专利名称：：Peg10基因的双链小干扰rna在制备治疗或预防肝癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医用医药，更具体涉及一种基因干扰序列在制备治疗和预防肝癌药物中的应用。遗传印记基因10(PEG10基因)的小干扰RNA(siRNA)可以抑制肝癌细胞的生长，促进肝癌细胞凋亡，从而达到治疗肝癌的目的，适用于原发性肝细胞癌，原发性混合细胞癌等的预防和治疗。
背景技术：
：肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，因其恶性度高、病情进展快，病人早期一般没有什么不适，一旦出现症状就诊，往往已属中晚期。故治疗难度大、疗效差，一般发病后生存时间仅为6个月，人称"癌中之王"。肝癌的发病率和死亡率均较高，发病率在我国居第五位，死亡率在恶性肿瘤中居第三位。原发性肝癌的发病率又是肝脏恶性肿瘤之首。本病多发于男性，男女之比约为4:l，且男性患病后，病情发展及死亡率也较女性凶险。研究发现，肝癌组织中雄激素受体(AR)的含量远高于癌旁肝组织，癌组织AR含量与肿瘤大小及分化程度有关，肝癌发展及预后与AR的含量存在一定的相关性。多数学者认为性激素在肝脏中可能通过非特异性药理作用或受体介导作用影响肝脏功能。有研究认为肝癌细胞能主动摄取雄激素，如睾酮等，且摄取量与AR的浓度成正相关。因此，肝癌被认为是一种雄激素依赖性肿瘤，但目前对于雄激素及其受体的表达与肝癌发生发展之间关系的分子机制仍不十分明了。尽管手术切除和肝移植是有望使肝癌获得根治的治疗手段，但实际上，大部分肝癌病例在临床确诊时已不适合手术切除或行肝脏移植治疗；且切除或肝移植术后肝癌的复发率高，大部分患者带瘤生存，生活质量较差。而且各种治疗方式对于肝癌患者生存率的提高并无太大帮助。并且在临床上，肝癌临床病理和生物学表型不同，且不同种类肝癌的发病机理亦有差异。现在人们已经发现了一些导致肝癌形成的基因，但绝大多数基因在肝癌形成中的作用有限。因此，寻找一种能够在大多数肝癌细胞中高度特异性表达的新的靶分子从而达到治疗肝癌的目的，这是一个具有十分重要的理论和实际意义的问题。基因治疗是目前肿瘤治疗研究的重要组成部分，也是多年来肝癌基因治疗研究的重点之一。基因治疗是导入外源遗传物质，达到治疗疾病的一种方法。对于遗传病，基因治疗将成为极为有效的治疗手段。但对于其它疾病，如恶性肿瘤，基因治疗将可能成为外科手术、放疗、化疗外的新武器。但肝癌的情况非常特殊，它在瘤体不太大的时候就发生血管内侵犯，门静脉瘤栓形成，同时肝内的播散以及原有肝硬化的基础上新的癌病灶的出现等等。这些因素严重影响了现有治疗手段对肝癌的疗效及预后。因此，针对肝癌来说，基因治疗有可能成为治疗肝癌的一个重要手段。尽管肝癌的基因治疗在某些方面已取得一定的进展，许多i期至m期临床试验在全世界范围内已经或正在进行中，但许多关键性的理论和技术问题仍有待进一步深入研究和突破。比如如何鉴定理想的肝癌治疗基因或基因组合等，都是肝癌基因治疗中尚待解决的问题。2001年，日本学者研究发现了一种新基因——遗传印记基因IO(paternallyexpressedgene10，PEGIO)，它定位于染色体7q21(OnoR,KobayashiS,\VagatsumaH,etal.Aretrotransposon-derivedgene,PEG10,isanovelimprintedgenelocatedonhumanchromosome7q21.[J].Genomics,2001，73:232-237)。Northernblot检测表明PEG10基因在正常组织中仅表达于胎盘、睾丸和卵巢等性腺组织中(OkabeH,SatohS,FurukawaY,etal.InvolvementofPEG10inhumanhepatocellularcarcinogenesisthroughinteractionwithSIAH1.[J].CancerRes,2003,63:3043-3048)。通过cDNA微阵列的方法，Okabe发现绝大部分肝癌细胞高表达PEG10基因，而正常肝细胞则很少表达(OkabeH,SatohS，KatoT,etal.Genome-wideanalysisofgeneexpressioninhumanhepatocellularcarcinomasusingcDNAmicroarray:identificationofgenesinvolvedinviralcarcinogenesisandtumorprogression.[J].CancerRes,2001,61:2129—2137)。另夕卜，再生的正常肝细胞也高表达PEG10基因，且PEG10基因对于细胞的生长有明显的促进作用。因此，对于PEG10基因在肝癌中的异常高表达机制的深入研究有助于避免目前内分泌治疗的盲目性，并为肝癌的临床诊断及治疗提供新的思路。端粒是真核细胞线性染色体末端的结构，对染色体末端起保护作用。在人类同源染色体中，端粒由数千个6碱基重复序列(TTAGGG)组成。端粒末端转移酶是一种延长端粒、保持基因组完整性的核糖核蛋白复合物。人类端粒酶由具有催化活性的亚单位(hTERT)、端粒酶模板RNA和端粒结合蛋白组成。其中hTERT作为逆转录酶(RT)的亚型，是调节端粒末端转移酶活性的关键因子。测定端粒末端转移酶的活性具有重要的临床意义，它可以作为肝细胞癌诊断和治疗的一个指标。研究发现，肝癌细胞中端粒末端转移酶的活性较高，而在正常肝细胞中则检测不到端粒末端转移酶活性。端粒酶与肝癌关系密切，端粒酶的活性与凋亡抑制之间的关系也开始被人们所关注，开发针对端粒酶的抗肿瘤药物成为近年来肿瘤治疗的又一热点。(YoussefN,ParadisV,FerlicotS,etal.Insitudetectionoftelomeraseenzymaticactivityinhumanhepatocellularcarcinogenesis.