专利名称：利用黄耆皂苷调节营养物质吸收之方法
技术领域：
本发明涉及一种用于调节营养物质吸收之方法，特别涉及一种利用黄耆皂苷调节营养物质吸收之方法。
背景技术：
在人类消化系统之研究中，发现通过在胃肠道中分解和消化食物可取得相当多营养物质。胃肠道为消化和吸收食物之重要路径。就吸收而言，可沿着整个肠道通过扩散或通过特殊运输过程来吸收营养物质，例如葡萄糖、氨基酸、维生素和其它较小分子。而且多数上述这些营养物质是通过紧密调节机制来运输，以取代自由地移经肠道内膜而进入血液或淋巴液。基于目前对于细胞生物学和生理学之理解，营养物质可利用固着在细胞膜上之特定运输蛋白和通道来运输。
在葡萄糖运输之实例中，几乎所有细胞都具有载体媒介机制(carrier-mediated mechanism)从血液运输葡萄糖。对多数细胞而言，是通过使用易化葡萄糖转运子家族中之一个或多个葡萄糖转运子蛋白(GLUT)之易化扩散作用来进行运输。在上述这些案例中，因为葡萄糖内向化学梯度之结果而发生净葡萄糖运输。少数细胞类型(例如小肠黏膜和近侧肾小管之细胞)可在所谓主动运输机制中，利用葡萄糖梯度由细胞外溶液摄取葡萄糖，因此允许在组织腔室之葡萄糖净吸收，其中组织腔室内的葡萄糖浓度可能低于血液中的葡萄糖浓度。有两种结合能量流动与转运子的方法，初级主动运输需要三磷腺苷酶(ATPase)提供能量，次级主动运输则提供了离子从较高浓度区流到较低浓度区的能量。
根据上述之次级主动运输模式，钠离子(Na+)会结合细胞间腔上之运输蛋白而造成运输蛋白之构形改变，开启葡萄糖之结合位。然后，葡萄糖和运输蛋白结合。与钠离子(Na+)和葡萄糖两者结合之运输蛋白将进一步发生构形改变，使葡萄糖和钠离子(Na+)能进入细胞。葡萄糖之主动运输涉及钠离子(Na+)与葡萄糖流之直接物理结合，而带有衍生自钠离子(Na+)内向梯度之过程能量。由于运输事件包括电核之净移动(具有非电解质葡萄糖之阳离子性钠(Na+)离子)，该摄取之驱动力包括钠离子(Na+)之化学梯度及跨膜之电位差两者。当葡萄糖逐渐累积在细胞中，其随后通过易化扩散，通过葡萄糖浓度梯度运出至血管。同样地，其它营养物质可利用上述运输机制加以吸收。
黄耆根(Radix Astragali)作为传统中药，其主要用于滋补强化脾脏功能并可增加精力和耐力。研究发现黄耆根可通过增加抑制病毒生长之免疫因子，如干扰素之制造，而特别在肺脏中加强免疫系统，并有助于人体抗病毒传染。黄耆根曾在伤风感冒和流行性感冒之治疗中作为一种辅助治疗成分。也有研究报导黄耆根具有心血管活性作用之效应。黄耆根之醇萃取物可提高由蛙或蟾蜍所分离之心脏之收缩性和收缩振幅。再者，由黄耆根分离出之黄耆皂苷对老鼠分离之心脏具有正向兴奋作用(positive inotropiceffect)。
然而，蒙古黄耆(Astragalus membranceus var.mongholicus)未用于调节营养物质吸收和运输。而且目前没有论文或研究专注于使用由中药(特别是蒙古黄耆)纯化之皂素(saponin)化合物来调节营养物质之吸收。
发明内容
本发明提供调节受试者体内营养物质吸收之方法，包含投予有效量由蒙古黄耆(Astragalus membranaceus var.mongholicus)纯化之黄耆皂苷化合物，以用于调节运输营养物质穿越受试者之肠道细胞。
根据本发明之具体实例，提供一种用于提高受试者体内营养物质吸收之方法，包括投予由蒙古黄耆纯化之有效量的黄耆皂苷化合物之步骤，用于促进运输营养物质穿越受试者之肠道细胞。
