专利名称：组织工程化周围神经移植体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物组织工程技术领域，具体涉及一种修复神经缺损移植用的组织工程化周围神经及其制备方法。
背景技术：
周围神经再生的基本生物学特性为周围神经损伤后，远端神经发生瓦勒变性，近端轴突发出的轴芽在间充质细胞的间隙向前滑行，长到远端的Büngner带中，并向靶器官生长形成突触连接；施万细胞使轴突髓鞘化；恢复神经结构，完成神经再生的过程。
目前国内外组织工程化周围神经均是依据周围神经再生的基本生物学特性而设计的。它们有一特定的三维结构支架-神经导管，可接纳再生轴突长入，对轴突起机械引导作用；种植的施万细胞在支架内有序地分布，类似Büngner带；施万细胞具有生物活性，能分泌神经营养因子，造成一个轴突生长的微环境，支持引导轴突的再生。但是在这种思路下构建的组织工程化神经，由于受神经趋化和接触引导的限制，桥接的距离一般不超过30mm，而临床上面临的主要问题是长段缺损时自体神经的来源不足；轴突再生需跨越两个吻合口，增加了神经再生的难度；另外，新生轴突生长时间的过长及在生长过程中的误入，易出现效应器的废用性萎缩或神经-效应器失配等。这些问题制约了组织工程化神经的临床应用。
2003年，Stephen等将脊髓分离的神经干细胞移植于横断的大鼠坐骨神经远断端，发现神经干细胞转化为运动神经元样细胞，并伸出轴突进入肌肉，形成胆碱能突触。受该研究的启发，为解决目前组织工程化神经的不足，本发明以神经元为主要细胞构建组织工程化周围神经，利用桥接神经元的方法重建缺损神经功能的思路和方法，可以克服诱导性组织工程化神经桥接距离较短、轴突再生需跨越两个吻合口和新生轴突生长时间过长的问题。
构建组织工程的关键因素是种子细胞，目前在组织工程化神经构建中研究较多的种子细胞是施万细胞、骨髓间充质干细胞和神经干细胞等。自体外周施万细胞为终末期细胞，存在增殖能力差，体外分离、培养困难和活性下降，需二次手术等缺点，虽经基因修饰得到了施万细胞的永生株，但其分泌利于神经修复因子的能力也显著下降；异体移植常面临免疫排斥反应。骨髓间充质干细胞具有取材方便、扩增迅速，避免了异体神经移植所致的免疫排斥反应等优点，但诱导分化成神经元样细胞的比率相对较低。神经干细胞作为组织工程化神经新的种子细胞，是近年来的研究热点，但自体神经干细胞来源困难，异体神经干细胞同样有免疫排斥反应问题。因此，寻找新的种子细胞应是组织工程化神经构建的当务之急。
Sieber-Blum等的研究表明，在成体毛囊隆突内存在着多潜能的干细胞，而且是神经嵴来源的，故将其命名为毛囊神经嵴干细胞(NCSC)，它可自然分化为神经元、平滑肌细胞、SC及黑素细胞等。Amoh等研究发现毛囊隆突部干细胞表现为巢蛋白(Nestin)阳性，能形成神经元，经10％胎牛血清诱导分化后，有近一半的细胞分化为神经元(48％)，30％的细胞分化为神经胶质细胞，还有其他细胞如角质细胞(18％)、平滑肌细胞(2％)、黑素细胞(2％)等，而且将这些Nestin阳性的毛囊干细胞移植至小鼠坐骨神经缺损处可使其转分化为施万细胞，对神经缺损起到了较好的修复作用。可见，毛囊NCSC可来源于自身，取材方便，损伤小，不涉及免疫原性和伦理学问题，并具备向神经细胞分化的优势。
支架材料是决定组织工程神经能否成功构建和应用于临床的又一关键。Yu等研究表明层粘连蛋白(参见Biomaterials，2005，26(13)1507-1514.)是一种可增强细胞粘附、迁移、分化和基因表达的细胞外基质，位于其β1链的YIGSR序列可增强神经细胞的粘附力，位于A链上的IKVAV序列可促进神经细胞的轴突生长，延长的氨基酸序列CDPGYIGSR和CQAASIKVAV则能进一步增强细胞的粘附力和促进轴突的生长。
发明内容