[J].JPathol，2001，194:459-465.;KomineF，ShimojimaM，MoriyamaM，etal.Telomeraseactivityofneedle-biopsiedliversamples:itsusefulnessfotdiagnosisandjudgementofefficacyoftreatmentofsmallh印atocellularcarcinoma.[J].JHepato,2000,132:235-241.;ZhangRG，WangXW，YuanJH，etal.Usinganon-radioisotopic,quantitativeTRAP-basedmethoddetectingtelomeraseactivitiesinhumanhepatomacells.[J].CellRes,2000，10:71-77.;WegeH,ChuiMS,LeHT，etal.SYBRGreenreal-timetelomericrepeatamplificationprotocolfortherapidquantificationoftelomeraseactivity.[J].NucleicAcidsRes,2003,31:E3-3.)。RNA干预(RNA-mediatedinterference,RNAi)作为目前研究较多的一门新兴技术，现逐渐成为基因功能研究的重要工具。RNAi主要通过双链RNA的介导，特异性地降解相应序列的靶mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后水平的基因沉默。RNAi在特异并高效抑制基因活性方面展示出了广阔的前且尔。现介绍一下目前国内外治疗或预防肝癌基因药物的现状及研发情况1免疫基因治疗主要集中在细胞因子治疗和基因修饰树突状细胞肿瘤疫苗两方面。细胞因子治疗既将IL-2,IL-12,IFN等细胞因子和/或共刺激因子B7等到导入免疫活性或肿瘤细胞，增强免疫活性细胞的抗肿瘤活性，使肿瘤局部细胞因子浓度增高，MHC类抗原分子表达增加、肿瘤细胞的免疫原性增强，有效激活肿瘤特异性免疫反应。其缺点是特异性较差，副作用大。2抑癌基因治疗抑癌基因是一类存在于正常细胞，与原癌基因共同调节细胞生长和分化的基因，已发现的抑癌基因有Rb，NF，DDC，nm23，p53气p46等。目前在大多数肿瘤中发现p53突变。现认为野生型p53突变或丧失功能，可能导致肿瘤的发生和肿瘤细胞对化疗药物的抵抗。其缺点是单纯针对某一抑制基因的治疗往往效果不理想，并且设计针对肝癌的特异性抑制基因也比较困难。3反义基因治疗主要包括反义DNA、反义RNA和核酶三类，Xing等利用AFP的反义寡核苷酸治疗体外和裸鼠的SMMC-7721肝癌模型取得了明显的抗癌作用，Su等用人端粒酶反转录酶的反义寡核普酸(As-hTERT)处理Hep2215细胞后发现肿瘤细胞的端粒酶活性被抑制、致癌作用降低，提示As-hTERT具有抗肿瘤作用。但反义基因治疗的缺点是反义核酸并不能与所有的靶基因mRNA结合，即其抑制作用并不完全。
发明内容本发明的目的在于提供一种PEG10基因的双链小干扰RNA(siRNA)作为制备治疗或预防肝癌的药物中的应用。PEG10基因在胎盘、睾丸和卵巢中显著高表达，而在肝脏和其它一些组织中则无表达，同时，PEG10基因可高表达在大多数人肝细胞癌(HCC)细胞和小鼠再生的肝G2/M期细胞中。肝癌是一种雄激素依赖性肿瘤，PEG10基因与雄激素及其受体在肝癌的发生发展中到底如何作用，对端粒酶活性又有何影响，目前国内外尚无相关报道。PEG10基因在性腺组织的特殊分布及已观察到的PEG10基因具有促进肝癌细胞生长的特性引起申请者的研究兴趣。研究表明PEG10基因很大程度上参与肝癌的形成，而遗传印记基因PEG10基因的双链小干扰RNA(siRNA)则抑制了肝癌细胞的生长，可以作为在制备治疗和预防肝癌的药物中的应用。在本实验研究中主要采用RNA干预作为基因功能研究的重要工具，通过有效的下调AR基因和PEG10基因的表达，首次将PEG10基因与雄激素及其受体联系起来，研究两者的相互作用及与肝癌生长和凋亡之间的联系。首次具体研究了两者的相互作用及与端粒酶之间的关系，并探讨了其在肝癌的发生发展中的作用及可能机制。首先比较了正常肝细胞及三种不同的肝癌细胞中AR表达的差异，并证实AR高表达的肝癌细胞在雄激素DHT的存在下，能明显促进肿瘤细胞的生长、抑制细胞凋亡，有效的促进肝癌的形成。目前有研究认为AR作为一种转录活化因子，可能影响肝细胞或肝癌细胞中的某些癌基因，通过调节与细胞分裂有关的信号传递系统而影响肝癌的发生发展，促进肝癌细胞的增殖。据此申请人认为，PEG10基因在性腺组织的特殊分布可能受到激素的影响从而被激活，最终影响肝癌的发生发展。结果发现在高表达AR的肝癌细胞中，DHT能显著增加癌细胞中PEG10基因的表达，且肿瘤细胞出现明显的生长加速和凋亡细胞数目的减少。同时在AR表达量较低的肝癌细胞中，加入DHT对PEG10基因的表达及肝癌细胞的生长无明显影响。实验结果显示在雄激素DHT存在的条件下，BEL细胞中人类端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达水平明显升高。但是当PEGIO基因表达下调后，DHT的存在对于hTERT的表达水平无明显影响。在共转染了AR和PEGIO基因的人胚肾HEK293T细胞(ATCC，Rockville,MD)中，同样观察到在DHT存在的条件下，细胞中hTERT的表达水平明显升高。然后，申请人采用RNAi技术，通过有效的下调AR基因和PEGIO基因的表达，进一步证明两者之间的相互关系及其与肝癌发生发展之间的联系。研究发现，DHT能使AR表达量较高的肝癌细胞生长加速以及产生抗凋亡作用，且siRNAAR对AR表达的下调作用不仅是剂量依赖性，而且是序列特异性的。高剂量的siRNAPEGIO基因能选择性的阻断雄激素的促生长作用。