控制次要过敏原以便提高免疫疗法的安全性的制作方法

专利名称：：控制次要过敏原以便提高免疫疗法的安全性的制作方法控制次要过敏原以便提高免疫疗法的安全性发明领域本发明涉及免疫学和变态反应学领域。具体地讲，本发明涉及通过新的生产方法改善过敏原疫苗的安全性，该方法取决于定量和调节免疫原性组合物中主要和次要过敏原的含量，以便所述组合物适用于剖析过敏性患者对它过敏的过敏原。发明背景过敏反应，即I型超敏性影响着全球数百万人，并且它的发病率在过去若干年中在发达国家有所提高，导致逐渐增加的人力和经济损耗(l)。过敏反应的重要临床表现包括哮喘、干草热、湿渗和肠胃失调。尽管过敏反应一般不被认为是威胁生命的疾病，但津喘每年会导致大量的死亡。过敏反应是由对外源的，通常是非致病性的物质的不适当的免疫反应造成的。所述过敏反应在特定群体对某些过敏原过敏的意义上是特异性的，而所述个体不一定对已知能造成过敏性疾病的其他物质产生过敏反应。过敏性表型以目标器官的明显的粘膜发炎和在循环系统中和在肥大细胞和嗜碱性粒细胞("嗜碱细胞")表面上存在IgE类型的过敏原特异性抗体为特征。IgE-介导的过敏性疾病是由一般被称为过敏原的蛋白、糖蛋白、脂蛋白和多糖引起的。对过敏原的接触可以通过吸入，接触，摄入或注射实现。最重要的过敏原来源出现在环境空气中具有特定大小的最常见的颗粒物。所述来源显然是普遍的，并且包括青草花粉和屋尘螨粪便颗粒，它们造成了所有过敏反应的大约50%。在全球范围内重要的还有动物毛屑，即猫和狗毛屑、其他花粉，如艾属植物花粉，和微型真菌，如链格孢属。在区域基础上，还有其他花粉起支配作用，如北欧和中欧的赤杨花粉，南欧的橄榄树和墙草属植物，美国东部和中部的豚草属，和日本的柳杉花粉。昆虫和它们的产物，例如蜜蜂和胡蜂毒液，以及食物各自造成所有过敏反应的大约2%。过敏性疾病控制包括诊断和治疗，包括预防治疗。过敏反应的诊断涉及验证过敏原特异性IgE和确定过敏原来源。在很多情况下，认真的既往病历就足以诊断过敏反应，并且确定入侵的过敏原来源材料。不过，最常见的是，诊断是通过客观测定进行的，如皮肤穿刺试验，验血，或诱发试验。对过敏性疾病的现有治疗方法主要包括症状緩解。用药物，如抗组胺和类固醇治疗患者，这些药物不会抑制IgE抗体的形成，并且通常具有副作用。正如在WHO专题报告(2)中所指出的，免疫疗法是能够影响过敏性疾病的自然进程的唯一治疗方法，并且还能阻止过敏性鼻炎患者发展成哮喘(2)。在施用剂量逐渐增加的合适的过敏原提取物时，免疫疗法可以调节患者的免疫反应。治疗上使用的过敏原提取物是从天然来源中分离的蛋白和非蛋白成分的粗制混合物。随着IgE分子在1966年被发现(3，4)，在七十年代和八十年代引入了科学方法，以便对过敏原提取物进行标准化(5)。所述方法基于新生产批次与参考提取物的比较，它的效能业已通过在特定患者体内进行皮试预先进行了测定。用于体外评估相对致敏效能的最常用的方法是RAST抑制或相关方法(6)。所述方法中的重要试剂是来自一組过敏性患者的血清混合物，效能的测定是通过比较测试提取物对来自所述血清混合物的特异性IgE的结合的抑制作用i敏原提取物的效能是来自对过:原提取物中任何分子2的任何表位专一的任意一种IgE分子的过敏原活性的总和。因此，所述效能测量总是取决于所选择的血清混合物或患者组，并且取决于所述参考提取物。另外，所述方法没有提供有关所述提取物的定量组成的任何信息，即，每一种过敏原的相对浓度。近几年来，随着杂交瘤和单克隆抗体技术的出现，通过单克隆抗体-型免疫测定方法测定主要过敏原含量，使过敏原提取物的标准化取得了显著进展。对某些物种来说，仅使用一种主要过敏原，如家猫(Fe/"化/ne^2'ci^)(7)或长叶车前(/Va力"^7a/ceo/a")(8)就可以观察到主要过敏原的浓度和提取物的效能之间的良好的相关性，并且，尽管上述技术不仅能够确定特定效能的过敏原浓度，而且还能够确定某些物种的两种主要过敏原之间的最佳比例，如来自表皮螨属("er迈a"/^ago/ffes)的螨虫(9)。上述重大进展是大量知识的增加和主要过敏原剂量目前被认为是预告免疫疗法效果的关键因素(10)。然而，在用过敏原提取物对过敏性患者进行免疫疗法治疗时，预料不到的副作用仍然造成了重大问题。因此，尽管特异性过敏反应免疫接种具有优点，但是没有被广泛使用，这主要是因为存在过敏性副作用的危险。传统的特异性过敏反应免疫接种是通过长时间内进行的多次皮下免疫完成的。在每次注射之后，患者必须保持接受30分钟的医疗监护，因为存在过敏反应副作用的危险，这种反应尽管极少却是威胁生命的。另外，应当装备门诊室，以便支持应急处理。亳无疑问的，提高所述过敏反应疫苗的安全性，有利于更广泛的使用，因为它解决了主要的健康和经济问题，同时，改善了过敏性患者的生活质量。因此，需要提供具有改善了的安全性的过敏原提取物。发明概述术语"主要过敏原"是基于对特定过敏原提取物过敏的一般性患者群体对特定过敏原过敏的普遍性的统计学估计。因此，只有那些在>50%的患者中引起过敏的过敏原被称为"主要过敏原"(11)。然而，本发明人业已发现非常重要的临床学相关因素，即针对特定过敏原，主要或次要过敏原的IgE抗体的数量和亲和力，它是独立患者可能产生的，在现有的标准化方法中没有考虑到。最近，本发明人的研究小组业已发现了卫生保健工作者的乳胶免疫疗法的最大耐受剂量和针对Hevb6.01(prohevein)的特异性IgE的血清浓度之间的显著的负相关性(r=-0."，p=0.012，cf.SastreJWa人，2006,Allergy61:206-210)。极有可能的是，这一结果可以延伸到其他过敏原，因此针对特定过敏原的高的IgE水平可能意味着在免疫疗法方案中对所述特定过敏原的较低的耐受剂量。现有的基于血清混合物的IgE-免疫测定或主要过敏原免疫测定的标准化方法能够以合理的方式控制主要过敏原的水平，并因此控制针对它们的安全剂量。不过，对于低普遍性过敏原来说存在某种不确定性，主要是如果满足两个条件在过敏患者体内针对过敏原的高特异性IgE水平，和在可利用的原材料中过敏原含量的重要的可变性。目前，对特定过敏原提取物过敏的所有患者都连续接受含有所述提取物的所有成分的相同的复杂混合物，只能对更普遍的过敏原的浓度进行定量控制，而忽视了统计学上的次要过敏原浓度，尽管这些过敏原可能对某些患者具有潜在危害，这些患者最终会产生针对所述特定过敏原的高特异性IgE水平。目前市场上出售的质量最高的过敏原提取物仅仅进行过定性技术处理以^更控制它的质量，如SDS-PAGE/Western印迹或免疫电泳，以《更检测次要过敏原的存在。根据本发明，对次要过敏原浓度的定量控制的缺乏，可能是在进行免疫疗法治疗时出现的一定比例副作用的起因，过敏性反应是与所述治疗相关的主要危险。例如，本发明人业已发现了周期性的有害反应群，显然与确定的过敏原提取物批次相关。不过，在进行深入分析时，不能确定通过用于质量控制的业已建立的方法分析的提取物的质量的相关性，这表明，有害反应可能是由非控制参数引起的，并且，本发明人认为，该参数是通常被确定为"次要"的过敏原的浓度。与上述相同的考虑可应用于目前用来诊断的现有过敏原提取物。因此，大部分对统计学上次要过敏原过敏的患者可能被误诊，如果在所使用的提取物中对他们过敏的次要过敏原的浓度过低，和过高的话，在测试期间他们可能接受不希望的副作用。本发明提供了用于提高计划的临床用途的过敏原提取物安全性的方法。因此，本发明涉及过敏性患者的过敏原敏化曲线的确定，和用于生产适合所述过敏原敏化曲线的过敏反应疫苗的方法的实施。所述生产方法优选包括次要过敏原的定量方法。目前强制用于生产过敏原疫苗的标准化方法没有考虑个别患者对存在于所述提取物中的过敏原的IgE抗体反应。每一位过敏性患者能产生针对入侵的过敏原源材料的独特的免疫反应，它取决于遗传学，接触途径，和接触过敏原来源的强度等。因此，所述患者与它起反应的过敏原来源的蛋白以及所产生的IgE抗体的浓度和亲和力对于每一位患者来说是不同的。具体地讲，某些患者可能对不会对大部分过敏群体过敏的一种过敏原产生强烈反应。即，所述患者对次要过敏原发生强烈反应。因此，更安全的免疫疗法治疗应当基于对按照控制方法制备的过敏原疫苗的施用，以便确保主要和次要过敏原的适当的平衡，降低它们的浓度的波动和/或调整特定亚群体的过敏原浓度，在这些群体中，通常被认为"次要的，，某些过敏原起着主要过敏原的作用。因此，如果必要的话，所述生产方法包括原材料的选择和混合，该方法必须是根据能使接触所述疫苗的过敏性患者过敏的次要过敏原的控制。因此，本发明提供了3种重要的新型关系l)在使用过敏原提取物时，有利地对主要和次要过敏原的相对含量进行定量控制，因为在不同批次之间可能存在很大差异。2)对相同过敏原物质过敏的不同的群体或亚群可能具有明显不同的过敏原性特征，这意味着可以对每一个群体的过敏原提取物和过敏原组合物进行调整。3)后一种关系使得可以制备不是来自天然来源的提取物的过敏原组合物，不过，其中，不同过敏原相对它们的相对浓度平衡，以便以对若干(主要)过敏原的过敏反应为特征的群体或个体可以用一种类型的组合物免疫(富含该群体的所有主要过敏原)，而以对少数几种过敏原或者甚至一种过敏原产生过敏反应为特征的群体可以用不同的组合物免疫，后一种发现打开了用于设计重组生产的过敏原组合物的新思路。例如，本发明适用于改善现有的过敏原提取物/疫苗，例如，由本专利受让人Alk-Abell6出售的下列任何一种产品因此，基于提取物的过敏原疫苗业已上市。例如，本受让人业已推出了以下过敏原疫苗产品AlutardSQ:明矾存储制剂，用于皮下施用的过敏原提取物。Aquagen:用于皮下施用的含水的冷冻干燥的过敏反应疫苗，不含明矾。Pharmalgen:与用于重建的稀释剂共同包装的冷冻干燥的产品，同样用于皮下施用。SLITOne:装在单一剂量容器中的液体过敏原提取物，用于一次性口服。PangraminSLIT:用于口腔滴服的液体甘油制备的液体过敏原提取物。上述所有产物都含有过敏原提取物，目前它们是按照现有标准控制的，以便控制主要过敏原含量，但可以进行为了提高安全性而实施的本发明方法的处理。本发明的详细说明定义为了清楚地理解本发明的界限，下面对本文所使用的多个术语进行定义术语"过敏原，，表示能够诱导过敏反应的任何分子，即在重复接触过敏原时由IgE介导的反应。天然存在的过敏原的例子包括花粉过敏原(树木、杂草、药草和青草花粉过敏原)，螨虫过敏原(例如，来自家庭尘螨和储螨)，昆虫过敏原(吸入剂，唾液和毒液过敏原，动物过敏原，例如，来自狗、猫、马、大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、鸟等的唾液、尿液、毛发和皮屑、羽毛；真菌或霉菌过敏原和食物过敏原。大部分过敏原是蛋白类的，不过，本发明不局限于蛋白类过敏原。所述过敏原可构成过敏原提取物的一部分，或构成纯化的过敏原，修饰的过敏原或重组过敏原或重组突变型过敏原，或任何超过30个氨基酸的蛋白类过敏原片段。天然存在的过敏原的例子包括花粉过敏原(树木、药草、杂草，和青草花粉过敏原)，昆虫过敏原(吸入剂，唾液和毒液过敏原，例如，螨虫过敏原，蟑,和蠓过敏原，膜翅目昆虫毒液过敏原)，尿液，动物毛发和皮屑过敏原(例如，来自狗、猫、马、大鼠、小鼠、豚鼠、兔子等)，皮毛过敏原(来自禽类)，橡胶，蠕虫以及食物过敏原。