一种治疗性乙肝疫苗组合物的制作方法

专利名称：一种治疗性乙肝疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明是一种生物制剂，特别是指用于慢性乙型肝炎治疗的一种治疗性乙肝疫苗组合物。
背景技术：
慢性乙型肝炎是我国常见的传染病之一，我国属乙型肝炎病毒(HBV)高流行区，HBV感染是一个严重的公共卫生问题。2004年，中国疾病预防控制中心对2002年中国居民营养与健康状况调查的血样检测结果表明，我国一般人群中HBsAg的流行率高达9.09％，据此推测，我国现有慢性HBV感染者约1.2亿人，其中慢性乙型肝炎约3000万例。慢性乙型肝炎给国家和个人带来了沉重的经济负担，我国每年因慢性乙型肝炎直接和间接损失约9000亿元人民币。应当指出在慢性乙肝治疗方面尚未取得突破性进展。
肝炎治疗的总体目标是最大限度的长期抑制或消除HBV，减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化，延缓和阻止疾病进展，减少和防止肝脏失代偿、肝硬化、肝细胞癌的发生，从而改善生活质量和延长存活时间。慢性乙型肝炎治疗主要包括抗病毒、免疫调节、抗纤维化和对症治疗。
目前我国SFDA批准用于治疗慢性乙型肝炎的抗病毒药物有干扰素和核苷类似物(包括拉米夫定、阿德福韦酯和恩替卡韦)，虽然这些药物对抑制病毒复制有重要作用，但存在着不彻底性。目前公认“正规抗病毒治疗结束1年后的病毒学应答”作为评价慢性乙型肝炎治疗效果的重要标准，现有的抗病毒药物治疗结果总体上的有效率约为30％，只有少数患者获得对病毒的持续应答。
慢性乙型肝炎的治疗应答的影响因素十分复杂，它涉及了患者感染HBV的年龄，感染的方式，感染HBV的异质性(不同的基因型和血清型)，HBV的载量，HBV的复制率，HBV的变异和HBV的免疫抑制作用以及机体的免疫应答状态特别是树突状细胞和T细胞的功能水平。应当指出抗病毒药物的使用是治疗的重要手段。且核苷类似物的研制近年来取得了较大的进展，但这类药物只能抑制HBV复制，还不能在人体内彻底的清除HBV。我们应十分关注免疫调节剂在慢性乙肝治疗中的重要作用，尽管目前还缺乏乙型肝炎特异性免疫治疗方法，但应合理的使用现有的免疫调节剂，努力研制开发新的免疫调节药物、治疗性疫苗、新的疫苗佐剂和某些细胞因子，归根结底调动和诱导机体自身的免疫清除机制是治疗慢性乙型肝炎的重要途径。
总之诱导和维持HBV特异性的免疫应答，打破免疫耐受重建机体免疫机制，具有重要的治疗意义，是开发持续性HBV感染的免疫调节治疗的重要理论依据和途径。免疫调节治疗的重要概念是企图在大部分HBV慢性感染患者中诱导维持HBV特异性的免疫应答，而这是抗病毒药物无法达到的目标，在这些免疫调节治疗方法的诸多选择中，无疑乙肝治疗性疫苗是研究的重点和热点。
我国研制的治疗性乙肝疫苗尚处在临床观察阶段闻玉梅等研制HBsAg-抗HBs抗体复合物疫苗、吴玉章等研制的TT830 HBc 18-27表位组成的MAP短肽疫苗，张宜俊等研制乙肝表面抗原蛋白疫苗和陈光明等研制的DNA疫苗正在进行I/II期临床观察。这些不同的研制者共同的特点是企图通过增加HBV结构或非结构蛋白的表位和糖基侧链修饰成分或改变疫苗形式，辅以不同成分佐剂等途径研制新型治疗性乙肝疫苗，希望打破免疫耐受，重建免疫应答特别是诱导和维持以HBV特异性的CTL为主的细胞免疫应答，这些治疗性乙肝疫苗的临床疗效有待于更多的和较长时间的临床观察。