高剂量的siRNAAR在下调AR表达的同时也有效降低了PEGIO基因的表达，提示AR的表达与PEG10基因有着密切的关系。而将AR基因转染低表达AR的HepG2细胞(ATCC，Rockville,MD)后，在DHT作用下，PEGIO基因的表达虽无变化，但细胞也能出现明显的生长加速和凋亡细胞数目的减少。其技术方案如下A.细胞培养、试剂和质粒-人肝癌细胞株BEL-7404(来自生物化学和细胞生物学协会的细胞库，SIBS，CAS，上海，中国)、HuH7、HepG2和人胚肾细胞株HEK293T来自美国细胞典藏中心ATCC(TheAmericanTypeCultureCollection,Rockville,MD)在含10X的胎牛血清DMEM的培养基中，37°C,5。/。C02培养。DMEM高糖细胞培养基为杭州吉诺生物公司的无菌DMEM高糖无血清培养基,加入新生牛血清(56'C灭活30min)使终浓度达到10%，4"保存备用。正常人肝细胞(NML)取自无肝疾病、意外腹部外伤部分肝切除的病人。双氢睾酮(DHT)、氟他胺(FLU)和丙戊酸盐(VPA，ref.M3)购自Sigma-Aldrich。RA的兔的单抗购于AbeamInc.(Cambridge,UK)。雄激素受体的抗体购于RocklandImmunochemicalsInc.(Gilbertsville，PA)。人PEG10基因的开放阅读框架(ORF)序列来自GenebankNM015068(来Ml，包含235个氨基酸，从BEL-7404细胞中分离相应的PEG10基因ORF全长cDNA,并将其克隆到质粒pcDNA3.0质粒(Invitrogen)的HindIII和EcoRI位点之间。用序列测定来分析重组载体pcDNA3.0-PEG10基因的方向和正确的框架。具体步骤如下1.总RNA提取由于RNA酶广泛存在，玻璃器皿洗干净后置于200'C烘箱中烘烤6小时以除去RNA酶，塑料用具(枪头和EP管等)要浸泡在0.1XDEPC溶液中过夜，高压灭菌。试剂用0.1%DEPC处理过的RNasefree水配制。用TRIzol试剂提取细胞总RNA:(1)取50(^1TRIZOL加入细胞中，用移液器吹打几次(lml/10crr^细胞)；(2)(15-30)。C孵育5min;(3)移入1.5ml离心管中，加入100nl氯仿，剧烈摇动15s，(15-30)。C孵育(2-3)min;(4)4°C，12000rpm离心15min，将上层水相移入新的RNase-free的管中；(5)加入250^il异丙醇沉淀RNA，(15-30)。C孵育10min;(6)4°C,12000rpm离心10min，弃上清；(7)用75%乙醇50(^1清洗沉淀，4°C，12000rpm离心5min，弃上清；(8)真空抽干5min;(9)用RNase-free的ddH2030pi溶解RNA沉淀，于(55-60)°C孵育10min。2.RT-PCR扩增目的片段用TRIzol试剂抽提得到人肝癌细胞株BEL的总RNA后，首先用DNase消化，去除抽提物中残存的DNA。然后以01igo(dT)2o为引物，按Promega公司逆转录试剂盒的说明合成cDNA，再用TaKaRa公司PCR试剂盒扩增目的DNA。2.1去除抽提物中残存的DNARQ1RNase-FreeDNase37。C孵育60min，65。C灭活10min。2.2逆转录反应用M-MLV反转录酶进行逆转录反应，反应体系为25pl(1)RNA(2ng):2^1Oligo(dT)20(0.5ng^il):lplNuclease-freeddH20:12jxl(2)70'C孵育5min，立即放于冰上(3)5XM-MLVReactionBuffer:5|allOmMdNTPmix:1^1M-MLVReverseTranscriptase(200u/)jl):0.5^1RNaseInhibitor(40u4tl):0.5^1Nuclease-freed犯2O:3jxl(4)42'C孵育60min,迅速放于冰上2.3目的基因的PCR扩增Template(反转录产物)5pl10XExTaqBuffer:5pl2.5mMdNTPmix:4^1Forwardprimer(25pM):2piReverseprimer(25pM):2|xlExTaq(5u/[il):0.5|ilddH20:31，反应条件为94。C预变性4min，94°Clmin，60°Clmin，72°Clmin30s，35个循环，最后于72'C延伸10min，保存于4'C。3.琼脂糖凝胶电泳lgAgarose加入100ml0.5XTBE,加热煮沸，待温度降至55'C左右，加入溴化已锭，混匀后倒入水平电泳槽中，插入梳齿。胶凝固后，上样，120v，60mA电泳约30min，凝胶成像仪中观察目的条带。4.胶回收(上海申能博彩生物工程公司试剂盒)(1)用Agarose胶电泳将目的条带与其它DNA尽量分开，然后用干净的手术刀片切下含所要回收DNA的琼脂块，放入1.5ml离心管中，称重；(2)按每100mg胶加入400^1SolutionSN，置于(55-65)。C水浴中5min，中途混匀几次，至胶完全融化。胶融化后每40(^1SolutionSN加入100^1SolutionB混匀；(3)将3S柱放入2ml收集管中，将融化的胶溶液转移到3S柱中，让盖子开着，室温20-25。C放置2min。盖上离心管盖，10000rpm室温离心1min;(4)取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一个收集管中，加入600^1WashSolution,10000rpm室温离心lmin;(5)重复步骤(4)一次；(6)取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一个收集管中，10000rpm室温离心2min;(7)将3S柱放入一根新的1.5ml离心管中，在3S柱子膜中央加3(^1ddH20，室温放置2min;(8)盖上离心管盖，10000rpm室温离心lmin,离心管中的液体即为回收的DNA片段，-20'C保存。'