专利名称：一种新型治疗性乙肝疫苗组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制剂，尤其是指用于乙肝治疗的一种新型治疗性乙肝疫苗组合物，本发明还涉及该疫苗组合物地制备方法。
背景技术：
慢性乙型肝炎是我国常见病，多发病。我国一般人群的HBV标志和乙肝表面抗原(HBsAg)流行率分别为57.6％和9.7％，估计约7亿人曾感染HBV，其中1.2亿人为HBsAg慢性携带者，每年由于慢性乙肝死亡的约30万例。但慢性乙型肝炎的治疗尚未取得突破性进展。
目前慢性乙型肝炎的治疗主要手段是抗病毒和免疫调节剂的使用。抗病毒药为α-干扰素和核苷类似物拉米呋定和阿德福韦，临床疗效尚未令人满意，对免疫清除期α-干扰素HBeAg及HBV DNA阴转率平均为30～40％。拉米呋定其主要作用位点为HBV DNA多聚酶，在治疗后20周大部分患者HBVDNA明显降低，但血清HBeAg转换率较低，完全应答率约35％～40％，长期治疗后病毒出现YMDD变异，一年内变异率为14～32％。阿德福韦虽然对YMDD变异病毒株有效，但HBeAg阴转率也较低，治疗48周后仅为12％左右。胸腺肽α1治疗慢性乙型肝炎HBV DNA和HBeAg阴转率约47％。应指出上述药物对免疫耐受期患者无效。其根本原因与现有的抗病毒药物其主要作用为阻断DNA多聚酶，对HBV的复制模板肝细胞内的共价闭合环状DNA(cccDNA)基本无效。cccDNA的半衰期为33～100天，只要肝细胞中还存在cccDNA乙肝病毒的复制就不会停止，并与病毒蛋白装配成新的完整HBV，以芽生的方式再感染健康的肝细胞。另外免疫耐受的患者对HBV不产生应答，以致HBV在体内呈高复制状态，这一态势可能与树突状细胞、特异性CTL及Th1细胞功能低下有密切关系。因此彻底清除肝细胞内cccDNA和打破免疫耐受，重建机体正常的对HBV的免疫应答通路是慢性乙肝治疗的关键所在。在这种背景下人们寄希望于乙肝治疗性疫苗的研究。通过治疗性乙肝疫苗弥补或激发机体的免疫反应，特别是细胞免疫从而达到治疗目的。目前国内正在研制的有重组酵母乙肝疫苗(HBsAg)，T细胞表位脂多肽治疗性疫苗和DNA质粒疫苗，三种疫苗都在进行临床观察，尚未进入市场。应该指出治疗性疫苗在临床治疗中的定位尚待确定。但选择最适当的佐剂，以提高疫苗的抗原性和机体的应答反应是个十分重要的问题。全面启动机体的免疫网络系统，作用于多个免疫反应位点的佐剂在清除体内HBV的过程中将起到重要的作用。
发明内容
本发明的其中一个目的在于提供一种具有更好治疗效果的新型治疗性乙肝疫苗组合物。
本发明的的另一目的在于提供一种上述疫苗组合物的制备方法。
本发明的前一目的是这样实现的一种新型治疗性乙肝疫苗组合物，其中疫苗制剂含有重组酵母乙肝疫苗(HbsAg)和人重组的IL-12，重组酵母乙肝疫苗(HbsAg)与IL-12的重量比为60～80∶2～10。
上述的新型治疗性乙肝疫苗组合物中重组酵母乙肝疫苗(HbsAg)与IL-12的重量比以20μg∶5μg最好。
上述的新型治疗性乙肝疫苗组合物中疫苗制剂中还添加有20000～60000单位的IL-2，具有进一步协同作用。
上述的新型治疗性乙肝疫苗组合物中疫苗制剂中重组酵母乙肝疫苗(HbsAg)、IL-12、IL-2的重量比以20μg∶5μg∶5万单位为佳。
本发明的后一目的是这样实现的一种新型治疗性乙肝疫苗组合物的制备方法其中将重组酵母乙肝疫苗(HbsAg)、IL-12或重组酵母乙肝疫苗(HbsAg)、IL-12、IL-2直接混合制成乙肝疫苗组合物，制剂为水剂。
本发明的关键所在是在重组酵母乙肝疫苗(HBsAg)的基础上加入重组人IL-12和IL-2形成一种更好治疗效果的治疗性乙肝疫苗组合物，下面从各组分的具体作用进行详细说明。
