甲氧西林菌株的金黄色葡萄球菌暴露给本发明的示例性聚合物。该实验所获得的结果存在于上文表3中“MIC MR S.a.”栏下，清楚地证明了本发明聚合物对耐抗生素细菌持续的抗微生物活性，尤其为实例C12(KNC12K)2NH2、C12KKNC12KNH2、FmocK(NC12K)2、C12K(KNC12K)2NH2、C12OrnNC12OrnNH2、C12ArgNC12ArgNH2、C12KNC12KNH2、C12K(NC12K)2、C12K(NC8K)4NH2和C12KK(NC8K)4NH2(分别参见，表3中第79，78，95，80，84，85，54，87，42和53条)。
时间间隔的抗微生物活性的动力学研究 如同上述方法部分，以相应3和6倍的MIC值的浓度，测试了本发明代表性聚合物C12K(NC8K)5NH2杀菌活性的动力学速度。这些结果存在于图3中，清楚地反映聚合物的抗菌活性。如图3中所示，在6小时内暴露给3倍MIC的浓度聚合物和在2小时内暴露给6倍MIC的浓度聚合物，存活的细菌数减少几乎七个对数单位。
这些惊人的结果以有效的药代动力学性质进一步证明本发明聚合物的抗微生物效力。
提高外膜渗透性情况下的抗微生物活性 按照向测定缓冲液中添加阳离子螯合剂EDTA(其针对提高革兰阴性菌例如大肠杆菌外膜渗透性)所获得的结果列于上表3中标题“MICEDTA E.c”栏下。这些结果清楚地显示在EDTA存在下聚合物的活性谱不同于没有EDTA时所获得的结果(上表3中标题“MIC E.c”栏下)。因此，聚合物如K(NC8K)7NH2、NC12K(NC8K)4NH2、NC12K(NC8K)5NH2、C12K(NC12K)2NH2、K(NC12K)5NH2、K(NC12K)6NH2、K(NC12K)7NH2、(NC12K)4NH2、(NC12K)5NH2、(NC12K)6NH2、(NC12K)7NH2和(NC12K)8NH2，这些在没有E DTA存在下显示较小的或没有抗微生物活性，在E DTA存在下变得高达50倍以上的更多活性(分别参见，表3中第38，49，50，55，62，63，64，67，68，69，70和71条)。其它的聚合物，例如K(NC12K)4NH2、C8K(NC8K)5NH2、C12K(NC8K)4NH2、NC12K(NC8K)6NH2和(NC12K)3NH2，这些在没有EDTA存在下显示仅有边缘的抗微生物活性，在E DTA存在下各自变为11倍至4倍之间的更多活性(分别参见，表3中第61，29，42，51和66条)。
这些结果说明抗微生物剂的膜渗透性和其功效之间的紧密相关性，和进一步说明本发明聚合物在抗微生物活性上，其正电荷和疏水性质之间的合成关系和微妙的平衡。
对血浆蛋白酶的敏感性的测定结果 通过在人血浆(50％)中多种时间期内，预孵化根据本发明的示例性聚合物C12K(NC8K)5NH2、K(NC12K)3NH2、C12KNC12KNH2、和C12KKNC12KNH2、和示例性对照AMP 16残基dermaseptin S4衍生物(S416)，此后测定它们对抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性，评价本发明聚合物对酶裂解的敏感性。从至少两次重复进行的独立实验中获得统计学数据。
这些结果列于下文表5中，其中“MIC(E.c.)C12K(NC8K)5NH2(μM)”为测量大肠杆菌时C12K(NC8K)5NH2以μM为单位的最小抑菌浓度；“MIC(E.c.)K(NC12K)3NH2(μM)”为测量大肠杆菌时K(NC12K)3NH2以μM为单位的最小抑菌浓度；“MIC(E.c.)S416(μM)”为测量大肠杆菌时S416(用作对照AMP的示例性dermaseptin)以μM为单位的最小抑菌浓度；“MIC S.a.C12KNC12KNH2(μM)”为测量金黄色葡萄球菌时C12KNC12KNH2以μM为单位的最小抑菌浓度；和“MIC(S.a.)C12KKNC12KNH2(μM)”为测量金黄色葡萄球菌时C12KKNC12KNH2以μM为单位的最小抑菌浓度。
