专利名称：治疗性多肽乙肝疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及治疗性多肽乙肝疫苗及其制备方法，具体而言，是一种可用于治疗仪型肝炎病毒感染的人工合成的多肽，多肽序列是从乙肝型病毒基因序列中筛选出来的，具有显著的激活体液免疫和细胞免疫的活性。
背景技术：
乙型肝炎是危害我国人民健康最严重的传染病之一。我国现有约1.2亿名乙肝表面抗原(HBsAg)携带者，不仅成为传染源，部分人还可发展成慢性肝炎，肝硬化，甚至肝癌。预防性乙肝疫苗在世界及我国均已证明可有效地预防乙肝，但是对乙肝患者无治疗作用。今年来在国内外相继有研究小组发现了可以用于治疗乙肝的治疗型疫苗，例如，我国科研人员闻玉梅发现抗原-抗体免疫原性复合物(Immunogenic Complex简称IC)可以有效地在部分鸭中清除病毒及病毒抗原，由此认为发展成为供人体应用的治疗性疫苗是有可能的。另外，有学者研究核酸疫苗(DNA Vaccine)在转基因鼠中的疗效。20世纪90年代中期以来，美国学者研究了病毒核心抗原合成肽交联佐剂构建成治疗性疫苗，在转基因鼠中有较好的治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗性多肽乙肝疫苗，其为具有高效免疫原性的并可以激发高效细胞免疫的多肽。
本发明的另一目的在于提供一种治疗性多肽乙肝疫苗的制备方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案为一种治疗性多肽乙肝疫苗，其特殊之处在于所述的治疗性多肽乙肝疫苗为多肽链，其两个多肽链的氨基酸序列分别为
HBVSPLFILLLCLIFLLVLL(15个氨基酸残基)HBVCPQLFHLCLIISCSCP(14个氨基酸残基)上述的治疗性多肽乙肝疫苗的多肽纯度为95％-99.99％。
一种治疗性多肽乙肝疫苗的制备方法，其多肽乙肝疫苗采用Fmoc固相法合成线性多肽疫苗。
上述的每条抗原肽的Fmoc法固相合成与标记的具体步骤如(1)-(9)(1)、第一个氨基酸与树脂的连接；(2)、第一个氨基酸与树脂的偶联率测定；(3)、Fmoc基团的脱保护；(4)、第二个氨基酸的偶联反应第二个氨基酸的连接采用原位活化法；(5)、肽链的延伸反应重复步骤(3)、(4)，直至偶联得到所需多肽链；(6)、肽链N端标记异硫氰酸荧光素(FITC)；(7)、肽链的侧链去保护及从树脂上的切割，得到合成抗原肽粗品；(8)、合成抗原肽的脱盐；(9)、HPLC纯化抗原肽；(10)、将两条多肽溶于医学蒸馏水中，制成疫苗溶液。
本发明相对于现有技术，其优点如下对HBV S区和C区抗原蛋白的氨基酸序列进行了分析，进行抗原表位预测分析，找到多处具有免疫原活性的单表位多肽序列，并合成了相应的多肽，通过免疫原性试验，从中筛选到两条可以使转基因鼠产生较强的细胞免疫和体液免疫的多肽链，这两个多肽链的氨基酸序列分别为HBVSPLFILLLCLIFLLVLL(15个氨基酸残基)，HBVCPQLFHLCLIISCSCP(14个氨基酸残基)，其多肽纯度应大于95％以上。
具体实施例方式本发明对HBV S区和C区抗原蛋白的氨基酸序列进行了分析，进行抗原表位预测分析，找到多处具有免疫原活性的单表位多肽序列，并合成了相应的多肽，通过免疫原性试验，从中筛选到两条可以使转基因鼠产生较强的细胞免疫和体液免疫的多肽链，这两个多肽链的氨基酸序列分别为HBVSPLFILLLCLIFLLVLL(15个氨基酸残基)HBVCPQLFHLCLIISCSCP(14个氨基酸残基)多肽纯度为95％-99.99％。
上述的治疗性多肽乙肝疫苗的制备方法具体步骤如下一、多肽的固相合成本研究采用Fmoc固相法合成线性多肽疫苗。
