专利名称：一种异体神经移植物、其制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种神经移植材料、其制备方法及其应用，尤其涉及一种彻底去除 了引起排斥反应的施旺细胞、轴突和髓鞘，但同时其基底膜管仍保持完整的异体神 经移植物，以及该异体神经移植物在临床上的应用，属于医学领域。
背景技术：
周围神经缺损的修复是一临床难题，其治疗重点应解决两个问题， 一是神经缺 损的桥接修复，另一个是神经纤维与远端靶器官的选择性对接。目前在临床治疗过 程中解决神经缺损的手段依然以自体神经移植为标准手术，但由于自体神经来源有 限且造成供区较多并发症，多年来医学界不断寻找能替代自体神经移植的生物材 料。理想的替代材料应具有与正常神经相似的物理和生化特性，包括正常神经轴突 再生所需细胞外基质及三维空间管道结构。自体骨骼肌、自体静脉等生物源性材料
及硅胶管、藻酸盐凝胶、PGA、 PLA等人工合成材料都作为替代材料被研究，但其 结构与神经基底膜有很大的不同，故临床应用价值不大。新鲜同种异体神经移植来 源相对广泛且不用牺牲自体神经，但因其存在免疫排斥反应，常导致手术失败。理 想的替代材料应具有与正常神经相似的物理和生化特性，包括正常神经轴突再生所 需细胞外基质及三维空间管道结构。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的异体神经移 植物。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的
一种异体神经移植物，该异体神经移植物彻底去除了引起排斥反应的施旺细 胞、轴突、髓鞘，其基底膜管保持完整。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种制备上述异体神经移植物的方法。
本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术途径来实现的-一种制备异体神经移植物的方法，步骤如下
1) 无菌条件下，去除人周围神经的外膜脂肪及结締组织；
2) 将去除了外膜脂肪及结缔组织的人周围神经浸泡于蒸馏水中，在10-4(TC温 度下振荡冲洗12小时以上；
3) 将经过步骤2)处理的人周围神经浸泡于由SB-10与磷酸盐缓冲液(PBS)
二者按任意比例配制成的萃取液1中振荡冲洗12小时以上；
4) 将经过步骤3)处理的人周围神经用PBS溶液冲洗20分钟以上；
5) 将经过步骤4)处理的人周围神经用由Triton X-200、 SB-16和PBS三者按 任意比例配制的萃取液2中振荡冲洗12小时以上；
6) 依次重复3)、 4)、 5)步骤一次；
7) 将人周围神经用PBS溶液冲洗20分钟以上，即得。
作为优选的，上述方法中，步骤2)中将去除了外膜脂肪及结缔组织的人周围 神经浸泡于蒸馏水中在25。 C温度下振荡冲洗24小时；
步骤3)中所述萃取液1的配制方法如下将SB-10溶解于0.01M的PBS液中 配制成125375 mM的SB — 10溶液；所述的振荡冲洗时间优选为24小时；
步骤4)中将经过步骤3)处理的人周围神经用0.01MPBS溶液冲洗30分钟；
步骤5)中所述萃取液2的配制方法如下将Triton X-200在0.01M PBS稀释 成0.14-0.42%的浓度，同时将SB —16溶解于此溶液中，配制成0.6-1.8mM的SB-16; 所述的振荡冲洗时间优选为24小时；
步骤7)中将人周围神经用0.01MPBS溶液冲洗30分钟。
本发明中所用到试剂，例如TrionX—200、 SB-IO、 SB-16都能从商业途径购买 得到(例如，可购自Sigma公司)。