B.siRNAs和转染siRNA寡核苷酸的正义和反义链的设计和合成是由国家分子生物学重点实验室完成的(中国科学院上海生物化学和细胞生物学研究所，SIBS，CAS)，95°C退火lmin，然后在退火缓冲液中37。C孵育lh[2x退火缓冲液(200mM醋酸钾，4mM醋酸镁，60mMHepes-OH,pH7.4)](15)。根据PEG10基因的基因序列同时设计了三对针对PEG10基因的siRNAs核苷酸序列(SEQIDNO:l，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3)，一种针对雄激素受体的siRNA核苷酸序列(SEQIDNo:4)。针对PEG10基因的siRNAs分别称为PEG10基因siRNAA,PEG10基因siRNAB和PEG10基因siRNAC。为了证实抑制的特异性，在实验中采用随机序列的siRNA作为阴性对照。SiRNA的序列如下1.针对PEG10基因的siRNA(—种RNA序列)PEG10基因siRNAA(SEQIDNo:l)正义5，gagcaccagggauuucucaTT3，反义5'ugagaaaucccuggugcucTT3，PEG10基因siRNAB(SEQEDNo:2)正义5，gucgcugucugcucugauuTT3，反义5'aaucagagcagacagcgacTT3'PEG10基因siRNAC(SEQIDNo:3)正义5'cuucauugaucacgaauauTT3'反义5，auauucgugaucaaugaagTT3，2.针对雄激素受体的siRNA(—种RNA序列)ARsiRNA(SEQIDNo:4)正义5，gggaaacagaaguaccuguTT3，反义5，acagguacuucuguuucccTT3，3.阴性对照siRNA(SEQIDNo:5)正义5，ugaaggaguuccugaucuuTT3，反义5，agaagaucaggaacucc皿TT3'转染前一天将细胞接种于6孔板，控制浓度使第二天转染时细胞密度约70%左右。用Opti-MEMI(Invitrogen)稀释siRNAs，Oligofectamine(Invitrogen)作用后将其瞬时转染到BEL-7404细胞中，然后用无血清的DMEM清洗细胞，转染6小时之后再加入10%的胎牛血清。Lipofectamine2000(Invitrogen)可带血清转染，将重组载体pcDNA3.0-PEG10基因瞬时转染到HEK293T细胞。细胞活力检测是将细胞消化后，进行台盼蓝染色后用血球计数器进行计数。C.Northernblot分析每个样本的总RNA均在1%的琼脂糖甲醛凝胶中电泳分离，然后印迹到Nytran膜(AmershamPharmaciaBiotech)上，紫外线照射进行交联。PEG10基因ORF编码序列是通过BEL-7404细胞总RNA的PCR扩增得到的。放射性标记探针采用KlenowFragment体系，7核苷酸随机引物标记同位素[oc-32P]dATP进行制备。杂交过程为在杂交溶液(PerfectHyb""^HybridizaitionSolution,TOYOBO)中68。C预杂交1小时后，加入标记探针，68。C杂交过夜。需要注意的是，在用Phosphorlmager(Storm860,AmershamBioscienceCompany,USA)扫描前要将膜洗净。具体步骤如下(1)细胞总RNA，溶于2.5^1去离子甲酰胺；(2)RNA处理10XMOPS:0.5|il甲醛0.875[ilNuclease-freeddH2C):1.125|oi溶解RNA的去离子甲酰胺2.5^1(3)65°Clmin,迅速放于冰上；(4)毎孔加入0.5ja110X上样buffer;(5)1%甲醛Agarose电泳；(6)125V,50mA，预电泳5min，电泳2h;(7)转膜(所用膜为带正电的尼龙膜)，胶正面向上，切除多余部分，平放在滤纸上，赶走气泡，加上膜并再次赶走气泡，四周用保鲜膜覆盖，依次加入双层滤纸、5-8cm厚吸水纸、玻璃板及重物，转膜过夜；(8)膜用6XSSC漂洗，RNA面向上晾干，紫外125mJ交联；(9)交联好的尼龙膜用5X冰乙酸固定5min,0.04%亚甲蓝染色至有条带出现，用流水终止反应，沥干，拍照，以28S的表达量作为内参照；(10)杂交探针a、探针标记采用KlenowFragment体系，7核苷酸随机引物标记同位素[a-32P]dATP。DNA模板为PCR得到的PEG10基因全长。模板DNA(25ng):5^17核苷酸随机引物(lnM/pl):2^1ddH20:7^195'C孵育3min，立即置于冰上5min。随后，在反应体系中依次加入下述试剂10XKlenowFragmentBuffer:2.5)ildGTP、dTTP、dCTP(0.2mMeach):2.5^110pCi[a-32P]dATP(比活性〉3000Ci/mM):5^1KlenowFragment(2U/5pl):5pl37°C反应3h，65°C5min终止反应。b、Sephadex制备及柱层析在100ml小烧杯中将lgSephadexG-50缓慢加入15mlddH20，ddH20洗涤溶涨的凝胶数次以去除可溶的葡聚糖。取约2cm高SephadexG-50至专用离心柱，1100g离心2min，弃掉液体及Ep套管。换上干净Ep套管，将标记好的探针加入离心后的SephadexG-50，1100g离心5min，将过柱后的标记探针一20°C保存备用。(11)杂交液PerfectHybTMHybridizaitionSolution,在68。C杂交炉中预杂交lh，加入探针杂交过夜；(12)杂交过夜的尼龙膜，2XSSC0.1%SDS5min、15min洗膜各两次；(13)沥干后用保鲜膜包裹，压磷屏5h;(14)Phosphorlmager扫描磷屏。