表5 如表5中所示，当对照AMP S416暴露给人血浆完全地失去活性时，本发明的聚合物维持它们的活性，因此，当与高活性但不稳定的AMPs相比时，清楚地证明了根据本发明聚合物具有优秀的稳定性。更特别地，如表5中所示，dermaseptin S416在暴露给血清酶3小时后没有显示可测量的MIC，甚至在比MIC值多于16倍高的浓度(大于50μM)时，这表明该肽可能由于酶蛋白水解作用灭活。
以鲜明的对比，本发明聚合物对酶降解显示出延长抵抗力。如表5中进一步所示，短聚合物例如C12KNC12KNH2和C12KKNC12KNH2的活性在暴露给血浆酶6小时后只减少只2倍，而更长的聚合物例如K(NC12K)3NH2和C12K(NC8K)5NH2甚至孵化18小时后也没有显示任何程度的失活。
溶血测定 如上文所述，测定本发明聚合物对人红细胞(红血球，RBC)毒性作用。这些结果列于表3中标题“LC50”栏下，以引起红血球在磷酸盐缓冲液(PBS)中50％(LC50)溶解的溶解浓度的表示。
如表3中所示，显示高抗微生物活性的聚合物例如C12K(NC8K)7NH2、C8(KNC12K)2NH2、C8K(KNC12K)2NH2、NC12K(KNC12K)2NH2、C12K(NC8K)5NH2、C12K(NC8K)6NH2、NC12(KNC12K)2NH2、C12KK(NC8K)4NH2、和K(NC12K)3NH2(分别参见表3中第45，76，77，83，43，44，82，53和60条)，显示低的溶血活性。如表3中进一步所示，特别地发现了包括与其N端结合的多种脂肪酸部分和/或相对大量数目的赖氨酸的聚合物，随同低的溶血活性一起显示有效的抗菌活性。这些结果清楚地证明本发明聚合物对人血细胞的低毒性。
圆二色性(CD) 如上文实验方法部分所述，通过在多种介质中的圆二色性(CD)测量，研究了根据本发明所选的聚合物的二级结构。图4中给出根据本发明的示例性抗微生物聚合物C12K(NC8K)5NH2和C12K(NC8K)7NH2，和示例性dermaseptin衍生物NC12K4S4(1-14)的CD图形。所给出的数据代表三次单独记录值的平均数。
如图4中所示，本发明聚合物的CD光谱显示最小近200nm，指示为随机结构(random structure)。在存在和缺失脂质体下所进行的测定中，观察同样的CD光谱。对照dermaseptin NC12K4S4(1-14)的CD光谱显示α-螺旋二级结构的一般光谱特征。在20％三氟代乙醇/水中观察相同的结果(数据没有展示)。
表面等离子共振测定 如上文方法部分所述，使用表面等离子共振(SPR)测量，研究了根据本发明的示例性聚合物与膜结合的性质。
所得到的数据表明根据本发明的聚合物显示对模拟细菌质膜的模型膜的高亲和结合力，其Kapp值为104至107/M-1)。图6，例如表示由C12K(NC8K)5NH2所得到的数据，证明根据本发明的示例性聚合物对模型膜的高亲和结合力(Kapp值为9.96×104M-1。
根据本发明另外的示例性抗微生物聚合物，K(NC12K)3NH2显示甚至更高亲和结合力(Kapp值为6.3×105M-1，数据没有显示)。
这些结果证实本发明聚合物对致病微生物膜的亲和力。
脂多糖结合测定 如上文方法部分所述，测量了根据本发明的正电荷聚合物对革兰阴性菌膜上存在的负电荷脂多糖(LPS)的亲合力。图8中，如同这些测定中的测量，表示根据本发明的七个示例性聚合物KNC8KNH2、K(NC8K)2NH2、K(NC8K)3NH2、K(NC8K)6NH2、KNC12KNH2、K(NC12K)2NH2、和K(NC12K)3NH2对用LPS孵化前和后的脂质体膜的最大结合水平。
