专利名称：治疗艾滋病的化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有抗HIV-1活性的化合物，及其药物组合物和用途。
背景技术：
作为趋化因子受体家族一成员的CCR5，其内源性激动剂有RANTES、MIP-1α和MIP-1β，它表达于外周血来源的树突状细胞，T淋巴细胞，单核细胞，巨噬细胞以及参与维持长期炎症反应的免疫细胞和炎症细胞。因此，调节CCR5的功能可能调节T细胞向炎症反应损伤处的募集，从而为治疗炎症反应和自身免疫性疾病提供了一个新的靶点。
尽管已经公布CCR5受体拮抗剂具有潜在的抗HIV-1的活性，但是CCR5受体拮抗剂不一定都有抗HIV-1的活性。据文献报道，国外几个制药公司在CCR5拮抗剂的开发过程中发现，一些化合物可高效地拮抗CCR5受体，但是却不能有效地抵抗病毒进入[参见1.Kim，D.Discovery of human CCR5 antagonists containing hydantoins for the treatment ofHIV-1 infection.Bioorg.Med.Chem.Lett.2001，11，3099；2.Hale，J.1，3，4-Trisubstitutedpyrrolidine CCR5 receptor antagonists.Part 2lead optimization affording selective，orallybioavailable compounds with potent anti-HIV activity.Bioorg Med Chem Lett.2001 Oct22；11(20)2741-5]。还有一些公司的CCR5拮抗剂在发现后，一直未有后续的关于生物活性的报道[参见Wieslaw Kazmierski.Recent Progress in Discovery of Small-MoleculeCCR5 Chemokine Receptor Ligands as HIV-1 Inhibitors.Bioorganic & Medicinal Chemistry11(2003)2663-2676]。
然而，迄今为止还缺乏有效抑制HIV病毒生长的化合物。因此，本领域迫切需要开发有效抑制或抵抗HIV病毒(如HIV-1病毒)的化合物。
发明内容
本发明的目的就是提供一类可显著抑制HIV病毒(如HIV-1病毒)的化合物及其制法和用途。
在本发明的第一方面，提供了一种通式(I)所示的化合物，或其药学上可接受的盐，
式中，R1为未取代的或被1-3个取代基取代的下列基团苄基、苯甲酰基、环己基甲酰基、环戊基甲酰基、苯磺酰基、或萘甲酰基，所述的取代基选自卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基；R3为氢、C1-C4烷基，苯基或 所述基团中苯环可被1-3个选自下组的取代基取代卤素和C1-C4烷基；R6为对硝基苄氧羰基、苄氧羰基、对卤素苄氧羰基、对甲氧基苄氧羰基、对甲基苄氧羰基、对三氟甲基苄氧羰基、N-苯基甲酰胺基、苯氧乙酰基、3，4-二氧亚甲基苄氧羰基、对氨基苄氧羰基、苯磺酰基、对甲基苯磺酰基。
在另一优选例中，所述的化合物选自下组烯丙基-{1-[1-苄基-4-羟基-4-(4-氟)苯吡咯-3-亚甲基]哌啶-4-位}甲酰胺-4-硝基苄酯；烯丙基-[1-(1-苄基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯；烯丙基-[1-(1-苯甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯；烯丙基-[1-[1-(2-碘)苯甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基]哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯；烯丙基-[1-(1-萘甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯；烯丙基-[1-(1-环戊基甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯；烯丙基-[1-(1-环己基甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯；烯丙基-[1-(1-环戊基甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺苄酯；烯丙基-[1-(1-环戊基甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-甲氧基苄酯；烯丙基-[1-(1-环戊基甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-溴苄酯；烯丙基-[1-(1-环戊基甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]-3-苯基脲；烯丙基-[1-(1-环戊基甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]乙酰胺苯醚。
在另一优选例中，所述的化合物具有以下结构式(II)所示结构 式中，R1为未取代的或被1-3个取代基取代的下列基团苄基、苯甲酰基、环己基甲酰基、环戊基甲酰基、苯磺酰基、或萘甲酰基，所述的取代基选自卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基；
R6为对硝基苄氧羰基、苄氧羰基、对卤素苄氧羰基、对甲氧基苄氧羰基、对甲基苄氧羰基、对三氟甲基苄氧羰基、N-苯基甲酰胺基、苯氧乙酰基、3，4-二氧亚甲基苄氧羰基、对氨基苄氧羰基、苯磺酰基、对甲基苯磺酰基。
在另一优选例中，所述的化合物选自下组烯丙基-[1-((3R，4S)-1-(环戊基甲酰基)-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯；烯丙基-[1-((3S，4R)-1-(环戊基甲酰基)-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯；烯丙基-[1-((3S，4R)-1-(环戊基甲酰基)-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-苄酯；烯丙基-[1-((3S，4R)-1-(环戊基甲酰基)-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-甲氧基苄酯；烯丙基-[1-((3S，4R)-1-(环戊基甲酰基)-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-溴苄酯。
在另一优选例中，所述化合物是TD0232，它具有以下结构式(III)所示结构 在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量(如0.0001-99.99wt％，更佳地0.01-99wt％)本发明上述的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分，以及药学上可接受的载体。
在本发明的第三方面，提供了本发明上述化合物的用途，它们被用于制备抗HIV病毒的药物。
本发明化合物还可用于选自下组的药物(a)抑制HIV病毒感染人的外周血单核细胞的药物；(b)抑制RANTES与CCR5的结合的药物；(c)抑制RANTES、MIP-1α或MIP-1β引起的GTPγS与CCR5细胞膜的结合的药物；(d)抑制RANTES引起的CCR5细胞内钙释放的药物；(e)抑制RANTES引起的CCR5细胞趋化运动的药物。
在另一优选例中，所述的HIV病毒是HIV-1病毒。
在另一优选例中，所述的HIV-1病毒是A、B、C或O亚型或多重耐药的HIV病毒株。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，合成了一类高效的CCR5受体拮抗剂。在证明了该类拮抗剂的CCR5拮抗作用后，又深入研究了其抗病毒活性，意外地发现式(I)、(II)或(III)所示的CCR5拮抗剂在体外实验中可非常显著抵抗HIV-1病毒的进入，而且这些化合物不仅对多种病毒亚型均有效，而且还可作用于对多种临床药物耐药的多重耐药病毒株。
本文所用的术语“烷基”指直链或支链饱和的、含有1-8个碳原子(较佳地1-6个碳原子)的脂族烃类基团；“链烯基”包括含有至少一个碳碳双键和2-8个碳原子(较佳地2-6个碳原子)的直链和支链烃基；“炔基”包括含有至少一个碳碳三键和2-8个碳原子(较佳地2-6个碳原子)的直链和支链烃基。
本文所用的术语“芳基”指芳族体系，可以是单环或原本稠合的或连接在一起的多芳环，从而使至少一部分稠合或连接的环形成共轭的芳系。芳基基团包括(但不限制于)苯基、萘基、四氢萘基。
本文所用的术语“杂环”指稳定的4-7元单环或稳定的多环杂环，该杂环可以是饱和的、部分不饱和的或不饱和的，且由碳原子和选自以下的1-4个杂原子构成N、O和S原子。N和S原子可以被氧化。杂环还可包括任何多环，其中任一上述杂环可稠合于芳环。
术语“取代的芳基”或“取代的杂环”指被1-4个选自下组的基团所取代的芳基或杂环卤素、CN、OH、NO2、氨基、烷基、环烷基、链烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、取代的烷氧基、烷基羰基、烷基羧基、烷基氨基或芳硫基。较佳地，取代基是卤素、C1-C4烷基。