1.材料和设备1.1主要试剂和材料Fmoc-氨基酸、2-氯三苯甲基树脂(2-Chlorotrityl chloride resin树脂)、1-羟基-苯并-三氮唑(HOBt)、N，N二异丙基乙胺(DIEA)、1-氧-3-双二甲胺羰基苯并三氮唑四氟化硼盐(TBTU)、二环己基碳二亚胺(DCC)、三氟乙酸(TFA)购自上海吉尔生化公司，乙二硫醇(EDT)、二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、茚三酮、哌啶、甲醇、无水乙醇、异丙醇等为国产分析纯试剂。
1.2实验仪器设备
1.3主要试剂配制(1)DMF分析纯DMF，加千分之一茚三酮负压重蒸，去溜头溜尾。
(2)脱保护(DEBLOCK)试剂分析纯哌啶，常压重蒸，去溜头溜尾，配置成25％的DMF溶液。
(3)茚三酮显色剂5％茚三酮无水乙醇溶液、80％苯酚和KCN(2ml 0.001M KCN，98ml哌啶)。
(4)切割试剂将TFA、硫代苯甲醚、水、苯酚和EDT按照82.5∶5∶5∶5∶2.5的体积比混匀。
(5)PBS(pH 7.4)0.2g KH2PO4，2.9g NaHPO4·12H2O，8.0g NaCl，0.2g KCl，去离子水补充至1000ml，调节pH为7.4。
(6)ELISA包被缓冲液(pH 9.60.05mol/L Na2CO3-NaHCO3)1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3，去离子水补充至1000ml。
(7)ELISA洗涤液含0.05％Tween20的PBS。
(8)ELISA抗体稀释液含0.2％BSA的PBS。
(9)ELISA底物缓冲液1.84g Na2HPO4，0.47g柠檬酸，去离子水补充至100ml。
(10)TMB显色液0.5ml TMB(10mg/5ml无水乙醇)，10ml底物缓冲液，32μl 0.75％H2O2。
(11)ELISA终止液2mol/L的H2SO4。
2.方法2.1抗原肽的Fmoc法固相合成与标记按照多肽疫苗的序列从羧端向氨端依次合成。
(1)第一个氨基酸与树脂的连接将2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂1g置于干燥洁净的肽合成柱中，加入8ml DCM，溶胀5min，真空吸弃溶剂。分别取2mmol Fmoc氨基酸和5mmolDIEA，溶于8ml DCM，并加入于树脂中，室温轻轻摇动反应60min。真空吸弃溶剂。用10ml DMF洗涤树脂2次，每次2min。加入10ml DCM/甲醇/DIEA(80∶15∶5)，轻轻摇动反应10min，真空吸弃溶剂。重复一次。用10ml DMF洗涤树脂3次，每次2min。真空吸弃溶剂，N2吹干。
(2)第一个氨基酸与树脂的偶联率测定精确称取2mg干燥的Fmoc氨基酸-树脂置于比色杯中，加入3ml 20％哌啶/DMF，轻轻摇动反应10min，用20％哌啶/DMF作为空白对照调零，紫外分光光度计测定样品的290nm光吸收值。重复测定2次，取平均值。偶联率通过以下公式计算偶联率(mmol/g)＝(Abs样品)/(样品重量mg×1.75)(3)Fmoc基团的脱保护向树脂中加入10ml脱保护(DEBLOCK)试剂，混匀，室温轻轻摇动反应5min。弃溶剂，用10ml DMF洗涤树脂3次，每次2min。用6ml异丙醇洗涤树脂3次，每次5min。用6ml己烷洗涤树脂3次，每次5min。真空吸弃溶剂。取少量树脂样品，用茚三酮显色法(Kaiser法)快速测定树脂上的游离氨基含量将树脂2ml用乙醇洗涤3次，分别加入2滴5％茚三酮、80％苯酚和KCN(2ml0.001M KCN98ml哌啶)，充分混匀，120℃加热4～6min。判断Fmoc基团的去保护反应程度。
(4)第二个氨基酸的偶联反应第二个氨基酸的连接采用原位活化法，取2mmol的Fmoc氨基酸、4.0mmol的TBTU和4.0mmol的HOBT，加入最少量的DMF溶解后加入5mmol的DIEA，充分混匀后，加于脱Fmoc基团的树脂中。室温轻轻摇动反应60min。真空吸弃溶剂。用5ml甲醇洗涤树脂3次，每次5min。用10ml DMF洗涤树脂3次，每次2min。真空吸弃溶剂。取少量树脂样品进行茚三酮显色分析。测定偶联率。