如图8中所示，聚合物对膜的亲合力受到聚合物长度的影响。因此，例如K(NC8K)6NH2的亲合力高于KNC8KNH2的亲合力，和发现了K(NC12K)3NH2的亲合力高于KNC12KNH2的亲合力。
如图8中进一步所示，观察到聚合物的长度和其对LPS亲合力之间的同样的关系。因此，例如聚合物K(NC8K)6NH2和K(NC12K)3NH2各自对用LPS孵化后的脂质体膜显示出接近于2倍减少的亲和力，表明孵化时期内聚合物与LPS的结合，干扰了其与膜性脂质体的结合。
这些结果提供进一步支持了涉及与LPS强相互作用的聚合物的作用机理，其促进对抗细菌膜的破坏作用并因此减少内毒素血症的发生风险。
DNA结合测定 在1％琼脂糖胶中的凝胶电泳期间通过测定其延缓DNA质粒迁移的能力，研究了根据本发明的示例性聚合物对核苷酸的结合性质。
所得到的结果显示根据本发明的聚合物以剂量依赖性方式延缓多种质粒(例如，pUC19，pGL3 Luciferase Reporter Vector(Promega))的迁移。图7中表示在本发明的三个示例性聚合物C12KKNC12KNH2、K(NC4K)7NH2和C12K(NC8K)5NH2缺失和存在下用质粒pUC19获得的代表性结果(注解质粒从细菌培养物中分离导致三个主光带和数个次光带，如在最左边的凝胶紫外像的槽中所见)。在最短的测试聚合物C12KKNC12KNH2存在下明显的剂量依赖性行为是显而易见的。更长的测试聚合物K(NC4K)7NH2和C12K(NC8K)5NH2进一步强调了剂量依赖性行为。因此，在C12KKNC12KNH2的最低剂量(聚合物与DNA比例为1∶1)下，超螺旋的质粒DNA光带消失，而其它光带显示轮廓不清的图像。这些结果提示本发明聚合物对超螺旋DNA较高的抑制效果。增加聚合物的剂量导致增强的效果，以致迟缓效果扩展到所有DNA种类。
此外，发现了多种聚合物-DNA复合物在暴露给DNA酶消化酶或肽酶消化酶后保持完整。这些发现揭示本发明聚合物和DNA分子之间的紧密结合，显示聚合物对DNA分子施加的和反之亦然的相互屏蔽。
唾液杀微生物测定 如上所述，研究了本发明的示例性聚合物C8K8对抗人唾液中的微生物的抗微生物活性。图9表示本研究得到的结果，其根据每ml的CFU对数单位作为样品孵化时间的函数，该样品用载体缓冲液(对照)、IB-367(已知活性的抗微生物剂对照)和C8K8。这些结果表示在对照的未治疗组中，唾液微生物没有任何治疗，持续存在并增生，对照的处理过的唾液微生物的生长受到抑制但在30分钟后重新开始增生；由此用根据本发明的聚合物治疗过的唾液微生物的生长受到不能恢复的抑制。
抗疟疾测定 测试了根据本发明的一组聚合物对寄生虫生长和哺乳动物细胞的抗疟的效果。获得的结果表示在下表6中，其中 “寄生虫的IC50(μM)”代表按照上文所述一样的测量，以μM为单位的测试聚合物浓度，该浓度要求50％的抑制引起疟疾的寄生虫的生长(表6中第3栏)； “MDCK的IC50(μM)”代表按照上文所述一样的测量，以μM为单位的测试聚合物浓度，该浓度要求50％的抑制MDCK细胞的生长(表6中第3栏)；和 “IC50比率”代表MDCK的IC50对寄生虫的IC50比率，指示聚合物对寄生虫膜的特异性超过对哺乳动物细胞的特异性。 表6 如表6所示，一些聚合物显示出非常高的抗疟原虫活性，具有微克分子以下(sub-micromolar)范围的IC50，如表示寄生虫的IC50的栏中所示(μM)(参见上表6中D和E条)。此系列显现出来的构效关系结论为链的延长增加抗疟活性(减少IC50)。在赖氨酸的N端存在烷基部分，常常增加抗疟活性(参见上表6中G和A条、H和C条、和I和E条)。至于一些聚合物，氨基基团进一步增加活性(参见上表6中C和D条)，但这种表现不一定一致(参见上表6中A和B条、和E和条F)。