“卤素”指F、Cl、Br、或I。
本发明的化合物可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下无机酸形成的盐如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、以及与有机酸形成的盐，而有机酸则指乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸和马来酸。其他盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式(当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分)。
本发明还包括药物组合物以及治疗方法，它包括给哺乳动物施用药物有效量的式I化合物。本发明的化合物可用于治疗HIV感染、哮喘和局部紊乱(如局部性皮炎、局部过敏)、风湿性关节炎、动脉硬化、牛皮癣、肉状瘤症和其它纤维化疾病、自身免疫性疾病(如多发性硬化症、炎症性肠炎)、慢性梗阻性肺病(COPD)。
当化合物用于上述用途时，它们可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，而且可以用如下形式口服给药片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含有如约0.05-5％悬浮剂)、糖浆(含有如约10-50％糖)、和酏剂(含有约20-50％乙醇)，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式(在等渗介质中含有约0.05-5％悬浮剂)进行非肠胃给药。例如，这些药物制剂可含有与载体混合的约25-90％，通常约为25-60％(重量)的活性成分。
所用的活性成分的有效剂量可随所用的化合物、给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明的化合物每天以约0.5-500mg/kg动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以2-4次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为1-100mg，较佳地约为2-80mg。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受的载体密切混合的约0.5-500mg的活性化合物。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
这些活性化合物可通过口服以及静脉内、肌内或皮下等途径给药。固态载体包括淀粉、乳糖、磷酸二钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体包括无菌水、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合活性成分的特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、BHT和BHA。
从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。化合物的口服给药是优选的。
这些活性化合物也可肠胃外或腹腔内给药。也可在适当混合有表面活性剂(如羟丙基纤维素)的水中制备这些活性化合物(作为游离碱或药学上可接受的盐)的溶液或悬浮液。还可在甘油、液体、聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散液。在常规储存和使用条件下，这些制剂中含有防腐剂以防止微生物的生长。
适应于注射的药物形式包括无菌水溶液或分散液和无菌粉(用于临时制备无菌注射溶液或分散液)。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器排出流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生物(如细菌和真菌)的污染影响。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有如水、醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、它们的适当混合物和植物油。
本发明人针对包括式(I)化合物在内的众多化合物进行了深入的抗HIV-1活性研究，发现一些优选的具有抗HIV-1活性的化合物，尤其是式(I)、(II)和(III)所示的化合物。
一种特别优选的化合物是烯丙基-[1-((3S，4R)-1-(环戊基甲酰基)-4-羟基-4-苯基吡咯烷-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯(下文简称TD0232)或其药学上可接受的盐。TD0232是CCR5特异性的拮抗剂，同时在体外实验中还表现出高效的抗R5嗜性HIV-1的生物活性。
试验研究结果显示，TD0232可显著地抑制不同的HIV-1病毒株感染人的外周血单核细胞(PBMC)，证明了此化合物在体外具有高效的抗HIV-1作用。在对三种R5嗜性的B亚型HIV-1病毒株的测试中，TD0232都明显抑制了HIV-1对人PBMC细胞的感染，其IC50值的范围在2.6nM到18.1nM之间，与以前报道过的一种CCR5的特异性拮抗剂SCH-C相比，TD0232在所测试的病毒株上至少有与之相当的抗病毒活性，在某些病毒株上甚至优于SCH-C。
为进一步确证TD0232的抗病毒活性，用来源于三个不同个体的PBMC细胞进行了抗病毒试验，结果证明TD0232确实有抗HIV-1病毒的活性。同时，对于利用另一个共受体CXCR4的HIV-1病毒株(即X4嗜性的病毒株)，HIV-1NL4-3，TD0232不能有效抑制其对人PBMC细胞的感染，说明TD0232可特异性地拮抗R5嗜性HIV-1病毒株。
为进一步确证TD0232是一种R5特异性的进入抑制剂，本发明人利用表达CCR5或CXCR4受体的U87.CD4细胞对TD0232进行了病毒进入实验。研究结果再一次表明，TD0232对于R5嗜性的B亚型毒株JR-FL和ADA具有进入抑制作用，而对作为对照的X4嗜性的B亚型毒株HXB2或amphotropic AmLV则不具有进入抑制作用。这一结果确证了该药物的抑制作用发生在病毒的进入阶段，并从机理上验证了TD0232作用的特异性。
在对多种亚型(A，B，C和O亚型)的HIV-1病毒株的抗病毒实验中，TD0232都显著地抑制了病毒对人PBMC细胞的感染，证明了TD0232对R5嗜性的HIV-1抗病毒谱广，具有广泛的抗多种亚型(A、B、C和O亚型)的R5嗜性HIV-1病毒株的活性。
针对目前抗艾滋病药物在临床上出现的耐药现象，本发明人选用了一种B亚型的HIV-1多重耐药株J18进行抗病毒实验，此病毒株对目前临床上广泛使用的多种抗病毒药物耐药。结果显示，TD0232可高效抑制J18病毒株对人PBMC细胞的感染，说明TD0232具有抗R5嗜性的多重耐药病毒株的能力。
本发明人还发现，TD0232的细胞毒性小，MTT实验结果表明，TD0232对CHO/CCR5、Jurkat和人的肝细胞L02的细胞毒性的半数致死量(CC50)均大于10μM。
本发明的化合物可用下列所示流程进行制备流程Iβ-丙胺酸化合物1在甲醇和二氯亚砜中回流上甲酯，再用两分子苄溴在碳酸钾作碱乙腈中保护氨基得化合物2。保护的β-丙氨酸酯2与酮酸酯3进行Aldol缩合得到两组对映异构体4。
得到的缩合产物催化氢化掉一个苄基后关五元内酰胺环得到两组顺反异构体5。接下来用强碱(氢氧化钠或氢氧化钾)皂化分子中的甲酯为反式酸6。
酸6在缩合试剂存在下与水合哌啶酮盐酸盐缩合得酮化合物7，锂铝氢还原得醇化合物8，Swern氧化醇为酮化合物9，再与丙烯胺在醋酸钠硼氢存在下缩合得化合物10，最后与R6Cl反应得到化合物11。
流程II流程I中得到的化合物8用乙酯保护得化合物12，催化氢化掉分子中的苄基，得到化合物13，再与R1Cl反应得化合物14，化合物14在碳酸钾甲醇中脱去仲醇上的保护基得到化合物15，Swern氧化仲醇为酮16，再与丙烯胺在醋酸钠硼氢存在下缩合得化合物17，最后与R6Cl反应得到化合物18。
流程III 流程IV当R1为环戊基甲酰基时， 流程V当R1为环戊基甲酰基时，
流程VI当R1为环戊基甲酰基时， 本发明的主要优点在于(a)本发明化合物可有效地抑制HIV病毒感染和进入人体细胞。
(b)本发明化合物对于多种亚型和多重耐药株有效。
(c)本发明化合物的毒副作用小。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1化合物III-a-a烯丙基-[1-(1-苄基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯N，N-二苄基β-丙氨酸甲酯按照流程I，冰浴下将SOCl2(10ml)滴入β-丙氨酸盐酸盐(7.05g)的甲醇(40ml)溶液后升温回流3h，冷却后旋干溶剂，抽干，加入K2CO3(38g)和150ml乙氰溶液搅拌，加入22ml苄溴室温搅拌20h，加水把碳酸钾溶解，乙酸乙酯萃取两次，食盐水洗，Na2SO4干燥，过滤浓缩，柱层析，得到N，N-二苄基β-丙氨酸甲酯(14.9g)，收率93.6％。
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.27(m，10H)，3.56(s，3H)，3.51(s，4H)，2.74(t，J＝6.9Hz，2H)，2.45(t，2H).