根据本发明，黄耆皂苷化合物为式A之环阿烷化合物(cycloartanecompound) 式A其中R1由下列组成之群中选出，包括氢、氢氧化物、O-乙烯、O-吡喃木糖基、O-(2-乙烯吡喃木糖基)、O-(3-乙烯吡喃木糖基)、O-(2，3-二乙烯吡喃木糖基)、O-(2，4-二乙烯吡喃木糖基)、O-吡喃木糖基-(1-2)-β-D-吡喃葡萄糖基及O-吡喃木糖基-(1-2)-α-吡喃树胶糖基；R2由下列组成之群中选出，包括氢、氢氧化物、O-乙烯、O-吡喃葡萄糖基及O-吡喃木糖基；R3由下列组成之群中选出，包括氢、氢氧化物及O-乙烯；R4由下列组成之群中选出，包括
黄耆皂苷化合物较佳由下列组成之群中选出，包括式I之黄耆皂苷I， 式I式II之黄耆皂苷II 式II
式III之黄耆皂苷III 式III式VI之异黄耆皂苷I 式VI
式VII之异黄耆皂苷II 式VII式IV之黄耆皂苷IV 式IV
式VI之黄耆皂苷VI 式VI或式VIII之环黄耆醇-6-O-β-D-葡萄哌喃糖。
式VIII根据本发明之具体实例，营养物质包括葡萄糖、氨基酸或维生素。特定而言，该氨基酸包括精氨酸和色氨酸。该维生素在其它维生素中较佳为叶酸。
本发明之其它特色和优点将在下列描述中分别提出，且可从描述中分别显见，或可通过本发明之实施而得知，而通过所述之要素和组合将能了解并达成本发明之特色和优点。
应了解前述之发明内容和下列实施方式仅为示例和解释，并非为本发明之限制。
当结合所附的图式阅读时，将更能了解前述之发明内容以及下列之实施方式。就说明本发明之目的而言，在图式具体实例中所显示的，其为目前较佳之说明。然而应了解，本发明并不限于所示之严格排列和工具。
在图中图1为线形图，显示以经选择浓度之式IV之纯化的黄耆皂苷AS4处理Caco-2细胞之葡萄糖摄取速率；图2为线形图，显示当Caco-2单层以选择浓度之式I经纯化的黄耆皂苷AS1处理时，经细胞单层膜运输穿越至底侧室所测量之精氨酸吸收速率；图3为线形图，显示当Caco-2单层以选择浓度之式I经纯化的黄耆皂苷AS1处理时，经细胞单层膜运输穿越至底侧室所测量之色氨酸吸收速率；图4为线形图，显示以经选择浓度之式I之纯化的黄耆皂苷AS1处理Caco-2细胞之叶酸摄取速率。
具体实施例方式
为了更佳了解本发明，本文中所使用之术语将另加以详细说明。黄耆皂苷乃定义为萃取自黄耆(Radix Astragali)，(膜荚黄耆(Astragalusmembranaceus)(Fisch)Bge.)和蒙古黄耆(Astragalus membranaceus(Bge.)Hsiao(Fabaceae)干燥根之三萜皂素化合物。
本文中所使用之术语“吸收”是指通过一条穿过肠上皮进入血液或淋巴液之通路摄取营养物质。
本文中所使用之术语“纯化”是指自粗制或天然形式分离重量纯度约为至少90％，较佳达100％，之纯化合物或物质之化学过程。“肠道细胞”一般是指包括肠细胞、黏膜细胞以及身体负责吸收营养物质之肠上皮细胞。
本发明提供调节受试者体内营养物质吸收之方法，包括投予由蒙古黄耆纯化之有效量的黄耆皂苷化合物，以用于调节运输营养物质穿越受试者之肠道细胞。该方法包括投予受试者有效量之黄耆皂苷化合物，用以调节运输营养物质穿越胃肠道内衬之单层肠道细胞，使得受试者体内营养物质之吸收得到调节。投予受试者之有效量黄耆皂苷化合物是指可在肠道细胞中维持存活率并增加或抑制运输营养物质穿越肠道细胞之细胞膜之浓度，且较佳为0.001至5μM。由于纯化自蒙古黄耆之黄耆皂苷化合物可提高或抑制运输营养物质穿越单层肠道细胞，因此依照所投予之黄耆皂苷化合物，可经调节该营养物质之吸收而维持受试者体内所需之营养物质吸收量。黄耆皂苷化合物可调配成液剂、锭剂、药丸、胶囊和散剂，以口服投予患有营养物质吸收问题之个体。同时，黄耆皂苷化合物可视情况和其它营养因子、添加物、安定剂、载剂、结着剂和填充剂混合，以制造任何需要调节营养物质吸收者之膳食补充品、饮料和食物。对于所属技术领域的技术人员来说，黄耆皂苷化合物可和其它人参皂苷与黄耆皂苷组合或以鸡尾酒方式投予以对营养物质吸收提供协同或累进效用乃显而易见。此外，亦可由其它中药植物或草本植物来纯化出纯化的黄耆皂苷化合物，以对营养物质吸收功能提供相同之调节效用。