近几年来NK细胞和NKT细胞的非特异性免疫机制在病毒性肝炎中的作用，特别是肝脏天然免疫学对HBV感染的影响越来越受到重视，肝脏中NK细胞、NKT细胞、γδT细胞占肝脏淋巴总数的2/3左右，如此庞大的天然免疫淋巴细胞在HBV感染及其免疫致病和治疗中的作用，引起学者的高度关注。传统理论认为Th1细胞和CD8+CTL在HBV感染、免疫损伤、病毒清除中起主导作用。但仅占肝脏淋巴细胞总数1/3的这类T细胞能否全部承担HBV引起的肝脏损伤和病毒清除，值得深入观察。NK细胞和NKT细胞通过细胞因子的分泌和细胞毒作用抑制HBV的复制在实验室得到充分的证明，特别应当指出NKT细胞产生的细胞因子不但可增强NKT细胞自身的细胞毒作用，还可选择性的激活其他细胞如NK细胞和T细胞。NKT表达的IFN-γ可以活化病原体特异性的Th1和CD8+CTL介导的细胞毒作用，可见NKT细胞除自身的免疫活性外，随后还可活化其他细胞，特别是T细胞。因此被视为是固有和获得性免疫之间的桥梁。大量研究结果提示NKT和NK系统做为抗HBV感染的疫苗成分具有重大潜力，通过疫苗对NK和NKT的活化作用来激活病原体特异性和非特异性免疫应答是一种有效而明智的选择。综上所述可见肝脏天然免疫细胞在机体抗HBV感染中起着重要的作用，活化肝脏天然免疫细胞特别是NKT和NK细胞可能会成为清除HBV的崭新途径。国外学者正在寻找和筛选NKT和NK的激活剂。Kakimi等发现在注射α-半乳糖酐神经酰胺(α-GalCer)24h内HBV转基因小鼠肝内可检测到IFN-γ和IFN-α/β，并且HBV复制被终止。这一现象与肝内NKT细胞的迅速消失和激活的NK细胞向肝内募集短暂相关，这一现象表明α-GalCer通过直接活化NKT细胞继而激活NK细胞分泌抗病毒的细胞因子抑制HBV复制。α-GalCer可能有希望作为NK和NKT细胞激活剂用于慢性乙型肝炎的治疗。

发明内容
本发明的要解决的技术问题是提供一种具有更好的治疗效果的治疗性乙肝疫苗组合物。
本发明的发明人通过大量的实验发现，在重组HBsAg蛋白疫苗(HBsAg疫苗)的基础上加入佐剂重组人白介素12(rhIL-12)和绿脓杆菌菌苗制剂(PA-MSHA菌苗)，可得到一种治疗效果更好的治疗性乙肝疫苗组合物。
本发明的发明人发现，每毫升治疗性乙肝疫苗组合物中，各组份在下述范围内均有较好的效果，其中HBsAg疫苗10～20μg、rhIL-1210～20μg、PA-MSHA菌苗9～18亿和余量的水。
本发明的治疗性乙肝疫苗组合物以每毫升组合物含有10μg重组HBsAg蛋白疫苗、10μg重组人白介素12、18亿绿脓杆菌菌苗制剂和余量的水溶液为最佳。
本发明的治疗性乙肝疫苗组合物的制备方法也非常简单，是将HBsAg疫苗、rhIL-12和PA-MSHA菌苗直接混制成，制剂为水剂。
本发明的关键是在HBsAg疫苗的基础上加入佐剂rhIL-12和PA-MSHA菌苗，利用rhIL-12和PA-MSHA菌苗的协同效应，提高治疗效果，下面从各组分的具体作用进行详细说明。
HBsAg疫苗一定剂量的HBsAg疫苗长期反复免疫可以诱导机体免疫系统产生特异性的免疫应答。主要为CD4+T细胞和CD8+CTL，上调非溶细胞和溶细胞的生物学反应，抑制HBV的复制和表达。
rhIL-12rhIL-12是在免疫网络中占有核心位置的重要细胞因子。IL-12的主要产生者是对微生物刺激应答的单核/巨噬细胞，抗原提呈细胞(APC)、B细胞、嗜中性粒细胞和角质细胞。Maron认为IL-12的产生经过2个不同的刺激途径，第一个途径是由各种细菌、真菌、原虫、病毒或它们的产物直接作用于APC，诱导IL-12产生称作非T细胞依赖性途径，另一个途径是依赖APC和活化的T细胞相互作用而诱导产生IL-12，则称为T细胞依赖性途径。IL-12是由35kd的轻链(P35，IL-12α)和40kd的重链(P40，IL-12β)组成的不同基因编码的两条链的异源二聚体，由多个二硫键连接，相对分子量为70～75kd，等电点介于pH3.5～pH5.5。由于两个亚单位是由不同的基因编码，基因转染试验结果表明，只有将两个亚单位同时转染才能获得具有生物活性的IL-12，二个亚单位单独存在时无生物学活性。
