专利名称：三氧化二砷在离子交换蛋白中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及三氧化二砷的新用途，具体是指三氧化二砷作为激动剂在离子交换蛋白中的应用。
背景技术：
三氧化二砷(Arsenic(III)oxide)的结构式为 化学式As2O3，分子量197.84，性状三氧化二砷有非晶系、等轴晶系、单斜晶系的结晶或无色粉末三种状态。它们既容易被还原也容易被氧化。熔点砷华275℃白砷石313℃，溶解度2g/100ml。三氧化二砷具有抗肿瘤药物作用。在中国专利申请号CN02132755.6，公开了一种防治血管再狭窄的药物，它是用三氧化二砷作为制备防治血管再狭窄的局部给药的药物应用。该药物具有明显的抑制损伤处血管内膜增生、防治再狭窄的作用。在中国专利申请号CN200410043871.8，公开了一种治疗恶性脑肿瘤的三氧化二砷局部缓释化疗药。该发明是由三氧化二砷和高分子生物分解型多聚体材料的复合，采用聚合物药剂复合法将抗肿瘤作用的三氧化二砷融合于可降解的聚合物高分子聚合物中。通过聚合物的溶蚀和水解，将药物缓慢、持续、稳定地释放并发挥作用。但是，至今为止尚未见到有关三氧化二砷作为激动剂在离子交换蛋白中的应用的报道。阴离子交换蛋白2(AE2)是阴离子交换蛋白家族成员，在细胞膜上普遍存在，其功能是调节细胞内外酸碱平衡、细胞体积和细胞稳态。各国科学家都对其进行着结构与功能的研究，在研究过程中，如能够有它的激动剂、抑制剂，将使对阴离子交换蛋白2的研究更深入和便利。目前市场上只有阴离子交换蛋白2抑制剂，无激动剂报道及研发。
发明内容
本发明的目的在于扩展三氧化二砷的用途，将其作为激动剂在离子交换蛋白中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的本发明涉及三氧化二砷作为激动剂在离子交换蛋白中的应用。涉及三氧化二砷作为激动剂在阴离子交换蛋白中的应用。还涉及三氧化二砷作为激动剂在阴离子交换蛋白2中的应用。
为了更好的理解本发明，发明人采用急性粒细胞性白血病细胞系NB4，急性单核细胞性白血病细胞系U937，急性粒细胞性白血病细胞系HL-60，Kasumi-1以及慢性髓性白血病细胞系K562进行了以下实验免疫印迹法、流式细胞仪检测细胞凋亡、白血病细胞分化检测、半定量RT-PCR、离子交换活性的检测。结果显示了三氧化二砷明显促进AE2的离子转运活性。进一步说明三氧化二砷是AE2激动剂。
本发明所公开三氧化二砷在离子交换蛋白中的应用，其优点表现在开发出阴离子交换蛋白2的激动剂，可作为试剂供今后实验室研究使用。
由于阴离子交换蛋白2调节细胞内外酸碱平衡、细胞体积和细胞稳态，如阴离子交换蛋白2功能低下会导致疾病，而它的激动剂可通过刺激阴离子交换蛋白2的功能而发挥治疗作用。因此该发明有申请国家新药的前景。
图1三种浓度0.5(A)，1(D)，2(E)μM三氧化二砷与NB4细胞(白血病细胞)进行孵育0-48小时，分别用蛋白印记检测AE2表达发现0.5uM一直上调AE2表达，1，2μM浓度先上调后下调AE2表达。对0.5μM上调AE2表达进行RNA水平的分析(B和C)显示RNA并不升高，说明三氧化二砷直接结合AE2并稳定AE2蛋白质结构。
图2用离子成像分析系统对单细胞的离子转运活性进行分析，发现三氧化二砷明显促进AE2的离子转运活性，DIDS(4，4.di-isothiocyanostilbene-2，2.-disulphonate)为已知的AE2抑制剂。
图3三氧化二砷具有降解细胞内RARa蛋白的作用，用AE2抑制剂明显减轻了RARa的降解，进一步说明三氧化二砷是AE2激动剂。
图4三氧化二砷具有诱导细胞凋亡的作用，用流式和细胞计数的方法进一步证明1和2μM诱导的NB4细胞凋亡可以被AE2抑制剂DIDS阻断。A，流式图；B，A的三组数据统计结果，横坐标为分组，纵坐标为凋亡细胞比率；C，NB4细胞计数；D，不表达AE2的Kasumi-1细胞进行对照。纵坐标为凋亡细胞数。