本发明聚合物对MDCK细胞的效果有类似的一致性。在赖氨酸的N端添加烷基导致减少活性(参见上表6中G和A条、H和C条、和I和E条)。氨基基团部分通常导致减少活性(参见上表6中A和B条、和C和D条)，但最长的聚合物观察到相反的效果(参见上表6中E和条F)。
IC50的比率基本上等同治疗比率。因此上表6中D和E条显示根据本发明的治疗最有效的聚合物。
用初级培养的心脏成纤维细胞(CF)和HepG2变异细胞获得相似的结果(结果没有展示)。
为了进一步研究关于聚合物的长度和疏水部分残基长度的构效关系，测试另一个系列的聚合物的抗疟活性。
如下表7中所示，其中“IC50(μM)”代表以μM为单位的测试聚合物浓度，该浓度要求50％的抑制引起疟疾的寄生虫的生长，如上文所述一样测量(表7中第3栏)，该结果指示添加辛酸(C8)至赖氨酸残基N端相当大地增加抗疟效能(最高达67倍)，但是当链长增长时，这种增幅减少。用月桂酸(C12)取代C8导致进一步增加抗疟效能(最高达20倍)，而在该端用ω氨基月桂酸(NC12)取代大量地恢复该效能。
在C12K(NC8K)nNH2组中最活性的聚合物之间，抗疟效能随着聚合物长度长度而减少(参见，下表7中第15-21条)。至于非酰化(在N端)基团K(NC8K)nNH2(参见，下表7中第1-7条)，尽管它们显示整体较低的活性，观察到相反的趋势。至于其它的组观察不到这样一致趋势。
该系列的聚合物在至少比各自IC50值2倍高的浓度下，没有一个使受染的RBC溶解(数据没有展示)。
表7 通过在环和滋养体阶期暴露寄生虫培养物给多种时间长度和不同的聚合物浓度，测试了聚合物C12K(NC12K)3NH2的抗疟效果(参见上表6中的E条)，除去该聚合物并在48小时后使用次黄嘌呤掺入试验，测试了受到不同处置的所有培养物的寄生虫成活力。
计算每个处置的IC50的耐氯喹FCR3菌株对氯喹敏感NF54菌株，该结果展示在图10中。如10中所见，环形阶期比滋养体阶期对聚合物更敏感，滋养体阶期中发挥抑制作用也需要化更长的时间。似乎在其IC50值48小时的累积效果也比暴露更短时间所观察的那些更低。
在不同阶期将寄生虫培养物暴露给C12KNC8KNH2(参见上表7中第15条)的时间对寄生虫成活的效果展示在图11中。如图11中所见，结果表明环和滋养体阶期对C12KNC8KNH2几乎是相同的敏感，然而，在环形阶期为了发挥完全的抑制活性，要求24小时周期，至于滋养体阶期要求更多的时间周期。
可以理解本发明的某些特征(为了清楚，在单独实施方案的上下文中描述它们)，也可以在单一实施方案中将它们组合提供。相反地，本发明的多种特征(为了简洁，在单一实施方案的上下文中描述它们)，也可以分别地或将它们以任何适当的子组合体(subcombination)提供。
尽管本发明结合其具体的实施方案描述，显然地，许多替代物、变体和变化对本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，打算包括所有这样的替代物、变体和变化，这些落在所附的权利要求书的精神和概况的范围内。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请书，在此将其全部内容作为参考并入本说明书，达到如每个个体出版物、专利或专利申请书特别地和个别地指出在此引入作为参考的相同程度。此外，本说明书中任何参考的引文或证明不应该解释为承认这样的参考对本发明是可获得的现有技术。
权利要求
1.包含多个氨基酸残基和至少一个疏水部分残基的聚合物，其中所述至少一个疏水部分残基中的至少一个与所述多个氨基酸残基中的至少两个氨基酸残基，经由所述至少两个氨基酸残基中的一个氨基酸残基的N-α和经由另一个氨基酸残基的C-α，以共价键连接。
2.权利要求1的聚合物，具有抗微生物活性。
3.权利要求2的聚合物，能够有选择地破坏致病微生物的至少一部分细胞。
4.权利要求3的聚合物，其中所述的致病微生物选自原核生物、真细菌、古细菌、真核生物、醇母、真菌、藻类、原生生物和寄生虫。