IL-12的生物学活性具有专一性，必须由高亲和力的受体来介导。IL-12R由β1和β2链构成，IL-12与单独的β1或β2链的亲合较弱，只有β1和β2共表达才能形成与IL-12具有高亲和力的受体复合物。P40与IL-12Rβ2结合介导P35与IL-12Rβ1结合，后者发挥生物学效应，IL-12R存在于活化的T细胞以及静止或活化的NK细胞。当NK细胞、CD4+、CD8+的T细胞被活化后，其细胞表面能表达出高亲和力的IL-12R。IL-12的信号通路尚不完全清楚。这一过程主要与JAK/STAT有关。最近的报告IL-12Rβ1在中央型记忆性CD4+T细胞转化为CD4+效应型T细胞是必须的。
IL-12是在免疫网络中占有十分重要地位的核心细胞因子，能使活化的T细胞增殖并增加其细胞毒活性，诱导IFN-γ的分泌，调节Th1/Th2细胞发育，促使其向Th1细胞分化。IL-12是诱生CTL免疫应答的最佳细胞因子启动细胞介导的免疫反应。不但能活化先天性免疫细胞，促进APC功能，促进其成熟，提高抗原提呈效率。还可作为第3信号直接活化初始T细胞，使其转变为效应性T细胞。已经证明效应性和记忆性CD8+T细胞在缺乏同源抗原刺激下，IL-12、IL-18可促使其具有分泌IFN-γ的能力。IL-12还是维持记忆性CD4+T细胞的一种候选因子。提示IL-12在促进记忆性细胞激活过程中起作用。特别值得指出IL-12不但协同IL-18促进NK细胞的增殖活化NK细胞产生细胞毒作用，诱生NK细胞产生IFN-γ，而且IL-12对NKT的活化及随后的IFN-γ分泌至关重要，NKT细胞表达丰富的IL-12受体复合物，成为IL-12作用的首要目标。NKT对自身配体的微弱反应被IL-12放大，从而启动免疫应答，可见IL-12在启动固有免疫应答在清除HBV中的重要作用。
PA-MSHA菌苗制剂绿脓杆菌PA-MSHA学名是铜绿假单胞菌，属革兰氏染色阴性细菌，是一种条件致病菌。绿脓杆菌可以产生多种与毒力有关的物质，例如内毒素、外毒素A、弹性蛋白酶、胶原酶、胰肽酶等。1980年本间逊发现绿脓杆菌的死菌体具有免疫调节作用，死菌体注射实验动物体内可以激发体液和细胞免疫，诱导干扰素生产，但由于菌体毒性大，免疫应答低，未能临床应用。1981年Gitboa-Garber发现绿脓杆菌染色体上有形成甘露糖敏感血凝菌毛的功能基因，但不能将甘露糖敏感血凝蛋白分泌到菌体外，也不能在菌体表面形成甘露糖敏感血凝菌毛。我国学者建立了绿脓杆菌甘露糖敏感血凝菌毛株，其主要特征主要为在菌体周围有许多细而刚直的菌毛。甘露糖敏感血凝试验呈强阳性。其成分包括DNA分子、RNA分子、蛋白质、脂类分子等，其特点为该菌株毒性低，免疫作用强，具有广谱特性。可激活和调节体液及细胞免疫。
关于PA-MSHA菌苗免疫调节的机理。已经证明绿脓杆菌鞭毛蛋白作为一种外源性的配体，(表达TLR-2、TLR-5和TLR-11配体)，能特异性的被Toll样受体所识别。免疫系统多种细胞可以表达TLRs如DC、巨噬细胞等通过分子模式的识别，启动十分复杂的信号转导通路，活化初始T细胞和NK细胞，触发并激活固有免疫和获得性免疫反应从而产生免疫调节作用。