分组1，不加药对照；2，加DIDS；3，加1μM三氧化二砷；4，加2μM三氧化二砷；5，加1μM三氧化二砷+DIDS；6，加2μM三氧化二砷+DIDS。
图5三氧化二砷具有使线粒体膜电位崩塌并诱导细胞凋亡的作用，用流式和蛋白免疫印记的方法进一步证明1和2μM诱导的NB4细胞线粒体膜电位崩塌可以被AE2抑制剂DIDS阻断。A，NB4流式图；B，对照Kasumi-1细胞；C和D分别为A和B的三组数据统计结果，Bcl-2和Mcl-1为抗凋亡蛋白，Bax为诱导凋亡蛋白。分组1，不加药对照；2，加DIDS；3，加1μM三氧化二砷；4，加2μM三氧化二砷；5，加1μM三氧化二砷+DIDS；6，加2μM三氧化二砷+DIDS。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1细胞培养和处理急性粒细胞性白血病细胞系NB4(由Michael Lannotte21博士提供)，急性单核细胞性白血病细胞系U937，急性粒细胞性白血病细胞系HL-60，Kasumi-1以及慢性髓性白血病细胞系K562(来自中国上海生命科学院细胞库)用含有10％加热后胎牛血清的1640培养液，在37℃，含5％CO2的空气以及湿润的条件下进行培养。在进行实验的时候，细胞以2-5×105个/ml的密度接种，加入指定浓度的As2O3或者AE蛋白特异性抑制剂DIDS(Sigma)。细胞活率用trypan-blue检测。
免疫印迹法准备好的样品用9％-10％的SDS-聚丙烯酰胺分析，电转移到硝酸纤维膜上(Amersham Bioscience，UK)。用0.2％的丽春红染色确保蛋白条带的存在。用含5％的TBS封闭以后，分别和AE2的抗体，RARα的抗体，PML的抗体(Santa cruz，RA)，Na+-K+-ATP酶抗体(Sigma，RA)及β-actin抗体(Oncogene，MA)孵育.用辣根过氧化物酶(Cell Signaling，Beverly，MA)按照使用说明检测信号。所有实验均重复至少三次并获得相似结果。流式细胞仪检测细胞凋亡用线粒体跨膜电位与Annexin V在流式细胞仪上检测凋亡细胞。用PBS悬浮大约106个细胞和10μg/ml的rhodamine 123(Rh123，Sigma，St.Louis，MO)在37℃孵育30分钟。然后用PBS洗一次，再用50μg/ml的propidium iodide(PI，Sigma，St.Louis，MO)染色，用流式细胞仪(Beckman Counter)分别检测Rh123和PI的荧光的强度。Annexin V检测使用的是ApoAlert Annexin V kit(BD Biosciences，Palo Alto，CA)，同样也是用流式细胞仪(Beckman Coulter，Miami，FL)来检测。
白血病细胞分化检测用鼠抗CD11b及CD11c的抗体通过流式细胞仪来检测白血病细胞的分化。简单来说，用100μl的磷酸缓冲液(PBS)重悬细胞，然后用phycoerythrin(PE)标记的抗CD11c(Beckman)抗体或者fluoresceinisothiocyanate(FITC)标记的抗鼠的CD11b(Beckman)抗体在暗室冰上孵育30分钟。PE或FITC标记的抗鼠抗体用作非特异阴性对照。细胞洗过之后用流式细胞仪检测(Beckman Coulter，Miami，FL)，每个样品至少需要100,000个细胞。