D.Westernblot分析细胞提取物用SDSloadingbuffer[2xSDSloadingbuffer(4%SDS,1%TritonX-100,50mMTris-HCl,pH7.4)]和1mMDTT进行配制。蛋白用12%SDS-PAGE凝胶电泳分离，并转印至PVDF膜上。然后用5%脱脂乳T-TBS(0.1。/。Tween-20，lOOmMTris-HCl，0.9%NaCl)封闭膜，并与兔抗PEGIO多抗一起孵育。然后加入过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(Rockland),用SuperSignalWestPico试剂盒(Pierce)检测系统进行检测。GAPDH为内参照。E.流式细胞术将细胞接种在6孔板(5x105个细胞/L)中进行转染(如B.siRNAs和转染所述)。转染24小时后，直接在DMEM培养基中加入5-氟尿嘧啶诱导凋亡。72小时后，胰蛋白酶消化收集细胞，PBS洗两次。将细胞固定，PI染色，上机分析。步骤为1.细胞的收集(1)收集6孔细胞培养板内的培养基，细胞用胰酶消化，然后用收集的培养基悬起消化好的细胞，2000rpm，5min.每样本细胞数应达到1X106/孔；(2)弃掉培养基，用预冷的无菌PBS洗涤，4'C2000rpm离心5min。2.细胞的处理(1)弃掉PBS,用中科院上海细胞所流式细胞仪室自行配制的预冷拧檬酸缓冲液(citratebuffer)4'C固定细胞10min;(2)加入PI(propidiumiodide)染液4t)避光孵育30min;(3)4。C1000rpm离心5min弃去染液；(4)加入FITC-conjugatedA皿exinV染液，4'C避光孵育30min。3.流式细胞仪分析流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。F.实时定量RT-PCR分析用TRIZOL试剂(Invitrogen)和RQ1DNase(RNasefree)(Promega)提取样本的总RNA。DNase在65°C热灭活10min。RNA用oligo(dT)加和逆转录酶(Promega)进行逆转录，进行逆转录时先在42'C孵育60min，然后加热至95。C5min,0-5°C孵育5min。95°C5min将会灭活AMV逆转录酶，防止它与cDNA结合。实时定量PCR釆用SYBRGreenI荧光标记，并用ABIPRISM7700系统检测。每一个PCR循环中产生的荧光信号为实时定量PCR提供信息。特异性引物的序列如下(:SEQIDNo:6)AR正义5，-AAGGCTATGAATGTCAGCCCA-3，，AR反义5'-CATTGAGGCTAGAGAGCAAGGC垂3';PEG10基因正义5'-ATGATGACATCGAGCTCCG-3，；PEG10基因反义5'-GCTGGGTAGTTGTGCATCA-3，;.hTERT正义5，-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3';hTERT反义5'-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3，；GAPDH正义5'-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG陽3，；GAPDH反义5'-GGTCCACCACTGACACGTTG-3，；反应体系为:SYBRGreen(20X):0.3nlcDNA:2(xl10XExTaqBuffer(Mg2+Free):2plMgCl2(25mM):O耀dNTPmix(2.5mM):l単Forwardprimer(25pM):1^1Reverseprimer(25|iM):1^1ExTaq(5u/|xl):0，ddH20:10.8nlGAPDH为内参照。PCR的过程为94。C2min，94°C45秒42个循环，每个循环中6(TC45秒，72'C90秒。在正常的肝细胞和不同的肝癌细胞中AR的表达有明显差异。申请人检测了在正常的肝细胞NML和不同的肝癌细胞HepG2、HuH7及BEL细胞中AR在mRNA及蛋白水平的表达。同时抽取不同组细胞的RNA，用SYBRGreen染料进行real-timeRT-PCR检须lj，图1A显示的是real-timeRT-PCR的实验结果。可见在正常肝细胞中AR表达量极低，HuH7细胞AR表达量中等(;K0.仍)，而BEL细胞高表达AR(p<0.007)。相对于其它肝癌细胞株，HepG2细胞中AR表达量较低，接近于正常肝细胞水平。为了证实以上的结果，对正常的肝细胞和不同的肝癌细胞中AR的表达进行了Northernblot和Westernblot的检测，实验结果与real-timeRT-PCR中所观察到的结果一致，详见图1B。G细胞生长测定细胞常规培养，即:用含10%胎牛血清、0.04X谷氨酰胺的RPMI-1640培养液于37'C、5。/。C02培养，通过血球计数器观察细胞生长情况。软琼脂生长测定法细胞增殖后，将其接种在直径35-mm的平皿中，用含3%琼脂的完全培养基进行培养，孵育5天后计数(m2)。为了检测雄激素DHT对细胞生长的影响，细胞(2x104)接种在无雄激素的12孔板中[在阻断实验中加入拮抗剂FLU(1pM)或VPA(100pM)],24小时后，换用DHT培养基培养48小时，48小时后，将BEL-7404、HuH7、HepG2和人胚肾细胞株HEK293T再用低DHT的DMEM培养基培养，5天后测细胞总数。H.AR转染为了分析HCC中AR的作用，瞬时转染不同浓度的含质粒的AR进行实验。将人AR的表达质粒pSVhAR(Invitrogen)克隆到CMV早期启动子下游的pCDNA3.0(Invitrogen)上。转染细胞用于进一步的研究。