Carm等研究工作表明人的T细胞可以表达大部分TLRs的mRNA编码，提示绿脓杆菌鞭毛蛋白可能直接作用于T细胞，促使其活化。另外近来的研究还表明TLRs的配体(如绿脓杆菌鞭毛蛋白)可以直接激活效应性记忆性T细胞。这二个作用的综合结果提示PA-MSHA菌苗可能上调CD4+T细胞和CD8+T细胞的免疫功能，促进IFN-γ的合成和分泌。我们的实验室工作表明PA-MSHA菌苗协同rhIL-12可以在体外诱导PBMCs产生大量IFN-γ，经多色流式细胞仪检测，在早期(大约作用后5小时)IFN-γ的主要产生者为NK细胞，在后期(大约48小时)IFN-γ的主要产生者为CD4+T细胞和CD8+T细胞。
已知NK细胞表达TLR3、TLR7和TLR8，而鞭毛蛋白表达TLR2、TLR5和TLR11的配体。似可排除鞭毛蛋白通过TLR的识别系统直接活化NK细胞，但我们应用PA-MSHA菌苗包括了是普通I型菌毛与绿脓杆菌全身菌毛及菌体结合在一起的综合性抗原物质，成分复杂，尚不能完全排除含有TLR3、TLR7和TLR8的配体。我们的实验表明在应用rhIL-12和PA-MSHA菌苗在体外诱导PBMCs分泌IFN-γ的试验，证明在作用5小时后即出现阳性反应，作用时间短暂，提示PA-MSHA菌苗可能并非必须通过APC介导途径。
NK细胞具有分泌细胞因子和细胞毒效应这种功能的发挥主要依赖NK细胞能够表达多种能有MHC或非MHC类配体结合的受体。但NK细胞的受体具有多样性，十分复杂，已发现有数十种之多，分属抑制性受体和活化性受体。在活化性受体中，NKG2D是一类非常重要的非MHC型活化性受体，在识别不同配体时使用一种诱导适应机制(inducedfit mechanism)，这种机制可使受体分子可以容忍配体的高度变异性，因此具有高亲和力。NK细胞通过NKG2D启动活化信号，当病毒感染的细胞或肿瘤细胞由于受到环境改变而表达NKG2D配体时，接着被NK识别而被激活。PA-MSHA菌苗是否会做为NKG2D的配体而激活NK细胞，这种可能性是存在的。还应指出NKG2D在许多免疫效应细胞上有所表达，包括NK细胞、NKT细胞、CD8+αβT细胞和γδT细胞，这些细胞都在肝脏中含量丰富，激活这些细胞在抗HBV感染中作用可能十分重要。
综上所述由HBsAg疫苗及佐剂rhIL-12和PA-MSHA菌苗组成的治疗性乙肝疫苗组合物中，HBsAg疫苗为在rhIL-12的辅助下通过第1信号和第3信号的介导，或作为第2次进入免疫系统的相同抗原诱导HBV特异性的CD4+和CD8+CTL产生IFN-γ启动非溶细胞或溶细胞机制抑制或清除HBV的复制，而rhIL-12可以直接活化NKT细胞，已知肝脏内富含NKT细胞，约占肝内淋巴细胞总数的30％细胞，活化后的NKT细胞通过穿孔素、颗粒酶、Fas及其配体能直接杀伤被HBV感染的细胞，其次NKT通过分泌的细胞因子特别是IFN-γ进一步抑制或清除HBV，并激活肝脏内的NK细胞，并导致NK细胞大量分泌IFN-γ而发挥抗HBV的作用，还应指出活化后的NKT细胞通过上调CD40L的表达，调整了CD40-CD40L相互作用对DC的活化，从而促进DC开始分泌IL-12。IL-12进一步活化NKT激发新一轮的IFN-γ分泌。而鞭毛蛋白作为TLR2、TLR5、TLR11的配体，通过APC的介导活化NK细胞，(NK细胞含有TLR7、TLR8和TLR3受体，尚未发现TLR2、TLR5、TLR11受体)。NK细胞在肝脏淋巴细胞中的比例约为30％(而在外周血淋巴细胞中只占2％)，NK细胞在体内针对病毒感染细胞的作用不需要特殊抗原的刺激。活化后的NK细胞迅速发生免疫反应可在数小时或一天内达到高峰，NK细胞通过细胞毒反应直接杀伤被病毒感染的细胞同时分泌大量细胞因子，如TNF-α、TNF-γ、IL-3、GM-MSF、M-CSF等。对HBV转基因鼠的研究表明NK细胞和NKT细胞的活化可以终止HBV复制。