专利名称：贯众总多糖在制备防治急性呼吸窘迫综合征药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属中药领域，涉及中药贯众总多糖新的药用用途。具体涉及贯众总多糖在防治急性呼吸窘迫综合征中的用途。
背景技术：
急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是指心源性以外的各种肺内外致病因素所导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭，其临床特点为急性呼吸窘迫和难治性低氧血症，是临床上较为常见的危急、重症之一，病死率高。Davidson TA(Davidson TA，Caldwell ES，et al.JAMA，1999，281354.)等报道在过去十年ARDS的死亡率高达30％-40％。有研究表明重症非典型肺炎(SARS)病人也可出现呼吸窘迫，且肺部病理改变与ARDS相似，主要表现为肺泡的损伤。SARS并发ARDS死亡率极高。糖皮质激素、抗生素、抗细胞因子治疗药物等常被用于ARDS的治疗，但目前为止，仍无一种特效药物能治疗上述疾病。研究表明免疫损害是ARDS的另一重要发病机制。而补体系统的过度激活与ARDS的发生与预后有显著联系。通过特异性抑制补体组成成分激活有可能提高治疗ARDS的临床疗效。因此急需高效低毒的补体抑制剂来防治急性呼吸窘迫综合征。
贯众为鳞毛蕨科植物粗茎鳞毛蕨(Dryopteris crassirhizoma)的根茎及叶柄基，也称为东北贯众或绵马贯众。此外，也有将蛾眉蕨(Lunathyrium acrostichoides)、狗脊蕨(Woodwardia japonica)、紫萁(Osmunda japonica)、苏铁蕨(Brainea insignis)、乌毛蕨(Blechnum orientale)荚果蕨(Matteuccia struthiopteris)和东方荚果蕨(M.orientalis)的根茎及叶柄基作贯众入药。贯众具有清热解毒、凉血止血、杀虫的功效，主治风热感冒、温热斑疹、吐血、咯血及肠寄生虫病等症。现代药理研究证明贯众含绵马酸类、三萜、鞣质、挥发油、多糖等化学成分。具有抗肿瘤、抗病原微生物和驱虫等作用(吴贻谷，宋立人，等.中华本草(上册)精选本.1996，p219)。
纵观国内外的报导，尚无关于贯众免疫抑制药理作用的报道，也未见报道贯众总多糖的防治急性呼吸窘迫综合征药效及其药物。
发明内容
本发明的目的是提供贯众总多糖新的药用用途，具体涉及贯众总多糖在制备防治急性呼吸窘迫综合征药物中的用途及其制备方法。
本发明从中药贯众中分离提取得到总多糖提取物。
所述总多糖提取物经体外实验证实，有较强抗补体活性，整体动物模型试验证实其具有很强的防治实验性急性呼吸窘迫综合征作用。
本发明所述的中药贯众包括狗脊蕨贯众(Woodwardia japonica)，绵马贯众(Dryopteris crassirhizoma)，荚果蕨贯众(Matteuccia struthiopteris)和东方荚果蕨贯众(M.orientalis)。
本发明的目的通过下述技术方案实现1、制备贯众总多糖取贯众药材以95％乙醇冷浸提取，滤过，药渣于室温下置通风处晾干，然后用热水提取3次，滤过，合并提取液，浓缩，离心，上清液以三氯醋酸去游离蛋白，离心，上清液用水透析3天，透析液浓缩至小体积后加乙醇至含醇量80％，离心，沉淀、冷冻、干燥，即得总多糖提取物，收率达5.72％，多糖含量为53.0-58.9％。