重要花粉过敏原来自树木，草类和药草，如来自分类学上以下目的植物山毛榉目，木犀目，风梨麻和悬铃木科，包括例如，桦树(桦属)，赤扬(Alnus)，榛木(Corylus)，鹅耳枥(Carpinus)和橄榄(Olea)、雪松(柳杉属和桧属)、悬铃木(Platanus)、禾本目包括例如，黑麦草属、猫尾草属、早熟禾属、绊根草属、猫尾草、绒毛草属、蘸草属、乔麦和高粱属，菊目，荨麻目和蔷薇目包括例如，豚草属、蒿属，和墙草属的药草。其他重要的吸入性过敏原是来自以下属的家庭尘螨表皮螨属和欧螨属，储螨属，例如，Lepidoglyphys,食甜螨属和食酪螨属，和螨虫，例如，来自蟑螂、蠓和跳蚤的过敏原，例如，小蠊属、大蠊属、摇蚊属和辨毛螨属，以及来自哺乳动物，如猫(猫属)、狗(犬属)、牛(牛属)、马(马属)、大鼠(家鼠属)、小鼠(小鼠属)和豚鼠(genusCarvia)的过敏原，毒液过敏原，包括如来自螫咬或吓咬昆虫的过敏原，如来自分类学上的膜翅目的过敏原，包括蜜蜂(总科蜜蜂科)、黄蜂(总科黄蜂科)和蚂蚁(总科蚁科)。来自真菌的重要的吸入过敏原，如来自链格孢属和芽枝霉属的过敏原。过敏原的例子包括Betv1、Betv2、Alng1、Cora1和Carb1、Cass1、Cass5、Quea1、Cryj1、Cryj2、Cupa1、Cups1、Jima1、Juna2、Juna3、Juno4、Juns1、Junv1、Olee1、Olee2、01ee5、01ee8、01ee9、Syrv1、Ligv1、Pla11、Plaa2、Plaa3、Amba1、Amba2、Amba3、Amba5、Amba6、Amba7、Ambt5、Artv1、Artv2、Artv3、Artv4、Parj1、Parj2、Parj3、Paro1、Salk1、Avee1、Cynd1、Cynd7、Cynd12、Dacg1、Dagg2、Dagg3、Fesp1、Fesp4、Hoi11、Lolp1.Lolp5、Lolp3、Lolp2、Phaa1、Pasn1、Phip1、Phip2、Phip3、Phip4、Phip5、Phip6、Poap1、Poap5、Secc1、Secc5、Sorh1、Derf1、Derf2、Derf3、Derf7、Derf10、Derf11、Derf14、Derp1、Derp2、Derp3、Derp4、Derp5、Derp6、Derp7、Derp8、Derp10、Derm1、Eurm2、Eurm14、Glyd1、Glyd2、Lepd2、Lepd5、Lepd7、Upd10、Lepd13、Biot1、Biot3、Biot6、Biot10、Tyrp2、Blag1、Blag2、Blag4、Blag5、Blag6、Pera1、Pera3、Pera7、Perf1、Feld1、Feld2、Canf1、Canf2、Canf3、Bosd2、Bosd4、Bosd8、Equc1、Equc2、Equc3、Musm1、Ratn1、Cavpl、m4、Vesv1、Vesv2、Ves3la1、Pola2、Pola5、4、Alta1、Alta2、Alta3、Alta6、Clah1、Cha12、Cha13、Aspf1、Aspf2、Aspf3、Maid1、Glym1、Glym2、Glym3、Arah1、Arah2、Arah3、Arah4、Arah5,鉴定的单一过敏原的综合目录还可参见以下网站"Theofficial'ListofAllergens"。(AllergenNomenclature.InternationalUnionofImmunologicalSocieties,AllergenNomenclatureSub-Committee)http://www.allergen.org/。在本发明的优选实施方案中，所述过敏原是树木花粉过敏原或青草花粉过敏原或尘螨过敏原或豚草属过敏原或雪松花粉或猫过敏原或蟑螂过敏原。另一种优选的过敏原是橄榄树花粉过敏原。本文中的术语"过敏原敏化曲线"表示由个体或群体所表现出来的IgE反应性形式，与针对来自过敏原物质的单一过敏原的反应性类似。在个体中，所述曲线仅仅是提供了个体针对某些过敏原的IgE反应性的信息，而在群体中，所述曲线还可以提供统计学结果，该结果sJi1ms、h和2"秀m:p21Anossb2mDp1oAms、1A、2o1Dpi、<aoCVS包括提供有关对特定过敏原起反应的群体中个体百分比的信息的其他尺寸。本文所使用的术语"过敏原提取物"表示通过提取生物学过敏原源材料获得的提取物，正如在"过敏原提取物"，H.Ipsenetal，chapter20inAllergy,principleandpractise(Ed.S.Manning)1993，Mosby-YearBook,St.Louis中总体上披露的。所述提取物可以通过提取水溶性材料的含水提取物，然后实施纯化步骤，如过滤，以便获得溶液，即所述提取物而获得。然后可以对所迷提取物作进一步纯化和/或加工，如冷冻干燥，大体上除去所有的水分。一般，过敏原提取物包括蛋白和其他分子的混合物。过敏原蛋白通常被划分为"主要过敏原"，或"次要过敏原"。过敏原提取物一般包括主要和次要过敏原。主要过敏原一般占平均过敏原提取物的大约5-15%，更常见的是，占大约10%。过敏原的分类基于对特定过敏原的临床重要性的评估，并且如下文所述。存在于提取物中的重要主要过敏原的例子包括青草l和5和6型过敏原(例如，Phip1、5和6)，尘螨1和2型过敏原(例如，Derp1、Derp2)，树木花粉过敏原1(例如，Betv1、Olee1)，雪松花粉过敏原1和2(例如，Cryj1、Cryj2)，豚草属花粉1和2(Amba1、Amba2)，猫过敏原1(即Feldl)，蟑螂过敏原(例如，Pera1或Perfl)。平均it敏群体会对一种或多种主要过敏原过敏和起反应，并且还可能对一种或多种次要过敏原过敏和起反应。本文所提到的过敏原提取物的数量表示所述过敏原提取物的干物质含量。优选的是，所述干物质的含水量优选不超过重量的10%,更优选5%。本文所使用的术语"生物学过敏原源材料"表示包括一种或多种过敏原的任何生物学材料。所述材料的例子是螨PMB(PureMiteBody)或WMC(WholeMiteCulture)，脱脂或未脱脂的花粉，例如，来自青草、药草、杂草和树木、动物毛发和毛屑，毛皮，真菌菌丝体和孢子，昆虫体，毒液或唾液和食物。术语"生物学过敏原源材料"在本文中可以与术语"过敏原物质"交换使用。"主要过敏原"是如上文所定义的过敏原，它在特定群体中可导致对所述过敏原物质过敏的过敏性患者的50%以上过敏，所述过敏原是从上述制剂中获得的。被分类为主要过敏原的过敏原可以进行若干种测试。如果至少25%的患者表现出强的IgE结合(3分)并且至少50%的患者表现出中等结合(2分)，通常就将过敏原归类为主要过敏原，所述结合是通过CRIE(CrossedRadioImmuneElectrophoresis)测定的(CRIE强结合，即一天之后在X-光胶片上可以看见的IgE-结合；CRIE中等结合，即在3天之后出现的结合；CRIE弱结合，即10天之后出现的结合)。因此，所有其他过敏原被称为"次要过敏原"。其他方法也可用于测定IgE结合，例如，IgE-印迹。一般公认的主要过敏原包括青草1型过敏原，例如，phlp1、lolp1、sorh1、dacg1、cynd1、hol11、phaa1、青草2/3型过敏原，例如，phip2/3、lolp2/3，青草5型过敏原，例如，phlp5、lolp5、dacg5、poap5，青草6型过敏原，例如，phlp6、poap6,树木花粉l型过敏原，例如，betv1、alng1、cora1、carb1、01ee1，螨虫l型过敏原，例如，derp1，derf1，eurm1，螨虫2型过敏原，例3口，derp2、derf2、eurm2、Biot1，cat过敏原，例如，feld1，雪松1型和2型过敏原，例如，cryj1、cryj2,短小或巨型豚草属花粉过敏原，例如，amba1、amba2、ambt1、ambt2,其他杂草过敏原，例如，parj1、paro1、parj2、昆虫过敏原、例如、pera1blag1、perf1、vesv1vesv5、pola1、dolm1。通过本说明书可以看出，如果排他性地考虑过敏群体亚型的话，次要过敏原可以构成"主要过敏原"(由于某些个体与次要过敏原起反应，并且这样的个体逻辑上构成了较大过敏群体的亚型)。由此强调了以下事实，即术语"主要过敏原"和"次要过敏原"是相当，的，并且取决于正在研究的过敏群体。不过，为了使过敏原被认为是本说明书和权利要求书范围内的主要过敏原，与"主要过敏原"起反应的群体必须具有一定规模，一般包括至少30个个体，并且可以与更大过敏群体中的其他患者在至少一种其他常见人口参数方面区分，这使得可以容易地鉴定这样的群体-所述参数可以是地理学上的(该群体中的所有患者生活在特定的地理区域)，遗传学上的(该群体的所有患者具有相同的起源或拥有共同的遗传学或表型标记)，环境的(例如所有个体拥有共同的接触历史)，或任何其他人口参数。本发明的"标准化过敏原提取物"表示来自特定过敏原物质的过敏原提取物，其中，对该提取物中的过敏原成分进行调节，以便获得主要和次要过敏原之间的适当的平衡，并且，获得适当的和安全数量的每一种过敏原。具体地讲，本发明的标准化过敏原提取物是这样的，其中，所述提取物与特定群体的过敏原过敏特征匹配，以便在对该群体的成员进行免疫时降低不良影响。术语"致免疫有效量"表示过敏原的剂量，当施用一次或重复施用单一剂量或以增量剂量施用时会导致，例如，获得性免疫反应，并因此被用作使过敏型患者脱敏的方法。优选的是，该术语应当表示在按照治疗方案重复施用所迷剂型之后诱导获得性免疫反应所必需的每一个剂型中过敏原的数量(时间范围为在几个月时间内使用几次到至少每天使用一次)。优选的脱敏方法包括在施用上述剂量时緩解过敏性症状。临床上的过敏反应症状包括鼻炎，结膜炎，哮喘，荨麻渗，湿瘆，包括在皮肤，眼睛、鼻腔、上呼吸道和下呼吸道中的反应，具有常见症状,如眼睛和鼻子发红和搔痒，搔痒和流鼻弟、哭泣、抽泣、气短、搔痒和组织肺胀。"最大可接受的"数量或剂量是被有经验的医生认为是给患者施用的特定物质的最大安全剂量的剂量。对于过敏原来说，导致过敏的数量相当小(在较小的微克范围内)，不过，敏化通常是在更小的剂量下开始的，出于安全原因，该剂量被认为是最大可接受的剂量。术语"单一剂型"用于表示从按照本发明制备的过敏原提取物中衍生/分离的单一剂量制剂。所述剂型可以通过浓缩所述提取物或稀释剂型获得。这意味着单一剂型中过敏原的总浓度可以与所述提取物的浓度不同，不过，该提取物中每一种过敏原之间的数量的比例大体上与单一剂型中每一种过敏原的数量的比例相同。生物学过敏原源材料/过敏原物质可以包括污染性材料，如过敏原花粉来源材料的外源花粉和植物和花的碎片。应当降低污染程度。优选的是，污染物的含量应当不超过生物学源材料的10%(w/w)。通常，过敏原提取物包括过敏原提取物干物质含量的至少10°/的蛋白，是通过标准蛋白测定方法，如BCA或Lowry方法测定的，而其余部分组成了其他的"非蛋白材料"，它们可以是诸如脂类，碳水化合物，或来自生物学过敏原来源的结合水分。