半定量RT-PCR用Trizol试剂(Invitrogen，USA)从细胞中抽提总RNAs。然后用TaKaRa RNA PCR kit(Takara，Dalian，China)按照指示进行逆转录。AE2和β-actin的cDNAs使用以下引物来扩增AE2的是CGG CGG TGAGAA CAT(上游)和GGC ATG GGC ATC TCA TTG(下游)，-actin cDNA的是CAT CCT CAC CCT GAA GTA CCC(上游)和AGC CTG GAT AGC AAC GTACAT G(下游).PCR的扩增使用了35个循环。用94℃，30s进行变性，58℃，45s进行退火，72℃，60s进行延伸。使用的PCR仪是GeneAmp PCR System 9600(Perkin-Elmer，Norwalk，CT，USA)，用β-actin的信号强度来校准扩增AE2片段的信号强度。
离子交换活性的检测将HEK-293T田胞接种在35mm的玻璃皿上，用不含血清的培养液洗过之后用1ml含2μM BCECF-AM的不含血清的培养液在37℃孵育20分钟。然后用不含血清的培养液洗两遍，再用含Cl-的Ringer′s缓冲液(5mM glucose，5mM potassium gluconate，1mM calcium gluconate，1mMMgSO4，2.5mM NaH2PO4，25mM NaHCO3，10Mm Hepes pH7.4)在黑暗中孵育20分钟。玻璃皿用含140mM NaCl的Ringer′s缓冲液和含140mMsodium gluconate的Ringer′s缓冲液交替的进行微灌流，同时还在上述两种灌流液中分别加入了As2O32μM，以及阴离子交换蛋白抑制剂DIDS100μM进行微灌流。用装备有NIKON TE2000E Microscope，HAMAMATSU IRCCD JVC color video monitor，DAD-8VCPP 8pinch valve灌流系统(激发波长440 and 490nm，发射波长528.7nm.)的离子成像仪来获得并记录下荧光图象。然后用高钾尼日利亚菌素法通过在四个pH值6.5，7.0，7.5和8.0的荧光强度校正来得到pH曲线。在单个HEK293T细胞内的Cl-/HCO3交换活性通过Cl-的渗出以及重新渗入时引起的与pH曲线线形相关变化得到。
结果1、三种浓度0.5(A)，1(D)，2(E)μM三氧化二砷与NB4细胞(白血病细胞)进行孵育0-48小时，分别用蛋白印记检测AE2表达发现0.5μM一直上调AE2表达，1，2μM浓度先上调后下调AE2表达。对0.5μM上调AE2表达进行RNA水平的分析显示RNA并不升高，说明三氧化二砷直接结合AE2并稳定AE2蛋白质结构。
2、用离子成像分析系统对细胞的离子转运活性进行分析，发现三氧化二砷明显促进AE2的离子转运活性。
3、三氧化二砷具有降解细胞内RARa蛋白的作用，用AE2抑制剂明显减轻了RARa的降解，进一步说明三氧化二砷是AE2激动剂。
4、三氧化二砷具有诱导细胞凋亡的作用，用流式和细胞计数的方法进一步证明1和2μM诱导的NB4细胞凋亡可以被AE2抑制剂DIDS阻断。
5、三氧化二砷具有使线粒体膜电位崩塌并诱导细胞凋亡的作用，用流式和蛋白免疫印记的方法进一步证明1和2μM诱导的NB4细胞线粒体膜电位崩塌可以被AE2抑制剂DIDS阻断。
权利要求
1.三氧化二砷作为激动剂在离子交换蛋白中的应用。
2.三氧化二砷作为激动剂在阴离子交换蛋白中的应用。
3.三氧化二砷作为激动剂在阴离子交换蛋白2中的应用。
全文摘要
本发明涉及三氧化二砷的新用途，具体是指三氧化二砷作为激动剂在离子交换蛋白中的应用。其优点表现在开发出阴离子交换蛋白2的激动剂，可作为试剂供今后实验室研究使用；由于阴离子交换蛋白2调节细胞内外酸碱平衡、细胞体积和细胞稳态，如阴离子交换蛋白2功能低下会导致疾病，而它的激动剂可通过刺激阴离子交换蛋白2的功能而发挥治疗作用。因此该发明有申请国家新药的前景。
文档编号A61P43/00GK1861096SQ200610024909
公开日2006年11月15日 申请日期2006年3月21日 优先权日2006年3月21日
发明者傅国辉 申请人:上海交通大学医学院