首先将针对AR的siRNAAR导入BEL细胞下调AR的表达，可见转染48h后高剂量的siRNAAR(2pg/ml)能完全抑制BEL细胞中AR在mRNA及蛋白水平的表达(/xftOW),real-timeRT-PCR、Northernblot和Westernblot的检测结果一致。而较低剂量的siRNAAR(0.02pg/ml)不能抑制AR的表达，对照用negativesiRNA即使以2pg/ml的剂量转染对AR的表达也无任何抑制作用，见图2A,2C。其中vector表示的是导入空载体vector的空白对照，control表示导入对照negativesiRNA(2pg/ml)，siRNAARl和siRNAARh分别表示导入低剂量的siRNAAR，即siRNAAR!(0.02pg/ml)和高剂量的siRNAAR,即siRNAARh(2吗/ml)。结果提示siRNAAR对AR表达的下调作用不仅是剂量依赖性，还是序列特异性的。同时观察到高剂量的siRNAAR在下调AR表达的同时还有效降低了PEG10基因的表达(j!7<fta5)，见图2B，2D。提示AR的表达与PEG10基因有着密切的联系。雄激素DHT能引起AR表达量较高的BEL肝癌细胞的生长加速和对凋亡的抵抗作用，高剂量的siRNAAR能选择性的阻断雄激素的这种促生长作用，但较低剂量的siRNAAR和对照用negativesiRNA则无此作用，见图3A，3B。图3A中(■)、(□)、()和(O)分别表示在雄激素DHT存在的条件下，分别导入空载体vector的空白对照，对照negativesiRNA(2|ag/ml)、siRNAARl(0.02吗/ml)和siRNAARh(2pg/ml)后，BEL细胞的生长情况。可以观察到，在雄激素DHT存在的条件下，细胞导入高剂量的siRNAAR后生长明显减慢，细胞数目减少(;Kft0W)，对给予较低剂量的siRNAAR细胞稍有影响，而对导入空载体vector和negativesiRNA的对照组BEL细胞生长影响不大。图3B中，BEL细胞分别给予以下处理空白对照、仅导入空载体vector的空白对照，导入对照negativesiRNA(2|ig/ml)、siRNAARl(0.02吗/ml)和siRNAARh(2pg/ml)。()表示空白对照的细胞给予雄激素DHT的处理。可以观察到，雄激素DHT能有效的抵抗5—氟尿嘧啶诱导的细胞凋亡，凋亡细胞数目明显减少。但当导入高剂量的siRNAAR有效抑制AR的表达后，BEL细胞中凋亡细胞数目明显增多。给予较低剂量的siRNAAR细胞中凋亡细胞数目稍有增多，而对导入空载体vector和negativesiRNA的对照组BEL细胞凋亡影响不大。在图可见4(A，B，C，D,E，F)siRNAPEG10基因导入BEL细胞下调PEG10基因的表达，转染48h后高剂量的siRNAPEG10基因(2|ug/ml)能有效的抑制肝癌细胞的生长，增加凋亡细胞数目。雄激素DHT能引起AR表达量较高的BEL肝癌细胞的生长加速和对凋亡的抵抗作用，高剂量的siRNAPEG10基因也能选择性的阻断雄激素的这种促生长作用，但较低剂量的siRNAPEG10基因和对照用negativesiRNA则无此作用。在图4A,4B，4C中，vector表示的是导入空载体vector的空白对照，control表示导入对照negativesiRNA(2pg/ml)，siRNAPEG10基因1和siRNAPEG10基因h分别表示导入低剂量的siRNAPEG10基因〔0.02pg/ml)和高剂量的siRNAPEG10基因(2吗/ml)。导入高剂量的siRNAPEG10基因后BEL肝癌细胞生长明显减慢(^<0.05)，加入雄激素DHT后细胞生长明显增加，但导入高剂量siRNAPEG10基因的细胞生长仍然缓慢(;KO力W)，而对给予较低剂量的siRNAPEG10基因细胞、导入空载体vector和negativesiRNA的对照组BEL细胞生长影响不大。图4D，4E，4F中，BEL细胞分别给予以下处理仅导入空载体vector的空白对照，导入对照negativesiRNA(2pg/ml)、siRNAPEG10基因1(0.02pg/ml)和siRNAPEG10基因h(2(ag/ml)。可以观察到高剂量的siRNAPEGlO基因能使肝癌细胞凋亡细胞数目增加。雄激素DHT能有效的抵抗5—氟尿嘧啶诱导的细胞凋亡，凋亡细胞数目明显减少，但导入高剂量的siRNAPEGlO基因有效抑制PEG10基因的表达后，BEL细胞中凋亡细胞数目仍多。给予较低剂量的siRNAPEG10基因细胞、导入空载体vector和negativesiRNA的对照组BEL细胞凋亡数目无明显影响。另外，在高表达AR和PEG10基因的HuH7细胞中也观察到了相似的结果。由此，可以认为雄激素DHT通过调节PEG10基因的表达影响肝癌细胞生长和凋亡。为进一步确认雄激素DHT抑制细胞凋亡作用的具体分子机制，申请人检测了肝癌细胞中端粒酶基因hTERT的表达水平。从图5A，5C中可看出，在雄激素DHT存在的条件下，BEL细胞中hTERT的表达水平明显升高。但在经过siRNAPEG10基因下调PEG10基因表达的BEL细胞中，雄激素的DHT存在对于hTERT的表达水平无明显影响(图5B,5D)。AR抑制剂FLU能完全抑制DHT引起的hTERT表达的变化。单独加入FLU对正常的肝细胞和肝癌细胞中PEG10基因的表达无影响。另外，在高表达AR和PEG10基因的HuH7细胞中也观察到了相似的结果。在共转染了AR和PEG10基因(各600ng)的人胚肾HEK293T细胞中，同样观察到在雄激素DHT存在的条件下，细胞中hTERT的表达水平明显升高，见图6A,6B。结果提示雄激素DHT与其受体结合后，可通过增加PEG10基因的表达明显上调hTERT的表达，从而促进肝癌细胞生长，抑制肝癌细胞凋亡的发生。这些结果也部分的解释了PEG10基因在促进肝癌形成中的可能作用机制。