专利名称：林蛙抗癌肽及其制备方法
技术领域：
本发明属于抗癌药物和保健品及其制备领域，特别涉及一种林蛙皮肤抗癌肽药物及其制备方法。
背景技术：
林蛙(Rana chensinensis)是我国东北地区长白山麓药、食两用的珍贵蛙种。林蛙是两栖类动物，生存环境复杂多样，它们的皮肤在维持它们生存和适应广阔栖息地中起着重要作用，为了适应生存环境，蛙类的皮肤中分布了种类繁多、具有特殊分子结构、功能复杂的生物活性物质，是一个巨大的生物活性分子资源库和药物资源库。
目前，国内对林蛙干皮抗菌肽进行了研究，申报的专利也在增多，以林蛙、皮肤和肽为关键词，检索国内外专利，没有查到国外关于林蛙的专利，国内4篇。其中CN1216768A“生物抗菌肽及其制备方法”是涉及一种具有广谱抗菌活性的林蛙蛙皮生物抗菌肽及其制备方法；CN1583166A“林蛙抗菌肽喷雾剂及其制备方法”、CN1583165A“林蛙抗菌肽凝胶剂及其制备方法”是涉及保护林蛙皮肤抗菌肽以喷雾剂和凝胶剂两种形式用于临床皮肤感染、烧伤烫伤感染领域；CN1679632A“林蛙镇痛水提物及其制备方法及”是关于保护从林蛙干皮中提取的一种具有镇痛作用的林蛙镇痛水提物及其制备技术。没有检索到林蛙蛙皮抗癌活性肽的研究和专利。
本发明从林蛙皮肤中提取的具有抗癌活性的生物活性肽，经Sephadex G-50柱层析分离得到林蛙抗癌肽。并将得到的产品用于体内和体外的抗癌作用研究，结果显示林蛙抗癌肽白对S180胃肉瘤、白血病K562细胞、乳腺癌MCF·7细胞、卵巢癌SKOV3细胞、宫颈癌Hela细胞、肝癌HepG2细胞和肝癌7721细胞有明显的抑制生长作用；并能诱导K562肿瘤细胞发生凋亡，细胞膜破损、细胞变形或出现胞芽和缢痕，细胞皱缩变小，胞浆致密，核固缩，染色质浓集、边聚化，胞质空泡化等。据此，本发明研究了林蛙抗癌肽的制备方法并进行了抗癌实验效果观察。
发明内容
本发明的目的是从林蛙蛙皮中提取具有抗癌活性的多肽，并进行体内和体外抗癌实验，使林蛙抗癌肽制成具有抗癌活性的药物或保健品。
本发明涉及的林蛙抗癌肽以林蛙皮肤为原料，其制备方法如下1.将林蛙皮加入2-10倍体积的酸化乙醇，于4-20℃浸提24-72小时；2.上述提取液在3000-8000rpm下离心10-60min，收集上清液，沉淀；3.沉淀重复1和2步骤2-3次；4.将多次获得的上清液冻干浓缩；5.冻干粉溶于蒸馏水中配成溶液；6.上述溶液经Sephadex G-50凝胶柱层析，收集活性组分；7.活性组分透析脱盐，冻干浓缩；于-20℃保存，得到本发明的林蛙抗癌肽。
图1林蛙抗癌肽Sephadex G-50柱层析2(1)对照组K562细胞(2)丝裂霉素作用的K562细胞(3)林蛙抗癌肽作用的K562细胞图3林蛙抗癌肽作用24h、48h、72h后K562细胞DNA电泳具体实施方式
下面实施例进一步说明本发明的制备方法，并不是用来限制发明的范围。
实施例11.将100g林蛙皮加入1000mL酸化乙醇，于4℃浸提24小时；2.提取液在3000rpm离心80min，收集上清液，沉淀；3.沉淀再加入1000mL酸化乙醇，于4℃浸提24小时；4.提取液在3000rpm离心10min，收集上清液，沉淀弃去；5.合并两次获得的上清液，冻干浓缩；6.冻干粉1g溶于蒸馏水10ml中配成浓度为10mg/mL的溶液；7.上述溶液经Sephadex G-50凝胶柱层析，收集活性组分，如说明书附图，图1凝胶柱层析图所示活性组分；8.活性组分透析脱盐，冻干浓缩；于-20℃保存，得到本发明的林蛙抗癌肽。
实施例21.将500g林蛙皮加入酸化乙醇1000mL，于常温下浸提48小时；2.上述提取液在5000rpm下离心30min，分别收集上清液和沉淀；3.沉淀加入酸化乙醇1000mL，于常温下浸提48小时；并重复1-3步骤1次；