重组酵母乙肝疫苗(HBsAg)一定剂量HBsAg长期反复免疫可以诱导机体产生特异性免疫应答(趋向Th1型)，上调非溶细胞性和溶细胞性细胞免疫应答，并能降低HBV感染后HBV复制和表达。
IL-2是人体内最主要、最强的T细胞生长因子，可提高辅助性T细胞数量和活性以增强整体的免疫功能；可诱导和增强NK和CTL的效应；可促进性别的增殖和分化；可促进多种细胞因子及其受体的表达。IL-2和IL12合用可以减少IL-12的用量，二者有协同互补作用，可提高免疫应答反应和各种细胞因子的分泌。
重组人IL-12的主要产生者是对微生物的刺激应答的单核/巨噬细胞、抗原提呈细胞和B细胞，它是一种具有多种生物功能的细胞因子，在细胞免疫应答过程中具有重要的意义，通过调节NK细胞和巨噬细胞介导的非特异性的免疫和Th1、CTL介导的特异性免疫作用，产生一系列的生物效应。
IL-12是由35Kd的轻链(p35IL-12α)和40Kd的重链(P40IL-12β)组成的二条异源性二聚体由二硫键连接，其重链由306个氨基酸组成，轻链由197个氨基酸组成。单独将P35或P40的cDNA转染Cos或CHO细胞后均只能得到对应的单条链，缺乏IL-12的生物活性。只有共转染才能得到具有生物活性的IL-12。IL-12的生物活性由专一性、高亲合力的受体IL-12R介导，由IL-12Rβ1和IL-12Rβ2构成，IL-12R主要由活化T细胞和静息或激活的NK细胞表达，大多数未活化的单核细胞、T细胞检测不到IL-12R。IL-12和IL-12R结合后通过复杂的信号传导系统(JAK2、STAT3、STAT4)才能产生生物效应。IL-12的生物功能是多方面的，主要有
1.诱导Th分化为Th1，在启动Th1应答和Th1细胞定型中起重要作用，并增加INF-γ的合成和分泌。
2.IL-12与IL-2协同诱导CTL分化，促进同种异体的CTL反应，增加穿孔素和颗粒酶的表达，促进溶解靶细胞的能力。
3.促进CD3+T细胞(包括CD4+和CD8+T细胞)的增殖，诱导T细胞产生多种细胞因子(如IFN-γ、TNF和单核巨噬细胞集落刺激因子)。
4.IL-12协同IL-2诱导CD56+NK细胞增殖，LAK细胞的产生，促进ADCC功能及NK细胞刺激因子(NKSF)的释放。
5.促进B细胞Ig类型的产生和Ig类型的转换，由IgM转为IgG，抑制IL-4诱导B细胞IgE的合成。
6.与亚适量IL-2联合应用可降低IL-12的用量。同时可以提高CTL、NK细胞和LAK细胞的杀伤能力
综上所述IL-12能促进Th1和CTL增殖和分化，诱导NK细胞和T细胞产生以IFN-γ为主的细胞因子，从而在抗病毒包括抗HBV的免疫反应中起重要作用。我们经过系统的实验室研究，证明HBsAg联合IL-12的新型治疗性乙肝疫苗具有较单独使用HBsAg疫苗或单独使用IL-12有更明显的调节和提升细胞免疫的作用，进一步提示IL-12具有强烈的佐剂作用，以它作为HBsAg疫苗的佐剂具有十分良好的应用前景。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例
本发明的实施方案中的重组酵母乙肝疫苗(HBsAg)从大连汉信生物制品有限公司惠赠，人重组的IL-12由本申请单位自行研制，IL-2可从深圳科兴生物工程股份有限工程公司购得，其中人重组的IL-12经过多年的实验研究，建立了高表达的稳定的IL-12的CHO细胞株，这个细胞株的特点是通过提高p35亚单位的表达强度使p35和p40两个亚单位的表达量平衡，因为只有p35和p40表达平衡才能提高具有生物活性的IL-12的表达量，经细胞培养、蛋白纯化已获得IL-12的纯品。蛋白纯化是将细胞培养液进行离心处理，去除细胞及碎片，将离心后的上清进行纯化处理。利用IL-12单克隆抗体连接到活化的Sepharose上，制备针对IL-12的亲合层析柱。将离心后的细胞培养液上清直接上样，低浓度的缓冲液(如0.1mol/L PBS)洗脱至基线，高浓度洗脱收集目标蛋白，一步纯化样品浓度可达90～95％，如需达到更高纯度，可以将收集的样品再过一次亲合层析。