5.权利要求1的聚合物，包含至少两个疏水部分残基，其中所述至少两个疏水部分残基中的至少一个在所述多个氨基酸残基的N端与氨基酸残基的N-α和/或在所述多个氨基酸残基的C端与氨基酸残基的C-α连接。
6.权利要求1的聚合物，包含至少两个疏水部分残基，其中所述至少两个疏水部分残基中的至少一个与所述多个氨基酸残基的氨基酸残基的侧链连接。
7.权利要求1的聚合物，其中所述的多个氨基酸残基包括至少一个正电荷氨基酸残基。
8.权利要求1的聚合物，其中所述的至少一个疏水部分残基与所述至少两个氨基酸残基中的至少一个经由肽键连接。
9.权利要求1的聚合物，其中所述的至少一个疏水部分残基与所述至少两个氨基酸残基中的每个经由肽键连接。
10.权利要求5的聚合物，其中所述的至少一个疏水部分残基与所述氨基酸残基的所述N-α经由肽键连接。
11.权利要求5的聚合物，其中所述的至少一个疏水部分残基与所述氨基酸残基的所述C-α经由肽键连接。
12.权利要求9的聚合物，其中所述的至少一个疏水部分在其一个末端具有羧基基团和在其另一个末端具有胺基团。
13.权利要求1的聚合物，其中所述的多个氨基酸残基包括2至50个氨基酸残基。
14.权利要求7的聚合物，其中所述至少一个正电荷氨基酸残基选自组氨酸残基、赖氨酸残基、鸟氨酸残基和精氨酸残基。
15.权利要求1的聚合物，包括1至50个疏水部分残基。
16.权利要求1的聚合物，其中所述的疏水部分残基包括至少一个烃链。
17.权利要求1的聚合物，其中所述的疏水部分残基包括至少一个脂肪酸残基。
18.权利要求17的聚合物，其中所述的至少一个脂肪酸残基选自未分支的饱和脂肪酸残基、分支的饱和脂肪酸残基、未分支的不饱和脂肪酸残基、分支的不饱和脂肪酸残基和它们的任何组合。
19.权利要求17的聚合物，其中所述的脂肪酸残基选自丁酸残基、辛酸残基和月桂酸残基。
20.权利要求12的聚合物，其中所述的至少一个疏水部分是ω氨基脂肪酸残基。
21.权利要求20的聚合物，其中所述的疏水部分选自4-氨基丁酸、6-氨基已酸、8-氨基辛酸、10-氨基癸酸、12-氨基月桂酸、14-氨基肉豆蔻酸、16-氨基棕榈酸、18-氨基硬脂酸、18-氨基油酸、16-氨基棕榈油酸、18-氨基亚油酸、18-氨基亚麻酸和20-氨基花生四烯酸。
22.权利要求20的聚合物，其中所述的疏水部分选自4-氨基丁酸、8-氨基辛酸和12-氨基月桂酸。
23.权利要求7的聚合物，其中所述的多个氨基酸残基基本上由正电荷氨基酸残基组成。
24.权利要求23的聚合物，其中所述正电荷氨基酸残基选自赖氨酸残基、组氨酸残基、鸟氨酸残基、精氨酸残基和它们的组合。
25.权利要求1的聚合物，进一步包括至少一种与其连接的活性剂。
26.权利要求25的聚合物，其中所述的至少一种活性剂为标记试剂。
27.权利要求26的聚合物，其中所述的标记试剂选自荧光试剂、放射性试剂、磁性试剂、发色团、磷光性试剂和重金属簇。
28.权利要求25的聚合物，其中所述的至少一种活性剂包括至少一种治疗活性剂。
29.权利要求28的聚合物，其中所述的至少一种治疗活性剂选自激动剂残基、氨基酸残基、止痛剂残基、拮抗剂残基、抗生素残基、抗体残基、抗抑郁剂、抗原残基、抗组胺残基、抗高血压剂、抗炎药物残基、抗代谢剂残基、抗微生物剂残基、抗氧化剂残基、抗增殖药物残基、反义残基、化疗药物残基、辅助因子残基、细胞因子残基、药物残基、酶残基、生长因子残基、肝素残基、激素残基、免疫球蛋白残基、抑制剂残基、配体残基、核苷酸残基、寡聚核苷酸残基、肽残基、磷脂残基、前列腺素残基、蛋白质残基、毒素残基、维生素残基和它们的任何组合。
30.权利要求25的聚合物，能够将至少一种活性剂释放给至少一部分的致病微生物细胞。
31.权利要求30的聚合物，其中所述的致病微生物选自原核生物、真细菌、古细菌、真核生物、醇母、真菌、藻类、原生生物和寄生虫。