由此可见以rhIL-12和PA-MASH菌苗为佐剂的治疗性乙肝疫苗，即可启动固有免疫(NKT细胞和NK细胞)又可激活获得性免疫(HBV特异性的CD4+和CD8+CTL)，也就是rhIL-12和PA-MSHA菌苗做为桥梁沟通非特异性免疫和HBV特异性细胞免疫，可以活化多个免疫靶点如NKT细胞、NK细胞、DC和T细胞(CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆性T细胞)，提示这个疫苗对打破HBV免疫耐受，重建细胞免疫功能，对抑制和清除HBV将产生良好效果。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例本发明实施方案中HBsAg疫苗由大连汉信生物制品有限公司提供，PA-MSHA菌苗来自海南微克西生物药业有限公司。
rhIL-12由本发明的发明人自行研制，由于IL-12是一个由P40和P35两个亚单位通过多对二硫键组成的异源性二聚蛋白编码P35和P40亚单位的基因位于不同的染色体上。P35亚单位不能单独分泌到细胞外，而P40亚单位可单独分泌到细胞外。因此在同一细胞内平衡表达二个亚单位是表达具有生物活性的IL-12的关键，因此构建的CHO细胞株必须使IL-12的两个亚单位平衡表达。为此我们将P40cDNA和P35cDNA分别插入二个表达效率不同的载体，然后共转染CHO细胞，这样可使IL-12的两个不同亚单位的表达基本平衡。此外通过载体上的扩增系统进一步提高P35亚单位的表达水平。这样就使得P40和P35的平衡表达进一步加强。构建成功表达IL-12的CHO细胞株应用Gibco的CHO-SFM-III进行静止培养，再应用Sartorius BiosSTAT plus细胞培养罐进行批培养和连续培养，细胞株已传至30多代，细胞生长状态良好，且蛋白表达稳定，采用ELISA法检测rhIL-12的含量及活性，静止培养平均浓度为4μg/ml，细胞培养罐连续培养平均浓度为10μg/ml，IL-12活性测定表明具有良好的IFN-γ诱生能力。
rhIL-12的纯化基本方法是将培养液的上清进行离心处理，去除细胞及其碎片，再进行超滤浓缩经阳离子层析、阴离子层析，最后通过分子筛获得纯化的rhIL-12，高效液相层析法检测表明纯度已接近98％。
以下是本治疗性乙肝疫苗组合物的初步药效学实验。
1.应用ELISA方法观察治疗性乙肝疫苗组合物对健康人和慢性乙肝各期病人PBMC产生IFN-γ的影响试剂盒(Human IFN-gamma ELISA set)为BD biosciences公司产品，按说明操作。简要流程如下取健康人和慢性乙肝各期病人外周血5ml，肝素抗凝，使用上海华精公司生产的淋巴细胞分离液按常规分离单个核细胞，洗涤后用含10％胎牛血清(GIBCO公司生产)的RPMI-1640培养基(GIBCO公司生产)配成2×106个/ml的悬液。在业经IFNγ单抗包被和阻断剂封闭的96孔微孔板小孔中，每孔取100ul细胞悬液入96孔培养板，再加100ulRPMI-1640(10％FCS，室温)稀释好的刺激物，并设不加刺激物的阴性对照孔，同一样品均设复孔，置37℃、5％CO2的培养箱(美国SHELLAB牌CO2培养箱)中孵育42～48h后，在无菌条件收集细胞上清液做ELISA INF-γ定量测定。采用HumanIFN-gamma ELISA set测定试剂盒(BD biosciences公司产品)，按常规ELISA检测方法操作。经过包被抗体，4℃过夜，加样，加二抗等步骤，显色后使用MULTISKAN MK3酶标仪(美国Thermo公司)450nm测定各孔O.D值，计算获得结果。