(1)IL-12的生物活性的测定(PBMC IFN-γ诱生法)
试验取人新鲜外周血10ml，肝素抗凝，等体积RPMI-1640稀释。将Ficoll加至10ml离心管中，每管4ml，再将4ml稀释后的血液小心加在Ficoll液面上，1000g离心20分钟，收集界面上的单个核细胞(PBMC)，RPMI-1640洗两遍后，悬于含anti-CD3(0.2ug/ml)、anti-CD28(1ug/ml)、10％小牛血清的RPMI-1640培养液中，调整细胞浓度4×106个/ml，予48孔板每孔1ml入板培养3天。3天后回收细胞，RPMI-1640洗涤后重新调整细胞浓度为4×106个/ml。取IL-12(5ug/ml)2.4ul加入RPMI-1640597.6ul中，稀释后IL-12的浓度为20ng/ml；取150ul加入RPMI-1640450ul中，稀释后IL-12的浓度为5ng/ml；再取稀释后液体150ul，同上稀释，稀释后浓度为1.25ng/ml；在稀释一次，最终浓度为0.32ng/ml。在每个培养孔中加入100ul的培养液或不同浓度的IL-12，再加入100ulPBMC。每一组做3孔。在37℃，5％CO2培养箱中培养48小时，上清液采用ELISA法检测IFN-γ。试验分为空白组和IL-120.16ng/ml组，IL-120.625ng/ml组、IL-122ng/ml组、IL-1210ng/ml组。各组上清液中IFN-γ的浓度分别为739.41±80.48ng/ml、20280.79±658.67ng/ml、31286.69±1052.12ng/ml、30719.89±3294.30ng/ml、63188.40±995.61ng/ml，结果说明我们制备的IL-12有较高的生物活性。
(2)用Elispot方法观察了IL-12对人外周血单个核细胞中HBsAg特异性分泌IFN-γ细胞频率的作用
试验取4名健康人，8名慢性乙肝病人外周血各5ml，肝素抗凝，试验分8组。空白组、HBsAg10μg/ml组，HBsAg10μg/ml+IL-122ng/ml组，HBsAg10μg/ml+IL-1210ng/ml组，HBsAg10μg/ml+IL-1250ng/m组，HBsAg10μg/ml+IL-122ng/ml+IL-210U/ml组，HBsAg10μg/ml+IL-1210ng/ml+IL-210U/ml组，HBsAg10μg/ml+IL-1250ng/m+IL-210U/ml组。预培养48小时后入已包被好IFN-γ抗体的96孔板，继续培养18小时，中断后按Elispot常规操作，显色后用斑点阅读机计数斑点数目。结果如下4名健康人均值为2.75±2.5，6.75±2.99，15.25±4.86，21±6.38，35.50±10.41，20.5±3.87，31.50±5.80，40±14.17；8名病人均值为2.00±2.71，5.5±2.65，8.0±2.83，18.5±7.85，22.50±8.06，12.5±3.4，23.5±7.0，31±7.48。结果显示IL-12和乙肝疫苗组合物对外周血单个核细胞中HBsAg特异性分泌IFN-γ细胞频率有明显的提高作用，IL-2有进一步的协同促进作用。
(3)应用FCM检测IL-12对人外周血单个核细胞中HBsAg特异性IFN-γ+CD4+细胞数的影响。