4-苯-1-苄基-4-羟基-5-氧基吡咯-3-羧酸先将反应体系无水操作，氮气保护下0℃向1.09ml(iPr)2NH的7ml THF溶液中滴加4.5ml 1.6M的丁基锂正己烷溶液，搅拌10min冷至-78℃，滴加N，N-二苄基β-丙氨酸甲酯(1.00g，3.53mmol)的40ml THF溶液后搅拌1h，再滴加反应物苯乙酮酸乙酯的5ml THF溶液，-78℃反应4h。用饱和NH4Cl水溶液淬灭，用(60×2)乙酸乙酯萃取，水洗，食盐水洗，Na2SO4干燥，过滤浓缩后柱层析，用(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶13)过柱得一固体化合物(0.654g)和一液体化合物(0.653g)，总收率73.3％。液体化合物(3.197g)溶于250ml MeOH中，加入0.32g Pd/C，室温一个气压氢气下反应3h，过滤，旋干甲醇，先用(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶4)过下未反应的原料1.065g，再用(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶2)过柱得到白色固体0.935g，转化率59.8％。
向上面得到的甲酯化合物的甲醇溶液中加入1.4当量1N的NaOH水溶液，室温反应到原料消失，旋干甲醇，加水用1N的HCl水溶液中和至pH＝3，用乙酸乙酯萃取两次，水洗，食盐水洗至中性，Na2SO4干燥，过滤浓缩得到固体化合物。
IR(KBr)3267，2887，1713，1688，1501，1487，1254，1299cm-1；1H NMR(DMSO d6，300MHz)δ12.45(s，1H)7.41-7.30(m，5H)，6.94-6.86(m，3H)，6.44(s，1H)，4.46(d，JAB＝15.3Hz，1H)，4.44(d，JAB＝15.0Hz，1H)，3.58(m，1H)，3.37(m，2H)。
烯丙基-[1-(1-苄基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯将前述获得的4-苯-1-苄基-4-羟基-5-氧基吡咯-3-羧酸中间体与DCC(1.1eq)和HOSu(1.1eq)溶于四氢呋喃中，室温反应6小时后过滤，加入三乙胺(2.0eq)和水合哌啶酮盐酸盐(1.1eq)并搅拌过夜。旋干四氢呋喃后加水和乙酸乙酯震荡分液，有机相用食盐水洗后干燥，过滤并旋干溶剂得到白色固体。
将固体溶于四氢呋喃中并加入锂铝氢(8eq)，升温回流24小时后用10％氢氧化钠淬灭，过滤并旋干溶剂得到固体泡沫仲醇化合物。
-78℃下，草酰氯(1.3eq)的二氯甲烷溶液滴加到二甲亚砜的二氯甲烷溶液中并搅拌10分钟，将上面的白色泡沫化合物(1eq)的二氯甲烷溶液加入上述体系中反应30分钟后加入三乙胺(3eq)并升温到室温，加水和乙酸乙酯震荡分液，有机相用食盐水洗后干燥，柱层析得到酮化合物。
向上面的酮化合物(1eq)和NaBH(OAc)3(1.5eq)的混合物中加入1，2-二氯乙烷，再向体系中加入烯丙胺(1eq)和醋酸(1eq)，反应过夜后加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取两次后合并有机相，食盐水洗后干燥，过滤旋干溶剂得到白色泡沫化合物。
将上面的固体泡沫溶于二氯甲烷，加入三乙胺(1.5eq)和对硝基苯氧羰基氯(1.2eq)并室温反应4小时，水洗分液后干燥，柱层析后得到化合物III-a-a。
IR(kBr)2938，2806，1751，1710，1608，1523，1496，1448，1378，1348，1261cm-1；
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ8.27-8.22(m，2H)，7.55-7.25(m，12H)，5.97-5.82(m，1H)，5.36-5.07(m，4H)，4.39(m，1H)，3.68(m，2H)，3.25(m，2H)，2.80-2.22(m，6H)，1.79(m，4H)；ESI-MS m/z 585(M++1)；HRMS计算值C34H41N4O5(M++1)585.3071，测量值585.3070.
实施例2 化合物III-a-b烯丙基-[1-(1-苯甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯按照流程II，将制备化合物III-a-a时得到的中间体仲醇化合物(1eq)溶于二氯甲烷中，向体系中加入催化量的DMAP(0.1eq)，三乙胺(5.0eq)和醋干(3.0eq)，零度反应2小时后加水震荡分液，有机相用食盐水洗并干燥，柱层析后得到固体泡沫。
上面的固体泡沫溶于甲醇中，加入5％的Pd/C在一大气压氢气下氢化过夜，滤除催化剂并旋干溶剂得到泡沫化合物。产物溶于二氯甲烷中并加入三乙胺(1.5eq)和苯甲酰氯(1.2eq)搅拌2小时，水洗并干燥后柱层析得到泡沫化合物。
得到的化合物(1eq)溶于甲醇∶水为5∶1溶剂中，加入碳酸钾(2.0eq)并搅拌4小时后旋干甲醇，用乙酸乙酯萃取两次后合并有机相，食盐水洗，干燥后过滤并旋干溶剂得到白色泡沫化合物。
-78℃下，草酰氯(1.3eq)的二氯甲烷溶液滴加到二甲亚砜的二氯甲烷溶液中并搅拌10分钟，将上面的白色泡沫化合物(1eq)的二氯甲烷溶液加入上述体系中反应30分钟后加入三乙胺(3eq)并升温到室温，加水和乙酸乙酯震荡分液，有机相用食盐水洗后干燥，柱层析得到酮化合物。
向上面的酮化合物(1eq)和NaBH(OAc)3(1.5eq)的混合物中加入1，2-二氯乙烷，再向体系中加入烯丙胺(1eq)和醋酸(1eq)，反应过夜后加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取两次后合并有机相，食盐水洗后干燥，过滤旋干溶剂得到白色泡沫化合物。
上面得到的泡沫化合物(1eq)溶于二氯甲烷中，加入三乙胺(2eq)和对硝基苄氧羰基氯(1.5eq)后搅拌2小时。加水和乙酸乙酯震荡后分液，有机相用食盐水洗后干燥，过滤后柱层析得到化合物III-a-b。
IR(KBr)3375，3063，2943，1701，1627，1608，1577，1522，1496，1421，1346，1250cm-1；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ8.24-8.19(m，2H)，7.61-7.21(m，12H)，5.82-5.77(m，1H)，5.22-5.11(m，4H)，4.14-3.61(m，8H)，3.17-3.07(m，1H)，2.98-2.40(m，4H)，2.20(m，1H)，1.82-1.50(m，4H)；ESI-MS m/z 599(M++1)；HRMS计算值C34H39N4O6(M++1)599.2864，测量值599.2879。
实施例3化合物III-a-c烯丙基-[1-[1-(2-碘)苯甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基]哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯按照制备化合物III-a-b相同的方法，将苯甲酰氯换成邻碘苯甲酰氯即可以得到化合物III-a-c。
IR(KBr)3375，2941，1701，1637，1522，1467，1421，1345，1249cm-1；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ8.24-8.20(m，2H)，7.86-7.80(m，1H)，7.55-7.06(m，10H)，5.95-5.76(m，1H)，5.23-5.12(m，4H)，4.16-4.04(m，2H)，3.96-3.85(m，3H)，3.70-3.13(m，3H)，3.03(m，1H)，2.80(m，2H)，2.57(m，1H)，2.18-2.02(m，2H)，1.87-1.64(m，4H)；ESI-MS m/z 725(M++1)；HRMS计算值C34H38N4O6I(M++1)725.1831，测量值725.1833。
实施例4III-a-d烯丙基-[1-(1-萘甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯按照制备化合物III-a-b相同的方法，将苯甲酰氯换成1-萘甲酰氯即可以得到化合物III-a-d。
IR(KBr)3381，3060，2943，1701，1633，1522，1465，1428，1384，1346，1249cm-1；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ8.23-8.18(m，2H)，7.96-7.82(m，3H)，7.58-7.21(m，11H)，5.95-5.76(m，1H)，5.21-5.11(m，4H)，4.20-3.96(m，3H)，3.94-3.58(m，3H)，3.52-3.21(m，2H)，3.10(m，1H)，2.82-2.52(m，4H)，2.25-2.06(m，1H)，1.74-1.39(m，4H)；ESI-MS m/z 649(M++1)；HRMS计算值C38H41N4O6(M++1)649.3021，测量值649.3016。
实施例5III-a-e烯丙基-[1-(1-环戊基甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯按照制备化合物III-a-b相同的方法，将苯甲酰氯换成环戊基甲酰氯即可以得到化合物III-a-eIR(KBr)3375，2948，1700，1637，1523，1467，1345，1249cm-1；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ8.23(d，2H)，7.54-7.23(m，8H)，5.83-5.77(m，1H)，5.23-5.12(m，4H)，4.10-3.67(m，7H)，3.58-3.40(m，1H)，3.06-2.60(m，4H)，2.59-2.40(m，1H)，2.14-2.03(m，1H)，2.00-1.48(m，13H)；ESI-MS m/z 591(M++1)；HRMS计算值C33H43N4O6(M++1)591.3177，测量值591.3168。
实施例6化合物III-a-f烯丙基-[1-(1-环己基甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯按照制备化合物III-a-b相同的方法，将苯甲酰氯换成环己基甲酰氯即可以得到化合物III-a-f。
IR(KBr)3375，2933，2855，1701，1638，1523，1450，1346，1250cm-1；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ8.22(d，J＝7.8Hz)，7.60-7.52(m，3H)，7.42-7.11(m，4H)，5.92-5.76(m，1H)，5.22(s，2H)，5.16-5.10(m，2H)，4.15-3.62(m，7H)，3.58-3.37(m，1H)，3.11-2.60(m，4H)，2.58-2.00(m，2H)，2.00-1.44(m，15H)；ESI-MS m/z 605(M++1)；HRMS计算值C34H45N4O6(M++1)605.3334，测量值605.3333.