(5)肽链的延伸反应用10ml DEBLOCK试剂脱去上一个氨基酸N端的Fmoc保护基团，10ml DMF洗涤树脂3次，真空吸弃溶剂。取少量树脂样品进行茚三酮显色分析。按照(3)方法偶联下一个氨基酸。重复进行Fmoc保护基团脱保护和氨基酸偶联反应，直至偶联得到所需多肽链。
(6)肽链N端标记异硫氰酸荧光素(FITC)合成好全部氨基酸序列的树脂，脱去氨基酸N端的Fmoc保护基团，用10ml异丙醇洗涤树脂3次，每次5min。取1.38g FITC，1.6g TBTU和0.76ml DIEA，混合后加于肽—树脂中，室温轻轻摇动反应60min。真空吸弃溶剂。用5ml甲醇洗涤树脂3次，每次5min。用10ml DMF洗涤树脂3次，每次2min。真空吸弃溶剂。
(7)肽链的侧链去保护及从树脂上的切割将已合成好全部氨基酸序列的树脂，用10ml DMF洗涤后再用6ml异丙醇洗涤树脂3次，每次5min。用6ml己烷洗涤树脂3次，每次5min。真空吸弃溶剂后N2吹干，放入裂解容器中。1g树脂加入25ml切割试剂，室温切割反应2h，不时摇动混匀，反应后的混合液经玻璃滤器过滤树脂，收集切割反应混合液，用TFA洗涤树脂3次。将反应混合液转移于一圆底烧瓶中，用等体积预冷的乙醚洗涤4次，收集沉淀。干燥后即得到合成抗原肽粗品。
(8)合成抗原肽的脱盐将抗原肽粗品加蒸馏水溶解。称取Amersham G-25凝胶15g，溶胀后装柱，装好后的柱子先用50ml蒸馏水平衡，平衡好后，每次上样3-5ml，用蒸馏水进行洗脱，紫外分光光度仪检测220nm处紫外吸收，按峰收集抗原肽。
(9)HPLC纯化抗原肽使用waters公司的waters4000制备型HPLC高效色谱仪分离纯化抗原肽。色谱柱为径向加压色谱柱(25×100，15μm，DELTA PAK C18填料)，洗脱系统为A液5％乙腈溶液(含0.1％TFA)；B液95％乙腈溶液(含0.08％TFA)。手动进样，每次进样1ml，流速4ml/min，线性梯度，45min内，B液从5％升到50％，然后5min内升到95％B液做最后洗脱。215nm处检测紫外吸收，按峰收集组分，用于质谱检测。将分子量检测正确的组分收集，真空冻干，成为需要的纯品。
(10)、将两条多肽溶于医学蒸馏水中，制成疫苗溶液。
使用常规方法，将两条多肽溶于医学蒸馏水中，制成50ug-5ug/ml的疫苗溶液，分装于安瓿中，每支1ml。
3.结果采用标准的Fmoc保护策略固相化学合成方法，比色法测定第一个氨基酸的偶联率均大于90％，Fmoc脱保护的效率均可达到98％以上。合成得到线性肽，经三氟乙酸切割，凝胶过滤除盐及制备HPLC纯化得到纯度为95％-99.99％的抗原肽。纯化后肽的总收率在15～30％之间。质谱测定的分子量与预期相符。
二、多肽疫苗治疗作用为了验证多肽疫苗治疗作用，下面列举实验说明1、实验目的观察所选的多肽疫苗可否刺激模型动物机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答。
2.实验方法2.1基因疫苗的免疫接种选用4～6周龄Balb/C小白鼠分为实验组与对照组。HBVSP实验组(n＝10)和HBVCP誓言组(n＝10)分别注射多肽疫苗，每只每次100μg多肽疫苗，用1ml的OT注射器(25号针头)行双后肢多点肌肉注射，第2周及第4周各追加免疫一次。对照组(n＝10)按实验组的方法注射生理盐水，第6周后处死小鼠，去眼球采血，分离血清-20℃保存，无菌取脾脏。
2.2体液免疫功能测定将HBVSP多肽和HBVCP多肽按1μg·ml-1分别包被于酶标板，1％BSA封闭后4℃备用。将小鼠血清用样本稀释液按1∶20比例稀释，每孔100μl；加于上述酶标板中，37℃30min；加羊抗小鼠IgG(购于武汉博士德公司)100μl(1∶15000)，37℃，30min；PBS洗涤，加入底物，37℃，10min，终止反应后，用酶标仪测定A值。