2、贯众总多糖用于抗补体和防治急性呼吸窘迫综合征试验1)抗补体激活经典途径细胞溶血试验豚鼠(购自复旦大学实验动物部)血清1∶32稀释液作为补体，抗原激活补体经典途径导致羊红细胞溶血，测得贯众总多糖可抑制细胞溶血。
绵马贯众(Dryopteris crassirhizoma)CH50＝0.170mg.ml-1(n＝4)。
狗脊蕨贯众(Woodwardia japonica)CH50＝0.114mg.ml-1(n＝4)。
荚果蕨贯众(Matteuccia struthiopteris)CH50＝0.137mg.ml-1(n＝4)。
东方荚果蕨贯众(M.orientalis)CH50＝0.125mg.ml-1(n＝4)。
2)抗补体激活旁路途径细胞溶血试验健康人血清1∶10稀释液作为补体，激活补体旁路途径导致兔红细胞溶血，测得贯众总多糖可抑制溶血。
绵马贯众(Dryopteris crassirhizoma)AP50＝0.764mg.ml-1(n＝4)。
狗脊蕨贯众(Woodwardia japonica)AP50＝0.703mg.ml-1(n＝4)。
荚果蕨贯众(Matteuccia struthiopteris)AP50＝0.375mg.ml-1(n＝4)。
东方荚果蕨贯众(M.orientalis)AP50＝0.682mg.ml-1(n＝4)。
3)防治急性呼吸窘迫综合征体内试验选用SD大鼠，以缺血再灌注+内毒素(LPS)二次打击，建立与补体过度激活相关的急性呼吸窘迫综合征模型。贯众总多糖灌胃给药。观察动物的血清中总补体活性及二氧化碳指标。
将试验大鼠在实验结束后放血处死，取肺，石蜡固定，切片，显微镜下观察病理改变。
结果证实口服贯众总多糖后，对大鼠急性呼吸窘迫综合征引起的肺损伤有明显的保护作用。
体外试验证实，贯众总多糖对在经典和旁路途径激活所引发的细胞溶血均有抑制，对体内大鼠的急性呼吸窘迫综合征有防治作用。
表1是动物血清补体活性测定的OD值变化率(％，X±SD)(n＝5)。
表2是动物血清CO2浓度变化率(％，X±SD)(n＝5)。
表1
*与ARDS模型组比较P＜0.05；**与ARDS模型组比较P＜0.01。
表2
*与ARDS模型组比较P＜0.05；**与ARDS模型组比较P＜0.01。
图1是ARDS大鼠血清补体活性测定的OD值变化率。
图2是ARDS大鼠血清CO2浓度变化率。
图3是ARDS大鼠肺切片图。
图4是空白对照组大鼠肺切片图。
图5是伪手术组大鼠肺切片图。
图6是阳性对照(氢化泼尼松)大鼠肺切片图。
图7是贯众总多糖给药组大鼠肺切片图。
具体实施例方式
实施例1取贯众药材100g，以95％乙醇冷浸提取，药渣于室温下置通风处晾干，然后用热水提取3次，滤过，合并提取液，浓缩，离心，上清液以S三氯醋酸去游离蛋白，离心，上清液用水透析3天，透析液浓缩至小体积加乙醇至含醇量80％，离心，沉淀冷冻干燥即得总多糖，产物收率达5％以上，多糖含量超过50％。表3是贯众总多糖收率及含量。
表3
实施例2将绵马贯众(Dryopteris crassirhizoma)总多糖约3.0mg.mL-1用巴比妥缓冲液(barbitol buffer solution，BBS)对倍稀释得八个浓度的溶液，各取0.2ml各浓度样品加入0.2ml补体(豚鼠血清1∶32稀释液)，0.1ml 2％羊红细胞(sheep red blood cell，SRBC)和0.1ml 1∶1000溶血素(抗SRBC血清)，将每管37℃水浴30分钟后放置入低温高速离心机2500G、4℃离心，20min后分别取每管上清0.25mL于酶标仪405nm下测定吸光度。再仅仅将0.2ml各浓度样品溶液与0.4mlBBS混合，放置入低温高速离心机以2500G、4℃离心10min，取每管上清0.25mL于酶标仪405nm下测定吸光度，作为样品吸光本色值。再将每种不同浓度的样品效价测定吸光度减去相应浓度下样品吸光本色值为加入药物后的溶血吸光度，并附加补体正常溶血管作为体系全溶血对照，计算药物抑制溶血的半数抑制浓度(CH50)为0.170mg.ml-1(n＝4)。