实施例7化合物III-a-g烯丙基-{1-[1-苄基-4-羟基-4-(4-氟)苯吡咯-3-亚甲基]哌啶-4-位}甲酰胺-4-硝基苄酯按照制备化合物III-a-a相同的方法，将中间体4-苯基-1-苄基-4-羟基-5-氧基吡咯-3-羧酸换成4-(4-氟)苯基-1-苄基-4-羟基-5-氧基吡咯-3-羧酸即可以得到化合物III-a-g。
IR(KBr)1H NMR(CDCl3，300MHz)δ8.21(m，2H)，7.64-7.47(m，3H)，7.40-7.20(m，6H)，7.05-6.96(m，2H)，5.89(m，1H)，5.18-5.06(m，4H)，3.68(m，3H)，3.28-3.21(m，3H)，2.95(d，1H)，2.86-2.74(m，3H)，2.60(m，1H)，2.53-2.25(m，5H)，1.85-1.75(m，4H).
ESI-MS m/z(M++1)603；HRMS计算值C34H39N4O5F(M++1)625.2797，测量值625.2808。
实施例8化合物III-a-h按照制备化合物III-a-e相同的方法，将对硝基苄氧羰基氯换为苄氧羰基氯，得到化合物III-a-h1H NMR(CDCl3，300MHz)7.52-7.26(m，10H)，5.85-5.77(m，1H)，5.21-5.08(m，4H)，4.05-3.88(m，1H)3.87-3.64(m，6H)，3.01-2.39(m，7H)，2.38-2.14(m，1H)，1.87-1.48(m，12H)；ESI-MS m/z 546.4(M++1)；实施例9化合物III-a-i按照制备化合物III-a-e相同的方法，将对硝基苄氧羰基氯换为对甲氧基苄氧羰基氯，得到化合物III-a-i1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.52-7.24(m，7H)，6.95-6.82(d，2H)，5.92-5.68(m，1H)，5.26-5.02(m，4H)，4.21-3.63(m，10H)，3.22-2.34(m，7H)，2.02-1.51(m，13H)；实施例10化合物III-a-j按照制备化合物III-a-e相同的方法，将对硝基苄氧羰基氯换为对溴苄氧羰基氯，得到化合物III-a-j1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.55-7.15(m，9H)，5.86-5.67(m，1H)，5.30-5.00(m，4H)，4.17-3.62(m，7H)，3.06-2.35(m，6H)，2.22-2.02(m，2H)，1.86-1.53(m，12H)；实施例11化合物III-a-k按照制备化合物III-a-e相同的方法，将对硝基苄氧羰基氯换为苯基异氰酸脂，得到化合物III-a-k1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.58-7.26(m，8H)，7.08-6.98(m，2H)，6.60-6.52(d，1H)，6.00-5.86(m，1H)，5.48-5.32(m，2H)，4.44-4.32(m，1H)，3.91-3.50(m，5H)，3.11-2.02(m，9H)，1.96-1.49(m，12H)；ESI-MS m/z 531(M++1)；实施例12化合物III-a-l按照制备化合物III-a-e相同的方法，将对硝基苄氧羰基氯换为苯氧乙酰氯，得到化合物III-a-l1H NMR(CDCl3，300MHz)7.52-7.26(m，7H)，7.00-6.89(m，3H)5.86-5.77(m，1H)，5.30-5.21(m，2H)，4.70-4.66(d，2H)，4.58-4.40(m，1H)，4.00-3.69(m，6H)，3.02-2.38(m，6H)，2.38-2.05(m，2H)，1.87-1.45(m，12H)；ESI-MS m/z 546.5(M++1)；上述实施例所制备的各化合物总结于表1中表1化合物
实施例13旋光异构化合物的制备参见流程III。
化合物19往苯甲酰甲酸乙酯中加入2N的NaOH和等体积的THF，室温下搅拌反应4小时；点板；反应完全后加盐酸淬灭；旋干THF；乙酸乙酯萃取；洗涤；干燥。得到无色粘稠固体，即化合物19。
化合物20
将原料丙烯酸甲酯溶解在适量的甲醇中，搅拌下加入1.2当量的(R)-α-甲基苄胺，反应体系在常温下搅拌20小时，减压(0.1Mpa，＜60℃)蒸去甲醇，得淡黄色粘稠状产物，即化合物20。无需进一步提纯即可直接向下做反应。
化合物21将化合物19和化合物20按等当量混合溶解在适量的二氯甲烷中，冰浴下依次往里加入HOBt和DCC，反应体系自然升至室温反应两天。过滤，依次用水、饱和食盐水洗涤，旋干溶剂后用乙酸乙酯重结晶得到淡黄色固体，即化合物21。
化合物22无水无氧条件下，将化合物21溶解在适量的无水四氢呋喃中，-78℃下缓慢滴加1.2当量的LDA，在该温度下反应8小时；点板跟踪；反应完后用乙酸淬灭；旋干；二氯甲烷萃取；干燥；浓缩即得化合物22。
拆分方法趁热向所得的浓缩液中加入适量的乙酸乙酯混合搅拌后静置析晶至少12小时，过滤，60℃烘干即得一白色晶体，经单晶X-射线衍射证实为具有绝对构型的单一化合物22″。
上述的母液继续二次结晶12小时又可得到另一淡黄色的晶体，经旋光测定后与上述的化合物4”的旋光度对比，确定为化合物4”的对映异构体，定为化合物22′。
化合物23将14g化合物22”溶解在适量的甲醇中，强烈搅拌下加入2当量的2N的NaOH溶液，反应体系在室温下搅拌6小时，加入水稀释后，减压(0.1Mpa，＜60℃)下蒸去甲醇，用3N的盐酸(36.5％的盐酸配制)调节体系到酸性(pH＝4)，过滤得粗产物。粗品中再加入适量的乙酸乙酯和石油醚，加热到50℃搅拌数小时，趁热过滤得到白色滤饼，烘干后得到白色粉末12g，即化合物23”。产率87％。
化合物24将化合物23”(12g)和HOSu(5.1g)溶解在干燥的THF中，冰浴将体系的温度冷却到0℃，然后往反应体系中缓慢加入DCC(9.12g)的无水THF溶液搅拌1小时后，慢慢升至室温，在室温下再搅拌约24小时。过滤，滤饼用干的THF快速洗涤，合并滤液，并向滤液中加入3当量的三乙胺(15mL)，将反应体系降温到0℃，再向反应体系中缓慢加入1.1当量的哌啶酮的盐酸盐(6.24g)，约30分钟加毕，慢慢升到室温，搅拌20小时后，过滤，旋干滤液，得到的固体中加入50mL乙酸乙酯和20mL水萃取，食盐水洗涤，干燥浓缩后静置数小时，过滤，50℃常压烘干得到白色粉末11g，即化合物24，产率73.3％。
化合物25向反应瓶中分别加入2g四氢铝锂和适量的THF，冰浴中冷却至0℃。然后将化合物24(10g)溶解在适量的四氢呋喃中，将该溶液均分成两份后分别缓慢滴加到上述的反应瓶中，约1小时左右滴毕。反应体系慢慢升温至四氢呋喃开始回流，并保持回流状态72小时，再次将反应体系冷却到0℃，分别向每个反应瓶中依次缓慢滴加约2mL水，2mL15％的NaOH溶液和2mL水，常温搅拌约过夜，过滤。滤饼用四氢呋喃洗涤，合并有机相，浓缩得无色粘稠状液体9.38g，即化合物25，粗品收率100％。该化合物不用进一步纯化可直接用于下一步反应。