本法制备得到的移植物采用冷冻干燥法存储，包括一2(TC冷冻干燥大于4小时 及采用Y射线辐照灭菌，具体方法如下将本发明化学萃取法得到的去细胞神经放 置铝板上在-8(TC的深低温冰箱中进行速冻，保持神经的外形，然后在冷冻干燥机 (Edwards)中-56t:下进行冷冻干燥12小时。用无毒塑料包装袋进行双层封装，250 万拉德Y射线辐照灭菌，4"C冰箱保存备用。
本发明采用化学萃取方法去除细胞异体神经移植物，所制备得到的异体神经移 植物不但去除了引起排斥反应的主要抗原一细胞、轴突和髓鞘，而且保存了轴突再
生所需细胞外基质及三维空间管道结构，为轴突的再生保存了诱导和促进物质及提 供完整的再生支架。本发明异体神经移植物具有与正常神经相似的物理和生化特 性，组织学检査发现，经本发明方法制备得到的异体神经移植物的植物细胞、轴突、 髓鞘被彻底去除，神经基底膜管基本保持完整。
本发明所制备的异体神经移植物可作为创伤或肿瘤切除造成的周围神经缺损 而无法直接吻合者的异体神经移植物。将本法制备的移植物作为神经支架，再加入 任何种类的神经营养因子和细胞，进行常规神经移植手术即可。作为参考，其操作 方法如下将本发明异体神经移植物用生理盐水浸泡和冲洗三次，每次10分钟， 进行复水。麻醉成功后，常规消毒铺单。手术采取原切口或根据伤口的情况，延长 切口，在正常部位解剖分离出神经，切除瘢痕(或清创)，锐刀切至正常神经乳头， 测量长度后，行异体神经移植，均用显微外科技术行外膜缝合法。注意在原伤口处 瘢痕较多的病例，神经适当转位至组织正常的位置，创造良好的组织床，以减少神 经的粘连与瘢痕形成。
图1为化学萃取前新鲜人尺神经大体观。 图2为本发明化学萃取后人尺神经大体观。
从外观可见呈淡乳白色，略透明，神经的延展性及神经外膜的韧弹性与新鲜神 经基本一致。
图3为化学萃取前新鲜人尺神经HE染色纵切片。
图4为本发明化学萃取后人尺神经HE染色纵切片(见细胞去除完全、轴突绝 大部分去除)。
图5化学萃取前新鲜人尺神经HE染色横切片。
图6为本发明化学萃取后人尺神经HE染色横切片(见细胞去除完全、轴突绝 大部分去除)。
图7为化学萃取前新鲜人尺神经fast—blue染色纵切片。
图8为本发明化学萃取后人尺神经fast—blue染色纵切片(见髓鞘大部分去除)。
图9为化学萃取前新鲜人尺神经fast—blue染色横切片。
图10为本发明化学萃取后人尺神经fast—blue染色横切片(见髓鞘大部分去除)。图11为化学萃取前新鲜人尺神经laminin染色纵切片。
图12为本发明化学萃取后人尺神经laminin染色纵切片(见促进和诱导轴突再 生的laminin—基底膜素大部分保留，为轴突生长提供支架和通道的基底膜管保存完 好)。
图13为化学萃取前新鲜人尺神经laminin染色横切片。
图14为本发明化学萃取后人尺神经laminin染色横切片(见促进和诱导轴突 再生的laminin—基底膜素大部分保留，为轴突生长提供支架和通道的基底膜管保存 完好)。
图15为化学萃取前新鲜人尺神经半薄切片美兰一复红染色横切片。 图16为本发明化学萃取后人尺神经半薄切片美兰一复红染色横切片(见轴突 和髓鞘绝大部分去除)。
图17为化学萃取前新鲜人尺神经超薄切片电镜切片。
图18为本发明化学萃取后人尺神经超薄切片电镜切片(可见髓鞘大部分去除)。 图19为化学萃取前新鲜人尺神经超薄切片电镜切片。
图20为本发明化学萃取后人尺神经超薄切片电镜切片(见髓鞘大部分去除)。 以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证 目的，绝不限制本发明的范围。
具体实施方式
实施例1
1材料来源人尺神经(死于急性颅脑损伤捐献者)。 2制备流程
1) 无菌条件下，显微镜下去除神经外膜脂肪及结缔组织；
2) 25°C，摇床上蒸馏水中振荡浸泡冲洗24h;