黄耆皂苷化合物可通过任何标准方法或所属技术领域的技术人员已知之方法制备。根据本发明，纯化自蒙古黄耆之黄耆皂苷化合物包括黄耆皂苷。上述这些物质可通过所属技术领域的技术人员已知之现有的萃取和分离方法加以纯化。根据本发明，黄耆皂苷化合物为式A之环阿烷化合物(cycloartane compound) 式A其中R1系由下列组成之群中选出，包括氢、氢氧化物、O-乙烯、O-吡喃木糖基、O-(2-乙烯吡喃木糖基)、O-(3-乙烯吡喃木糖基)、O-(2，3-二乙烯吡喃木糖基)、O-(2，4-二乙烯吡喃木糖基)、O-吡喃木糖基-(1-2)-β-D-吡喃葡萄糖基及O-吡喃木糖基-(1-2)-α-吡喃树胶糖基；R2系由下列组成之群中选出，包括氢、氢氧化物、O-乙烯、O-吡喃葡萄糖基及O-吡喃木糖基；R3系由下列组成之群中选出，包括氢、氢氧化物及O-乙烯；R4系由下列组成之群中选出，包括 根据本发明之具体实例，黄耆皂苷化合物可通过包括磨碎蒙古黄耆根以及利用醇萃取以产生醇萃取物步骤之方法来制得。蒙古黄耆之醇萃取物可经分离和纯化得到七种已知之环阿烷型(cycloartane)化合物，其包括
式I之黄耆皂苷I(以下称为AS1) 式I式II之黄耆皂苷II(以下称为AS2) 式II
式III之黄耆皂苷III(以下称为AS3) 式III式IV之黄耆皂苷IV(以下称为AS4) 式IV
式VI之黄耆皂苷VI(以下称为AS6) 式VI式V之异黄耆皂苷I(以下称为IsoAS1) 式V
以及式VII之异黄耆皂苷II(以下称为IsoAS2)。
式VII上述这些环阿烷型化合物可利用硅胶和逆相式层析法加以分离和纯化。AS4可利用柚苷酶(naringinase)另外加以水解而得到代谢物，例如式VIII之环黄耆醇6-O-β-D-葡萄哌喃糖(以下称为AA)。
式VIII由于纯化自蒙古黄耆(Astragalus membranaceus var.mongholicus)之黄耆皂苷化合物可提高运输营养物质穿越肠道细胞之细胞膜，因此依照所投予之黄耆皂苷化合物之群组，该营养物质之吸收可经调节而维持个体内所需之营养物质吸收量。黄耆皂苷化合物可调配成液剂、锭剂、药丸、胶囊和散剂，以口服投予患有营养物质吸收问题或吸收不良症候群之个体，其改变肠子吸收足够之营养物质进入血液中的能力。例如，在制备液剂之实例中，可将人参皂苷化合物之一溶于任何溶剂，较佳为溶入共溶剂以产生含任一人参皂苷化合物之液剂<例如，将大约10毫克的任一人参皂苷化合物溶入1毫升的TranscutolP>。同时，可视情况将黄耆皂苷化合物和其它营养因子、添加物、安定剂、载剂、结着剂及填充剂混合，以制造膳食补充品、饮料、食物和动物饲料。
本发明提供一种提高受试者体内营养物质吸收之方法，其包含投予由蒙古黄耆纯化之有效量的黄耆皂苷化合物之步骤，用于促进运输营养物质穿越受试者之肠道细胞。该营养物质包括葡萄糖、氨基酸或维生素，其中该氨基酸为精氨酸或色氨酸；该维生素包括叶酸及其它。
根据本发明之具体实例，提高葡萄糖之吸收是通过投予浓度为0.001至5μM之黄耆皂苷化合物来促进运输葡萄糖穿越受试者之肠道细胞；其中该黄耆皂苷化合物包括式I之AS1、式IV之AS4、式VI之AS6、式V之IsoAS1、式VII之IsoAS2或式VIII之AA。
根据本发明之具体实例，提高精氨酸之吸收是通过投予浓度为0.001至5μM之黄耆皂苷化合物来促进运输精氨酸穿越受试者之肠道细胞；其中该黄耆皂苷化合物包括式I之AS1、式II之AS2、式III之AS3、式IV之AS4、式VI之AS6、式VII之IsoAS2或式VIII之AA。