实施例3将狗脊蕨贯众(Woodwardia japonica)总多糖约3.0mg.mL-1用巴比妥缓冲液对倍稀释得八个浓度的溶液，各取0.2ml各浓度样品加入0.2ml补体(豚鼠血清1∶32稀释液)，0.1ml 2％羊红细胞和0.1ml 1∶1000溶血素(抗SRBC血清)，将每管37℃水浴30分钟后放置入低温高速离心机2500G、4℃离心，20min后分别取每管上清0.25mL于酶标仪405nm下测定吸光度。再仅将0.2ml各浓度样品溶液与0.4mlBBS混合，放置入低温高速离心机以2500G、4℃离心10min，取每管上清0.25mL于酶标仪405nm下测定吸光度，作为样品吸光本色值。再将每种不同浓度的样品效价测定吸光度减去相应浓度下样品吸光本色值为加入药物后的溶血吸光度，并附加补体正常溶血管作为体系全溶血对照，计算药物抑制溶血的半数抑制浓度(CH50)为0.114mg.ml-1(n＝4)。
实施例4将荚果蕨贯众(Matteuccia struthiopteris)总多糖约3.0mg.mL-1用巴比妥缓冲液对倍稀释得八个浓度的溶液，各取0.2ml各浓度样品加入0.2ml补体(豚鼠血清1∶32稀释液)，0.1ml 2％羊红细胞和0.1ml 1∶1000溶血素(抗SRBC血清)，将每管37℃水浴30分钟后放置入低温高速离心机2500G、4℃离心，20min后分别取每管上清0.25mL于酶标仪405nm下测定吸光度。再仅将0.2ml各浓度样品溶液与0.4mlBBS混合，放置入低温高速离心机以2500G、4℃离心10min，取每管上清0.25mL于酶标仪405nm下测定吸光度，作为样品吸光本色值。再将每种不同浓度的样品效价测定吸光度减去相应浓度下样品吸光本色值为加入药物后的溶血吸光度，并附加补体正常溶血管作为体系全溶血对照，计算药物抑制溶血的半数抑制浓度(CH50)为0.137mg.ml-1(n＝4)。
实施例5将东方荚果蕨贯众(M.orientalis)总多糖约3.0mg.mL-1用巴比妥缓冲液对倍稀释得八个浓度的溶液，各取0.2ml各浓度样品加入0.2ml补体(豚鼠血清1∶32稀释液)，0.1ml 2％羊红细胞和0.1ml 1∶1000溶血素(抗SRBC血清)，将每管37℃水浴30分钟后放置入低温高速离心机2500G、4℃离心，20min后分别取每管上清0.25mL于酶标仪405nm下测定吸光度。再仅仅将0.2ml各浓度样品溶液与0.4mlBBS混合，放置入低温高速离心机以2500G、4℃离心10min，取每管上清0.25mL于酶标仪405nm下测定吸光度，作为样品吸光本色值。再将每种不同浓度的样品效价测定吸光度减去相应浓度下样品吸光本色值为加入药物后的溶血吸光度，并附加补体正常溶血管作为体系全溶血对照，计算药物抑制溶血的半数抑制浓度(CH50)为0.125mg.ml-1(n＝4)。