32.权利要求30的聚合物，其中所述的至少一种活性剂为标记试剂。
33.权利要求30的聚合物，其中所述的至少一种活性剂包括至少一种治疗活性剂。
34.具有通式I的聚合物
X-W0-[A1-Z1-D1]-W1-[A2-Z2-D2]-W2-...[An-Zn-Dn]-Wn-Y
式I
其中
n为2至50的整数；
A1，A2，...，An各自独立地为氨基酸残基；
D1，D2，...，Dn各自独立地为疏水部分残基或缺失，条件是所述的D1，D2，...，Dn中至少一个为所述的疏水部分残基；
Z1，Z2，...，Zn和W0，W1，W2，...，Wn各自独立地为连接氨基酸残基与疏水部分残基的连接部分，或缺失；
X和Y各自独立地为氢、氨基酸残基、疏水部分残基或具有所述的通式I。
35.权利要求34的聚合物，具有抗微生物活性。
36.权利要求35的聚合物，能够有选择地破坏致病微生物的至少一部分细胞。
37.权利要求36的聚合物，其中所述的致病微生物选自原核生物、真细菌、古细菌、真核生物、醇母、真菌、藻类、原生生物和寄生虫。
38.权利要求34的聚合物，其中至少一个所述的氨基酸残基为正电荷氨基酸残基。
39.权利要求38的聚合物，其中所述的正电荷氨基酸残基选自组氨酸残基、赖氨酸残基、鸟氨酸残基和精氨酸残基。
40.权利要求38的聚合物，其中每个所述的氨基酸残基为正电荷氨基酸残基。
41.权利要求40的聚合物，其中所述的正电荷氨基酸残基选自组氨酸残基、赖氨酸残基、鸟氨酸残基和精氨酸残基。
42.权利要求34的聚合物，其中X为疏水部分残基。
43.权利要求34的聚合物，其中Y为疏水部分残基。
44.权利要求34的聚合物，其中每个X和Y为疏水部分残基。
45.权利要求34的聚合物，其中至少一个所述的氨基酸残基具有与其侧链连接的疏水部分残基。
46.权利要求34的聚合物，其中所述的W0，W1，W2，...，Wn和所述的Z1，Z2，...，Zn中至少一个为肽键。
47.权利要求34的聚合物，其中每个所述的W0，W1，W2，...，Wn和所述的Z1，Z2，...，Zn均为肽键。
48.权利要求34的聚合物，其中所述的D1，D2，...，Dn中至少一个为ω氨基脂肪酸残基。
49.权利要求34的聚合物，其中至少一个所述的疏水部分残基包括至少一个烃链。
50.权利要求34的聚合物，其中至少一个所述的疏水部分残基包括至少一个脂肪酸残基。
51.权利要求50的聚合物，其中所述的至少一个脂肪酸残基选自丁酸残基、辛酸残基和月桂酸残基。
52.权利要求48的聚合物，其中所述的至少一个ω氨基脂肪酸残基选自4-氨基丁酸、6-氨基已酸、8-氨基辛酸、10-氨基癸酸、12-氨基月桂酸、14-氨基肉豆蔻酸、16-氨基棕榈酸、18-氨基硬脂酸、18-氨基油酸、16-氨基棕榈油酸、18-氨基亚油酸、18-氨基亚麻酸和20-氨基花生四烯酸。
53.权利要求34的聚合物，进一步包括至少一种与其连接的活性剂。
54.权利要求53的聚合物，其中所述的至少一种活性剂为标记试剂。
55.权利要求53的聚合物，其中所述的至少一种活性剂包括至少一种治疗活性剂。
56.药物组合物，包括作为活性成分的权利要求1的聚合物和药学上可接受的载体。
57权利要求56的药物组合物，包装在包装材料中并在所述包装材料中或上印刷标识，用于治疗致病微生物相关的医学疾病。
58.权利要求57的药物组合物，其中所述的致病微生物选自原核生物、真细菌、古细菌、真核生物、醇母、真菌、藻类、原生生物和寄生虫。
59.权利要求56的药物组合物，进一步包括至少一种另外的治疗活性剂。
60.权利要求59的药物组合物，其中所述的至少一种治疗活性剂选自激动剂、止痛剂、拮抗剂、抗生素、抗体、抗抑郁剂、抗原、抗组胺、抗高血压药、抗炎药物、抗代谢剂、抗微生物剂、抗氧化剂、抗增殖剂、反义药(antisense)、化疗药物、辅助因子、细胞因子、酶、生长因子、激素、免疫球蛋白、抑制剂、配体、核苷酸、寡聚核苷酸、前列腺素、毒素、维生素和它们的任何组合。