化合物26将得到的中间体仲醇化合物25(1eq)溶于适量的二氯甲烷中，向体系中加入催化量的DMAP(0.1eq)，三乙胺(5.0eq)和醋干(3.0eq)，在0℃下反应2h后加水震荡分液，有机相用食盐水洗并干燥，柱层析后得到固体泡沫，即化合物26。
化合物27将上面的固体泡沫化合物26溶于适量的甲醇中，加入5％的Pd/C在一大气压氢气下氢化过夜，滤除催化剂并旋干溶剂得到无色泡沫化合物，即化合物27。
化合物28上述化合物27溶于二氯甲烷中并加入三乙胺(1.5eq)和环戊甲酰氯(1.2eq)搅拌4h，水洗并干燥后柱层析得到淡黄色泡沫化合物，即化合物28。
化合物29将得到的上述化合物28(1eq)溶于甲醇∶水＝5∶1溶剂中，加入碳酸钾(2.0eq)并搅拌4h后旋干甲醇，用乙酸乙酯萃取两次后合并有机相，食盐水洗，干燥后过滤并旋干溶剂得到白色泡沫化合物，即化合物29。
化合物30-78℃下，草酰氯(1.3eq)的二氯甲烷溶液滴加到二甲亚砜的二氯甲烷溶液中并搅拌10分钟，将上面的白色泡沫化合物29(1eq)的二氯甲烷溶液加入上述体系中反应30分钟后加入三乙胺(3eq)并升温到室温继续搅拌20分钟，加水和乙酸乙酯震荡分液，有机相用食盐水洗后干燥，柱层析得到酮化合物，即化合物30。
化合物31向上面的酮化合物30(1eq)和NaBH(OAc)3(1.5eq)的混合物中加入1，2-二氯乙烷，再向体系中加入烯丙胺(1eq)和醋酸钠硼氢(1eq)，反应过夜后加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取两次后合并有机相，食盐水洗后干燥，过滤旋干溶剂得到白色泡沫化合物，即化合物31。
化合物32上面得到的泡沫化合物31(1eq)溶于二氯甲烷中，加入三乙胺(2eq)和对硝基苄氧羰基氯(1.5eq)后搅拌4小时。加水和乙酸乙酯震荡后分液，有机相用食盐水洗后干燥，过滤后柱层析得到化合物32，即TD0232，淡黄色泡沫。TD0232结构表征IR(KBr)3375，2948，1700，1637，1523，1467，1345，1249cm-1；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ8.23-8.20(d，2H)，7.52-7.27(m，8H)，5.85-5.77(m，1H)，5.22-5.11(m，4H)，4.04-3.66(m，8H)，3.06-2.83(m，1H)，2.82-2.60(m，3H)，2.59-2.40(m，2H)，2.30-2.03(m，2H)，2.00-1.48(m，13H)；13C NMR(CDCl3，300MHz)δ175.3，175.1，147.5，144.1，143.4，128.4，128.3，128.0，127.3，127.2，125.1，125.0，123.7，82.1，65.6，61.3，55.8，55.4，55.2，54.6，54.0，47.7，46.3，44.3，42.7，42.5，29.9，29.7，26.1，26.0；ESI-MS m/z 591(M++1)；HRMS计算值C33H43N4O6(M++1)591.3177，测量值591.3168。
其绝对构型通过中间体化合物29的单晶X-射线衍射谱图得到间接证实。
按照流程III的方法，同样制备获得TD0231，其合成路线从拆分后同TD0232。
按照流程IV，将化合物31溶解在CH2Cl2∶H2O＝1∶1的溶液中，冷至0℃，1.2eq的NaOH缓慢加入，然后开始滴加苄氧羰基氯。用1N的NaOH小心维持pH＝10，搅拌2小时。用水稀释，二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，柱层析得到白色固体，命名为化合物TD02371H NMR(CDCl3，300MHz)7.52-7.26(m，10H)，5.85-5.77(m，1H)，5.21-5.08(m，4H)，4.05-3.88(m，1H)3.87-3.64(m，6H)，3.01-2.39(m，7H)，2.38-2.14(m，1H)，1.87-1.48(m，12H)；ESI-MS m/z 546.4(M++1).
按照流程V，固体光气溶解在无水乙醚中，N2保护，冰盐浴下滴加对溴苄醇和N，N-二甲基苯胺的无水乙醚溶液，搅拌1小时，过滤，低温浓缩，乙醚洗涤，再低温浓缩得到白色晶体。
将化合物31溶解在二氯甲烷中，加入催化量的DMAP和1.5eq的三乙胺，冰浴中，N2保护下滴加上述白色晶体的二氯甲烷溶液。自然升至室温反应过夜。加水淬灭，二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析得到白色的固体TD02451H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.55-7.15(m，9H)，5.86-5.67(m，1H)，5.30-5.00(m，4H)，4.17-3.62(m，7H)，3.06-2.35(m，6H)，2.22-2.02(m，2H)，1.86-1.53(m，12H)按照流程VI，实验操作同化合物TD0245，获得化合物TD02401H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.52-7.24(m，7H)，6.95-6.82(d，2H)，5.92-5.68(m，1H)，5.26-5.02(m，4H)，4.21-3.63(m，10H)，3.22-2.34(m，7H)，2.02-1.51(m，13H)；表2上述实施例所制备的各旋光异构化合物
实施例14各化合物的体外抗HIV-1活性研究1.试验材料细胞人PBMC细胞，购自武汉市中心血站，分别来自3个健康人。
HIV-1毒株HIV-1JR-FL、HIV-120678和HIV-1NL4-3，购自NIH AIDS Research andReference Reagent Program，HIV-1HNz2购自武汉大学现代病毒研究中心。
P24试剂盒HIV-1 p24 Antigen EIA，购自Beckman Coulter公司。
用RPMI1640配制不同浓度的溶液。将TD0232按照所需的浓度制备，分别为600nM、200nM、66.7nM、22.2nM、7.4nM、2.5nM、0.8nM。
病毒的稀释用于药物体外抑制实验的病毒株，一般选用100TCID50/孔。用培养液稀释成100TCID50/50ul/孔。
提前两天从人血中制备PBMC(外周血单核细胞)，并在含PHA和IL-2的培养基中培养。
实验当天1.提取PBMC并以105个细胞每孔置于96孔板培养，每孔100ul.
2.梯度稀释药物3.每孔加入50ul的(已稀释)药物4.每孔加入病毒50ul，终浓度100TCID50每孔.