2.3细胞免疫功能的测定无菌取脾后，用100目钢网研磨，低渗破坏红细胞，调细胞浓度到5×106·ml-1，放于24孔培养板内(每孔1ml)，再加入ConA(终浓度为20μg·ml-1)，37℃，5％CO2培养48h，经2000r·min-1离心20min收集上清液，即为白细胞介素2(IL-2)及γ干扰素(IFNγ)的粗品，-20℃保存待测。
2.3.1IL-2的测定IL-2活性以刺激指数表示 2.3.2IFNγ的测定采用病变抑制法测定IFNγ，IFNγ活性以U·ml-1表示。
3结果体液免疫功能的检测结果用HBVSP和HBVCP多肽分别包被ELISA板，分别检测相应免疫小鼠血清抗-HBs IgG，抗-HBc IgG。结果HBVSP和HBVCP组的抗HBsIgG(A＝1.23±0.22)的，抗-HBc IgG(A＝1.31±0.19)的水平明显高于对照组(A＝0.13±0.02)(P＜0.01)。
细胞免疫功能的测定(1)IL-2测定计算IL-2刺激指数，发现HBVSP和HBVCP组明显高于对照组(P＜0.01)(附表)。(2)IFNγ的测定采用病变抑制法测定IFNγ水平，发现HBVSP和HBVCP组明显高于对照组(P＜0.05)(附表)
附表 小鼠IL-2刺激指数和IFNγ水平的比较
结论HBVSP多肽疫苗和HBVCP多肽疫苗能诱导机体产生强烈的细胞及体液免疫应答。用HBVSP多肽疫苗和HBVCP多肽疫苗疫苗小鼠后，均可在小鼠血清中检测到抗-HBsIgG和抗-HBcIgG，并发现有明显的脾细胞增殖现象，小鼠的CTL活性明显增强，多肽疫苗诱导特异性细胞的能力明显优于传统的疫苗，这为HBV的防治开辟了一种新的途径。
权利要求
1.一种治疗性多肽乙肝疫苗，其特征在于所述的治疗性多肽乙肝疫苗为多肽链，其两个多肽链的氨基酸序列分别为HBVSPLFILLLCLIFLLVLL(15个氨基酸残基)HBVCPQLFHLCLIISCSCP(14个氨基酸残基)
2.根据权利要求1所述的治疗性多肽乙肝疫苗，其特征在于所述的治疗性多肽乙肝疫苗的多肽纯度为95％-99.99％。
3.一种治疗性多肽乙肝疫苗的制备方法，其特征在于所述的多肽乙肝疫苗采用Fmoc固相法合成线性多肽疫苗。
4.根据权利要求3所述的治疗性多肽乙肝疫苗的制备方法，其特征在于所述的每条抗原肽的Fmoc法固相合成与标记的具体步骤如(1)-(9)(1)、第一个氨基酸与树脂的连接；(2)、第一个氨基酸与树脂的偶联率测定；(3)、Fmoc基团的脱保护；(4)、第二个氨基酸的偶联反应第二个氨基酸的连接采用原位活化法；(5)、肽链的延伸反应重复步骤(3)、(4)，直至偶联得到所需多肽链；(6)、肽链N端标记异硫氰酸荧光素(FITC)；(7)、肽链的侧链去保护及从树脂上的切割，得到合成抗原肽粗品；(8)、合成抗原肽的脱盐；(9)、HPLC纯化抗原肽；(10)、将两条多肽溶于医学蒸馏水中，制成疫苗溶液。
全文摘要
本发明涉及治疗性多肽乙肝疫苗及其制备方法。乙型肝炎是危害我国人民健康最严重的传染病之一；科研人员发现抗原－抗体免疫原性复合物可以有效地在部分鸭中清除病毒及病毒抗原，由此认为发展成为供人体应用的治疗性疫苗是有可能的；另外，有学者研究核酸疫苗在转基因鼠中的疗效；20世纪90年代中期以来，美国学者研究了病毒核心抗原合成肽交联佐剂构建成治疗性疫苗，在转基因鼠中有较好的治疗效果。本发明对HBV S区和C区抗原蛋白的氨基酸序列进行了分析，进行抗原表位预测分析，找到多处具有免疫原活性的单表位多肽序列，并合成了相应的多肽。通过免疫原性试验，从中筛选到两条可以使转基因鼠产生较强的细胞免疫和体液免疫的多肽链，其多肽纯度为95％－99.99％。
文档编号A61P1/16GK1899611SQ20051004297
公开日2007年1月24日 申请日期2005年7月20日 优先权日2005年7月20日
发明者闫小君, 郭晏海 申请人:中国人民解放军第四军医大学