根据本发明之具体实例，提高色氨酸之吸收是通过投予浓度为0.001至5μM之黄耆皂苷化合物来促进运输色氨酸穿越受试者之肠道细胞；其中该黄耆皂苷化合物包括式I之AS1、式II之AS2、式III之AS3、式IV之AS4、式VI之AS6、式V之IsoAS1、式VII之IsoAS2或式VIII之AA。
根据本发明之具体实例，提高叶酸之吸收是通过投予浓度为0.001至5μM之黄耆皂苷化合物来促进运输叶酸穿越受试者之肠道细胞；其中该黄耆皂苷化合物包括式I之AS1、式II之AS2、式III之AS3、式IV之AS4、式VI之AS6、式V之IsoAS1、式VII之IsoAS2或式VIII之AA。
本发明更特定地通过下列实例加以解释。然而，应了解本发明不应以任何方式受限于上述这些实例。
实例1纯化的黄耆皂苷对葡萄糖摄取之调节效用细胞培养为了评估纯化的黄耆皂苷化合物对经过肠腔摄取营养物质之效用，将Caco-2细胞放置在可渗透滤膜上生长以作为实验模型。Caco-2细胞取自人类结肠癌并在两周后同时分化成类肠上皮细胞表现型。这些细胞形成具有发展良好之紧密连接之单层，并经详细评估可作为活体外模型，以用于研究营养物质和药物两者在肠腔内细胞间之运输。
Caco-2细胞购自于美国菌株保存中心(American Type CultureCollection)。将上述这些细胞放置在Dulbecco氏修饰Eagle培养基(DMEM)中，其含有4.5g/L葡萄糖和25mM之Hepes，并添加10％胎牛血清、100U/mL盘尼西林G和10g/L链霉素。每两天更换一次培养基。每个月定期检查上述这些细胞之霉浆菌，将衍生自人类大肠癌之Caco-2细胞株用于供研究药物在胃肠道中吸收之活体外模型系统。在半透膜上培养Caco-2细胞，以分化成高度官能化上皮细胞屏障，与小肠柱状上皮细胞具有显著型态及生化相似性。因此Caco-2细胞单层可用于研究多种化合物之膜运输性质。将培养盘以磷酸缓冲生理食盐水(PBS)清洗一次，接着加入胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsine-EDTA)持续10分钟，以胰蛋白酶消化细胞。使用35-μm滤网盖(Falcon 2235)分离并过滤经胰蛋白酶消化之细胞以得到单细胞，之后再接种细胞以进行下一步实验。
细胞存活率分析为了检测经纯化黄耆皂苷对于Caco-2细胞是否具有毒性，使用分别添加有1％和10％FBS之培养基来进行细胞存活率分析。将细胞以每孔具有5000个细胞之浓度接种在96孔盘中。为了消除细胞生长之边际效应，细胞只接种在盘中间区之60孔，而在盘周围区域之36孔只填充100μlPBS。一旦细胞附着于盘上，以含有不同剂量(0、1、10、20和50μM)之纯化黄耆皂苷的培养基培养细胞。三天后，利用含有相同化合物之新鲜培养基取代培养基，并在进行细胞存活率分析前再培养2天。
利用细胞计数试剂盒-8(CCK-8，日本熊本市Dojindo实验室)分析来判断细胞存活率，该分析是根据具有细胞增生试剂WST-8之活细胞内的NADH之氧化还原反应，通过脱氢酶在细胞内粒线体之电子还原链(ETC)中还原WST-8，而得到黄色之甲臜(formazan)产物，其可溶于组织培养基。细胞内之脱氢酶活性所产生之甲臜染剂量和活细胞的数量成正比。因此，由ELISA判读机在波长450nm所检测到之吸光值愈高，显示愈多数量之活细胞存在。
在96格式盘之每个孔中加入10μl CCK-8试剂以进行CCK-8分析。然后以铝箔纸覆盖测定盘并再培养两小时后，使用ELISA判读机于波长450nm测量吸光值。
