专利名称：抗癌作用的林蛙卵蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明属于抗癌药物和保健品及其制备领域，特别涉及一种林蛙卵抗癌蛋白药物及其制备方法。
背景技术：
林蛙(Rana chensinensis)是我国东北地区长白山麓药、食两用的珍贵蛙种。林蛙蛙卵具有很高的营养价值，可应用于制药和保健食品，具有调节免疫、延缓衰老、壮阳、明目、调节血脂和预防妇女更年期综合症的作用。在民间被公认是与林蛙输卵管即林蛙油、蛤士蟆油、田鸡油并列的滋补佳品。目前，国内很多学者和企业已经对林蛙蛙卵的卵油进行了研究开发和利用，主要是采用CO2超临界萃取技术等方法提取其中脂溶性的林蛙卵油，发现林蛙卵油中的不饱和脂肪酸种类和含量都十分丰富，其中不饱和脂肪酸含量为76.36％，饱和脂肪酸含量为23.64％，主要不饱和脂肪酸均为十六碳烯酸、油酸、亚油酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十碳四烯酸、二十碳烯酸、二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPA)。此外，中国林蛙卵油中还含有雌二醇以及维生素A、D、E等。对林蛙卵油的一些生物活性研究结果表明，林蛙卵油可以拮抗四氯化碳对肝脏的毒性，提高小鼠红细胞中SOD的抗氧化活性，具有中枢神经抑制作用，进而起到抗惊厥和保护惊厥动物的作用。
申报林蛙研究的专利也逐年增多，以林蛙和卵为关键词，检索国内外专利，没有查到国外关于林蛙的专利，国内31篇。其中CN1287837“林蛙卵及其应用”是保护林蛙卵在调节免疫、延缓衰老、壮阳、明目、调节血脂和预防更年期方面的作用；CN1670192“中国林蛙输卵管分泌细胞体外培养方法”、CN1546497“林蛙卵卵磷脂分离提纯方法”、CN1389552“活体林蛙的取油方法”、CN1346639“一种林蛙雌蛙成体输卵管全质营养液的制作方法”、CN1212140“促钙吸收作用的林蛙卵组合物及其制剂”等只是涉及保护林蛙卵卵磷脂的提取方法和林蛙油，即林蛙输卵管的应用；此外CN1370559“抗衰老降血脂营养保健软胶囊及其制法”等10余篇专利都是关于保护林蛙卵油的萃取技术、林蛙卵油降血脂、抗焦虑作用产品的生产技术。没有检索到林蛙蛙卵抗癌活性蛋白的研究和专利。
本发明从林蛙卵中提取的具有抗癌活性的蛋白提取物，经Sephadex G-100和DEAE-cellulose柱层析分离得到林蛙蛙卵抗癌活性蛋白。并将得到的产品用于体内和体外的抗癌作用研究，结果显示林蛙卵蛋白对S180胃肉瘤、白血病K562细胞和HL60细胞有明显的抑制生长作用，其抑制率达到50％以上；并能诱导K562肿瘤细胞发生凋亡，细胞膜破损、细胞变形或出现胞芽和缢痕，细胞皱缩变小，胞浆致密，核固缩，染色质浓集、边聚化，胞质空泡化等，其S期DNA含量低于G1期。据此，本发明研究了林蛙卵抗癌活性蛋白的制备方法并进行了抗癌实验效果观察。
发明内容
本发明的目的是从林蛙蛙卵中提取具有抗癌活性的蛋白质，并进行体内和体外抗癌实验，使林蛙卵蛋白制成具有抗癌活性的药物或保健品。
