专利名称：一种能增强动物抗体应答的多肽片段及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属免疫学和遗传工程技术领域，具体涉及一种能增强动物抗体应答的多肽片段及其应用。
背景技术：
国际兽医局将口蹄疫列为A类传染病之首。口蹄疫是当今世界上最为严重的家畜传染病，主要危害猪、牛、羊等偶蹄类动物。多年来，口蹄疫在世界范围内大规模爆发和流行，给畜牧业造成巨大经济损失。预防接种是控制该病毒的主要手段。在各种预防口蹄疫的疫苗中，基因工程疫苗由于安全性好，易于保存，效果稳定等优点具有广阔的应用前景。一个基因工程疫苗成败的关键在于其能否引起动物产生足够高的中和抗体应答。现已证明口蹄疫病毒VP1蛋白G-H环是一个重要的诱导中和抗体的抗原位点，涉及130-160位肽段。然而，含有该肽段的融合蛋白却不能诱发动物产生足够高的中和抗体应答。因此，寻求一种能够增强该肽段诱发动物产生中和抗体能力的新型免疫增强佐剂显得尤为必要。
发明内容
本发明的目的在于提出一种能增强动物抗体应答的多肽片段及其应用。
本发明提出的能增强动物抗体应答的多肽片段，是一种能够刺激基因工程疫苗诱发中和抗体应答水平的免疫刺激多肽片段。该免疫刺激片段为口蹄疫病毒VP2蛋白1-33位氨基酸，其氨基酸序列为DKKTEEATLLEDRILTTRNGHTTSTTQSSVGVT(SEQ ID NO.1)，该肽命名为B1，不同型的口蹄疫病毒，该免疫刺激片段有1-3个氨基酸可被置换。
本发明提出的免疫刺激片段，用western blotting和T细胞增殖实验证实该片段含有B细胞表位，具有T细胞刺激功能。该片段的免疫刺激效应主要在于其增强动物体内T细胞应答，进一步促进B细胞成熟于分化，增强了抗体的分泌。
本发明还采用β-半乳糖苷酶作为载体蛋白，将上述免疫刺激肽段连接在该载体蛋白半乳糖苷酶C端，制备得融合蛋白LacZ-B1，该融合蛋白可作为新型口蹄疫基因工程多肽疫苗免疫刺激佐剂。该融合蛋白佐剂安全性好，能有效提高动物抗体应答水平。
图1融合蛋白表达及其免疫原性检测。
A融合蛋白在JM101菌表达SDS-PAGEM蛋白分子量Marker.
1JM101空菌对照2pWR590对照3pWRB1B Western blotting检测融合蛋白免疫原性1-3与上述相同图2采用MTS法测定T细胞增殖。
具体实施例方式
实施例1，以β-半乳糖苷酶为载体蛋白构建免疫刺激蛋白pWRB1表达质粒。其结果如下SDS-PAGE电泳检测证明表达获得的融合蛋白LacZ-B1分子量与预期一致(见图1A)。Western blotting检测证明该LacZ-B1融合蛋白具有很强的抗原性，能与标准抗体发生特异的抗原抗体反应(见图1(B))。
用该融合蛋白免疫豚鼠，检测T细胞增殖。结果证明VP2中1-33肽段能有效地诱导动物T细胞增殖(见图2)。图中的横坐标表示标准抗原稀释倍数X，纵坐标表示刺激指数SI(注本实验采用MTS/PMS法测定T细胞增殖，刺激指数以实验组的OD值与不加抗原的阴性对照组OD之差与不加抗原的阴性对照组OD值的比值)。
用纯化的融合蛋白LacZ-B1配制疫苗，把该疫苗与LacZ-D7疫苗(亚洲I型口蹄疫病毒VP1蛋白133-163肽段连在β-半乳糖苷酶C端所形成的融合蛋白，该融合蛋白免疫豚鼠，能引起豚鼠中和抗体应答见表1)联合两次免疫豚鼠(免疫剂量各组分蛋白单次免疫300μg)，与单独免疫LacZ-D7融合蛋白组相比，前者所引起的中和抗体水平比后者显著提高(见表2)。
表1融合蛋白分别免疫豚鼠中和抗体测定
表2融合蛋白混合在一起免疫豚鼠中和抗体测定
序列表SEQID NO.1DKKTEEATLLEDRILTTRNGHTTSTTQSSVGVT
权利要求
1.一种能增强动物抗体应答的多肽片断，其特征为该多肽片段连在载体蛋白半乳糖苷酶C端，构成一融合蛋白，所述多肽片段为口蹄疫病毒VP2蛋白1-33位氨基酸，其氨基酸序列为DKKTEEATLLEDRILTTRNGHTTSTTQSSVGVT。
2.根据权利要求1所述的多肽片断，其特征在于该多肽片断有1-3个氨基酸可被置换。
3.一种如权利要求1或2所述的多肽片断在制备口蹄疫基因工程多肽疫苗的免疫刺激佐剂中的应用，该佐剂是以β-半乳糖苷酶作为载体蛋白、由所述多肽片断连接在该载体蛋白半乳糖苷酶C端而得到的融合蛋白。
全文摘要
本发明属免疫学与遗传工程技术领域，具体为一种能增强动物抗体应答的多肽片段及其应用。该多肽片断是一种能够刺激基因工程疫苗诱发中和抗体应答水平的免疫刺激多肽片断，具体为口蹄疫病毒VP2蛋白第1－33位氨基酸序列。本发明采用β－半乳糖苷酶作为载体蛋白，将上述免疫刺激肽段连接在该载体蛋白半乳糖苷酶C端，制备得融合蛋白LacZ－B1。该融合蛋白可作为新型口蹄疫基因工程多肽疫苗免疫刺激佐剂。该融合蛋白佐剂安全性好，能有效提高动物抗体应答水平。
文档编号A61P31/00GK1986562SQ20061014725
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月14日 优先权日2006年12月14日
发明者郑兆鑫, 严维耀, 王加龙, 刘明秋, 陈维灶, 韩姬 申请人:复旦大学