根据以上的实验研究结果，遗传印记基因10(PEG10基因)的双链小干扰RNA(siRNA)作为制备治疗或预防肝癌的药物中的应用。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果-1将表达反义RNA的基因以合适的载体导入到病变部位，使其在病变的原位生成反义RNA,并发挥抗mRNA的作用,这就是反义技术的基因治疗策略。通过这种方法可避开反义分子难以大量纯化、制备的难题。2PEG10基因的表达不但具有比AFP更高的肝癌组织特异性，而且具有相对器官组织特异性,这也是用PEG10基因的双链小干扰RNA(siRNA)抑制肝癌细胞预防和治疗肝癌的一大优点。图1为正常的肝细胞和不同的肝癌细胞中AR的表达其中A是real-timeRT-PCR的实验结果。与正常肝细胞(NML)中AR表达量相比，*表示/<0.05;**表示；K0力W。B中上图为Northernblot检测结果，下图为Westernblot检测结果。28S及Actin分别作为Northernblot检测和Westernblot检测的内参照。图2siRNAAR对BEL肝癌细胞AR和PEG10基因的表达的影响图2显示siRNAAR转染48h后BEL细胞中AR(图2A)及PEG10基因(图2B)的表达情况。图2A，2B为real-timeRT-PCR的结果，图2C，2D中从上至下依次Northernblot和Westernblot的检测结果，其中28S及Actin分别作为Northernblot检测和Westernblot检测的内参照。vector表示的是导入空载体vector的'空白对照，control表示导入对照negativesiRNA(2pg/ml)，siRNAARl和siRNAARh分别表示导入低剂量的siRNAAR(0.02ng/ml)和高剂量的siRNAAR(2pg/ml)。与导入空载体vector空白对照的BEL肝癌细胞的AR及PEG10基因的表达量相比，*表示;<0.05;**表示;KftOW。图3雄激素DHT与siRNAAR对BEL肝癌细胞生长和凋亡的影响其中A为显示siRNAAR转染48h后在雄激素DHT存在的条件下，BEL肝癌细胞生长变化情况图，在雄激素DHT存在的条件下，B—导入空载体vector的空白对照，口一对照negativesiRNA(2吗/ml)、一siRNAARl(0.02吗/ml)、O—siRNAARh(2吗/ml)后，BEL细胞的生长情况。；B为显示siRNAAR转染48h后在雄激素DHT存在的条件下，BEL肝癌细胞凋亡变化情况图，令表示空白对照的细胞给予雄激素DHT的处理。Un-treated表示的是未经处理的BEL肝癌细胞，vector表示的是导入空载体vector的空白对照，control表示导入对照negativesiRNA(2|xg/ml)，siRNAARl和siRNAARh分别表示导入低剂量的siRNAAR(0.02|ig/ml)和高剂量的siRNAAR(2ng/ml)。与导入空载体vector空白对照的BEL肝癌细胞的数目相比，**表示;K0力W。；图4雄激素DHT与siRNAPEG10基因对BEL肝癌细胞生长和凋亡的影响其中A为在DHT不存在条件下siRNAPEG10基因转染48h后BEL肝癌细胞的生长变化情况图；B为在DHT存在条件下siRNAPEG10基因转染48h后BEL肝癌细胞的生长变化情况图；C为在FLU/DHT都存在条件下siRNAPEGlO基因转染48h后BEL肝癌细胞的生长变化情况图；D为在DHT不存在条件下siRNAPEGlO基因转染48h后BEL肝癌细胞的凋亡变化情况图；E为在DHT存在条件下siRNAPEGlO基因转染48h后BEL肝癌细胞的凋亡变化情况图；F为在FLU/DHT都存在条件下siRNAPEGlO基因转染48h后BEL肝癌细胞的凋亡变化情况图；vector表示的是导入空载体vector的空白对照，control表示导入对照negativesiRNA(2pg/ml),siRNAPEGlO基因1和siRNAPEGlO基因h分别表示导入低剂量的siRNAPEGlO基因(0.02吗/ml)和高剂量的siRNAPEGlO基因(2pg/ml)。与导入空载体vector空白对照的BEL肝癌细胞PEG10基因的表达量相比，与导入空载体vector空白对照的BEL肝癌细胞的生长数目和凋亡细胞数目相比，*表示/<0.05;**表示/K0.W7。图5雄激素DHT与BEL细胞中端粒酶基因hTERT的表达水平其中A为用real-timeRT-PCR检测正常的BEL肝癌细胞中DHT与hTERT表达的变化；B为用real-timeRT-PCR检测经过siRNAPEGlO基因下调PEG10基因表达的BEL细胞中DHT与hTERT表达的变化;C为用Northernblot的检测正常的BEL肝癌细胞中DHT与hTERT表达的变化；D为用Northernblot的检测经过siRNAPEGlO基因下调PEG10基因表达的BEL细胞中DHT与hTERT表达的变化。显示在DHT+、DHT'或FLlf/DHr、FLU/DHT+不同条件下BEL肝癌细胞中端粒酶基因hTERT表达的变化。上图为real-timeRT-PCR的检测结果，下图为Northernblot的检测结果，其中28S作为Northernblot检测的内参照。BELPEGIO基因+表示正常的BEL肝癌细胞，BELPEGIO基因'表示经过siRNAPEGlO基因下调PEG10基因表达的BEL细胞。与FLU/DHr情况下，细胞中hTERT基因表达量相比，*表示;<0.05;**表示/<{.00/。图6雄激素DHT与HEK293T细胞中端粒酶基因hTERT的表达水平图中显示在DHT+、DHTT或FLU+/DHr、FLU/DHT+不同条件下共转染了AR和PEG10基因的HEK293T细胞中端粒酶基因hTERT表达的变化。其中A为real-timeRT-PCR的检测结果，B为Northernblot的检测结果，其中28S作为Northernblot检测的内参照。