葡萄糖摄取分析将Caco-2细胞(5×104)接种在48-孔盘中并保持在培养基(含有10％FBS、1％非必需氨基酸、L-麸氨酰胺、盘尼西林G(100U/mL)和两性霉素B(amphotericin B)(2.5μg/mL)之DMEM、)中于37℃培养10天，使细胞分化。每两天更换一次培养基。然后以PBS清洗细胞，之后补充含有5％FBS之培养基及显示浓度(0.01、0.1和1μM)之黄耆皂苷持续48小时。以PBS对Caco-2细胞洗掉剩余之葡萄糖并在葡萄糖缓冲液(80mM氯化钠(NaCl)、100mM甘露醇(mannitol)、20mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、pH 7.4、3mM磷酸氢二钾(K2HPO4)、1mM氯化钙(CaCl2)、1mg/mL胎牛血清蛋白(BSA))中放置1小时。利用含有2μCi/mL之14C-葡萄糖和未标定冷葡萄糖(unlabeled cold glucose)之0.2ml葡萄糖缓冲液来取代葡萄糖缓冲液以开始葡萄糖的摄取，得到最终葡萄糖浓度为25mM。移除葡萄糖缓冲液并在指定时间区间以PBS清洗来终止葡萄糖摄取。在0.2mL之0.2N氢氧化钠(NaOH)中溶解细胞并将20μL之细胞溶解液转移至含有过滤底盘之UniFilter盘中(Perkim-Elmer，Wellesley，MA，USA)并于37℃真空烘箱中干燥。将UniFilter盘底密封并将25μL之计数溶液加到各孔中。使用具有黏性之盘黏着剂以代替封盖，且每个样本之放射性使用微盘液体闪烁计数器(TopCount，Packard NXT，PackardBioScience Company，Meriden，CT，USA)加以计算。计算出累积在细胞内之葡萄糖含量并除以蛋白质浓度，所得摄取速率以每分钟每毫克细胞蛋白质之纳摩尔葡萄糖(nmol/min/mg)来表示。蛋白质浓度可利用标准二辛可宁酸(Bicinchoninic acid；BCA)蛋白质分析来测定。加入2μCi之L-[14C]-葡萄糖以测量非特定葡萄糖的摄取，并与每个测定值相减，而得到特定葡萄糖摄取量。
在细胞存活率分析中，纯化的黄耆皂苷在浓度范围从1至50μM通常不会影响Caco-2细胞之生长，除了当式I之AS1在10μM浓度下投予Caco-2细胞之外。因此，在后续葡萄糖摄取试验或叶酸摄取试验投予不会造成细胞毒性之浓度范围之纯化的黄耆皂苷。较佳地，可投予浓度范围为0.001至1μM之纯化的黄耆皂苷。
由表1中所示之葡萄糖摄取分析，发现纯化的黄耆皂苷例如式I之AS1、式II之AS2、式IV之AS4、式VI之AS6、式VIII之AA和式VII之IsoAS2对于Caco-2细胞之葡萄糖摄取具有调节效用。决定葡萄糖的摄取量可并以“每毫克细胞蛋白质之纳摩尔”来表示。如图1所示，经式IV之AS4处理之Caco-2细胞显示其具有比对照组高出许多之葡萄糖摄取速率。纯化的黄耆皂苷对于Caco-2细胞中葡萄糖运输之调节效用列于下表1，其中箭头朝上代表对于葡萄糖摄取具提高效用。
表1黄耆皂苷对葡萄糖摄取之调节效用
结论是可利用由蒙古黄耆纯化之黄耆皂苷，包括式I之AS1、式IV之AS4、式VI之AS6、式VIII之AA或式VII之IsoAS2来提高葡萄糖之吸收。
实例2纯化的黄耆皂苷对精氨酸吸收之调节效用精氨酸吸收分析在测量精氨酸穿越Caco-2细胞单层之运输中，将培养室(transwells)之两侧以包含137mM NaCl、10mM Hepes、0.3mM磷酸二氢钠(NaH2PO4)、0.3mM K2HPO4、5.4mM氯化钾(KCl)、2.8mM CaCl2、1mM硫酸镁(MgSO4)、10mM葡萄糖，调整至pH值7.4之精氨酸培养缓冲液清洗。然后，将细胞层放置在培养缓冲液，在37℃预先培养1小时。顶室(apical chamber)和底侧室(basolateral chamber)中培养缓冲液之体积分别为0.2和0.9ml。