本发明涉及的林蛙卵抗癌活性蛋白以林蛙卵为原料，其制备方法如下1.将林蛙蛙卵加入2-8倍体积的10mM pH6.5的磷酸钠缓冲液，于4000-8000rpm条件下常温匀浆；2.上述匀浆液在3000-8000rpm下，4-20℃离心10-60min，吸取脂肪层与沉淀之间的上清液，冷冻干燥；3.将上述冻干粉溶于蒸馏水中配成溶液；4.上述溶液经Sephadex G-100凝胶柱层析，收集活性组分；5.活性组分透析脱盐，冻干浓缩；6.冻干粉溶于蒸馏水中配成溶液，经DEAE-cellulose柱层析，收集活性组分；7.活性组分透析脱盐，冻干，于-20℃保存，得到本发明的林蛙卵抗癌活性蛋白。
图1是本发明的SephadexG100的凝胶层析图；图2是本发明的DEAE-cellulose柱层析图。
图3(1)对照组K562细胞 (2)丝裂霉素 (3)林蛙蛙卵抗癌活性蛋白图4中国林蛙蛙卵抗癌活性蛋白作用不同时间对K562细胞的抑制作用图具体实施例下面实施例进一步说明本发明的制备方法，并不是用来限制发明的范围。
实施例11.取鲜林蛙蛙卵100g加入10mM pH6.5的磷酸钠缓冲液200ml，于8000rpm条件下常温匀浆；2.匀浆液在8000rpm下，4℃离心60min，吸取脂肪层与沉淀之间的上清液，冷冻干燥；
3.将冻干粉溶于蒸馏水中配成浓度为6mg/ml的溶液；4.上述溶液经Sephadex G-100凝胶柱层析，收集活性组分；其活性组分见说明书附图1所示活性组分。
5.活性组分透析脱盐，冻干浓缩；6.冻干粉加入蒸馏水，配成浓度为6mg/ml的经DEAE-cellulose柱层析，收集活性组分；其活性组分见说明书附图2所示活性组分。
7.活性组分透析脱盐，冻干，于-20℃保存，得到本发明的林蛙卵抗癌活性蛋白。
实施例21.取鲜林蛙蛙卵100g加入10mM pH6.5的磷酸钠缓冲液500ml，于4000rpm条件下常温匀浆；2.匀浆液在5000rpm下，4℃离心40min，吸取脂肪层与沉淀之间的上清液，冷冻干燥；3.将冻干粉溶于蒸馏水中配成浓度为6mg/ml的溶液；4.上述溶液经Sephadex G-100凝胶柱层析，收集活性组分；其活性组分见说明书附图1所示活性组分。
5.活性组分透析脱盐，冻干浓缩；6.冻干粉加入蒸馏水，配成浓度为6mg/ml的经DEAE-cellulose柱层析，收集活性组分；其活性组分见说明书附图2所示活性组分。
7.活性组分透析脱盐，冻干，于-20℃保存，得到本发明的林蛙卵抗癌活性蛋白。
实施例31.取鲜林蛙蛙卵100g加入10mM pH6.5的磷酸钠缓冲液800ml，于6000rpm条件下常温匀浆；2.匀浆液在6000rpm下，常温下离心20min，吸取脂肪层与沉淀之间的上清液，冷冻干燥；3.将冻干粉溶于蒸馏水中配成浓度为6mg/ml的溶液；4.上述溶液经Sephadex G-100凝胶柱层析，收集活性组分；其活性组分见说明书附图1所示活性组分。
5.活性组分透析脱盐，冻干浓缩；6.冻干粉加入蒸馏水，配成浓度为6mg/ml的经DEAE-cellulose柱层析，收集活性组分；其活性组分见说明书附图2所示活性组分。
7.活性组分透析脱盐，冻干，于-20℃保存，得到本发明的林蛙卵抗癌活性蛋白。
本发明的林蛙蛙卵抗癌活性蛋白具有如下特征(1)黄白色粉末；(2)pH4-10；(3)分子量10-110kD；(4)稳定性-4℃保存24个月仍然具有抗癌活性。
(5)抗癌活性对多种癌细胞具有抑制作用。