过敏原提取物能够以冷冻干燥的材料形式制备和保存，所述材料可以通过在低于800微巴的压力下冷冻干燥过敏原提取物液长达100小时时间除去水分获得。导致本发明的发现的简要说明本发明人业已发现，过敏性有害反应倾向于在时间上，以及在某些场合下，还可以是空间上集中出现，这种反应局限于特定的地理区域。一般，对所述有害反应原因的研究一直集中在对特定批次的过敏原疫苗的组成的研究上，并且，一般来说，这些批次的材料满足了建立的质量控制标准。因此，本发明人致力于研究所述有害反应的其他原因，首先，研究的焦点放在过敏原提取物的可变性方面，其次研究的焦点放在患者对统计学上的次要过敏原不同反应上。在说明本发明的例子中，观察到了过敏原提取物的组成和患者的IgE抗体反应两方面的惊人的和极端的可变性。应当指出的是，出现在所述例子中的大部分过敏原提取物业已在商业上满足了质量控制，所述质量控制是按照现有的标准化指标建立的，即总的致敏效能和主要过敏原含量。另外，本发明人业已检测了对通常被定义为次要过敏原的过敏原表现出非常强烈的IgE反应的大量患者。这一点清楚地表现在与下面所披露的链格孢属(""i77ar/a)过敏原的例子相关的图8中。在某些场合下，与对橄榄花粉过敏相关的例子类似，有证据表明，接触不同环境花粉水平的患者表现出不同的过敏特征。因此，生活在橄榄树大量生长的地理区域的患者表现出对过敏原(01ee9)的高的IgE水平，这种过敏原几乎不能被来自生活在上述区域以外的患者的IgE所识别。根据主要和次要过敏原的定义，这种过敏原应当被认为是次要过敏原，因为它不能被对橄榄树花粉过敏的50%以上的患者识别。不过，在橄榄树大量生长的特定区域，这种过敏原可能被认为是主要过敏原，因为它能被多数患者所识别。另外，本发明人业已发现，对01ee9过敏的所有患者同样对"传统的"主要橄榄树过敏原Olee1过敏，并且对Olee9的IgE水平的平均值很高。似乎明显的是，大量接触01ee9的含量没有得到适当控制的过敏原疫苗的过敏性患者的治疗，可能出现较大的过敏反应风险。为了建立生产具有已知含量的这种过敏原的橄榄树过敏原性产物的生产方法，本发明人业已开发了用于定量Olee9的ELISA。利用这种ELISA检测不同批次的橄榄树花粉，发现了这种过敏原含量的极端的和出乎预料的波动性，并且还发现了Oleel和01ee9的比例之间的高度可变性。应当指出的是，采用现有的标准化方法，不同批次的过敏原疫苗可以释放出的01ee9的浓度具有160倍的变化，这意味着存在着较高的严重有害反应的危险。因此，通过使用本发明的方法，可以明显减弱过敏原提取物的可变性，并且将主要和次要过敏原之间的平衡维持在适当范围内，以便减弱所述有害反应的危险。所开发出的技术不仅可用于加工过程中的控制，和中间产物和最终产物的分析，而且更重要的是，还可用于原材料的选择。过敏原源材料，如花粉、霉菌、螨虫等的生物起源使它们具有固有的可变性。具体地讲，表现出高的批次与批次之间的可变性的花粉取决于品种，地理位置，和花粉季节。这意味着要发现具有主要和次要过敏原之间的适当平衡的单一的花粉批次几乎是不可能的，并且，为了确保供应类似批次的花粉以便生产一致的过敏原疫苗批次也是几乎不可能的。不过，由于本发明的发现和所开发的免疫测定方法，可以制备来自以前分析过的若干花粉批次的混合物，以便获得主要和次要过敏原之间的适当的比例。涉及次要过敏原的另一方面，在本发明中被认为某些次要过敏原可以与来自相同来源的主要过敏原交叉反应。在这种情况下，主要和次要过敏原上的IgE-交叉反应表位对来自患者的IgE抗体的结合具有叠加效应。因此，尽管对提取物中的主要过敏原含量进行了定量，为未受控制的高含量次要过敏原的存在可能暗示对交叉反应表位过敏的患者存在产生有害反应的较高的风险。在下面的实施例中提供了这种情况的例子。本发明人业已开发了免疫测定方法，用于对梯牧草(户//e咖/7i"We/;ye)花粉中的次要过敏原(Phlp6)进行定量，所述过敏原能与主要过敏原Phip5发生交叉反应。若干批次的梯牧草的分析发现了这种次要过敏原的显著可变性，在制备过敏原疫苗时应该考虑这种可变性。总之，对于一部分过敏性患者来说，统计学上的次要过敏原是非常有关的过敏原，并且，确定的过敏原过敏特征与施用具有高含量相关次要过敏原的过敏反应疫苗组合可能导致严重的有害反应。因此，为了提高过敏原疫苗的安全性，重要的是降低次要过敏原含量的波动，这一目的可以通过使用控制次要过敏原含量的方法实现。本发明与制备提取物相关的方面本发听的第一方面涉及用于制备过敏原物质的标准化提取物的方法，包括-从所述过敏原物质获得含过敏原的提取物，-测定所述含过敏原的提取物中主要和次要过敏原的相对浓度，其中，所述主要和次要过敏原是按照对所述过敏原物质过敏的群体获得的过敏原敏化曲线确定的，-调节所述主要和次要过敏原的浓度，来获得所述标准化提取物，以便la)从所述标准化提取物中分离的单一剂型包括主要过敏原的总量不超过所述过敏原物质的任意单一种主要过敏原的最大可接受量和/或lb)标准化过敏原提取物中的主要和次要过敏原的浓度是定量控制的，和2)从所述标准化提取物中分离的单一剂型包括免疫有效量的所述主要和任选性地次要过敏原的每一种。因此，本发明的这一方面涉及过敏原提取物的制备，该提取物在其中的过敏原含量方面与某些过敏原反应群体匹配。正如上文所讨论的，本发明可以针对特定过敏群体调节所述过敏原提取物，以便降低在免疫过程中不良影响的危险。值得注意的是，主要过敏原的总浓度是平均的，以便降低由其他主要和次要过敏原以及交叉反应主要过敏原造成的不良影响的危险。根据本发明人知识的最佳理解，以前从来没有尝试或暗示以这种方式控制提取物中的过敏原含量。第二方面，本发明涉及用于制备一组包括至少2种彼此不同的过敏原物质的标准化提取物的方法，所述标准化提取物各自适合对不同的对所述过敏原物质过敏的过敏群体进行免疫，包括-从所述过敏原物质获得含过敏原的提取物，-测定所述含过敏原的提取物中过敏原的相对浓度，-根据上述测定，制备对所述过敏原物质过敏的至少两个不同群体的每一个多种所述组的提取物，所述至少两个不同群体的每一个限定了不同的主要过敏原，其中，对每一个成员中所述过敏原的浓度进行调节，以便la)从一个成员中分离的单一剂型包括的主要过敏原总量不超过所述过敏原物质的任意单一种主要过敏原的最大可接受量和/或lb)标准化过敏原提取物中的主要和次要过敏原的浓度是定量控制的，和2)从所述成员中分离的单一剂型包括免疫有效量的所述主要和任选性地次要过敏原的每一种。因此，这一方面提供了制备组成不同的过敏原提取物的可能性，以便l)优化仅对一种过敏原过敏的群体(或个体)的治疗，和2)降低对来自所述过敏原物质的2种或两种以上过敏原过敏的患者的不良影响的危险。第三方面，本发明涉及用于由过敏原物质制备标准化过敏原提取物的方法，该方法包括从所述过敏原物质获得过敏原提取物，测定单一提取物中主要和次要过敏原的浓度，如果必要，调节所述提取物中主要和次要过敏原的相对数量，以便获得标准化过敏原提取物，其中，所述主要和次要过敏原的相对数量在预定范围内，以便能够从所述标准化过敏原提取物中分离单一剂型，其中l)所述主要过敏原的总量不超过来自所述过敏原物质的任意单一种主要过敏原的最大可接受量和/或主要和次要过敏原的浓度是定量控制的，和2)主要和任选性地次要过敏原是以免疫有效量存在的。所述第三方面提供了本发明的更简单的部分，其中，测定了特定过敏原提取物的组成，如果所述提取物满足与相关的过敏应群体相对的过敏原含量的标准，所述过敏原提取物"通过该测试"并且不进行调整，如果过敏原提取物不满足该标准，就要按照本发明详细披露的方法对过敏原含量进行调整。本发明的特定方面是用于制备过敏原物质的标准化提取物的方法，包括-从所述过敏原物质获得含过敏原的提取物，—测定所述含过敏原的提取物中过敏原的相对浓度，其中，所述过敏原是通过过敏对象的过敏原敏化曲线确定的，-调节所述过敏原的浓度，以便1)所述提取物的单一剂型包括的过敏原的总量不超过所述过敏原物质的任意一种过敏原的最大可接受量和/或标准化过敏原提取物中的所有过敏原的浓度是定量控制的，和2)所述提取物的单一剂型包括免疫有效量的每一种所述过敏原。因此，这一方面是基于本发明的有关过敏原提取物的过敏原含量的巨大波动的可能性的发现，提供了本发明的大部分"个性化"形式。在该特定方面，术语"主要"和"次要"过敏原是不相关的，不过，调节特定提取物的过敏原含量是重要的，以便不危害进行最终免疫的对象。一般，本发明用于制备过敏原提取物的方法可以长时间重复，以便产生组成类似的提取物曲线，从而可以随着时间推移对患者采用一致的治疗方案。因此，本发明的方法还可以制备多种提取物。在这种情况下，任何一种所迷多种提取物的过敏原浓度(例如，主要过敏原和次要过敏原浓度)相对所述多种提取物中任何其他一种的波动最多为50%。不过，优选更小的波动，如最多40%、最多30%、最多25%、最多15%、最多5%、最多2%和最多1%。不过，应当理解的是，单一过敏原可以进行比总的主要和/或次要过敏原的波动更大的波动。例如，按照欧洲药典的有关过敏原产物的专著，50%-200%的标称值的过敏原浓度的波动是允许的。例如，如果油橄榄(01eaeuropaea)提取物的01eel含量的标称值为60jig/ml，允许的波动为30-120^g/ml。因此，在制备本发明可以接受的多种提取物时，所述任何一种多种提取物中的任何一种主要过敏原和/或任何次要过敏原的浓度不超过所述多种提取物中任何其他一种过敏原浓度6倍以上。当然，所述倍数可以更低，以便它不超过5或4(遵循在所述专著中提出的上述极限)或3或2倍。技术人员显而易见的，标准化提取物中过敏原的含量可以通过若干种方法调节。最筒单的方法是确定通过本领域技术人员公知方法获得的大量过敏原提取物中相关过敏原的相对浓度，然后使用不同批次的提取物，以便制备两个或两个以上批次的过敏原提取物的适当平衡的混合物，以便获得适当平衡的标准化提取物。另外，通过本领域公知的纯化方法可以除去某些过敏原(由于它的高专一性，最常见的是采用抗体亲和纯化方法)，并且，在少数情况下，除了极低浓度的一种或少数几种过敏原之外，过敏原的平衡是适当的，所述提取物可以掺加相关的过敏原。通过本发明方法获得的标准化提取物可以进行浓缩(甚至是干燥)或稀释，不过，根据本发明，它们仍然被认为是"标准化提取物"，只要过敏原的相对浓度保持不变。其他过敏原组合物本发明人相信，支持本发明的构思，即以下事实"主要"和"次要"过敏原是群体依赖性的。因此，本领域公认的制备过敏原疫苗的其他方法取决于，例如，重组产物，可能存在某些与传统过敏原提取物相同的问题，因为它们的组成不能对特定的明确的群体进行优化。因此，本发明还涉及制备标准化过敏原组合物的方法，该方法包括确定群体的过敏原敏化曲线，以便鉴定在所述群体中有反应性的主要过敏原和次要过敏原，随后混合由此鉴定的主要和次要过敏原，以便la)从所述标准化过敏原组合物中分离的单一剂型中的所述主要和次要过敏原的浓度含有的主要过敏原的总量不超过所述过敏原物质的任意单一种主要过敏原的最大可接受量和/或lb)所述标准化过敏原组合物中主要和次要过敏原的浓度是定量控制的，和2)从所述过敏原组合物中分离的单一剂型包括免疫有效量的所述主要和任选性地次要过敏原的每一种。随后可以对所述标准化过敏原组合物进行浓缩或稀释，该组合物中的过敏原优选是从天然来源分离的和/或重组生产的和/或通过合成方法制备的，后一种选项适合蛋白类过敏原，特别适合可以通过液相或固相肽合成方法合成的小的过敏原。