实施例6将绵马贯众(Dryopteris crassirhizoma)总多糖约5.0mg.mL-1用含Mg2+的明胶-巴比妥缓冲液[GVB/Mg(10mM)EGTA]对倍稀释得八个浓度的溶液，取0.15ml各浓度样品加入0.15ml补体(人血清1∶10稀释液)，0.2ml 2％兔红细胞，将每管37℃水浴30分钟后放置入低温高速离心机2500G、4℃离心，20min后分别取每管上清0.25mL于酶标仪405nm下测定吸光度。再仅仅将0.15ml各浓度样品溶液与0.35ml GVB/Mg(10mM)EGTA混合，放置入低温高速离心机以2500G、4℃离心10min，取每管上清0.25mL于酶标仪405nm下测定吸光度，作为样品吸光本色值。再将每种不同浓度的样品效价测定吸光度减去相应浓度下样品吸光本色值为加入药物后的溶血吸光度，并附加补体正常溶血管作为体系全溶血对照，计算药物抑制溶血的半数抑制浓度(AP50)为0.764mg.ml-1(n＝4)。
实施例7将狗脊蕨贯众(Woodwardia japonica)总多糖约5.0mg.mL-1用含Mg2+的明胶-巴比妥缓冲液[GVB/Mg(10mM)EGTA]对倍稀释得八个浓度的溶液，取0.15ml各浓度样品加入0.15ml补体(人血清1∶10稀释液)，0.2ml 2％兔红细胞，将每管37℃水浴30分钟后放置入低温高速离心机2500G、4℃离心，20min后分别取每管上清0.25mL于酶标仪405nm下测定吸光度。再仅仅将0.15ml各浓度样品溶液与0.35ml GVB/Mg(10mM)EGTA混合，放置入低温高速离心机以2500G、4℃离心10min，取每管上清0.25mL于酶标仪405nm下测定吸光度，作为样品吸光本色值。再将每种不同浓度的样品效价测定吸光度减去相应浓度下样品吸光本色值为加入药物后的溶血吸光度，并附加补体正常溶血管作为体系全溶血对照，计算药物抑制溶血的半数抑制浓度(AP50)为0.703mg.ml-1(n＝4)。
实施例8将荚果蕨贯众(Matteuccia struthiopteris)总多糖约5.0mg.mL-1用含Mg2+的明胶-巴比妥缓冲液[GVB/Mg(10mM)EGTA]对倍稀释得八个浓度的溶液，取0.15ml各浓度样品加入0.15ml补体(人血清1∶10稀释液)，0.2ml 2％兔红细胞，将每管37℃水浴30分钟后放置入低温高速离心机2500G、4℃离心，20min后分别取每管上清0.25mL于酶标仪405nm下测定吸光度。再仅仅将0.15ml各浓度样品溶液与0.35ml GVB/Mg(10mM)EGTA混合，放置入低温高速离心机以2500G、4℃离心10min，取每管上清0.25mL于酶标仪405nm下测定吸光度，作为样品吸光本色值。再将每种不同浓度的样品效价测定吸光度减去相应浓度下样品吸光本色值为加入药物后的溶血吸光度，并附加补体正常溶血管作为体系全溶血对照，计算药物抑制溶血的半数抑制浓度(AP50)为0.375mg.ml-1(n＝4)。
实施例9将东方荚果蕨贯众(M.orientalis)总多糖约5.0mg.mL-1用含Mg2+的明胶-巴比妥缓冲液[GVB/Mg(10mM)EGTA]对倍稀释得八个浓度的溶液，取0.15ml各浓度样品加入0.15ml补体(人血清1∶10稀释液)，0.2ml 2％兔红细胞，将每管37℃水浴30分钟后放置入低温高速离心机2500G、4℃离心，20min后分别取每管上清0.25mL于酶标仪405nm下测定吸光度。再仅仅将0.15ml各浓度样品溶液与0.35ml GVB/Mg(10mM)EGTA混合，放置入低温高速离心机以2500G、4℃离心10min，取每管上清0.25mL于酶标仪405nm下测定吸光度，作为样品吸光本色值。再将每种不同浓度的样品效价测定吸光度减去相应浓度下样品吸光本色值为加入药物后的溶血吸光度，并附加补体正常溶血管作为体系全溶血对照，计算药物抑制溶血的半数抑制浓度(AP50)为0.682mg.ml-1(n＝4)。