在进行运输实验前，对两室中之细胞更换新鲜培养基。以含有10mM L-精氨酸之溶液(其中包含0.125μCi/mL之L-[3H]-精氨酸)更换顶侧之培养溶液以启动运输实验。在指定时间区间，从底侧移除10μL-溶液样本并使用微盘液体闪烁计数器(TopCount，Packard NXT)计算各样本之放射性。实验过程中，每自底侧取出10μL-样本即另补充同体积之培养缓冲液至底侧室中以维持固定体积，并使用[3H]-甘露醇之摄取来校正穿过单层膜之分子的非特定运输。结果以精氨酸运输在相对时间(以分钟计算)穿越Caco-2细胞单层之纳摩尔数(nmol/min)来表示。
由表2所示之精氨酸吸收分析结果发现纯化的黄耆皂苷，例如式I之AS1、式II之AS2、式III之AS3、式IV之AS4、式VI之AS6、式VIII之AA、式V之IsoAS1和式VII之IsoAS2，对运输精氨酸穿越Caco-2细胞单层具调节作用。请参照图2和表2，当Caco-2细胞单层以浓度为0.001至0.1μM的式I之AS1或式II之AS2加以处理时，精氨酸运输速率会增加。当Caco-2细胞单层分别以浓度为0.01至1μM的式III之AS3、式VI之AS4、式VI之AS6、式VIII之AA、式V之IsoAS1或式VII之IsoAS2加以处理时，精氨酸运输速率会增加。纯化的黄耆皂苷对于Caco-2细胞中精氨酸运输之调节效用列在下表2，其中箭头朝上代表对于精氨酸运输具提高效用。
表2经纯化的黄耆皂苷对精氨酸运输之调节效用
结论是可利用投予由蒙古黄耆纯化之黄耆皂苷，包括式I之AS1、式II之AS2、式III之AS3、式IV之AS4、式VI之AS6、式VIII之AA、式V之IsoAS1或式VII之IsoAS2来提高精氨酸之吸收。
实例3纯化的黄耆皂苷对色氨酸吸收之调节效用色氨酸吸收分析除了使用含有137mM氯化胆碱、10mM Hepes、0.6mM磷酸二氢钾(KH2PO4)、5.4mM KCl、2.8mM CaCl2、1mM MgSO4和10mM葡萄糖之色氨酸培养缓冲液，并使其pH值调整至7.4以外，使用类似于实例2中之实验程序来测量色氨酸分子穿过Caco-2膜之摄取。结果以色氨酸运输在相对时间(以分钟计算)穿越Caco-2细胞单层之纳摩尔数来表示。
由表3显示之色氨酸吸收分析结果发现纯化的黄耆皂苷，例如式I之AS1、式II之AS2、式III之AS3、式IV之AS4、式VI之AS6、式VIII之AA、式V之异AS1和式VII之异AS2，对运输精氨酸通过Caco-2细胞单层具调节作用。如图3和表3所显示，当Caco-2细胞单层以浓度为0.01至1μM的式I之AS1或浓度为0.01至0.1μM的式II之AS2加以处理时，色氨酸运输速率会增加。如表3所显示，当Caco-2细胞单层分别以浓度为0.01至1μM的式III之AS3、式IV之AS4、式VI之AS6、式VIII之AA、式V之IsoAS1或式VII之IsoAS2加以处理时，会增加色氨酸运输速率。纯化的黄耆皂苷对Caco-2细胞中色氨酸运输之调节效用列于下表3中，其中箭头朝上代表对色氨酸运输具提高效用。
表3纯化的黄耆皂苷对色氨酸运输之调节效用
结论是可利用投予由蒙古黄耆纯化之黄耆皂苷，包括式I之AS1、式II之AS2、式III之AS3、式IV之ASAS4、式VI之AS6、式VIII之AA、式V之IsoAS1、或式VII之IsoAS2来提高色氨酸之吸收。