制备药物制剂(疫苗)进行本发明方法处理的过敏原提取物的大量生产为本领域所熟知，例如，参见过敏原提取物(AllergyPrinciplesandPractice,Chapter20，Ipsenetal,Mosby-YearBook,1993)。提取物可以根据总体要求保存，最常见的是以冷藏或冷冻提取物或干燥的或冷冻干燥的提取物形式保藏，例如，参见WO2005/058474,按照本发明制备的过敏原提取物由于自身原因适合用作药物和疫苗，不过还可以进一步操作(通过本领域公知的方法)，以便制备特殊的药物制剂，关于药物的制备参见下面有关过敏原物质讨论。因此，本发明还涉及用于制备用于诱导对过敏原的耐受性的药用组合物的方法，该方法包括按照本发明的方法制备标准化提取物或组合物，然后将由此获得的标准化提取物与药物学和免疫学上可接受的载体，媒介物或稀释剂配制在一起。在这里应当注意的是，标准化提取物可以是稀释的和浓缩的(如冷冻干燥的)，因此，可以制备具有任何相关浓度和数量的过敏原的组合物。含有肽序列或多肽作为活性成分的疫苗的制备一般为本领域所熟知，例如，参见美国专利4，608，251;4，601，903;4，599,231;4，599，230;4，596，792;和4,578，770，PCT/DK2005/000601和W02004/075875，以上所有文献都被收做本文参考。一般，所述疫苗是以可注射的液体溶液或悬浮液形式制备的；还可以制剂成在注射之前适合溶解或悬浮在液体中的固体形式。所述制剂还可以是乳化的。所述疫苗还能够以局部使用的液体形式制备，例如粘膜施用。活性致免疫成分通常与赋形剂混合，所述赋形剂是可以药用的，并且与所述活性成分相容，混合是在疫苗的最终制备过程中或之前进行的。合适的赋形剂是，例如，水，盐水，葡萄糖，甘油，或乙醇等，以及它们的组合。另外，如果需要的话，所述疫苗还可以包含微量的辅助物质，如湿润剂或乳化剂，pH緩冲剂或能增强疫苗效果的佐剂；参见下文有关佐剂的详细讨论。疫苗还可以制备成固体剂型，如片剂，压缩的或非压缩的，胶嚢和锭剂。所述疫苗还可以制备成本领域所公知的固体中间产物，如颗粒，微小颗粒或纳米颗粒或在固体剂型中进一步制备的粉末。例如，固体剂型中的疫苗参见WO2004/075875，具体地讲，快速分散的固体可以参见US6,709，669、EP1024824、EP1154757、WO2005/120464和WO20G4/047794,以上所有文献都被收作本文参考。所述疫苗通常是通过注射，例如，皮下，皮内，真皮内，真皮下或肌内注射而肠胃外施用的。适合其他施用模式的其他制剂包括，口腔粘膜、即口月l、含服、舌下、胃肠制剂、栓剂，以及在某些场合下，腹膜内，阴道内，肛门，硬膜外，脊髓，和颅内制剂。对于栓剂来说，传统的黏合,剂和载体可以包括，例如，聚亚烷基二醇或甘油三酯；所述栓剂可以用包含0.5%-10%的，优选1-2%的活性成分的混合物制备。口腔和口腔粘膜制剂包括常用的赋形剂，例如药品级的明胶(来源于哺乳动物或非哺乳动物)、甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素，和碳酸镁等。非肠胃外组合物采用溶液，悬浮液，片剂，非压缩快速分散制剂形式，例如，锭剂，丸剂，胶嚢，緩释制剂或粉末，并且，对于过敏原来说，活性成分的含量可小到1%。，最常见的范围是O.01-25%，优选O.1%-10%。所述过敏原可以制备成中性或盐形式的疫苗。可以药用的盐包括酸加成盐(与所述肽的游离氨基基团形成)，并且，它是与无机酸形成的，例如盐酸或磷酸，或与有机酸形成，如乙酸、草酸、酒石酸和扁桃酸等。与游离羧基形成的盐还可以来自无机碱，例如，氩氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙，或氢氧化铁，并且，诸如异丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、组胺、普鲁卡因等的有机碱。还可以采用化学修饰的，例如，戊二醛修饰的过敏原。有时候让所述疫苗还包括佐剂物质是有利的，特别是，如果所述佐剂能够刺激T-细胞的适当的亚型，以便启动针对IgG反应的过敏性IgE反应。获得所述疫苗的佐剂效果的各种方法是公知的。一般原理和方法详细披露于以下文献中"TheTheoryandPracticalApplicationofAdjuvants"，1995,DuncanE.S.Stewart-Tul1(ed.)，JohnWiley&SonsLtd,ISBN0-471-95170-6，以及"Vaccines:NewGenerationImmunologicalAdjuvants"，1995,GregoriadisGe"/.(eds.),PlenumPress,NewYork,ISBN0-306-45283-9，以上两份文献都4皮收作本文参考。合适佐剂的非限定性例子选自下列一组免疫定向佐剂；免疫调节佐剂，如毒素，细胞因子，和分枝杆菌衍生物；油类制剂；聚合物；成胶束佐剂；皂苷；颗粒；DDA;铝佐剂；DNA佐剂，Cpg佐剂；y-菊糖；糖脂佐剂，非病原菌和胶囊化佐剂。佐剂的应用包括使用诸如氢氧化铝或磷酸铝(明矾)的试剂，通常以緩冲盐溶液的0.05-0.1%的溶液使用，与合成的糖类聚合物混合(例如，Carbopol)，以0.25。A的溶液形式使用，通过在70t:-101"C的温度下分别处理30秒至2分钟时间使所述疫苗中的蛋白聚合，还可以通过使用交联剂聚合。通过使胃蛋白酶处理过的抗体(Fab片段)与白蛋白起反应聚合，与细菌细胞的混合物，如C.;arra迈或与格兰氏阴性细菌的内毒素或脂多糖成分，用生理学上可接受的油类媒介物，如二缩甘露醇一油酸酯(AracelA)或用20%的全氟化碳溶液(Fluosol-DA)制备的乳液，它被用作阻断替代物。用诸如角篁烯和IFA的油类的混合物同样是优选的。还了解脂质体制剂可以产生佐剂效果，因此，脂质体佐剂是本发明所优选的。另外，根据本发明，优选选择免疫刺激复合物基质类型(ISC0M基质)佐剂，特别是因为业已证实这种类型的佐剂能够通过APCs上调MHCII型表达。ISC0M⑧基质包括(选择性分离的)来自表皂树(w/;o/7flr/a)的皂苷类(三辟系化合物)，胆固醇，和磷脂。在与致免疫蛋白混合时，所得到的颗粒制剂是被称作ISC0M颗粒的制剂，其中，皂苷占60-70%w/w，胆固醇和磷脂占10-15%w/w，而蛋白占10-15%w/w。与免疫刺激复合物的组成和使用相关的细节可以参见，例如，上面所提到的与处理佐剂相关的教科书，还可参见MoreinB"a入，1995，Clin.Immunother.3:461-475aswellasBarrIGandMitchellGF，1996,Immunol,andCellBiol.74:8-25(两个文献都被收作本文参考)，提供了有关制备完整免疫刺激复合物的说明。其他可能涉及定向和免疫调节物质(i'.a.细胞因子)的使用。就此而言，还可以使用合成的细胞因子诱导物，如polyI:C。合适的分枝杆菌衍生物选自下列一组胞壁酰二肽，完全弗氏佐剂，RIBI，和海藻糖二酯，如TDM和TDE。合适的DNA佐剂包括免疫刺激序列(例如，包含DNA序列的CpG基序)以及类似成分。合适的糖脂佐剂包括LPS(Lipo-Poly-Saccharides)化合物和组合物和MPL(MonoPhosphorylLipidA)以及它们的衍生物，参见US4,803，070，US4，806，352，US4，866，034，US4，987，237，US5，762，943，EP0729473和WO01/46127。合适的免疫定向佐剂选自下列一组例如，CD40配体和CD40抗体或它们的特异性结合片段，甘露糖，Fab片段，和CTLA-4。合适的聚合物佐剂选自下列一组碳水化合物，如葡聚糖，PEG,淀粉，甘露聚糖，和甘露糖；塑料聚合物；和乳胶，如乳胶颗粒。在很多场合下，业已证实微粒和纳米颗粒制剂能增强蛋白抗原的免疫原性，因此，是本发明的另一种优选实施方案。微粒是以与聚合物，脂类，碳水化合物或适合制备颗粒的其他分子共同制备的或微粒可以是仅由抗原本身组成的均匀的颗粒。基于微粒和納米颗粒的聚合物的例子是PLGA和PVP型颗粒(GuptaRKWa/.，1998)，其中，聚合物和抗原缩合成固体颗粒。液体型颗粒能够以脂质体的胶束形式(所谓的脂质体)，将抗原包埋在所述胶束内(PietrobonPJ,1995)制备。碳水化合物型颗粒通常是用合适的可降解的碳水化合物制备，如淀粉或壳聚糖。混合碳水化合物和抗原，并且通过类似于用于聚合物颗粒的方法缩合成颗粒(KasHSe"/.，1997)。另外，披露于US5，219，577和W003/051394中的磷酸钓颗粒可以作为例子。仅包括过敏原的颗粒可以通过各种喷雾和冷冻干燥技术制备。特别适用于本发明目的的方法是超临界流体技术，该技术被用于制备非常均匀的具有控制粒度的颗粒(YorkP，1999&ShekunovBa/.，1999)。控制提取物中过敏原成分的含量优选的是，按照本发明使用和生产的标准化过敏原提取物或组合物中的主要和次要过敏原的浓度定量控制在预定范围内。正如上文业已讨论的，如果使用提取物生产的现有方法的话，所谓的次要过敏原可以有很大变化，因此，将主要和次要过敏原的相对浓度限定为临床上可接受的是有价值的，并且可以生产临床上可接受的药物。一般，标准化提取物或组合物中每一种次要过敏原的浓度应当调节到低于标准化提取物或组合物中最低浓度的主要过敏原的浓度，不过，对于某些次要过敏原来说，更重要的是，次要过敏原具有不是高于或低于主要过敏原的浓度的特定浓度。事实上，存在某些情况，次要过敏原的浓度比主要过敏原更丰富，这样不会构成事实上的问题，只要控制了诸如次要过敏原的浓度。例如，在猫毛屑提取物中，白蛋白通常是次要过敏原，它的含量远比主要过敏原Feldl丰富，不过，在大部分群体中，这并不会造成临床问题。然而，优选的是，单一剂型中最丰富的次要过敏原和任何主要过敏原之间的重量或摩尔比不超过1:50，不过，通常需要更少数量的次要过敏原，以便任何次要过敏原和最丰富的主要过敏原之间的重量或摩尔比应当不超过l:100或甚至1:200。同样，标准化提取物或组合物中的最丰富的主要过敏原和单一剂型中任何其他主要过敏原之间的重量或摩尔比应当不超过30:1，不过，更理想的是，主要过敏原尽可能以丰富的含量存在。因此，优选的是，最丰富的和任何其他主要过敏原之间的重量或摩尔比不超过15:1。更优逸的是，最丰富的和任何其他主要过敏原之间的重量或摩尔比不超过10:1，甚至不超过5:l或甚至2.5:1。无论如何，当制备或使用标准化过敏原提取物或组合物时，优选的是，它包括来自所述过敏原物质的所有主要过敏原。这应当能确保最有效地诱导针对所述过敏原物质的耐受性。标准化过敏原提取物在过敏反应提取物领域，不存在国际上公认的标准化方法。存在多种不同的提取物强度，即生物-效能单位。所采用的方法和使用的单位通常衡量过敏原含量和生物活性。它的例子是SQ-单位(标准化质量单位)，BAU(生物学过敏原单位)，BU(生物学单位)，UM(质量单位)，IU<国际单位)和IR(反应性指数)。