第一天1.用普通培养基清洗被感染细胞三次；
2.最后一次清洗后，加入新配的含药物生长培养基200ul；第七天收集病毒上清，进行p24检测结果可根据p24检测结果，利用计算公式计算出该药物抑制病毒率。
公式药物抑制率＝((对照孔-检测孔)/对照孔)×100％结果显示，化合物TD0232与阳性对照药SHC-C均可明显抑制三种B亚型R5嗜性HIV-1毒株对人PBMC的感染，TD0232的IC50值范围在2.6nM到18.1nM之间，其抗病毒活性稍好于阳性对照药SHC-C。在三个不同个体的PBMC细胞上进一步验证TD0232的抗病毒活性，结果显示TD0232可在体外显著抵抗HIV-1对PBMC细胞的感染。在对B亚型X4嗜性HIV-1毒株NL4-3的实验中，TD0232与阳性对照药SHC-C都没有表现出明显的抗病毒作用，说明TD0232具有特异性的抗R5嗜性HIV-1的活性。结果见表3。
表3.各化合物及SCH-C抑制B亚型R5嗜性HIV-1病毒株在人PBMC中复制的IC50(IC90)及对PBMC的CC50值
实施例15TD0232体外抗HIV-1作用的特异性研究1.实验材料细胞表达CCR5或CXCR4受体的U87.CD4细胞，购自NIH AIDS Research andReference Reagent Program。
毒株HIV-1JR-FL、HIV-1ADA、HIV-1HXB2和HIV-1Amlv，购自NIH AIDSResearch and Reference Reagent Program。
荧光素酶检测试剂盒Promega公司荧光仪DYNEX Technologies，Inc公司2.实验方法和评价A.将TD0232用DMEM培养基配制不同浓度的药物溶液。按药物试验所需的浓度制备，实验终浓度为600nM、200nM、66.7nM、22.2nM、7.4nM、2.5nM、0.8nM。
B.病毒的稀释用于药物体外抑制实验的病毒株，一般选用100TCID50/孔。
用DMEM培养液稀释成100TCID50/50ul/孔C.实验程序
提前一天准备U87.CD4.CCR5和U87.CD4.CXCR4(来源)，并在96孔板中，用含10％FBS的DMEM培养基培养。细胞数目为4×104/孔。
实验当天1.梯度稀释药物2.每孔加入50ul的(已稀释)药物3.每孔加入病毒50ul，终浓度为相当于10ng/每孔的p24值的病毒72小时后收集被感染的细胞，用Promega公司的试剂盒检测荧光素值，酶标仪是DYNEXTechnologies，Inc 公司生产。
结果可根据荧光素的检测结果，利用计算公式计算出该药物抑制病毒率。
公式药物抑制率＝((对照孔-检测孔)/对照孔)×100％CCR5和CXCR4是目前已发现的HIV-1进入细胞的两种共受体，CCR5受体主要在感染早期介导R5嗜性HIV-1病毒进入PBMC细胞，而CXCR4受体主要在感染晚期介导X4嗜性HIV-1病毒的进入。实验结果表明，TD0232对于R5嗜性的B亚型毒株JR-FL和ADA具有进入抑制作用，而对作为对照的X4嗜性的B亚型毒株HXB2或amphotropic AmLV则不具有进入抑制作用。同时，此实验也验证了TD0232是在病毒的进入阶段发挥抑制作用，并且对辅助受体CCR5有高度的选择性。
实施例16.TD0232抗多种亚型的R5嗜性HIV-1病毒株的活性研究1.实验材料细胞人PBMC细胞，购自武汉市中心血站，分别来自3个健康人HIV-1毒株三个亚型(A，C and O)R5嗜性的原始HIV-1病毒株，购自NIH AIDSResearch and Reference Reagent Program。
2.实验方法和评价A.将TD0232用RPMI1640配制不同浓度的溶液。按药物试验所需的浓度制备，实验终浓度为600nM、200nM、66.7nM、22.2nM、7.4nM、2.5nM、0.8nM。
B.病毒的稀释用于药物体外抑制实验的病毒株，一般选用100TCID50/孔。
用培养液稀释成100TCID50/50ul/孔C.实验程序提前两天从人血中制备PBMC(外周血单核细胞)，并在含PHA和IL-2的培养基中培养.
实验当天1.提取PBMC并以105个细胞每孔置于96孔板培养，每孔100ul.
2.梯度稀释药物3.每孔加入50ul的(已稀释)药物
4.每孔加入病毒50ul，终浓度100TCID50每孔.
第一天1.用普通培养基清洗被感染细胞三次；2.最后一次清洗后，加入新配的含药物生长培养基200ul；第七天收集病毒上清，进行p24检测结果可根据p24检测结果，利用计算公式计算出该药物抑制病毒率。
公式药物抑制率＝((对照孔-检测孔)/对照孔)×100％实验结果见表4。化合物TD0232能有效抑制4种亚型的R5嗜性毒株感染人PBMC的作用，说明TD0232具有广泛的抗多种亚型(A、B、C和O)的R5嗜性HIV-1病毒株的活性。
表4.TD0232抑制A、C和O亚型的R5嗜性HIV-1毒株在人PBMC中复制的IC50(IC90)
实施例17TD0232的抗R5嗜性的多重耐药病毒株的能力1.实验材料细胞人PBMC细胞，购自武汉市中心血站，分别来自3个健康人HIV-1毒株R5嗜性多重耐药株HIV-1J18，购自美国洛克菲勒大学Aaron Diamond艾滋病研究中心2.实验方法和评价A.将TD023用RPMI1640配制不同浓度的溶液。按药物试验所需的浓度制备，实验终浓度为600nM、200nM、66.7nM、22.2nM、7.4nM、2.5nM、0.8nM。
B.病毒的稀释用于药物体外抑制实验的病毒株，一般选用100TCID50/孔。
用培养液稀释成100TCID50/50ul/孔。
C.实验程序提前两天从人血中制备PBMC(外周血单核细胞)，并在含PHA和IL-2的培养基中培养。
实验当天1.提取PBMC并以105个细胞每孔置于96孔板培养，每孔100ul。
2.梯度稀释药物3.每孔加入50ul的(已稀释)药物4.每孔加入病毒50ul，终浓度100TCID50每孔。
第一天1.用普通培养基清洗被感染细胞三次；2.最后一次清洗后，加入新配的含药物生长培养基200ul；第七天收集病毒上清，进行p24检测结果可根据p24检测结果，利用计算公式计算出该药物抑制病毒率。
公式药物抑制率＝((对照孔-检测孔)/对照孔)×100％J18是一种已知的R5嗜性B亚型多重耐药的HIV-1病毒株，对多种蛋白酶抑制剂和数种逆转录酶抑制剂耐药。结果显示，化合物TD0232在体外实验中显著抑制了HIV-1J18对人PBMC细胞的感染，具有高效的抗多重耐药病毒株的活性，见表5。
表5.TD0232抑制HIV-1J18耐药株在PBMC中复制的IC50(IC90)值
实施例18TD0232在PBMC细胞上的细胞毒性1.实验材料细胞人PBMC细胞，购自武汉市中心血站，分别来自3个健康人2.实验方法和评价A.将TD0232用RPMI1640配制不同浓度的溶液。按药物试验所需的浓度制备，实验终浓度为100uM、20uM、4uM。
B.实验程序第0天在细胞上加入稀释药物第3天用来自Beckman Courter的Vi-CELLTMCell Viability Analyzer检测细胞存活率。相同浓度药物下的细胞的存活率的监测重复进行了3次，每次试验重复检测两个培养孔的细胞，所以获得的是一个平均值。
实验结果见表6，可见化合物TD0232对人PBMC的细胞毒性较低。
表6.TD0232对人PBMC的细胞毒性作用
实施例19TD0232的作用机理研究——TD0232与[125I]-RANTES竞争性地结合CCR5
实验方法如下A.用柠檬酸钠消化液(15mM Na3Citrate，134mM KCl)消化细胞，加入1ml0.2％BSA-PBS溶液，用1ml的枪反复吹打30次，形成单细胞悬液。1,200rpm，离心4min弃上清。
B.加4ml 0.2％BSA-PBS溶液，吹散，1,200rpm，离心4min弃上清。
C.加入500μl裂解缓冲液(5mM Tris-Cl，5mM EDTA，5mM EGTA，pH7.5)，充分吹匀，12,000rpm，4℃离心15min，弃上清。
D.加入1ml结合缓冲液(50mM HEPES，125mM NaCl，1mM CaCl2，5mM MgCl2，0.2％BSA，pH7.4)悬浮细胞膜，充分混匀，待用。
E.向每只5ml离心管中加入79μl细胞膜悬液，每组平行做2只离心管。加入1μl的药物溶液或DMSO，4℃操作，充分混匀。
F.向上述体系中加入0.5nM[125I]-RANTES 10μl，充分混匀，25℃放置45分钟。加入10μl 30mg/ml悬浮的Wheatgerm Agglutinin SPA Beads，充分混匀，每管实验体系总体积为100μl，25℃反应15分钟。