本发明的目的在于提供一种材料来源广泛、活性强、无免疫原性、不涉及伦理学问题、可修复长段神经缺损的组织工程化周围神经移植体，及其制备方法。
本发明提供一种组织工程化周围神经移植体，包括种子细胞和支架，其中的种子细胞是以毛囊神经嵴干细胞(NCSC)诱导分化的神经元样细胞和类施万细胞的混合细胞，其中的支架是以具有SEQ ID NO1和SEQID NO2所示氨基酸序列的寡肽修饰的异种去细胞神经基膜管。
本发明提供一种组织工程化周围神经移植体的制备方法，包括毛囊神经嵴干细胞(NCSC)的分离、培养、纯化、扩增和鉴定；毛囊NCSC向神经元样和类施万细胞的诱导分化及鉴定；异种去细胞神经基膜管支架的制备及修饰；神经元性组织工程化周围神经的体外构建。
具体步骤如下1.制备成体毛囊神经嵴干细胞(NCSC)按贴块法从成年毛囊隆突部分离获得毛囊NCSC(参见Sieber-Blum等，Developmental Dynamics，2004，231258-269.)。取清洁级SD大鼠触须垫皮肤毛囊隆突部，于神经干细胞培养液中贴块培养，传代培养获得毛囊NCSC。
2.成体毛囊NCSC的诱导分化以维甲酸RA(5～20μmol/L；购自Sigma)和音猥因子激动剂hedgehogagonist(HhAg1.3，5～20μmol/L；购自Curis Inc.)联合诱导毛囊NCSC，使之分化为神经元样细胞。最佳诱导浓度为10μmol/L。作用时间为1d～14d，最佳作用时间为7d。
以神经调节蛋白neuregulin-1(NRG1，50～150ng/ml，购自Sigma)诱导毛囊NCSC，使之分化为类施万细胞。最佳诱导浓度为100ng/ml。作用时间为1d～14d，最佳作用时间为7d。
3.异种去细胞神经基膜管支架的制备及修饰以1％溶血卵磷脂等处理犬坐骨神经，获得异种去细胞神经基膜管支架。并以寡肽CDPGYIGSR(SEQ ID NO1)、CQAASIKVAV(SEQ IDNO2)按1∶1的比例联合浸泡支架，最佳浸泡时间是12小时，低压冻干，环氧乙烷灭菌，-20℃保存备用。
4.体外构建神经元性组织工程化周围神经在手术显微镜下分别按1∶1、2∶1、3∶1的比例种植毛囊NCSC诱导分化的神经元样细胞和类施万细胞，将复合了种子细胞的异种去细胞神经基膜管支架置于旋转培养腔内进行体外构建。
本发明的种子细胞选材于毛囊神经嵴干细胞(NCSC)，不仅可来源于自身，而且来源广泛、取材方便，损伤小、活性强、不涉及免疫原性和伦理学问题，NCSC诱导的神经元样细胞对神经再生有更好的促进作用；本发明以寡肽CDPGYIGSR和CQAASIKVAV联合修饰支架材料更有利于种子细胞的粘附、迁移和分化。
具体实施例方式
现结合实施例，对本发明作进一步的描述，但本发明的实施并不仅限于此。
实施例11.制备成体毛囊神经嵴干细胞(NCSC)(1)毛囊NCSC的原代培养清洁级SD大鼠，体质量100g，颈椎脱臼处死。75％乙醇消毒，取大鼠触须垫毛囊，室温、显微镜下、无菌条件，每只大鼠取10～20个毛囊，以供制备1～2条组织工程神经用。完整毛囊置于4℃DPBS中，剪去毛囊球部，剥除毛囊外层结缔组织囊，暴露毛囊隆突部(保留毛干1mm，便于贴块操作)，以4℃DPBS清洗2遍，备用。每35mm培养皿均匀涂布鼠尾胶(1mg/ml，购自Sigma)50μl，室温置超净台干燥1h以上，置于37℃、5％CO2培养箱中以原代培养液孵育3h备用。每35mm培养皿种植5～8个毛囊隆突，于37℃、5％CO2培养箱中静置1h后，再缓慢加入原代培养液[DMEM/F12(1∶1)，购自GIBCO；B27(2％)，购自GIBCO；N2(1％)，购自GIBCO；ITS+3(insulin，transferrin，selenium，andthree essential fatty acids)，购自Sigma；bFGF(20ng/ml)，EGF(20ng/ml)；L-谷氨酰胺(200μmol/L)；胎牛血清(10％)，购自GIBCO]，静置培养4～6天后传代培养。