3) 在萃取液1中振荡浸泡冲洗24h [萃取液1的配制方法如下将SB-10(购自 Sigma公司)溶解于0.01M的PBS液中配制成250 mM的SB —10溶液];
4) 0.1MPBS溶液冲洗30分钟；
5) 萃取液2中振荡冲洗24h [萃取液2的配制方法如下将TritonX-200(购自 Sigma公司)在0.01M PBS稀释成0.28%的浓度，同时将SB —16(购自Sigma公司) 溶解于此溶液中，配制成1.2mM的SB-16];6) 依次重复3)、 4)、 5)步骤一次；
7) 用0.01MPBS溶液冲洗30分钟，即得。
将本实施例制备得到的异体神经移植物釆用下述常规的组织学染色切片检査 1、 HE染色切片HE (苏木素-伊红)染色(参考文献朱有华.浅谈石蜡切片HE 染色.诊断病理学杂志.1997;4(2):111-112); 2、 fast-blue染色切片(参考文献龚 志锦，詹溶洲.病理组织制片和染色技术.上海科学技术出版社，1994: 110—111); 3、 laminin染色切片(参考文献Sondell M， Lundborg Q Kanje M. Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction. Brain Res ， 1998， 795:44-54); 4、半薄切片美兰一复红染色切片(参考文献李跃军，陈绍 宗.去细胞异体神经材料复合碱性成纤维细胞生长因子修复周围神经缺损.中华创伤 杂志，2003， 19 (18): 491—493); 5、超薄切片电镜切片(参考文献龚志锦， 詹溶洲.病理组织制片和染色技术.上海科学技术出版社，1994: 348 — 353)。
检测结果见图4、图8、图12、图16，从切片结果可以看出，本实施例所制备 的异体神经移植物彻底去除了引起排斥反应的施旺细胞、轴突和髓鞘，基底膜管保 持完整。
实施例2
1材料来源人尺神经(死于急性颅脑损伤捐献者)。 2制备流程
1) 无菌条件下，显微镜下去除神经外膜脂肪及结缔组织；
2) 10° C，摇床上蒸馏水中振荡浸泡冲洗28h;
3) 萃取液1中振荡浸泡冲洗30h (萃取液1的配制方法如下将SB-10溶解于 0.01M的PBS液中配制成125 mM的SB—10溶液)；
4) 0.1MPBS溶液冲洗40分钟
5 )萃取液2中振荡冲洗30h(萃取液2的配制方法如下将Triton X-200在0.01M PBS稀释成0.14。/。的浓度，同时将SB—16溶解于此溶液中，配制成0.6mM的SB-16);
6) 依次重复3)、 4)、 5)步骤一次；
7) 将人尺神经用0.01MPBS溶液冲洗40分钟，即得。
将本实施例制备得到的异体神经移植物采用下述常规的组织学染色切片检查: 1、 HE染色切片HE (苏木素-伊红)染色；2、 fast-blue染色切片；3、 laminin染色 切片；4、半薄切片美兰一复红染色切片；5、超薄切片电镜切片。
检测结果见图6、图10、图14，从切片结果可以看出，本实施例所制备的异
体神经移植物彻底去除了引起排斥反应的施旺细胞、轴突和髓鞘，基底膜管保持完 整。
注组织染色参考文献同实施病例1。 实施例3
1材料来源人尺神经(死于急性颅脑损伤捐献者)。 2制备流程
1) 无菌条件下，显微镜下去除神经外膜脂肪及结缔组织；
2) 40° C摇床上蒸馏水中振荡浸泡冲洗12h;
3) 萃取液1中振荡浸泡冲洗16h (萃取液1的配制方法如下将SB-10溶解于 0.01M的PBS液中配制成375 mM的SB—10溶液)；
4) 0.01M PBS溶液冲洗30分钟
5) 萃取液2中振荡冲洗16h(萃取液2的配制方法如下将TritonX-200在0.01M PBS稀释成0.42%的浓度，同时将SB — 16溶解于此溶液中，配制成1.8mM的SB-16 );