G.取出管子，2000转/分室温离心10分钟，用液闪仪测定cpm值。
H.[125I]-RANTS结合的量按以下公式计算％未处理＝100％×(cpmcompound/cpmnocompound)，用Sigmaplot8.0软件处理数据，计算IC50值。
结果见表7，可见TD0232有效抑制[125I]-RANTES与CCR5的结合，并呈现浓度依赖性，TD0232的IC50为1.4nM，说明TD0232以较高的亲和力与CCR5结合。
表7.TD0232抑制[125I]-RANTES与CCR5的结合情况
实施例20TD0232的作用机理研究——TD0232抑制RANTES、MIP-1α和MIP-1β引起的CCR5介导的G蛋白的激活实验方法如下A.从培养箱中取出细胞，倾去培液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，加入0.04％EDTA-PBS室温作用5分钟，加入1ml PBS放入1.5ml离心管，3,000rpm离心2分钟，弃上清。
B.用600μl裂解液缓冲液(5mM Tris-Cl，5mM EDTA，5mM EGTA，PH7.5)，并用胰岛素注射器吸打6次，12,000rpm，4℃离心15min，弃上清。
C.根据沉淀量，用适当体积的反应液(50mM Tris-Cl，5mM MgCl2，1mM EGTA，100mM NaCl，PH7.5)重悬，用胰岛素注射器反复吸打6次至形成均匀的细胞膜悬液。
D.分别往4只1.5ml离心管中加入反应液5μl，再分别加2、4、6和8μl的标准蛋白液(1.0μgBSA/μl)，再取一只新的1.5ml离心管，加入5μl待测膜悬液，分别往5只eppendorf管中加入800μl考马斯亮蓝溶液，摇匀。根据颜色对比，估计膜悬液的蛋白浓度，调至0.2μg/μl。
E.每只5ml离心管中反应体系为100μl，体系中含0.5nM[35S]-GTPγS(1,200Ci/mmol)(购自Amersham)、40μM的GDP、0.01％BSA、蛋白浓度为0.1μg/μl的细胞膜悬液，10nM的激动剂(RANTES(购自Peprotech EC Ltd)，MIP-1α或MIP-1β(购自Peprotech ECLtd))，各反应浓度下的TD0232(溶解于DMSO)。混匀，30℃反应1小时。
F.将玻璃纤维膜(GF/C膜)放入抽滤器上，加入4ml PBS于反应体系，倾倒在GF/C膜上，再重复洗涤一次。
G.打开真空抽滤泵，升压抽滤，待水分被完全抽走时，旋松抽滤器上的旋钮，打开抽滤器，关闭抽滤泵。
H.将抽滤完毕的GF/C膜放入烘箱中烘干，放入1.5ml离心管中，加入1ml液闪液，放入液闪仪中测量。
I.数据处理将不加激动剂的体系作为本底结合的样品(basal)，待测样品记为sample，将既加入激动剂又加入待测化合物的样品记为compound，将加入激动剂而没有待测化合物的样品记为agonist，则[35S]-GTPγS结合的量占最大刺激的百分比(％ofuntreated)按下列公式计算100％×(cpmcompound-cpmbasal)/(cpmagonist-cpmbasal)，用Sigmaplot8.0软件处理数据，计算IC50值。
结果见表8，可见TD0232可高效拮抗RANTES、MIP-1α或MIP-1β引起的[35S]-GTPγS与CHO-CCR5细胞膜的结合，其IC50分别为2.9nM、0.6nM和0.7nM。
表8.TD0232抑制RANTES、MIP-1α或MIP-1β引起的[35S]-GTPγS与CHO-CCR5细胞膜的结合情况
注释ND为未测的数据。
实施例21TD0232的作用机理研究——TD0232不能抑制在相应激动剂作用下CCR1、CCR2b、CCR3、CCR4、CXCR1、CXCR2、CXCR3或CXCR4介导的G蛋白激活实验方法同实施例22。
结果见表9，1pM至10μM的TD0232都不能降低在相应激动剂(RANTES(购自Peprotech EC Ltd)、MCP-1(购自Peprotech EC Ltd)、Eotaxin(购自Peprotech EC Ltd)、MDC(购自Peprotech EC Ltd)和SDF-1(购自Peprotech EC Ltd))作用下[35S]-GTPγS与CHO细胞膜的结合水平，说明化合物TD0232无法拮抗受体CCR1、CCR2b、CCR3、CCR4、CXCR1、CXCR2、CXCR3和CXCR4偶联激活G蛋白的功能。但是该化合物却能拮抗CCR5的功能，说明该化合物为CCR5的特异性拮抗剂。
表9.TD0232对受体的选择性研究
实施例22TD0232的作用机理研究—TD0232抑制RANTES引起的CHO/CCR5细胞内钙释放实验方法如下A.CHO/CCR5或CHO/CXCR4细胞以0.6×106个/ml的浓度种到96孔板里，100μl/孔，混匀后放入5％CO2培养箱过夜培养。
B.取出FLEXstationTM Calcium Plus Assay Kit里的Assay Buffer(component B，ready to use)及染料(component A)，平衡到室温。
C.称取14.27mg的Probenecid(Sigma)，加入component A中，再加入10mlAssayBuffer，使component A及Probenecid彻底溶解。
D.从培养箱中取出过夜培养的96孔细胞培养板，按100μl/孔加入上述溶液，放入培养箱中孵育1小时。
E.取出孵育的96孔板，放入FlexStation II(Molecular Devices)，设定37℃，加入待测化合物，每1.6秒读一次，读100秒。先加25μl小分子化合物，再加25μl的25nMRANTES，体系中DMSO的终浓度为0.1％。
以加入待测试剂前后相对荧光单位(Relative Fluorescence Units)的最大差值(RFUchange)来代表细胞内钙离子浓度的变化。用Sigmaplot8.0软件处理数据，计算IC50值。
结果见表10，TD0232能抑制5nM RANTES激活CHO/CCR5细胞内钙离子的释放，其IC50为78.9±9.9nM。0.01μM TD0232对RANTES引起的钙离子的释放没有影响，1μM的TD0232能够完全抑制5nMRANTES引起的CHO/CCR5细胞内钙离子的释放。结果表明化合物TD0232可在第二信使水平上高效拮抗CCR5受体。
表10.TD0232抑制CHO/CCR5细胞内钙离子的释放情况
实施例23TD0232的作用机理研究—TD0232抑制RANTES引起的CHO/CCR5细胞趋化运动实验方法如下A.用3.3μg/ml的Fibronectin浸泡聚碳酸酯趋化膜(NeuroProbe)，4℃过夜，取出晾干。
B.将CHO/CXCR4或CHO/CCR5细胞用0.02％EDTA-胰酶溶液消化下来后，加入趋化缓冲液(含0.1％BSA的无血清MEM-α)，500rmp离心2分钟，弃上清，再重复洗两次，用趋化缓冲液重悬细胞后计数，将细胞浓度调至1×106个/ml，将一定浓度的待测化合物和细胞孵育15分钟。
C.取26μl激动剂或趋化缓冲液加入48孔趋化板(NeuroProbe)的下层板的小室，上层板加入50μl细胞悬液，放入培养箱，孵育4小时。
D.用镊子取下膜，将膜放在4％多聚甲醛中固定2小时以上，将固定好的膜放在0.5％结晶紫中染色2-6小时(室温)或过夜(4℃)。染好的膜用清水洗5遍，然后在玻璃上晾干。
E.在扫描仪上扫出图像，用ScionImage系统统计与细胞接触的圆形区域的灰度值计算。
F.数据统计方法为待测孔穿过趋化膜的细胞的灰度值定义为该圆形区域的灰度值减去同样大小面积的空白处的灰度值(G)。在测定化合物对激动剂诱导的细胞趋化作用的影响时，化合物对趋化指数的影响以趋化指数的百分比表示，按以下列公式计算100％×(Gcompound-Gcontrol)/(Gagonist-Gcontrol)。用Sigmaplot8.0软件处理数据，计算IC50值。
结果见表11，TD0232可拮抗RANTES引起的CHO/CCR5细胞趋化作用，且呈剂量依赖性。在100nM浓度下TD0232可完全抑制细胞的趋化，IC50为3.0nM。实验结果证明化合物TD0232可拮抗CCR5受体在细胞水平上的功能。
表11.TD0232抑制CHO/CCR5细胞趋化运动的情况
实施例24TD0232的作用机理研究——TD0232抑制CCR5的内吞但不抑制CXCR4的内吞实验方法如下A.0.02％EDTA-胰酶溶液消化CHO/CCR5或CHO/CXCR4细胞，加入无血清MEM-α收集细胞，500rmp离心2分钟，弃上清，再重复洗一次，用无血清MEM-α重悬细胞，将细胞密度调至1×106个/ml，80μl/管分装于5ml离心管中。