(2)毛囊NCSC的传代培养以显微器械剔除毛囊隆突，0.25％胰酶消化2min，胰酶抑制剂终止消化，每35mm皿加入2ml培养液(不含胎牛血清，其余成分同原代培养液)，以吸管吹打制备单细胞悬液，细胞密度为1×105/ml。37℃、5％CO2培养箱中静置培养，每两天换半液。
2.成体毛囊NCSC的诱导分化(1)向神经元样细胞的诱导分化取第2代毛囊NCSC，加入10μmol/L维甲酸RA(Sigma)和10μmol/L音猥因子激动剂hedgehog agonist(HhAg1.3，Curis Inc.)，作用时间为7d。
(2)向类施万细胞的诱导分化取第2代毛囊NCSC，以100ng/ml neuregulin-1(NRG1，Sigma)诱导分化，作用时间为7d，之后进行类施万细胞的鉴定。
3.异种去细胞神经基膜管支架的制备及修饰委托上海生工生物工程有限公司合成寡肽CDPGYIGSR(SEQ ID NO1)、CQAASIKVAV(SEQ ID NO2)。
无菌条件下取犬坐骨神经，DPBS(pH 7.3)4℃，5d，1％溶血卵磷脂/0.1mol/L PBS(pH 7.0)，室温，4d，每隔24h换液1次，DPBS洗30min，DNase I(600U/ml)、RNase A(10U/ml)，37℃，24h，DPBS洗3次，1h，寡肽CDPGYIGSR/CQAASIKVAV(1∶1，1.5mg/ml，溶于PBS中)浸泡12h，其间轻微振动。PBS充分漂洗3次，低压冻干，环氧乙烷灭菌，-20℃保存备用。
4.体外构建神经元性组织工程化周围神经种子细胞的种植密度为1×106/ml～1×107/ml，在手术显微镜下，分别按1∶1、2∶1、3∶1的比例种植毛囊NCSC诱导分化的神经元样细胞和类施万细胞。
先显微注射(显微手术镜下以微量加样器将种子细胞混合悬液注射入支架，间隔5mm，每次注射20～50μl)，后浸润接种(将种子细胞混合悬液均匀地滴加于支架上，在培养皿内悬空孵育4h)，再旋转培养(将支架固定于旋转培养腔内培养1～2d，使细胞分布更为均匀)。2d后供移植修复SD大鼠坐骨神经缺损用。
实施例21.组织工程化周围神经移植体修复SD大鼠坐骨神经缺损切除成年雄性SD大鼠(已取其皮肤进行了毛囊NCSC的分离培养)一侧坐骨神经10mm，断端距离维持15mm，用显微外科技术将神经移植体套接坐骨神经断端；另一侧不做手术。动物存活9周。
动物分组如下自体神经移植组、组织工程化周围神经移植组(毛囊NCSC诱导分化的神经元样细胞和类施万细胞分别按1∶1、2∶1、3∶1的比例植入)、诱导性组织工程神经移植组(仅植入毛囊NCSC诱导分化的类施万细胞)、犬去细胞神经基膜管支架移植组。每组5只动物，其中自体神经移植组所切除的坐骨神经长15mm，并用此段神经原位移植修复缺损神经。
2.功能恢复的评估(1)参照deMedinaceli法(参见Exp Neurol，1982，77634)测量大鼠后爪印迹，计算出坐骨神经功能指数。
(2)以平步梯形仪检测各组动物的触板次数，以评估其功能恢复情况。触板次数越少，功能恢复越好。
(3)手术9周后在再生神经近侧端实施电刺激，在远侧端记录其动作电位，同时观察腓肠肌的收缩情况；测量小腿三头肌的重量和肌力。
研究发现，组织工程化周围神经移植组的功能恢复优于诱导性组织工程神经移植组和空支架移植组，与自体神经移植组相接近。其中效果最佳的实验组是毛囊NCSC诱导分化的神经元样细胞和类施万细胞按1∶1的比例种植组。
SEQUENCE LISTING<110>中国人民解放军第二军医大学<120>组织工程化周围神经移植体及其制备方法<130>说明书，权利要求书<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>1Cys Asp Pro Gly Tyr Ile Gly Ser Arg1 5<210>2<211>10<212>PRT