6) 依次重复3)、 4)、 5)步骤一次；
7) 将人尺神经用0.01MPBS溶液冲洗35分钟，即得。
将本实施例制备得到的异体神经移植物采用下述常规的组织学染色切片检査 1、 HE染色切片HE (苏木素-伊红)染色(参考文献朱有华.浅谈石蜡切片HE 染色.诊断病理学杂志.1997;4(2):111-112); 2、 fast-blue染色切片；3、 laminin染 色切片；4、半薄切片美兰一复红染色切片；5、超薄切片电镜切片。
检测结果见图18和图20，从切片结果可以看出，本实施例所制备的异体神经 移植物彻底去除了引起排斥反应的施旺细胞、轴突和髓鞘，基底膜管保持完整。 注组织染色的参考文献同实施病例1。
权利要求
1.一种制备异体神经移植物的方法，步骤如下(1)无菌条件下，去除人周围神经的外膜脂肪及结缔组织；(2)将去除了外膜脂肪及结缔组织的人周围神经浸泡于蒸馏水中，在10-40℃温度下振荡冲洗12小时以上；(3)将经过步骤2)处理的人周围神经浸泡于由SB-10与磷酸盐缓冲液二者按任意比例配制成的萃取液1中并振荡冲洗12小时以上；(4)将经过步骤3)处理的人周围神经用磷酸盐缓冲液冲洗20分钟以上；(5)将经过步骤4)处理的人周围神经在由Triton X-200、SB-16和磷酸盐缓冲液三者按任意比例配制的萃取液2中振荡冲洗12小时以上；(6)依次重复步骤3)、4)、5)一次；(7)将经过上述步骤处理后的材料用磷酸盐缓冲液冲洗20分钟以上，即得。
2. 按照权利要求1的方法，其特征在于步骤2)中将去除了外膜脂肪及结缔 组织的人周围神经浸泡于蒸馏水中在25° C温度下振荡冲洗24小时；
3. 按照权利要求1的方法，其特征在于步骤3)中所述萃取液1的配制方法如 下将SB-10溶解于0.01M的磷酸盐缓冲液中配制成125-375 mM的SB — 10溶液。
4. 按照权利要求1的方法，其特征在于步骤3)中所述的振荡冲洗时间为24小时。
5. 按照权利要求1的方法，其特征在于步骤4)中将经过步骤3)处理的人周 围神经用0.01M磷酸盐缓冲液冲洗30分钟。
6. 按照权利要求1的方法，其特征在于步骤5)中所述萃取液2的配制方法如 下将Triton X-200用0.01M磷酸盐缓冲液稀释成0.14-0.42Q/。的浓度，同时将SB — 16溶解于此溶液中，配制成0.6-1.8mM的SB-16。
7. 按照权利要求1的方法，其特征在于步骤5)中所述的振荡冲洗时间为24小时。
8. 按照权利要求1的方法，其特征在于步骤7)中将人周围神经用O.OIM磷酸 盐缓冲液溶液冲洗30分钟。
9. 一种异体神经移植物，其特征在于是由权利要求1-8任意一种方法制备得到 的产品。
10.按照权利要求9的异体神经移植物，其特征在于该异体神经移植物中引起 免疫排斥反应的施旺细胞、轴突和髓鞘被彻底去除；该异体神经移植物的基底膜管 保持完整。
全文摘要
本发明公开了一种新的异体神经移植物、该移植物的制备方法及其在医学上的应用。本发明采用化学萃取方法去除了异体神经移植物中引起排斥反应的施旺细胞、轴突和髓鞘，而且保存了轴突再生所需细胞外基质及三维空间管道结构，为轴突的再生保存了诱导和促进物质并提供完整的再生支架。本发明异体神经移植物具有与正常神经相似的物理和生化特性，可作为创伤或肿瘤切除造成的周围神经缺损而无法直接吻合者的异体神经移植物。
文档编号A61L27/00GK101095963SQ200610090910
公开日2008年1月2日 申请日期2006年6月30日 优先权日2006年6月30日
发明者卢世璧, 孙明学, 莉 张, 江 彭, 智 李, 鑫 王, 王冠军, 玥 田, 许文静, 斌 赵 申请人:中国人民解放军总医院