实施例10SD大鼠25只(250-300g)，随机分为A、B、C、D、E组。A组为内毒素致伤ARDS组，B组为阴性对照组，C组为阳性对照组，D组为伪手术对照组，E组为贯众多糖组。除了D组外的所有组动物在20min内自颈部动脉放血至平均动脉压为45±5mmHg，室温下休克1h后回输血液，在随后的1h内回输全部采集血液，然后气管内给予LPS200μg.kg-1；E组在给予LPS前半小时灌胃给药，剂量为10mg/kg；D组仅实施麻醉和颈动脉插管等手术操作。B组其余操作与E组相同，以生理盐水替代贯众多糖，作为阴性对照。C组则在给予LPS前半小时以70mg/kg腹腔注射氢化泼尼松作为阳性对照组。A-E组分别在气管内注入内毒素前(T0)及注入内毒素后的0.5h(T0.5)、1h(T1)、1.5h(T1.5)、2.5h(T2.5)采集血样，分别测定血中CO2浓度及补体经典途径的溶血活性。给予内毒素2.5h后动物处置，取肺，石蜡固定，切片，显微镜下观察病理改变。结果显示A组与B组血样CO2浓度呈现较大幅度的上升，补体活性小幅度下降。C、E组血样CO2浓度上升幅度相对较小，补体活性大幅度下降。D组血样CO2浓度与补体活性略微下降，基本稳定。病理切片按肺部损伤情况A组评级均数为3.67，B组评级均数为2.33，C组为3.33，D组为1.17，E组别为2.67。结果表明，贯众多糖在体内也有抑制补体的作用，且能不同程度地改善内毒素致伤引起缺氧及肺脏的炎症，有缓解ARDS大鼠模型肺损伤趋势。
权利要求
1.贯众总多糖在制备防治急性呼吸窘迫综合征药物中的用途。
2.贯众总多糖在制备防治重症非典型肺炎药物中的用途。
3.贯众总多糖在制备防治人禽流感药物中的用途。
4.贯众总多糖在制备抗补体药物中的用途。
5.按权利要求1或2或3或4的用途，其中所述的贯众总多糖通过下述方法和步骤制备贯众药材以95％乙醇冷浸提取，滤过，药渣于室温下置通风处晾干，然后用热水提取3次，滤过，合并提取液，浓缩，离心，上清液以三氯醋酸去游离蛋白，离心，上清液用水透析3天，透析液浓缩至小体积后加乙醇至含醇量80％，离心，沉淀冷冻干燥即得总多糖提取物，收率5.72％，多糖含量为53.0-58.9％。
6.按权利要求5的用途，其中所述的贯众药材选自狗脊蕨贯众(Woodwardiajaponica)，绵马贯众(Dryopteris crassirhizoma)，荚果蕨贯众(Matteucciastruthiopteris)或东方荚果蕨贯众(M.orientalis)。
全文摘要
本发明属中药领域，涉及贯众总多糖在制备防治急性呼吸窘迫综合征药物中的用途。本发明从中药贯众中分离提取得到总多糖提取物，平均产物收率5.72％，多糖含量为53.0－58.9％。所述总多糖提取物经体外实验证实，对在经典和旁路途径激活所引发的细胞溶血均有抑制，有较强抗补体活性；整体动物模型试验显示，对大鼠急性呼吸窘迫综合征引起的肺损伤有明显的保护作用，证实对急性呼吸窘迫综合征有防治作用。本发明的总多糖提取物可制备防治急性呼吸窘迫综合征药物和防治人禽流感药物。
文档编号A61P31/16GK1994336SQ200610147309
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月14日 优先权日2006年12月14日
发明者陈道峰, 徐晗, 章蕴毅, 周捷, 张建文, 卢燕 申请人:复旦大学