实例4纯化的黄耆皂苷对叶酸摄取之调节效用叶酸摄取分析将Caco-2细胞以类似上列实例1葡萄糖摄取分析中所描述之方法进行叶酸摄取试验。在叶酸摄取试验中，是以含有5％FBS和浓度0.1μM之纯化的黄耆皂苷之培养基，将Caco-2细胞预处理2天，之后将细胞置于叶酸摄取缓冲液(添加有0.14g/L CaCl2、0.1g/L MgCl2和0.1g/L MgSO4，pH6.0之Hank氏平衡盐溶液)培养1小时。然后开始吸取缓冲液，并加入0.2ml新鲜叶酸摄取缓冲液，其含有2μCi/mL放射性叶酸(3，5，7，9-3H-叶酸，25mCi/mmol，ARC))及冷的未标定叶酸开始摄取，得到最终浓度5μM之叶酸。在指定时间区间移除摄取缓冲液以终止摄取。然后以冰冷的PBS清洗细胞三次并加入0.2mL之0.2N NaOH使细胞溶解，接着于65℃培养20分钟。将20μL细胞溶解液转移至含过滤底盘之UniFilter盘(Perkim-Elmer)并如前面实例1中所述之计数来测定细胞内的3H-叶酸摄取。计算出叶酸在细胞内之累积量并除以蛋白质浓度，所得摄取速率以每分钟每毫克细胞蛋白质中之皮可摩尔(picomoles)(pmol/min/mg)来表示。蛋白质浓度是利用上述之标准二辛可宁酸(Bicinchoninic acid；BCA)蛋白质分析来测定。
请参照图4，发现以浓度0.1μM的式1之AS1处理之Caco-2细胞比含有未处理Caco-2细胞之对照组展现出较高的叶酸摄取。纯化的黄耆皂苷对Caco-2细胞内叶酸摄取之调节效用列于下表4中，其中箭头朝上代表对于叶酸摄取具有提高作用。
表4纯化的黄耆皂苷对叶酸摄取之调节效用
结论是可利用投予由蒙古黄耆纯化之黄耆皂苷，包括式I之AS1、式II之AS2、式III之AS3、式IV之AS4、式VI之AS6、式VIII之AA、式V之异AS1、或式VII之异AS2而提高叶酸之摄取。
尽管上列实例描述了调节大肠癌细胞之营养物质吸收，但本发明应并不受限于此。只要肠道细胞和胃肠系统之细胞具有相似之营养物质运输机制，亦可预期这些细胞能从本发明提出之黄耆皂苷化合物之调节效用中得到利益。而且本发明描述之黄耆皂苷除了在葡萄糖和叶酸吸收中扮演调节角色外，其同样可应用于调节营养物质(包括维生素、氨基酸、荷尔蒙、生长因子及其它细胞代谢之重要元素)之吸收。再者，可相互交换施行具体实例中所描述之营养物质吸收试验和营养物质摄取试验，用于评定和评估本发明所纯化的黄耆皂苷对个人营养物质吸收之调节效用。
所属技术领域的技术人员应了解，在不悖离其广泛的发明概念下，上述具体实例可做改变。因此应了解，本发明并不受限于本文中所揭示之特定具体实例，而应将上述这些修正涵盖在如权利要求所定义之本发明的精神和范畴内。
权利要求
1.一种提高受试者体内营养物质吸收之方法，其特征是包含投予有效量由蒙古黄耆纯化之黄耆皂苷化合物，用于促进运输营养物质穿越受试者之肠道细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是黄耆皂苷化合物为式A之环阿烷化合物 式A其中R1由下列组成之群中选出，包括氢、氢氧化物、O-乙烯、O-吡喃木糖基、O-(2-乙烯吡喃木糖基)、O-(3-乙烯吡喃木糖基)、O-(2，3-二乙烯吡喃木糖基)、O-(2，4-二乙烯吡喃木糖基)、O-吡喃木糖基-(1-2)-β-D-吡喃葡萄糖基及O-吡喃木糖基-(1-2)-α-吡喃树胶糖基；R2由下列组成之群中选出，包括氢、氢氧化物、O-乙烯、O-吡喃葡萄糖基及O-吡喃木糖基；R3由下列组成之群中选出，包括氢、氢氧化物及O-乙烯；R4由下列组成之群中选出，包括
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是该黄耆皂苷化合物由下列组成之群中选出，包括式I之黄耆皂苷I 式I式II之黄耆皂苷II 式II式III之黄耆皂苷III 式III式VI之异黄耆皂苷I 式VI式VII之异黄耆皂苷II 式VII式IV之黄耆皂苷IV 式IV式V之黄耆皂苷VI 式V或式VIII之环黄耆醇-6-O-β-D-葡萄哌喃糖。 式VIII