4.合并3次获得的上清液冻干浓缩；5.冻干粉溶于蒸馏水中配成浓度为10mg/ml溶液；6.上述溶液经Sephadex G-50凝胶柱层析，收集活性组分，如说明书附图，图1凝胶柱层析图所示活性组分；7.活性组分透析脱盐，冻干浓缩；于-20℃保存，得到本发明的林蛙抗癌肽。
实施例31.取20g林蛙皮加入100ml酸化乙醇中，于4℃浸提72小时；2.提取液在8000rpm下离心10min，收集上清液和沉淀；3.沉淀重复1和2步骤1次；4.将两次获得的上清液合并，冻干浓缩；5.冻干粉溶于蒸馏水中配成浓度为20mg/ml的溶液；6.上述溶液经Sephadex G-50凝胶柱层析，收集活性组分，如说明书附图，图1凝胶柱层析图所示活性组分；7.活性组分透析脱盐，冻干浓缩；于-20℃保存，得到本发明的林蛙抗癌肽。
本发明的林蛙抗癌肽具有如下特征(1)白色粉末；(2)pH3-10；(3)分子量1-20kD；(4)稳定性-4℃保存24个月仍然具有抗癌活性。
(5)抗癌活性对多种癌细胞具有抑制作用。
林蛙抗癌肽的抗癌实验1.林蛙抗癌肽体内抗癌活性的研究1.1材料和方法1.1.1林蛙抗癌肽由上述试验方法制备。将林蛙抗癌肽用蒸馏水配制成2.5、5、10mg/mL的溶液，用无菌的0.45μm的滤菌膜过滤，制备成无菌样品注射液。试验选用BALB-c小鼠体重20±1g，雌雄各半，清洁级。胃肉瘤细胞株S180，大连医科大学卫生学教研室提供。
1.1.2 S180肿瘤细胞的培养及传代S180细胞接种前于RPMI 1640+10％FBS培养液中37℃、5％CO2条件下复苏至状态良好，制成5×106个/mL的细胞悬液。小鼠腋下常规消毒，皮下注射癌细胞悬液0.2mL，使每只小鼠癌细胞接种量达到106个。
1.1.3动物分组和接种BALB/c小鼠40只，随机分为4组，每组10只，雌雄各半。I组为荷瘤对照组，每日注射生理盐水，II组-IV组每日分别注射浓度为2.5、5、10mg/mL林蛙抗癌肽溶液，生理盐水和样品溶液的注射剂量均为0.01mL/d/g体重，连续注射15天，实验结束后，断椎处死小鼠，剥离瘤体，称取瘤重，计算抑瘤率。
1.1.4抑瘤率的计算抑瘤率％＝100(A-B)/AA荷瘤对照组的平均瘤重B给药组的平均瘤重1.2结果与分析表1林蛙抗癌肽对小鼠S180肉瘤的抑制作用(n＝10，x±S)
aP＜0.01 compared with control group表1可以看出，中国林蛙皮肤生物活性肽对S180胃肉瘤细胞的抑制作用表现了一定的剂量依赖性，但是其对S180胃肉瘤细胞的抑制在5mg/mL时就已经达到了最好的作用效果。
2.林蛙抗癌肽体内抗癌活性的研究2.1材料和方法
2.1.1林蛙抗癌肽由上述试验方法制备。试验瘤株为K562细胞株、7721细胞株、Hela细胞株和SKOV3细胞株，HepG2细胞株和MCF·7细胞株。
2.1.2药物浓度的筛选取对数生长期癌细胞，接种于96孔培养板中(1×104·well-1)，每孔200μL，培养24h后，分别加入5、10、20mg/mL不同浓度已除菌的林蛙抗癌肽，阳性对照药物选取丝裂霉素，其浓度为0.13mg/mL，经0.45μm滤膜除菌后，每孔加药量为4μL，阳性对照组和各个浓度的林蛙抗癌肽设平行孔5个，将正常K562细胞组作为阴性对照组。于37℃、5％CO2条件下继续培养至20h、44h和68h，每孔加5mg/mL MTT 20μL，继续培养4h后，分别收集每孔细胞，于1000rpm离心10min，弃上清，再加入150μLDMSO溶解，按照原孔位置将溶液解移回培养板中，于酶标仪490nm处测OD值。