因此，提取物需要相对明确的提取物进行标准化，以便以SQ单位或上述任何单位确定它们的效能。涉及的对象是"过敏原提取物"，H.Ipsenetal，chapter20inAllergy,principleandpractise(Ed.S.Manning)1993，Mosby-YearBook,St.LouisandL0wensteinH.(1980)ArbPaulEhrlichInst75:122。另外，普通使用的指南，测定过敏原生物效能的可接受的测试方法可以参见，例如，NoteforGuidanceonAllergenProduct;TheEuropeanAgencyfortheEvaluationofMedicinalProduct,CPMP_BWP_243_96,London,1996。有若干种实验室试验可用于表征过敏原。最常用的技术是十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),等电子聚焦(IEF)，交叉免疫电泳(CIE)和火箭免疫电泳(RIE)。每一种过敏原的定量可以通过多种定量免疫电泳技术(QIE)，径向免疫扩散(RIE)或通过酶联免疫吸附测定(ELISA)实现。总过敏原活性的测定最常见的是通过放射变应原吸附试验(RAST)，MagicLiteassay(LIA)或相关技术实现的，还可以使用ELISA-型技术。因此，本发明的单一剂型的过敏原含量可以通过常规免疫测定方法测定，如CIE(交叉免疫电泳)，RIE(放射免疫电泳)和SDS-PAGE(十二烷基石克酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)和免疫测定方法，如ELISA和针对诸如主要和/或次要过敏原的提取物的MagicLike特异性IgE测定(LIA)。特定提取物的生物效能，即体内过敏原活性，取决于多种因素，最重要的因素是提取物中主要过敏原和次要过敏原的含量，所述含量随着生物学源材料的组合物而变化。用于获得需要的生物效能的以克计算的过敏原提取物的数量随着相关提取物的类型而改变，并且，对于特定类型的提取物来说，过敏原提取物的数量随着提取物的实际生物效能在不同批次之间有所不同。对于特定批次的提取物来说，用于获得所需生物效能的以克计算的过敏原提取物的数量可以采用以下方法确定a)各秤数量的参考提取物的生物效能是使用一种或多种免疫学体内试验测定的，以便建立生物效能和参考提取物数量之间的关系。所述免疫学体内试验的例子有皮肤穿刺试验(SPT)，眼结膜激发试验(CPT)，用过敏原进行支气管激发(BCA)以及监测一种或多种过敏反应的各种临床试验，例如，参见Haugaard等，JAllergyClinImmunol,Vol.91,No.3，pp709-722，March1993。b)根据所建立的生物效能和参考提取物之间的关系，选择用于本发明剂型的一种或多种相关剂量的生物效能，适当考虑以下因素的平衡i)治疗或緩解过敏反应症状的效果，ii)在免疫学体内试验中记录的副作用，和iii)不同个体之间i)和ii)的可变性。实施平衡，以便获得最合适的治疗效果，而又不会出现不可接受水平的副作用。平衡以上因素的方法为本领域技术人员所熟知。所发现的一种或多种相关剂量的生物效能可以用任何现有的生物效能单位表达，如SQ单位，BAU，IR单位，IU,参见上文。c)用所述参考提取物制备一种或多种生物效能参考标准提取物，如果使用的话，根据分配给所述一种或多种相关剂量的生物效能单位值计算参考标准提取物的生物效能单位值，例如，BAU的单位可以按以下方法从FDA获得。d)对于每一种类型的提取物的参考标准提取物来说，选择用于评估提取物的生物效能的多种参数。所述评估参数的例子有总过敏原活性，特定主要过敏原的数量，以及提取物的总体分子组成。总过敏原活性可以使用体外竟争免疫测定方法测定，如ELISA和MagicLite⑧发光免疫测定(LIA)，使用针对通过标准方法获得的提取物的标准化抗体混合物，例如，在小鼠或兔中产生的抗体，或过敏性患者血清的混合物。例如，主要过敏原的含量可以通过火箭免疫电泳(RIE)定量，并且与参考标准比较。例如，可以通过交叉免疫电泳(CIE)和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检查总体分子组成。e)对于具有未知生物效能的特定批次的提取物(试验提取物)来说，用于获得所需生物效能水平的提取物的数量(用于本发明固体剂型中的有效剂量)可以按以下方法确定对于每一种选择的评估参数来说，试验提取物与参考标准提取物进行比较，使用上文所披露的相关测量方法，并且根据测量结果计算具有所需生物效能的提取物的数量。溶液中不同过敏原的最佳pH像它们的等电点(pl)那样跨越几乎整个pH范围。过敏原样提取物的混合物同样具有溶解度和稳定性的最佳pH，它是由诸如提取物中每一种过敏原的浓度的因素决定的。因此，可以设计用于本发明制剂的pH的可行范围的个别确定。相关过敏原的最佳pH是通过使用具有不同pH的制剂进行加速稳定性研究确定的。所述研究的设计为本领域技术人员所公知。优选将过敏原提取物的pH调整到3.5-10,更优选4-9,最优选6-9。SQ-单位SQ-单位是按照ALK-Abe116A/S"SQ生物效能，，-标准化方法测定的，其中，100，000SQ单位等于标准的皮下维持剂量。通常1mg的提取物包括100，000-1，000，000SQ-单位，这取决于获得它们的过敏原来源和所使用的生产工艺。这意味着，在lmg提取物-10mg过敏原提取物中含有1，000，000SQ,并且，在0.1mg提取物-1mg过敏原提取物中含有100,000SQ。类似地，可以将任何SQ剂量换算成过敏原提取物剂量范围。以此为基础，上面以SQ形式提供的剂量范围可以重新换算成mg或mg过敏原提取物的剂量范围，其中，对于SQ范围的下限来说，使用相应的过敏原提取物的下限，而对于SQ范围的上限来说，使用相应过敏原提取物的下限。精确的过敏原数量，即总的主要过敏原含量和总的过敏原活性可以通过免疫测定确定。质量单位标准化构成了存在于过敏原提取物中的主要过敏原的定量，通过过敏原-特异性免疫测定将其用于临床目的，主要是基于单克隆抗体的2-位点ELISA,它将过敏原含量的质量单位(例如，pg)已知的制剂用作参考。BAU(生物学过敏原单位)是按照FDA对过敏原产品的要求测定的效負巨单位,参见"Quantitativedeterminationofrelativepotencyofallergenicextracts"("MethodsoftheallergenproductstestingLaboratory""EUSAcompetitionassay".Page15，#49N-0012，FDA，October1993)。含有剂量为100，000SQ-单位的青草提取物等于按照上述方法的2600-4700BAU含量。同样，可以按照上述方法评估其他提取物。本发明的治疗方法本发明还涉及用于在对过敏原物质过敏的对象体内诱导耐受性的方法，该方法包括重复施用包括来自所述过敏原物质的过敏原的标准化过敏原提取物中分离的单一剂型，其中，所述单一剂型的每一种过敏原的相对数量随时间推移大体上保持稳定。这一方面的实施方案是这样的，其中，所述单一剂型来自业已与对象的过敏原敏化曲线或过敏群体的过敏原敏化曲线匹配的过敏原提取物，以便1)构成所述对象过敏原的或构成所述过敏群体的主要过敏原的过敏原的总量不超过所述过敏原物质的任意单一种主要过敏原的最大可接受量和/或标准化过敏原提取物中的主要和次要过敏原的浓度是定量控制的，和2)所述过敏原提取物的单一剂型包括免疫有效量的每一种所述过敏原。即，本实施方案以合理的方式利用了本文所披露的标准化提取物，并且这是可行的，因为，医生可以了解特定的标准化提取物和与每一种标准化提取物以及用它制备的药品匹配的最相关的目标群体。在一个相关方面，本发明还涉及用于在对过敏原物质过敏的对象体内诱导耐受性的方法，该方法包括获得所述对象或所述对象所属过敏群体的过敏原敏化曲线，筛选与所述对象对它过敏的过敏原匹配或或过敏原组合物，随后重复施用从标准化过敏原提取物或过敏原组合物中分离的单一剂型，以便诱导对所述过敏原物质的耐受性，其中，所述标准化过敏原提取物和过敏原组合物是这样的，其中l)它的单一剂型所包含的存在于所述群体中的主要过敏原的总量不超过所述过敏原物质的任意单一种主要过敏原的最大可接受量和/或标准化过敏原提取物中的主要和次要过敏原的浓度，并且过敏原组合物是定量控制的，和2)它的单一剂型包括免疫有效量的所述主要和任选性地次要过敏原的每一种。应当理解的是，用于治疗的标准化过敏原提取物可广泛使用(因为所有过敏对象对相同的主要过敏原起反应，并且所述提取物相对主要和次要过敏原来说具有受控制的组成)。不过，当本发明适合用不同的提取物在不同群体内诱导耐受性时，本发明的治疗方法要求标准化过敏原提取物必须是一组至少两种不同过敏原提取物的一部分，其中每一种不同的提取物与在所述群体中有反应性的主要过敏原的群体匹配。不同标准化提取物的数量可能明显大于2，如至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，或至少10。一般，相对于其他变量，本发明的治疗方法按照本领域一般接受的方法实施。一般，患者以如下方式接受单一剂量的过敏原提取物，使剂量随时间增加达到维持剂量，将该剂量正常用于其余治疗。一般，在皮下免疫疗法中起作用的主要过敏原维持剂量范围为每次注射5-20^g,而起始剂量比维持剂量低大约10倍(10)。因此，所述疫苗通常是通过注射，例如，皮下，皮内，真皮内，真皮下或肌内注射等肠胃外施用的。适用于其他施用模式的其他制剂包括口腔粘膜，即口服、含服、舌下、胃肠道制剂、栓剂，以及在某些场合下腹膜内，阴道内，肛门，硬膜外，脊髓，和颅内制剂。所述疫苗是以与剂型相容的形式施用的，并且其用量是治疗有效的和致免疫的。要施用的数量取决于要治疗的对象，例如，包括个体免疫系统产生免疫反应的能力。合适的剂量范围在每次免疫使用几百微克活性成分的数量级上，优选的范围为大约0.1pg-2，OOOpg(尽管1-10mg范围内的更大的数量是可行的)，如大约O.5jtg-2，000pg或O.5pg-l，000pg的范围，优选lpg-500ng的范围，特別是大约2.5ng-100jig和2.5-75|ig的范围，特别优选的范围是10-20jug。合适的治疗方案通常包括起始施用，然后进行随后的接种或其他施用，一般逐渐加大过敏原的剂量，直到达到平高线水平，然后将免疫维持在该平高线水平上。某些口服给药要求每天进行免疫。使用方式可以有很大变化，用于施用疫苗的任何常规方法都可以使用，所述方法包括固体生理学上可接受的底料或生理学上可接受的分散液的口腔粘膜施用，肠胃外注射或类似方法。疫苗的剂量取决于施用途径，并且可以根据要免疫的人体的年龄和抗原的制备加以改变。如上文所述，典型的抗-过敏反应治疗方案要求每次施用使用少量过敏原进行早期免疫，然后随时间推移加大过敏原剂量。其他方法要求口腔粘膜施用含有单一剂量的固体剂型，不需要用不同的过敏原剂量进行任何加量。第三种可能性是液体单一剂量的口腔粘膜或舌下给药，优选不需要用不同的过敏原剂量进行任何加量。