61.权利要求59的药物组合物，其中所述的至少一种另外的治疗活性剂包括抗生素。
62.治疗致病微生物相关的医学疾病的方法，该方法包括给需要它的受治疗者施用治疗有效量的权利要求1的聚合物。
63.权利要求1的聚合物的用途，用于治疗致病微生物相关的医学疾病。
64.权利要求1的聚合物用于制备治疗致病微生物相关医学疾病的药物的用途。
65.权利要求62-64的任何一项的方法或用途，其中所述的致病微生物选自原核生物、真细菌、古细菌、真核生物、醇母、真菌、藻类、原生生物和寄生虫。
66.权利要求62的方法，其中所述的施用是经口服、直肠、静脉内、局部、鼻内、皮内、经皮肤、皮下、肌内、腹膜内或鞘内导管实现。
67.权利要求62的方法，进一步包括给所述的受治疗者施用至少一种治疗活性剂。
68.权利要求63的用途，其中所述的聚合物与至少一种治疗活性剂组合使用。
69.权利要求67和68的任何一项的方法或用途，其中所述的至少一种治疗活性剂选自激动剂、止痛剂、拮抗剂、抗生素、抗体、抗抑郁剂、抗原、抗组胺、抗高血压药、抗炎药物、抗代谢剂、抗微生物剂、抗氧化剂、抗增殖剂、反义药、化疗药物、辅助因子、细胞因子、酶、生长因子、激素、免疫球蛋白、抑制剂、配体、核苷酸、寡聚核苷酸、前列腺素、毒素、维生素和它们的任何组合。
70.权利要求67和68的任何一项的方法或用途，其中所述的至少一种治疗活性剂包括抗生素。
71.权利要求62的方法，其中所述的聚合物以本身或作为药物组合物的一部分施用，所述的药物组合物进一步包括药学上可接受的载体。
72.医学装置，其包括权利要求1的聚合物和配置用于递送该聚合物至受治疗者身体部位的递送系统。
73.权利要求72的医学装置，其中所述的聚合物组成药物组合物的一部分，所述的药物组合物进一步包括药学上可接受的载体。
74.权利要求72的医学装置，其中所述的递送是经吸入实现。
75.权利要求72的医学装置，其中所述的递送是经皮肤实现。
76.权利要求72的医学装置，其中所述的递送是经局部实现。
77.权利要求72的医学装置，其中所述的递送是经身体器官内植入医学装置实现。
78.食品防腐剂，包括有效量的权利要求1的聚合物。
79.权利要求78的食品防腐剂，进一步包括可食用的载体。
80.用于探测致病微生物的成像探针，该成像探针包括聚合物，该聚合物包括多个氨基酸残基和至少一个疏水部分残基，其中所述至少一个疏水部分残基中的至少一个与所述多个氨基酸残基中的至少两个氨基酸残基，经由所述至少两个氨基酸残基中的一个氨基酸残基的N-α和经由另一个氨基酸残基的C-α，以共价键连接，同时该聚合物进一步包括至少一种与其连接的标记试剂。
81.权利要求80的成像探针，其中所述的至少一种标记试剂与所述聚合物的所述多个氨基酸残基的至少一个氨基酸残基的侧链连接。
82.权利要求80的成像探针，其中所述的至少一种标记试剂与所述聚合物的所述多个氨基酸残基的C端和/或N端连接。
83.权利要求80的成像探针，其中所述的至少一种标记试剂与所述聚合物的所述至少一个疏水部分残基中的至少一个连接。
84.权利要求80的成像探针，其中所述的至少一种标记试剂选自发色团、荧光试剂、磷光性试剂、重金属簇和放射性试剂。
全文摘要
本发明公开了一类新的抗微生物聚合物和其制备方法，该聚合物被设计为发挥抗微生物活性，同时具有稳定、无毒和避免对其发生抗药性。进一步公开了包含该聚合物的药物组合物和利用该聚合物治疗病态微生物相关的医学疾病的方法、医学装置、成像探针和食品防腐剂。进一步公开了氨基酸残基和疏水部分残基的结合物和其制备方法。
文档编号A61P31/04GK101065131SQ20058004018
公开日2007年10月31日 申请日期2005年9月26日 优先权日2004年9月27日
发明者A·莫尔, I·拉德兹舍夫斯基 申请人:技术研究及发展基金有限公司