与FLU/DHT情况下，细胞中hTERT基因表达量相比，*表示/<0.05;**表示p〈0.銜。具体实施方式实施例1(PEG10基因)的双链小干扰RNA(siRNA)对于小鼠肝癌动物模型肝癌形成的抑制和作为制备治疗或预防肝癌的药物中的应用:图为AR的促效剂，拮抗剂，siRNAAR,和siRNAPEG10基因对肝癌形成的影响。裸鼠肝癌形成为了检测雄激素_雄激素受体复合物和/或siRNAs的体内作用，申请者从Jackson实验室(BarHarbor,ME)购得裸鼠(CBy.Cg-Foxnlnu)，将人肝癌细胞株(HepG2和BEL细胞)分别注射入裸鼠左侧大腿的皮下(每只鼠5x106细胞，6只一组)。注射40天后处死裸鼠取出肿瘤，测量肿瘤的直径和体积(见表1)。表1AR的促效剂、拮抗剂，siRNAAR和siRNAPEG10基因对肝癌形成的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>fl:HepG2和BEL-7404(BEL)人肝癌细胞注射裸鼠形成肝癌模型.6:细胞未经基因转染或siRNAs基因敲除处理.c:细胞经基因转染或siRNAs基因敲除处理后.细胞经AR促效剂DHT和或拮抗剂FLU,VPN处理.D,肿瘤直径(xmm);W,肿瘤重量(xg)./.数据用平均数±标准差表示.为了表格的简洁，标准差未标明.g:-,未测.*p<0.001，n-6,AR促效剂，拮抗剂组与未处理组比较；"p〈0.001,n-6,siRNAs基因敲除组与versus未处理细胞组比较.用HepG2和BEL细胞处理过的裸鼠所形成的肿瘤，其平均直径和体积与未经处理组相比有显著差别。雄激素DHT处理能有效的增加肿瘤的大小，特别是注射了AR高表达的BEL细胞的小鼠。导入AR基因的HepG2细胞在经过雄激素DHT处理后，肿瘤生长明显加速。在转染siRNAPEG10基因的HepG2和BEL细胞中，肿瘤生长明显减慢，即使给予雄激素DHT处理，肿瘤生长也不明显。雄激素受体抑制剂FLU或VPA都能有效减慢裸鼠肿瘤的生长。结果提示在体内实验中，雄激素DHT也能通过增加PEG10基因的表达影响，肿瘤的形成和生长。本动物模型模拟了肝癌的形成和肝癌细胞的生长过程，证明在PEG10基因在肝癌的形成发展中具有重要作用，而PEG10基因的双链小干扰RNA(siRNA)显著抑制了肝癌的形成和肝癌体积的大小。综上所述，研究者认为PEGIO基因在肝癌的发生发展中发挥着重要的作用。本研究的初步实验结果提示，雄激素DHT与其受体AR结合后，在AR表达量较高的肝癌细胞中通过增加PEG10基因的表达，显著促进了肝癌细胞的生长并可诱导其抗凋亡作用；对于低表达AR的肝癌细胞，将AR基因转染后对PEGIO基因的表达量无明显影响，其在雄激素DHT的作用下能出现的生长加速和凋亡细胞数目减少的作用，可能是通过活化PEG10基因，从而上调hTERT的表达，导致肝癌细胞生长加速及对凋亡的抵抗作用。通过千扰RNA的方法用PEG10基因的双链小干扰RNA(siRNA)处理肝癌细胞,能抑制肝癌细胞的生长，促进肝癌细胞地凋亡。SEQUENCELISTING<110>武汉大学<120>PEG10基因的双链小干扰RNA在制备治疗或预防肝癌药物中的应用<130>PEGIO基因的双链小干扰RNA序列和雄激素受体AR的双链小干扰RNA序列<160>8<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>Homosapiens<柳>1gagcaccagggauuucucatt21<210>2<211>21<212>DNA<213>Homosapiens<400>2ugagaaaucccuggugcuctt21<2]0>3<211>21<212>DNA<213>Homosapiens<400>3gucgcugucugcucugauutt21<210>4<211>21<212>DNA<213>Homosapiens<400>4aaucagagcagacagcgactt21<210>5<211>21<212>DNA<213>Homosapiens<400>5cuucauugaucacgaauautt21<210>6<2U>21<212>DNA<213>Homosapiens<400>6auauucgugaucaaugaagtt21<210>7<211>21<212>DNA<213>Homosapiens<400>7gggaaacagaaguaccugutt21<210>8<211>21<212>DNA<213>Homosapiens<400>8acagguacuucuguuuccctt2权利要求1、一种PEG10基因的双链小干扰RNA在制备治疗或预防肝癌的药物中的应用。2、一种RNA序列，其核苷酸序列如SEQIDN0:1所示。3、一种RNA序列，其核苷酸序列如SEQIDN0:2所示。4、一种RNA序列，其核苷酸序列如SEQIDN0:3所示。5、一种RNA序列，其核苷酸序列如SEQIDN0:4所示。全文摘要本发明公开了一种PEG10基因的双链小干扰RNA(siRNA)在制备治疗或预防肝癌药物中的应用，该研究表明在肝癌细胞中雄激素可上调遗传印记基因10(PEG10基因)的表达水平，而雄激素诱导的PEG10基因的高表达能上调人端粒末端转移酶逆转录酶(hTERT)的表达，因此其可能通过抑制凋亡来参与肝癌的形成。这些发现证明PEG10基因在肝癌细胞抵抗凋亡的过程中发挥着重要作用，用PEG10基因的双链小干扰RNA(siRNA)可以诱导肝癌细胞凋亡，预防肝癌的形成，有效减慢肿瘤的生长速度，缩小癌组织的体积，表明该siRNA可以作为治疗或预防肝癌的药物制品。文档编号A61K48/00GK101152575SQ20061012465公开日2008年4月2日申请日期2006年9月29日优先权日2006年9月29日发明者张秋萍,洁熊,谭锦泉申请人:武汉大学