本发明的试剂盒可以理解的是，本发明的实施总是取决于存在于过敏原疫苗中的过敏原和要免疫的群体/个体之间的相互作用。在这一方面，作为本发明一部分的"种非常重要的产品是抗过敏试剂盒，所述试剂盒包括-用于剖析过敏对象的诊断工具，以便确定来自过敏原物质的哪一种过敏原在所述对象体内是过敏性的，——组不同标准化过敏原提取物，其中，所述不同标准化过敏原提取物中的每一种包括来自所述过敏原物质的过敏原，所述不同标准化过敏原提取物是相对过敏群体确定的，以便l)每一种标准化过敏原提取物包括在所述每一个群体中有反应性的主要过敏原，以便在所述群体中有反应性的最丰富的主要过敏原和任何其他主要过敏原之间的重量比不超过30:1，和ii)任何次要过敏原和最丰富的主要过敏原之间的比例不超过1:50或次要过敏原的浓度在限定范围内。所述诊断工具可以是本领域公知的任何合适的诊断工具，不过，一般是用于进行免疫测定的装置，它能够检测对多种不同过敏原起反应的对象体内的IgE抗体。优选的免疫测定是ELISA，例如，夹心ELISA，包括涂在固体支持物上的过敏原，然后通过标记过的抗-IgE抗体检测与涂敷过的过敏原结合的IgE。不过，本文所披露的用于剖析过敏对象的任何类型的测定方法都可以使用。同样，本发明还涉及抗过敏试剂盒，所述试剂盒包括-用于剖析过敏对象的诊断工具，以便确定来自过敏原物质的哪一种过敏原在所述对象体内是过敏性的，——组不同的过敏原组合物，其中，所述不同的过敏原组合物的每一种包括来自所述过敏原物质的过敏原，所述不同的过敏原组合物是相对过敏群体确定的，以便每一种过敏原组合物包括在所述群体中有反应性的主要过敏原，以便i)在所述群体中有反应性的最丰富的主要过敏原和任何其他主要过敏原之间的重量比不超过30:1,和ii)任何次要过敏原和最丰富的主要过敏原之间的比例不超过1:50或次要过敏原的浓度在限定范围内。在该实施方案中，所述过敏原是分离的过敏原或重組或合成生产的过敏原。在优选实施方案中，本发明的试剂盒包括不同的过敏原组合物或标准化提取物中的所述过敏原物质的所有主要过敏原。所述试剂盒的标准化过敏原组合物和提取物一般拥有本文所披露的标准化过敏原提取物和组合物的所有特征，这意味着，本文所披露的标准化过敏原提取物和组合物的所有特征加以必要的变更之后可用于所述试剂盒的过敏原组合物和提取物。将通过以下非限定性实施例对本发明进行说明。实施例通过结合以下具体实施例可以获得对本发明更全面的理解。这些实施例仅仅是用于说明目的的，而不是要限定本发明的范围。尽管本文业已使用了专用术语，这些术语仅仅是用于说明目的的而不是用于限定目的。例1本实施例披露了对来自橄榄树花粉的两种过敏原(主要过敏原Olee1和次要过敏原Olee9)的不同的致敏作用形式，所述过敏形式是由生活在具有高或低水平空气传播的橄榄树花粉的地区的患者表现的，以及与所述过敏原的浓度有关的橄榄树花粉批次的可变性，包括对测量橄榄树花粉提取物中Olee9的浓度的新方法的说明。橄榄树花粉是地中海地区和北美某些地区呼吸道过敏反应的最重要的原因(12，13)。迄今为止，业已在橄榄树花粉中鉴定了十种不同的过敏原(14，15)。所有作者都认为Olee1是最重要的过敏原(14，16，17，18)。不过，对于其余过敏原来说，流行性数据是有争议的，因为多种因素，如所选择的群体，分析方法和用于进行测试的试剂可能影响所获得的结果(14)。具体地讲，用花粉提取物进行的试验有可能导致不正确的结果，因为橄榄树花粉的可变性(14，19)，某些过敏原的浓度可能低于所述分析方法的检测极限。为了克服这一问题，本发明人分析了致敏作用的发病率并且使用已知浓度的纯化蛋白在ADVU-Centaur设备上分析了血清特异性-IgE水平，正如下文所披露的。所检测的蛋白是01eel和01ee9。Oleel是具有145个氨基酸残基的蛋白(18-20kDa)，它是以糖基化和非糖基化的形式组成的(20)。所述过敏原属于业已表明与花粉萌发，管生长和/或花粉萌发相关的蛋白家族(21)。Olee9由单个糖基化的多糖链组成(434个氨基酸残基，46kDa)，具有1，3-p-葡聚糖酶活性(22)，它属于2型致病相关蛋白家族。Olee9由两个明确的结构域组成N-末端蛋白(大约340个残基)，包括催化位点，和C-末端结构域(大约IOO个残基)，它的功能迄今未知(23，24)。业已作为重组蛋白在巴斯德毕赤酵母中分别生产了两种01ee9结构域。所述重组蛋白是正确折叠的，并且表现出类似于天然对映体的免疫化学特性(23，24)。为了进行本研究，本发明人比较了用来自生活在报导过具有对橄榄树花粉致敏的类似发病率(25)，但是环境花粉水平不同地区(马德里和Ja6n)的患者的血清获得的结果。因此，例如，在马德里2004年橄榄树花粉散粉季节每天的最大高峰剂量为70个花粉粒/m3，而在Ja6n地区的值为3354个花粉粒/m3(数据来自西班牙过敏反应和临床免疫学协会的网页http://www,seaic.es)。另外，本发明人业已利用基于单克隆抗体(mAbs)的特殊方法分析了花粉提取物中过敏原Olee1和Olee9的含量。用于测量Olee(18)。为了进行01ee9测定，业已生产了新的抗-01ee9抗体，并且业已开发了ELISA方法。这种ELISA方法使用吸附在固相上的一种抗-01ee9单克隆抗体，和作为二级抗体的抗-01ee9兔多克隆血清，参见下文。在以下部分，将提供对所使用的方法的说明，然后，提供所获得的最相关的结果。才法抗-01ee9单克隆抗体的生产正如业已公开，从橄榄树花粉中纯化的Olee9过敏原(22)，是由Dr.Rodrfguez馈赠的(UniversidadComplutense，马德里，Spain)。用溶解在弗氏完全佐剂中的16yg的该过敏原对雌性BALB/c小鼠(CRIFFA，Barcelona,Spain)进行腹膜内注射。在注射后第15天和第30天，用存在于弗氏不完全佐剂中的相同数量的抗原对小鼠进行强化免疫。在第42天，用存在于PBS中的相同剂量的抗原对小鼠进行强化免疫，并且在3天以后将来自免疫小鼠的脾细胞与P3.X63.Ag8.653骨髓瘤细胞按照Galfr6和Milstein的方法进行融合(26)。融合10天之后，细胞通过ELISA用过敏原在固相上筛选抗-Olee9特异性抗体。将P3.X63.Ag8小鼠骨髓瘤培养上清液用作阴性对照。通过有限稀释克隆和亚克隆阳性杂交瘤。使用蛋白G琼脂糖亲和层析柱(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)，按照生产商的说明从杂交瘤培养上清液中筛选单克隆抗体。通过ELISA使用抗-小鼠亚型抗血清(Nordic,Tilburg,TheNetherlands)测定所述抗体的同种型。单克隆和多克隆抗体生产(参见下文)是按照OECDprinciplesofgoodlaboratorypractice(在1997年修改)和EuropeanCouncilDirectiveNo.609(1986)进行的。橄榄树花粉提取物的制备对本实施例来说，来自不同供应商的不同批次的橄榄树花粉是以1:10(w/v)的比例在磷酸緩沖液，pH6.5中，于4。C在磁力搅拌下提取的。可溶性级份是通过在4t:下，以22,000g速度离心20分钟并且用0.22戶滤膜过滤(SartoriusAG，G6ttingen，Germany)分离的。通过亲和层析法纯化Olee9。按照生产商的说明通过将抗-01ee9mAb1.18结合在CNBr-激活的Sepharose4B明胶(AmershamBiosciences)上制备免疫吸附柱。让橄榄树花粉提取物通过该柱，然后用磷酸緩沖的盐溶液(PBS)充分洗涤，用pH2.5的100mM甘氨酸洗脱Olee9。将l-ml级份收集在装有50jal中和緩沖液(lMTris緩冲液，pH9.0)的管中。根据蛋白含量合并级份，用蒸馏水透析，并且以等份样品形式在-4(TC下保存待用。通过SDS-PAGE分析亲合纯化的Olee9的纯度，用SDS-PAGE/免疫印迹对来自橄榄树-过敏性患者血清混合物的IgE结合能力进行分析。用购自BiochromLtd.(Cambridge,UK)的试剂和设备进行氨基酸分析。抗01ee9的多克隆抗血清抗01ee9的多克隆抗体是在新西兰兔子体内生产的。每一只兔子肌内注射溶解在500plPBS中并且用等体积弗氏佐剂(笫一次注射使用完全佐剂，其余使用不完全佐剂)混合的150pg亲和纯化的Olee9进行肌内注射。每15天重复注射1次，并且在每次注射10天之后收集血清。来自两只动物的兔子血清混合物是由3次连续放血组成的。Olee9-ELISAELISA平板(Costar，reference3590，Cambridge,MA，USA)用100m1溶解在PBS中的浓度为10jng/ml的抗-Olee9mAb18.1在4'C下包衣过夜。在用溶解在PBS(PBS-BSA-Tween)中的l%(w/v)BSA，0.05%(v/v)Tween20封闭之后，依次用样品和参照物，抗-01ee9兔血清(1/1000稀释)，和与辣根过氧物酶缀合的山羊抗-兔免疫球蛋白抗体(1/10000稀释；Calbiochem,SanDiego，CA，USA)依次培养。样品，对照和试剂用PBS-BSA-Tween稀释，所有培养都在室温下进行1小时，在两个步骤之间用溶解在PBS中的0.05%(v/v)Tween20洗涤中间产物。检测是通过用过氧物酶底物緩冲液(0.012%H202，0,66mg/ml间苯二胺，OPD;DAKO，Glostrup，Denmark)黑暗中培养30^^钟进行的。然后通过添加IOOm1的2NHC1终止颜色反应，并且在492nm波长下用650-nm基准滤波器读出光学密度。重复进行分析。将封闭緩冲液用作阴性对照。样品的01ee9含量是通过从用从15.7jag/ml开始的八个系列亲合纯化的Olee9的三倍稀释液制备的标准曲线推导获得的。Oleel-ELISAELISA实现的(18)。用100in1溶解在PBS中的浓度为5pg/mi的抗-01ee1mAb0L7在4"C下对ELISA平板(Costar，reference3590)进行包衣过夜。在室温下用溶解在PBS中的r/。BSA封闭30分钟之后，依次用样品和参考物，生物素-标记的抗-01eelmAbOL2(1/1000稀释)和抗生物素蛋白链菌素-过氧物酶(1/1000稀释，AmershamBiosciences)依次培养。所有培养都在室温下进行1小时，在两个连续步骤之间，用溶解在PBS中的0.l%Tween-20洗涤中间产物。最后，在室温下，在黑暗中用过氧物酶底物緩冲液培养所述孔，与Olee9-ELISA类似。30分钟之后，用50jjL的2MH2S04终止该反应，并且在492nm波长下用650nm基准滤波器测量每一个孔的光学密度。分析是重复进行的。将封闭緩冲液用作阴性对照。样品的01eel含量是通过从用具有已知Olee1浓度的参照物的一系列2倍稀释液制备的标准曲线(范围为0.435jug/ml-0.006pg/ml)推导获得的(18)。SDS-PAGE和IgE-免疫印迹SDS-PAGE是使用非还原条件在10-20%曲辛-聚丙烯酰胺电泳胶(Novex，SanDiego，CA，USA)上进行的。