2.1.3细胞形态学观察K562细胞以5×105个细胞/mL的浓度接入培养瓶中，每瓶3mL，分别加入已除菌的20mg/mL的林蛙抗癌肽60μL，阳性对照组加入浓度为0.13mg/mL的丝裂霉素60μL，将正常K562细胞组作为阴性对照组，培养72h后收集细胞，先经2.5％戊二醛和1％锇酸固定后，用乙醇脱水，环氧树脂包埋后切片，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，置于JEM-200EX型(JEOL日本电子株式会社)透射电镜下观察形态改变。
2.1.4细胞DNA提取及电泳观察收集经过林蛙抗癌肽作用72h后的K562细胞1×106个，1000rpm离心5min，PBS漂洗1次，加入TE、1％SDS、RNase(5mg/mL)和proteinase K(2.5mg/mL)于37℃孵育2h。用苯酚/氯仿/异戊醇抽提后，加入冷无水乙醇和1/10体积3MNaAC沉淀DNA，70％乙醇漂洗DNA，干燥后将DNA溶于TE中，置于100V，0.8％琼脂糖凝胶电泳40min，用EB染色，凝胶成像系统观察并记录结果。
2.2结果与分析2.2.1林蛙抗癌肽对多种癌细胞的抑制作用林蛙抗癌肽作用于多种癌细胞IC50值为K562细胞0.1569mg/mL，Hela细胞0.2352mg/mL，SKOV3细胞0.1764mg/mL，MCF·7细胞0.1373mg/mL，HepG2细胞0.2549mg/mL，7721细胞0.2157mg/mL。
2.2.2林蛙抗癌肽对K562细胞形态的影响终浓度为0.3922mg/mL和0.1961mg/mL的林蛙抗癌肽处理的细胞呈现凋亡改变，包括细胞皱缩变小，胞浆致密，核固缩，染色质浓集、边聚，形成不同形状、不同大小的块状，胞质空泡化等。
2.2.3林蛙抗癌肽对K562细胞DNA的影响林蛙抗癌肽以终浓度0.1961mg/mL作用于K 562细胞时，可诱导其发生DNA片段化。观察电泳结果，可见随时间的增加，梯带强度增加，细胞凋亡呈现时效关系。
3.结论通过体内外抗癌实验证明本发明的林蛙抗癌肽具有抑制多种癌细胞生长的作用，并可以诱导癌细胞凋亡。其制备工艺简单，产品稳定性好。
权利要求
1.一种以林蛙皮为原料制备的具有抗癌作用的林蛙活性肽，其特征在于林蛙抗癌肽可以作为抗癌药物和保健食品。
2.一种权利要求1所述的具有抗癌作用的林蛙抗癌肽的制备方法，其特征是(1)将林蛙皮加入2-10倍体积的酸化乙醇，于4-20℃浸提24-72小时；(2)上述提取液在3000-8000rpm下离心10-60min，收集上清液，沉淀；(3)沉淀重复1和2步骤2-3次；(4)将多次获得的上清液冻干浓缩；(5)冻干粉溶于蒸馏水中配成溶液；(6)上述溶液经Sephadex G-50凝胶柱层析，收集活性组分；(7)活性组分透析脱盐，冻干浓缩；于-20℃保存，得到本发明的林蛙抗癌肽。
3.如权利要求2所述方法制备的具有抗癌作用的林蛙抗癌肽，其具有如下特征(1)白色粉末；(2)pH3-10；(3)分子量1-20kD；(4)稳定性-4℃保存24个月仍然具有抗癌活性。(5)抗癌活性对多种癌细胞具有抑制作用。
4.如权利要求1所述的林蛙抗癌肽，可以在体内外抑制多种癌细胞的生长，并诱导癌细胞凋亡，具有较强的抑癌作用。
全文摘要
本发明公开了具有抗癌作用的林蛙抗癌肽及其制备方法。它可以用于抗癌药物和保健品及其制备领域。以林蛙皮为原料，用酸化乙醇提取，离心。经SephadexG50柱层析，得到具有抗癌活性的林蛙抗癌肽。体内外抗癌实验表明，林蛙抗癌肽可以明显抑制癌细胞的生长，并能诱导多种癌细胞的凋亡。本发明为林蛙皮在抗癌药物和保健食品中的应用创造了条件。
文档编号A61P35/00GK101041686SQ20061004697
公开日2007年9月26日 申请日期2006年6月19日 优先权日2006年6月19日
发明者尚德静, 李庆伟 申请人:辽宁师范大学