B.在细胞悬液中加入10μl待测化合物，37℃孵育15分钟，DMSO的终浓度为0.1％。在CHO/CCR5或CHO/CXCR4细胞中分别加入2×10-6M的激动剂(SDF-1或RANTES)或无血清MEM-α10μl，37℃孵育1个小时。
C.放于冰上中止反应，加入冰冷的0.1％BSA-PBS，4℃，1200rpm，离心4min，弃上清。重复洗涤一次。
D.加入10μg/ml CCR5或CXCR4的抗体10μl，混匀，4℃孵育40min。
E.加入冰冷的0.1％BSA-PBS，4℃，1200rpm，离心4min，弃上清。重复洗涤一次。
F.加入1100稀释的FITC标记的羊抗小鼠的二抗100μl，混匀，4℃孵育40min。
G.加入0.1％BSA-PBS，4℃，1200rpm，离心4min，弃上清。重复洗涤一次。
H.加入300μlPBS重悬细胞，放于冰上，流式细胞仪检测。
I.将与待测化合物或激动剂孵育的细胞的平均荧光强度为Meancompound，不加一抗的细胞的平均荧光强度为Meancontrol，加一抗但不与化合物或激动剂孵育的细胞的平均荧光强度为Meannocompound，细胞表面受体的表达量按下列公式计算100％×(Meancompound-Meancontrol)/(Meannocompound-Meancontrol)。用Sigmaplot8.0软件处理数据。
TD0232拮抗CCR5或CXCR4内吞的情况见表12。TD0232不能单独诱导CCR5或CXCR4的内吞，也不能抑制SDF-1引起CXCR4的内吞，但是可以抑制RANTES引起的CCR5的内吞，并且呈现剂量依赖性。0.01μM的TD0232对RANTES诱导的CCR5的内吞没有影响，0.1μM的TD0232部分抑制CCR5的内吞，1μM的TD0232则可以完全抑制RANTES引起的CCR5的内吞。该实验结果表明化合物TD0232具有CCR5拮抗剂的特性，而非CXCR4的拮抗剂。
表12.TD0232拮抗CCR5或CXCR4内吞的情况
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种通式(I)所示的化合物，或其药学上可接受的盐， 式中，R1为未取代的或被1-3个取代基取代的下列基团苄基、苯甲酰基、环己基甲酰基、环戊基甲酰基、苯磺酰基、或萘甲酰基，所述的取代基选自卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基；R3为氢、C1-C4烷基，苯基或 所述基团中苯环可被1-3个选自下组的取代基取代卤素和C1-C4烷基；R6为对硝基苄氧羰基、苄氧羰基、对卤素苄氧羰基、对甲氧基苄氧羰基、对甲基苄氧羰基、对三氟甲基苄氧羰基、N-苯基甲酰胺基、苯氧乙酰基、3，4-二氧亚甲基苄氧羰基、对氨基苄氧羰基、苯磺酰基、对甲基苯磺酰基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，选自下组烯丙基-{1-[1-苄基-4-羟基-4-(4-氟)苯吡咯-3-亚甲基]哌啶-4-位}甲酰胺-4-硝基苄酯；烯丙基-[1-(1-苄基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯；烯丙基-[1-(1-苯甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯；烯丙基-[1-[1-(2-碘)苯甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基]哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯；烯丙基-[1-(1-萘甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯；烯丙基-[1-(1-环戊基甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯；烯丙基-[1-(1-环己基甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯；烯丙基-[1-(1-环戊基甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺苄酯；烯丙基-[1-(1-环戊基甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-甲氧基苄酯；烯丙基-[1-(1-环戊基甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-溴苄酯；烯丙基-[1-(1-环戊基甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]-3-苯基脲；烯丙基-[1-(1-环戊基甲酰基-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]乙酰胺苯醚。
3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述的化合物具有以下结构式(II)所示结构 式中，R1为未取代的或被1-3个取代基取代的下列基团苄基、苯甲酰基、环己基甲酰基、环戊基甲酰基、苯磺酰基、或萘甲酰基，所述的取代基选自卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基；R6为对硝基苄氧羰基、苄氧羰基、对卤素苄氧羰基、对甲氧基苄氧羰基、对甲基苄氧羰基、对三氟甲基苄氧羰基、N-苯基甲酰胺基、苯氧乙酰基、3，4-二氧亚甲基苄氧羰基、对氨基苄氧羰基、苯磺酰基、对甲基苯磺酰基。
4.根据权利要求3所述的化合物，其特征在于，选自下组烯丙基-[1-((3R，4S)-1-(环戊基甲酰基)-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯；烯丙基-[1-((3S，4R)-1-(环戊基甲酰基)-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-硝基苄酯；烯丙基-[1-((3S，4R)-1-(环戊基甲酰基)-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-苄酯；烯丙基-[1-((3S，4R)-1-(环戊基甲酰基)-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-甲氧基苄酯；烯丙基-[1-((3S，4R)-1-(环戊基甲酰基)-4-羟基-4-苯吡咯-3-亚甲基)哌啶-4-位]甲酰胺-4-溴苄酯。
5.根据权利要求3所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有以下结构式(III)所示结构
6.一种药物组合物，含有权利要求1-5中任一所述的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分，以及药学上可接受的载体。
7.如权利要求1-5任一所述的化合物的用途，其特征在于，可用于制备抗HIV病毒的药物。
8.如权利要求1-5任一所述的化合物的用途，其特征在于，可用于制备药物，所述药物选自下组(a)抑制HIV病毒感染人的外周血单核细胞的药物；(b)抑制RANTES与CCR5的结合的药物；(c)抑制RANTES、MIP-1α或MIP-1β引起的GTPγS与CCR5细胞膜的结合的药物；(d)抑制RANTES引起的CCR5细胞内钙释放的药物；(e)抑制RANTES引起的CCR5细胞趋化运动的药物。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的HIV病毒是HIV-1病毒。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的HIV-1病毒是A、B、C或O亚型。
全文摘要
本发明提供了一类具有抗HIV－1活性的化合物及其药学上可接受的盐。本发明还公开了含有所述化合物的药物组合物，以及所述化合物在抑制HIV病毒方面的用途。本发明的化合物可有效地抑制HIV病毒感染人体细胞，并且毒副作用小。
文档编号A61K31/4439GK1939916SQ20061015168
公开日2007年4月4日 申请日期2006年9月4日 优先权日2005年9月5日
发明者陈力, 陈仁海, 李本, 翟培彬, 吴瑜, 黄立东, 张瑾, 马大为, 裴钢 申请人:上海靶点药物有限公司