将通过SDS-PAGE分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜(0.4x7cm)上，按照Towbin等披露的方法进行(27)。在封闭之后，IgE-结合蛋白的免疫检测是通过用患者血清的1/3稀释液培养，然后依次用小鼠抗-人IgEmAbHE-2腹水(28)的1/3000稀释液和与辣根过氧物酶缀合的兔抗-小鼠免疫球蛋白抗体(1/5000稀释，DAKO)培养实现的。按照生产商的说明(ECL,AmershamBiosciences)通过增强化学发光检测IgE-结合蛋白。作为阴性对照，用稀释緩沖液取代患者血清培养具有转移蛋白的印迹。RAST-抑制通过RAST-抑制测定橄榄树花粉提取物的过敏原活性。用CNBr激活纸圆片，并且用橄榄树花粉室内参考提取物(批号T272)按公开方法(6)进行敏化。在整个实验中使用包含针对橄榄树花粉提取物的特异性IgE的来自20位患者的人类血清混合物。这些患者具有阳性皮肤穿刺试验，并且具有对橄榄树花粉的超敏性病史。在96孔微量滴定板(Costar，reference3370)的每一个孔中添加50ji1体积的血清混合物的1/3稀释液，并且与相同体积的样品(橄榄树花粉提取物)和室内参考物T272的3倍系列稀释液一起在37C下培养30分钟。然后在每一个孔中添加一个过敏原圆片，并且在室温下再培养3-4小时。在用溶解在PBS中的0.1%Tween-20洗涤所述圆片3次之后，添加大约125，000cpm/孔的1251-标记的抗-人IgEmAbHE-2(28)，并且在室温下培养过夜。最后，洗涤所述圆片，并且用y计数器测量结合的放射性。橄榄树花粉提取物的过敏原活性是通过与室内参考物T272比较以BU/ml形式表达的，所述参考物事先业已通过皮肤穿刺试验以BU/ml形式进行过校正(29)。过敏原的生物素化用于本实施例的生物素化的过敏原是天然Oleel和在巴斯德毕赤酵母中表达的Olee9的重组C-和N-末端结构域。所述过敏原业已按以前披露的方法纯化(17，23，24),并且是由Dr.R.Rodrfguez(UniversidadComplutense，马德里，Spain)馈赠的。将过敏原(250Mg)溶解在0.1MNaHC03，pH8.5(500M1)中，并且添加5ja1以5mg/ffll的浓度溶解在N，N-二甲基甲酰胺中的生物素EZ-LinkNHS-LC-LC(Pierce,Rockford，IL，USA)溶液，并且让它在4C下反应2小时。然后让反应混合物通过事先用PBS平衡的NAP5柱(AmershamBiosciences)使多余的试剂与生物素化的过敏原分离。洗脱是使用PBS完成的。用相同体积的甘油稀释含有生物素化的过敏原的l-ml的级份，并且以等份样品形式在-20X:下保存。特异性IgE测定人类血清中的过敏原-特异性IgE是通过ADVIACentaur-特异性IgE测定确定的。血清样品来自生活在马德里(n=49)或Ja6n(n=40)具有对橄榄树花粉的超敏性的过敏性患者，正如通过病史和针对体内诊断商品(ALK-Abel16，S.A.)的阳性皮肤穿刺试验所证实的。生物素-标记的过敏原是按上述方法获得的。为了进行01ee9-特异性IgE测定，混合Olee9的等摩尔数量的重组C-和N-末端结构域。用于ADVIACentaur测定的生物素化的过敏原的最佳剂量是通过滴定标记过的制剂确定的。发现了每次试验的20ng的最佳剂量。校准器、对照和通用试剂包(URP)是从ALK-Abell6(Stenloese，Denmark)获得的。仪器和其他试剂和消费品是从BayerDiagnostics(Tarrytown，NY，USA)获得的。ADVIACentaur-特异性IgE测定是反向夹心免疫测定，使用基于BayerDiagnostics的ADVIACentaur平台的直接化学发光技术，所述平台是连续的和完全自动化的系统，其中，限制参与实践活动的工作人员加载含有顺磁性颗粒和低盐(Lite)试剂的URPs，洗涤緩冲液，酸，碱，样品池，吸液管头，生物素化的过敏原和校准器和条形码对照和血清样品。图l表示所述测定的结构(30)。将血清样品(25m1)分配到样品池中(步骤1)，然后让IgE与和顺磁性颗粒(固相)结合的抗-IgE结合(步骤2)。在进行磁力分离之后，将未结合的血清材料洗去(步骤3)，然后让生物素-标记的过敏原与患者-特异性IgE结合(步骤4)。含有的吖啶嗡酯-标记的抗生物素蛋白链菌素的低盐试剂与结合的过敏原结合(步骤5)，并且在洗涤(步骤6)和激活之后，用光度计测量由所得到的复合物发射的化学发光(步骤7)。在血清样品中的过敏原-特异性IgE的数量和通过所述系统检测的相对发光单位数量之间存在线性关系。用于ADVIACentaur特异性IgE测定的校正系统基于所披露的线性算法(30)。业已提出过每一种过敏原的校正斜率系数等于1。潜^生产抗-01ee9单克隆抗体，并且通过亲和层析法纯化01ee9IgG类型的对Olee9专一的四十种单克隆抗体是从用Olee9免疫的小鼠的脾细胞和P3.X63.Ag8.653骨髄瘤细胞的融合体获得的。选择所述mAbs之一(18.1)用于免疫亲和层析法，并且开发定量Olee9的ELISA。亲和层析法使得本发明人能够从橄榄树花粉提取物中纯化Olee9。该方法比以前披露的其他方法简单，使得Olee9具有高纯度。免疫亲合纯化的Olee9的电泳图谱(图2A)表现出46和92kDa的两条带，它们分别相当于所述蛋白的单体和二聚体形式(22)。两条带是使用来自橄榄树-过敏性患者的血清在Western印迹上免疫染色的(图2B)，表明所述过敏原在纯化步骤之后保持了它的IgE-结合能力。将这种亲合纯化的01ee9用于在兔子体内生产多克隆抗血清。用ELISA对Olee9定量由本发明人开发的对01ee9进行定量的方法，构成了夹心ELISA，具有结合在固相上的mAb18.1和作为二级抗体的抗-01ee9兔血清。兔抗体结合的检测是使用与辣根过氧物酶缀合的山羊抗-兔免疫球蛋白抗体进行的。用来自青草，树木，和杂草花粉的大量提取物评估了该方法的特异性。只有来自属于木犀科(欧洲白蜡树，野丁香和女贞)的花粉提取物在ELISA方法中产生了有效反应，而其余的提取物在所述分析中是阴性的(数据未发表)。以上结果表明，在其他木犀科植物中存在与Olee9同源的蛋白。在ELISA中用亲合纯化的Olee9和橄榄树花粉提取物获得的剂量反应曲线是平行的(图3)，表明所述过敏原在纯化过程中没有改变，并且，所述测定方法在不同制剂中测量的是相同的分子。通过定量氨基酸分析精确测量亲合纯化的Olee9的浓度，并且将该制剂用作ELISA方法的原始标准物。橄榄树花粉的可变性使用上述用于Olee9定量的ELISA，用于Olee1定量的ELISA和用于过敏原活性的RAST-抑制用12种不同批次的提取物研究了橄榄树花粉的可变性。所获得的结果归纳在表l中。表1.各批橄榄树花粉的过敏原活性值(用BU/ml表示)，以及Olee1和Olee9含量(用mg/ml表示)。样品按照在方法部分披露的方式进行分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>观察到了过敏原活性的高可变性。大部分有效提取物的活性几乎是具有最低活性提取物活性的10倍。按照本受让人的生产车间的规定，由于它的低活性而将这样一个样品(样品批号1)排除在用于生产橄榄树过敏反应疫苗之外(图4)。在01eel含量中出现了更高的可变性(图5A)。因此，估计具有最高Oleel含量的样品(样品批号ll)和具有最低含量的样品(样品批号1)之间的比例为25。由于确定了60Olee1/ml浓度的活性为100BU/ml，可接受的范围为30-120g/ml(9)，发现四个其他批次(样品2，4，5，和8)不符合上述规定(图5B)。另外，在分析所述样品的01ee9含量时，发现了出乎预料的异常高的可变性。样品3中Olee9的浓度比样品批次12中的浓度高161倍(图6A)。应当指出的是，Olee9含量差异高达161倍的批次可以按照现有标准化方法释放，因为按照以前的标准，这两种批次都符合规定。在确定过敏原浓度之间的比例时，观察到了更高的可变性(图6B)。另外，观察到了不同批次橄榄树花粉中Olee1和Olee9含量之间的显著的负相关性(rs=-0.7203，p=0.0082)。Olee1/Olee9的比例在0.6-390.4的范围内，几何平均值为17.5。如果根据这一数值确定验收标准，可接受的范围为8.75-35.0，应该排除其他五个批次(样品3，9,10，11，和12)。因此，只有两批(样品6和7)满足上述验收标准。总之，所开发的新方法使得本发明人能够检测不同批次橄榄树花粉可变性的未知来源。以前未曾注意到的01ee9含量的高可变性可能是针对橄榄树免疫疗法的严重有害反应的起源。在橄榄树花粉具有不同接触水平地区对Oleel/01ee9致敏的形式按照在方法部分所述，通过测量针对过敏原Olee1和Olee9的特异性IgE的水平，研究了生活在对橄榄树的过敏反应具有类似流行性，但是接触强度水平具有很大不同地区，即马德里和Ja6n的患者的致敏。在表2中示出了所获得的来自每一个地区的患者体内出现的致敏流行性和特异性IgE水平的中位值。表2.来自马德里和Ja6n的橄榄树-过敏性患者体内的致敏流行性和针对过敏原Olee1和Olee9的特异性IgE水平的平均值。特异性IgE水平>0.35KU/L的患者被认为是阳性的。中位值的估算仅仅考虑了阳性患者。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>以上数据清楚地表明，Olee9在马德里不是流行的过敏原，而它在Ja6n地区更为流行。因此，可以得出这样的结论，当接触强度增加时，患者倾向于产生针对Olee9的IgE抗体。另外，来自Ja和马德里的过敏患者体内的对该过敏原的特异性IgE水平与针对Olee1的特异性IgE水平类似，表明Olee9对所述患者具有重大临床相关性。另外，本发明人没有发现任何对Olee9过敏的患者不会同时对Olee9致敏。这表明，Olee9可以被认为是对橄榄树花粉过敏反应临床严重性的标记。显然，具有这种过敏原识别特征的患者是出现有害反应的高危人群，如果给他们施用高含量的Olee9过敏反应疫苗的话。由于上文所证实的橄榄树提取物Olee9含量的极端可变性和在某些患者体内发现的高特异性IgE水平，该过敏原有可能是决定在Ja6n地区偶尔报导的大量有害反应的决定制剂。总之，本发明人业已证实，被认为是次要过敏原的过敏原对某些患者群体来说可能具有非常相关的临床意义。在对所述患者进行免疫疗法治疗时，为了降低引起有害反应的危险，本发明人提出与实施主要过敏原定量和总过敏原活性方法的同时实施测定次要过敏原的浓度的方法，能够正确选择原材料，并且生产具有适合患者过敏特征的过敏原比例的提取物。所述具有受控制浓度的次要过敏原的提取物可以提高过敏原疫苗的安全性，并且还可以提高它们的效力。例2本实施例披露了来自梯牧草花粉的提取物的过敏原Phip6浓度的可变性，以及这种过敏原与交叉反应性主要过敏原Phip5的紧密的免疫化学关系。提供了用于测量花粉提取物中Phip6的浓度的新的ELISA方法，该方法可用于控制过敏反应疫苗中的这种过敏原。青草花粉是世界范围内最重要的空气传播的过敏原来源之一。