<213>人工序列<400>2Cys Gln Ala Ala Ser Ile Lys Val Ala Val1 5 10
权利要求
1.一种组织工程化周围神经移植体，包括种子细胞和支架，其特征在于其中的种子细胞是以毛囊神经嵴干细胞诱导分化的神经元样细胞和类施万细胞的混合细胞，其中的支架是以具有SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示氨基酸序列的寡肽修饰的异种去细胞神经基膜管。
2.根据权利要求1所述的一种组织工程化周围神经移植体，其特征在于其中的神经元样细胞和类施万细胞的比例是1∶1、2∶1或3∶1。
3.一种如权利要求1所述的组织工程化周围神经移植体的制备方法，其特征在于它包括以下步骤A)毛囊神经嵴干细胞的分离、培养、纯化、扩增和鉴定；B)毛囊神经嵴干细胞向神经元样细胞和类施万细胞的诱导分化及鉴定毛囊神经嵴干细胞向神经元样细胞的诱导分化条件是以5～20μmol/L的维甲酸和5～20μmol/L的音猥因子激动剂联合诱导毛囊神经嵴干细胞，作用时间为1d～14d；毛囊神经嵴干细胞向类施万细胞的诱导分化条件是以50～150ng/ml的神经调节蛋白诱导毛囊神经嵴干细胞，作用时间为1d～14d；C)异种去细胞神经基膜管支架的制备和以具有SEQ ID NO1和SEQ IDNO2所示氨基酸序列的寡肽按1∶1的比例联合浸泡支架进行修饰；D)组织工程化周围神经移植体的体外构建先在支架上种植以毛囊神经嵴干细胞诱导分化的神经元样细胞和类施万细胞的混合细胞，然后将支架置于旋转培养腔内进行体外构建。
4.根据权利要求3所述的一种组织工程化周围神经移植体的制备方法，其特征在于其中的B)步骤中，毛囊神经嵴干细胞向神经元样细胞的诱导分化条件是以10μmol/L的维甲酸和10μmol/L的音猥因子激动剂联合诱导毛囊神经嵴干细胞，作用时间为7d；毛囊神经嵴干细胞向类施万细胞的诱导分化条件是以100ng/ml的神经调节蛋白诱导毛囊神经嵴干细胞，作用时间为7d。
5.根据权利要求3所述的一种组织工程化周围神经移植体的制备方法，其特征在于其中的C)步骤中，以具有SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示氨基酸序列的寡肽按1∶1的比例联合浸泡支架进行修饰，浸泡时间为12小时，浸泡时轻微振动。
6.根据权利要求3所述的一种组织工程化周围神经移植体的制备方法，其特征在于其中的D)步骤中，在支架上种植以毛囊神经嵴干细胞诱导分化的神经元样细胞和类施万细胞的混合细胞，种植密度为1×106/ml～1×107/ml，神经元样细胞和类施万细胞的种植比例是1∶1、2∶1或3∶1。
全文摘要
本发明涉及生物组织工程技术领域，具体涉及一种修复神经缺损移植用的组织工程化周围神经及其制备方法。本发明提供的组织工程化周围神经移植体，其中的种子细胞是以毛囊神经嵴干细胞(NCSC)诱导分化的神经元样细胞和类施万细胞的混合细胞，其中的支架是以寡肽CDPGYIGSR和CQAASIKVAV修饰的异种去细胞神经基膜管。本发明还提供了上述组织工程化周围神经移植体的制备方法。本发明内的种子细胞尤其是神经元样细胞对神经再生有更好的促进作用，为临床提供一种材料来源广泛、无免疫原性、不涉及伦理学问题、修复长段神经缺损效果更好的组织工程化神经移植体。
文档编号A61F2/04GK101066472SQ20071003957
公开日2007年11月7日 申请日期2007年4月18日 优先权日2007年4月18日
发明者刘芳, 张传森, 许家军, 郭金萍, 蔺海燕 申请人:中国人民解放军第二军医大学