全血培养，对照组加入HBsAg(10μg/ml)，试验组加入HBsAg(10μg/ml)和IL-12(10ng/ml)，6小时后用免疫荧光标记的单克隆抗体染色，FCM检测IFN-γ+CD4+的细胞数，结果对照组占总T的8.92±1.9％，试验组占17.3±2.6％。显示IL-12能促进HBsAg刺激下的Th细胞分泌IFN-γ，能起到促进Th向Th1分化和活化，进而增强细胞免疫的作用。
(4)应用免疫荧光标记流式细胞仪观察外周血在IL-12的作用下活化淋巴细胞表型的变化
细胞培养浓度为1.0×106，IL-12浓度10ng/ml，培养96小时，结果显示加入IL-12培养的淋巴细胞比空白组CTL和NK细胞增加15％以上，提示IL-12促进CTL细胞和NK细胞增殖和分化。
(5)IL-12对慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞产生IFN-γ(pg/ml)的影响。
从9例慢性乙型肝炎患者抽取外周血5毫升，肝素抗凝。制备单核细胞悬液，用RPMI1640培养液漂洗细胞二次。计数细胞，将细胞浓度调至2×106/ml。试验分四组第1组为空白组；第2组为HBcAg 0.2μg/ml；第3组为IL-120.1ng/ml；第4组为HBcAg 0.2μg/ml+IL-120.1ng/ml。将细胞放置在37℃，5％CO2培养箱进行培养72小时。取上清液用ELISA检测IFN-γ。结果表明HBcAg刺激IFN-γ产生的量为3.2±9.6pg/ml，IL-12刺激IFN-γ产生的量为16.7±17.8pg/ml，HBcAg联合IL-12刺激IFN-γ产生的量为274.2±236.1pg/ml(见表一)，提示HBcAg联合IL-12刺激可显著提高IFN-γ的分泌。
表一IL-12对慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞产生IFN-γ(pg/ml)的影响
注1)与HBcAg+Ik-12组相比P＜0.05
2)与HBcAg+IL-12组相比P＜0.0权利要求
1.一种新型治疗性乙肝疫苗组合物，其特征是疫苗制剂含有重组酵母乙肝疫苗(HBsAg)和人重组的IL-12，重组酵母乙肝疫苗HBsAg与IL-12的重量比为60～80∶2～10。
2.根据权利要求1所述的新型治疗性乙肝疫苗组合物，其特征是重组酵母乙肝疫苗(HBsAg)与IL-12的重量比20μg∶5μg。
3.根据权利要求1或2所述的新型治疗性乙肝疫苗组合物，其特征是疫苗制剂中还添加有20000～60000单位的IL-2。
4.根据权利要求3所述的新型治疗性乙肝疫苗组合物，其特征是疫苗制剂中重组酵母乙肝疫苗(HBsAg)、IL-12、IL-2的重量比为20μg∶5μg∶5万单位。
5.权利要求1至4中所述新型治疗性乙肝疫苗组合物的制备方法其特征是将重组酵母乙肝疫苗(HBsAg)、IL-12或重组酵母乙肝疫苗(HBsAg)、IL-12、IL-2直接混合制成乙肝疫苗组合物，制剂为水剂。
全文摘要
本发明公开了一种新型治疗性乙肝疫苗组合物及其制备方法，属生物制剂技术领域，其中疫苗制剂含有重组酵母乙肝疫苗(HbsAg)和人重组的IL－12，重组酵母乙肝疫苗(HbsAg)与IL－12的重量比为60～80∶2～10。制备方法是将重组酵母乙肝疫苗(HbsAg)、IL－12或重组酵母乙肝疫苗(HbsAg)、IL－12、IL－2直接混合制成乙肝疫苗组合物，制剂为水剂。本发明具有更好的治疗效果，用于乙型肝炎的治疗。
文档编号A61P1/00GK1814285SQ200510101400
公开日2006年8月9日 申请日期2005年11月22日 优先权日2005年11月22日
发明者王添章, 夏书奇, 杨联勇, 张宜俊, 邱向南 申请人:广州市恺泰生物科技有限公司