试验采血，健康人10人，慢性乙肝免疫耐受期25人，慢性乙肝免疫清除期18人，非活动或低(非)复制期22人。试验分为空白对照，抗-CD3对照(0.2μg/ml)，HBsAg疫苗(0.1，0.5，1μg/ml)，rhIL-12(0.1，1，2ng/ml)，PA-MSHA菌苗(1∶1000，1∶100，1∶10)，HBsAg疫苗(0.1μg/ml)+PA-MSHA菌苗(1∶1000)+rhIL-12(0.1ng/ml)，HBsAg(0.5ug/ml)+PA-MSHA菌苗(1∶100)+IL-12(1ng/ml)，HBsAg(1ug/ml)+PA-MSHA菌苗(1∶10)+rhIL-12(2ng/ml)。
不同刺激源对正常人及慢性乙肝患者PBMC诱生IFN-γ的结果见表1。结果表明，单独HBsAg疫苗诱生IFN-γ的能力小于PA-MSHA菌苗和rhIL-12(P＜0.01)。单独rhIL-12诱生IFN-γ的能力大于HBsAg疫苗和PA-MSHA菌苗(P＜0.01)。HBsAg疫苗+PA-MSHA菌苗+rhIL-12诱生IFN-γ的能力明显大于任一种药物单独使用或两种药物相加数值(P＜0.01)。正常人和不同发展时期慢性乙肝患者对上述不同刺激源的单独或联合使用诱导PBMC产生IFN-γ之间无明显差异(P＞0.01)。
表1不同刺激原对健康人及慢性乙肝患者PBMCs诱生IFN-γ的结果


2.应用4色FCM检测治疗性乙肝疫苗组合物对5名慢性乙肝患者外周血中IFN-γ+CD4+细胞、IFN-γ+CD8+细胞和IFN-γ+NK细胞频率的影响。
全血培养，对照组加入HBsAg(2μg/ml)刺激，疫苗组加入HBsAg疫苗(2μg/ml)、rhIL-12(1ng/ml)和PA-MSHA菌苗(1∶10)刺激，6小时后用免疫荧光标记的单克隆抗体染色，FCM检测IFN-γ+CD4+的T细胞、IFN-γ+CD8+T细胞和IFN-γ+NK细胞，结果IFN-γ+CD4+对照组占总T的4.42±2.3％，疫苗组占14.7±3.3％；IFN-γ+CD8+对照组占总T的5.62±2.3％，疫苗组占13.8±4.9％；IFN-γ+NK细胞占NK总数对照组为5.96±3.3％，疫苗组占35.7±3.2％。显示乙肝疫苗组合物能促进CD4+的T细胞和CD8+T细胞，特别是NK细胞分泌IFN-γ，明显高于单独使用HBsAg疫苗组。
权利要求
1.一种治疗性乙肝疫苗组合物，其特征是每毫升组合物中含有10～20μg重组HBsAg蛋白疫苗、10～20μg重组人白介素12、9～18亿绿脓杆菌菌苗制剂和余量的水溶液。
2.根据权利要求1所述的治疗性乙肝疫苗组合物，其特征是每毫升组合物中含有10μg重组HBsAg蛋白疫苗、10μg重组人白介素12、18亿绿脓杆菌菌苗制剂和余量的水溶液。
全文摘要
本发明公开了一种治疗性乙肝疫苗组合物，属于生物制剂技术领域，所述的组合物每毫升含有10～20μg重组HBsAg蛋白疫苗、10～20μg重组人白介素12、9～18亿绿脓杆菌菌苗制剂和余量的水溶液。本发明的组合物可以活化多个免疫靶点如NKT细胞、NK细胞、DC和T细胞(CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆性T细胞)，对打破HBV免疫耐受，重建细胞免疫功能，对抑制和清除HBV将产生良好效果。
文档编号A61P1/00GK1966078SQ20061012343
公开日2007年5月23日 申请日期2006年11月10日 优先权日2006年11月10日
发明者张宜俊, 邱向南, 夏书奇, 杨联勇, 曾振飞, 叶倩君, 赵峰, 王添章, 曾水娣, 郭凯璇, 王翠玲 申请人:张宜俊, 邱向南, 潘敬东, 张志翔