林蛙卵抗癌活性蛋白的体内和体外抗癌实验1.体内抗癌实验1.1材料林蛙蛙卵抗癌活性蛋白，由上述制备方法获得；用蒸馏水配制成0.1、0.2、0.3、0.5、1、2mg/mL的溶液，用无菌的0.45μm的滤菌膜过滤，制备成无菌样品注射液，4℃保存。
1.2动物瘤株传代及皮下肿瘤的接种BALB-c小鼠体重20±1g，雌雄各半，清洁级，由大连医科大学病理教研室提供。胃肉瘤细胞株S180，由大连医科大学卫生学教研室提供。S180细胞接种前于RPMI 1640+10％FBS培养液中37℃、5％CO2条件下复苏至状态良好，细胞数达到105数量级左右，接入小鼠腹腔内传代2次，每次一周。将小鼠腹水置于冰浴中，再于1000rpm离心5-8min，弃去上清液，用无菌的冷生理盐水悬浮，计数后制成5×106个/mL的细胞悬液。小鼠腋下常规消毒，皮下注射癌细胞悬液0.2mL，使每只小鼠癌细胞接种量达到106个。小鼠接种肿瘤细胞后第三天，开始注射用药，每只小鼠每天注射0.2mL样品溶液，正常饲喂、自由饮水，实验周期为15天，第16天对小鼠颈椎脱臼处死。剥出皮下肉瘤称重。
1.3抑瘤率的计算抑瘤率％＝100(A-B)/A A荷瘤对照组的平均瘤重 B给药组的平均瘤重1.4实验结果表1林蛙卵蛋白对S180胃瘤的抑制作用
结果表明，林蛙卵蛋白对小鼠S180胃瘤具有明显的抑制作用，当样品浓度为03mg/ml时，其抑瘤率就可达到74％，而且随着用药浓度的增大，中国林蛙蛙卵抗癌活性蛋白对小鼠S180肉瘤的抑制作用增大。
2.体外抗癌实验
2.1材料林蛙蛙卵抗癌活性蛋白，由上述制备方法获得；用蒸馏水配制成0.1、0.5、1、2、3、4、5、6mg/mL的溶液，用无菌的0.45μm的滤菌膜过滤，制备成无菌样品注射液，4℃保存。
2.2白血病K562细胞培养将K562细胞接种在含有10％小牛血清(FBS)的RPMI 1640培养液中，在培养液中分别加入100国际单位的青霉素和链霉素，pH6.8-7.6，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。待细胞生长状态良好时，进行传代。
2.3体外药物敏感性和细胞生长抑制实验——MTT比色法将浓度为5×104个K562细胞/mL的细胞悬液接入96孔细胞培养板，每孔200μL。每孔加入4μL林蛙蛙卵抗癌活性蛋白浓度分别为0.0020、0.0098、0.0196、0.0392、0.0588、0.0784、0.0980、0.1176mg/mL。在24h、48h和72h，提前4h在每孔内加入20μL的MTT，继续培养4h，将悬浮细胞于1000rpm离心10min，弃上清，加150μL的DMSO振荡。加入DMSO后20min，待沉淀完全溶解，于490nm下用酶标仪测定OD值。
2.4凋亡的形态学观察将K562细胞以1×105个细胞/mL的浓度，接种于24孔培养板中，每孔接种1mL细胞悬液，中国林蛙蛙卵抗癌活性蛋白浓度为6mg/mL，每孔加入20μL中国林蛙蛙卵抗癌活性蛋白液，使其终浓度达到0.1176mg/mL，选择培养后的24h、48h和72h三个时间点观察中国林蛙蛙卵抗癌活性蛋白对K562细胞形态的影响，并做显微照相。将加入丝裂霉素的组作为阳性对照组，将正常K562细胞组作为阴性对照组。丝裂霉素的浓度为0.13mg/mL，其用量与中国林蛙蛙卵抗癌活性蛋白样品一致，所用样液均经0.45μm滤膜除菌。