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是该营养物质包括葡萄糖、氨基酸或叶酸。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征是该氨基酸包括精氨酸或色氨酸。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征是该营养物质为葡萄糖。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征是通过投予浓度为0.001至5μM之黄耆皂苷化合物来促进运输葡萄糖穿越受试者之肠道细胞以提高该葡萄糖之吸收。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征是该黄耆皂苷化合物为包括式I之黄耆皂苷I、式IV之黄耆皂苷IV、式V之黄耆皂苷VI、式VII之异黄耆皂苷II或式VIII之环黄耆醇-6-O-β-D-葡萄哌喃糖。
9.根据权利要求4或5所述的方法，其特征是该营养物质为精氨酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征是通过投予浓度为0.001至5μM之黄耆皂苷化合物来促进运输精氨酸穿越受试者之肠道细胞以提高该精氨酸之吸收。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征是该黄耆皂苷化合物为包括式I之黄耆皂苷I、式II之黄耆皂苷II、式III之黄耆皂苷III、式IV之黄耆皂苷IV、式V之黄耆皂苷VI、式VI之异黄耆皂苷I、式VII之黄耆皂苷II或式VIII之环黄耆醇-6-O-β-D-葡萄哌喃糖。
12.根据权利要求4或5所述的方法，其特征是该营养物质为色氨酸。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征是通过投予浓度为0.001至5μM之黄耆皂苷化合物来促进运输色氨酸穿越受试者之肠道细胞以提高该色氨酸之吸收。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征是该黄耆皂苷化合物为包括式I之黄耆皂苷I、式II之黄耆皂苷II、式III之黄耆皂苷III、式IV之黄耆皂苷IV、式V之黄耆皂苷VI、式VI之异黄耆皂苷I、式VII之异黄耆皂苷II或式VIII之环黄耆醇-6-O-β-D-葡萄哌喃糖。
15.根据权利要求4所述的方法，其特征是该营养物质为叶酸。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征是通过投予浓度为0.001至5μM之黄耆皂苷化合物来促进运输叶酸穿越受试者之肠道细胞以提高该叶酸之吸收。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征是该黄耆皂苷化合物为包括式I之黄耆皂苷I、式II之黄耆皂苷II、式III之黄耆皂苷III、式IV之黄耆皂苷IV、式V之黄耆皂苷VI、式VI之异黄耆皂苷I、式VII之异黄耆皂苷II或式VIII之环黄耆醇-6-O-β-D-葡萄哌喃糖。
全文摘要
本发明提供一种提高受试者体内营养物质吸收之方法，其包含投予有效量由蒙古黄耆(Astragalus membranaceus var.mongholicus)纯化之黄耆皂苷化合物，以用于促进运送营养物质穿越受试者之肠道细胞。
文档编号A61K31/58GK1919203SQ20061009011
公开日2007年2月28日 申请日期2006年6月23日 优先权日2005年6月23日
发明者林汉钦, 张温良, 张自忠, 丁秀玉, 吴天赏 申请人:维京仲华(上海)生物医药科技有限公司