2.5流式细胞检测分析林蛙蛙卵抗癌活性蛋白对K562细胞周期的影响2.6于JEM-200EX型(JEOL日本电子株式会社)透射电镜下观察K562细胞形态2.7实验结果2.7.1不同浓度中国林蛙蛙卵抗癌活性蛋白对K562细胞的生长抑制作用表2不同浓度中国林蛙蛙卵抗癌活性蛋白对K562细胞的生长抑制作用
不同浓度中国林蛙蛙卵抗癌活性蛋白作用于K562细胞，对细胞生长的抑制作用不同，随着作用浓度的增大，作用时间的延长，抑制效果增强。
2.7.2中国林蛙蛙卵抗癌活性蛋白诱导K562细胞凋亡电镜下观察，未加样品组的细胞形态完整。加入中国林蛙蛙卵抗癌活性蛋白后，细胞呈现凋亡改变，包括细胞皱缩变小，胞浆致密，核固缩，染色质浓集、边聚，形成不同形状、不同大小的块状，胞质空泡化等。
2.7.3林蛙蛙卵抗癌活性蛋白对K562细胞周期的影响中国林蛙蛙卵抗癌活性蛋白作用于K562细胞，24、48、72h后，分别分析细胞周期的分布情况。对照组未见凋亡现象出现，使用林蛙蛙卵抗癌活性蛋白样品组G0/G1期细胞减少，产生典型凋亡峰，出现了亚G0/G1期，通常认为此期细胞为凋亡细胞，其凋亡程度与时间关系如图4所示。从24h开始，S期细胞明显减少，说明细胞周期被阻滞在G1期到S期的关键点上。
通过体内外抗癌实验证明本发明的林蛙蛙卵蛋白具有抑制多种癌细胞生长的作用，并可以诱导癌细胞凋亡。其制备工艺简单，产品稳定性好。
权利要求
1.一种以林蛙卵为原料制备的具有抗癌作用的林蛙卵蛋白，其特征在于林蛙卵蛋白可以作为抗癌药物和保健食品。
2.一种权利要求1所述的具有抗癌作用的林蛙卵蛋白的制备方法，其特征是(1)将林蛙蛙卵加入2-8倍体积的10mM pH6.5的磷酸钠缓冲液，于4000-8000rpm条件下常温匀浆；(2)上述匀浆液在3000-8000rpm下，4-20℃离心10-60min，吸取脂肪层与沉淀之间的上清液，冷冻干燥；(3)将上述冻干粉溶于蒸馏水中配成溶液；(4)上述溶液经Sephadex G-100凝胶柱层析，收集活性组分；(5)活性组分透析脱盐，冻干浓缩；(6)冻干粉溶于蒸馏水中配成溶液，经DEAE-cellulose柱层析，收集活性组分；(7)活性组分透析脱盐，冻干，于-20℃保存，得到本发明的林蛙卵抗癌活性蛋白。
3.如权利要求2所述方法制备的具有抗癌作用的林蛙卵蛋白，其具有如下特征(1)黄白色粉末；(2)pH4-10；(3)分子量10-110kD；(4)稳定性-4℃保存24个月仍然具有抗癌活性。(5)抗癌活性对多种癌细胞具有抑制作用。
4.如权利要求1所述的林蛙卵蛋白，可以在体内外抑制多种癌细胞的生长，并诱导癌细胞凋亡，具有较强的抑癌作用。
全文摘要
本发明公开了具有抗癌作用的林蛙卵蛋白及其制备方法。它可以用于抗癌药物和保健品及其制备领域。以林蛙蛙卵为原料，用磷酸缓冲液提取，离心。经SephadexG100和DEAE－cellulose柱层析，得到具有抗癌活性的林蛙卵蛋白。体内外抗癌实验表明，林蛙卵蛋白可以明显抑制癌细胞的生长，并能诱导多种癌细胞的凋亡。本发明为林蛙卵在抗癌药物和保健食品中的应用创造了条件。
文档编号A61P35/00GK101089018SQ20061004688
公开日2007年12月19日 申请日期2006年6月12日 优先权日2006年6月12日
发明者尚德静, 李庆伟 申请人:辽宁师范大学