对青草花粉的变应性致敏，可能影响一般群体的多达20%,以及特异反应性个体的多达40°乂(31)。迄今为止，业已从一种或多种物种中鉴定和表征了十一种不同类型的青草花粉过敏原。业已在早熟禾亚科的多个成员中鉴定了5型青草花粉过敏原，以及l型过敏原，它们是最重要的青草花粉过敏原(31)。迄今为止已经在梯牧草和早熟禾中鉴定了6型青草花粉过敏原。来自梯牧草的Phlp6是酸性的，非-糖基化的13-kDa蛋白，它最初是作为与Phip5共同纯化并且与它具有交叉反应性的蛋白出现的，并且被称作Agl9(32)。Phlp6和Phlp5过敏原的序列比较发现了在N-和C-末端区域具有高度同源性(33)，并且与来自青草过敏性患者血清的免疫吸附实验证实了Phip5和Phip6拥有一个或多个IgE-结合表位(34)。关于对Phlp6的过敏流行性，在文献中业已报导了差别很大的值。因此，Vrtala等发现来自75%的青草花粉-过敏性患者的血清IgE能与在大肠杆菌中表达的重组过敏原起反应(35)。相反，West-ritschnig等报导了在津巴布韦进行的研究具有15%流行性(36)。业已报导了在意大利进行的两项研究的中间值用77位患者进行的研究的值为68%(37)，和749位患者进行的研究的值为44%(38)。类似地，Ghunaim等业已研究了58位青草花粉过敏性患者的过敏流行性，这些患者按照他们的IgE抗体特征被分成三组单独的青草花粉组(27。/。对重组Phlp6过敏)，青草和树木花粉组(24%)，以及青草，树木和菊科花粉组(57%)(39)。除了更高的流行性值之外，在最后一个组中对Phip6的特异性IgE值的平均值也更高。有趣的是，在最新的文献中，业已研究了生活在芬兰和俄罗斯交界的卡累利阿地区的对梯牧草过敏的对象血清中每一种过敏原的IgE反应性，并且业已发现了对rPhlp6过敏流行性的非常显著的差异(芬兰卡累利阿的47%与俄罗斯卡累利阿的0%)(40)。对于01ee9来说，对Phip6过敏流行性的差异可能体现了接触水平的差别，多重过敏，或其他因素，这些因素在某些群体中可能导致对这种过敏原的特别高的反应。因此，考虑到上述共同的IgE-结合表位出现在Phip6和主要过敏原Phip5中的因素，要给所述患者群体施用的疫苗应当控制Phip6的浓度。在本实施例中，本发明人披露了针对天然和重组Phlp6的单克隆抗体的生产。评估了所述mAbs对rPhlp5的交叉反应性，并且选择能识别Phlp6，而不是Phlp5的一种mAb用于开发定量Phlp6的ELISA方法。使用该方法，业已评估了梯牧草提取物中Phip6含量的可变性。在以下部分，提供了对所使用方法的说明，随后提供了所获得的最相关的结果。才法抗-Phlp6单克隆抗体的生产抗-Phlp6单克隆抗体的生产大体上是按照与例1所述相同的方法进行的。小鼠免疫是使用从花粉中分离的天然Phip6和在巴斯德毕赤酵母中表达的重组Phlp6进行的(41)。通过ELISA，使用天然或重组过敏原在固相上筛选细胞培养上清液的抗-Phlp6特异性抗体。为了检验抗-Phlp6mAbs对Phip5的识别，用吸附在固相上的Phip5进行了类似的测定(41)。使用ProteinGSepharose亲和层才斤柱(AmershamBiosciences)，按照生产商的i兌明从杂交瘤培养上清液中纯化特定单克隆抗体。抗梯牧草提取物的多克隆抗血清抗梯牧草花粉提取物的多克隆抗体是在新西兰兔子体内生产的。每只兔子肌内注射2mg溶解在500p1PBS中并且与等体积的弗氏佐剂(第一次注射使用完全佐剂，其余注射使用不完全佐剂)的提取物。每隔15天重复注射一次，并且在每次注射IO天之后收集血清。来自四只动物的兔血清混合物是通过三次连续放血组成的。梯牧草花粉提取物的制备来自若干供应商的不同批次的梯牧草花粉按例1所述提取橄榄树花粉提取物的方法进行提取。按以前所述通过ELISA测定Phlp5含量(42)。Phip6-ELISA在4t:下用溶解在PBS中的浓度为10Mg/ml的100Ml抗-Phlp6mAbRl.11对ELISA平板(Costar，reference3590)进行包衣过夜。在用溶解在PBS(PBS-BSA-Tween)中的l%(w/v)BSA，0.05%(v/v)Tween20封闭之后，平板的孔依次用样品和参考物，抗-梯牧草兔血清(1/5000稀释)，和与辣根过氧物酶缀合的山羊抗-兔免疫球蛋白抗体(1/15000稀释；Calbiochem)培养。样品，对照和试剂是用PBS-BSA-Tween稀释，并且所有培养都在室温下进行1小时，在两个步骤之间用溶解在PBS中的0.05%(v/v)Tween20洗涤中间产物。检测是通过在黑暗中用过氧物酶底物緩冲液(0.012%H202，0.66mg/mlOPD;DAKO)培养30分钟实现的。然后通过添加100y12NHC1终止颜色反应，并且在492nm波长下用650-nm基准滤波器读出光学密度。分析是重复进行的。将封闭緩沖液用作阴性对照。样品的Phlp6含量是根据用从127ng/ml开始的nPhlp6的十个系列2倍稀释液制备的标准曲钱推导的。潜^抗-Phlp6单克隆抗体的生产以及它们的特异性研究抗nPhlp6的19种mAbs和抗rPhlp6的20种mAbs是从P3.X63.Ag8.653骨髓瘤细胞与分别用天然或重组过敏原免疫的小鼠的脾细胞的融合体获得的。通过ELISA检验了针对Phip6和Phip5的mAbs的特异性。所有mAbs都能同样地识别重组和天然Phip6，证实了所述重组形式是正确折叠的(表3)。_<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>表3.抗-Phlp6单克隆抗体与Phip5的结合。在490nm波长下用固定在固相上的纯的过敏原的直接ELISA的O.D.值。孔按照方法步骤所述依次用杂交瘤培养上清液(1:2稀释)，过氧物酶-缀合的兔抗-小鼠IgG抗体和OPD培养。用星号(*)标记的细胞表示不能识别Phlp5的mAbs;用美元符号($)表示的细胞表示以低亲和力结合Phip5的mAbs。同样，大部分抗-Phlp6mAbs同样能以高亲和力结合Phlp5。这支持了所述蛋白之间的抗原相似性。在39种mAbs中仅有14种不能结合Phlp5，其他三种结合力较弱(表3)。选择一种能识别Phip5所不拥有的Phip6的表位的mAbs(mAbRl.11)开发用于定量Phlp6的ELISA的方法。用于Phip6定量的ELISA由本发明人开发的用于定量Phip6的方法构成了夹心ELISA，具有结合在固相上的mAbRl.11和作为二级抗体的抗-梯牧草兔血清。兔抗体结合的检测是用与辣根过氧物酶缀合的山羊抗-兔免疫球蛋白抗体实现的。评估了对Phlp5的方法的特异性，并且正如根据mAbRl.11的特异性测定预期的，即使Phlp5的浓度高达10Mg/ml也没有出现光学密度(图7)。在ELISA中用天然过敏原作为原始标准物，和使用梯牧草花粉提取物获得的剂量响应曲线是平行的(图7),表明所述过敏原在纯化过程中没有改变，并且该测定方法测量的是不同制剂中相同的分子。因此，业已证实所述方法可用于测量Phip6,而不会受Phlp5存在的影响，尽管它们存在抗原相似性。梯牧草花粉的可变性用来自不同批次梯牧草的6种提取物对梯牧草花粉的可变性进行了初步研究(表4)。表4.通过方法部分所述的ELISA技术测定了来自梯牧草花粉的提取物中5型和6型过敏原的浓度。提取物Phip5(pg/ml)Phip6(pg/ml)Phip6/Phlp5PhiA378.0306.40.81PhiB94.261.40.65PhiC970.0641.10.66PhiD1049.3534,00.51PhiE1179.0680.00.58PhiF736.3770.61.05观察到的5型和6型过敏原浓度的可变性具有相同的数量级(大约12.5倍)。6型与5型比例的可变性在0.51-1.05的范围内。尽管迄今为止所分析的样品的数量不足以得出明确结论，但似乎Phip6的可变性不像数据中所提供的Olee9那样高。然而，另外，如果本发明人考虑了Phip6上的IgE-结合表位与Phip5具有交叉反应性这一事实的话，浓度方面12.5倍的波动可能足以造成有害反应。因此，这两种过敏原浓度波动的叠加作用可能体现了引起对梯牧草过敏反应疫苗的有害反应的较高的危险。因此，本发明人提出，应该测量次要过敏原Phlp6的浓度，并且将Phlp6/Phlp5的比例调整到特定范围内，以便降低所述有害反应的危险。业已证实本发明所提供的ELISA方法可用于实现上述目的。因此，可将它用于选择合适的原材料，并且用于过敏原产物的质量控制，所述产物可以通过混合不同批次的花粉制备，以便获得需要的组合物。例3本实施例披露了对霉菌交链孢菌过敏的患者的个体反应的可变性。本实施例只是用于表明，除了在前面的实施例中所提到的反应之外，个体患者可能产生针对多种不同过敏原提取物中的次要过敏原的强的IgE-反应。因此，所述过敏原的浓度应当通过适当的定量方法加以控制，以便降低有害反应的危险。由于它们固有的复杂性，过敏原霉菌提取物表现出高的可变性。真菌菌林的类型，不同的培养条件，和不同的提取方法是所述不一致性的最重要的原因。迄今为止业已鉴定了十种不同的过敏原(43)。所披露的过敏频率超过5(^的唯一的过敏原是Alta1(43)。本发明人开发了用于定量这种过敏原的mAb-型ELISA方法(44)。然而，根据所提供的结果，本发明人认为，控制所述提取物中的次要过敏原的便利性对某些患者来说在临床上可能相关。才法和趁^交链孢菌原材料由通过培养若干菌林获得的菌丝体和孢子组成，所述菌林是事先根据过敏原活性和蛋白特征选择的。链格孢属原材料是作为例1中的橄榄树花粉提取的，以便进行IgE-免疫印迹实验。结果如图8所示。所有六位患者具有针对Alta1(在非还原条件下的分子量约为33kDa)的IgE。不过，两位患者(33%)能识别大约22kDa的蛋白(它可能相当于Alta7)，有3位患者(50%)能识别分子量低于20kDa的蛋白(可能是Alta6)。应当指出的是，作为特异性IgE水平指标的染色强度在所述患者体内很高，并且与Alta1带的强度相当。这表明，次要过敏原可能也与链格孢属免疫疗法的有害反应相关，因此，应当对临床使用的产品中它们的浓度加以控制。参考文献1)JarvisD，BurneyP(1997)Epidemiologyofatopyandatopicdisease.InAllergyandAllergicDiseases,1stedn，pp1208-24.BlackwellScience,Oxford.2)BousquetJ，LockeyRF，MailingH-J.WHOPositionPaper.AllergenImmunotherapy:therapeuticvaccinesforallergicdiseases.Allergy1998;53Suppl:1-42.3)IshizakaK，IshizakaT，Hornbrook亂Physicochemicalpropertiesofreaginicantibody.V.Correlationofreaginicactivitywithgamma-E-globulinantibody.JImmunol1966;97:840-53.4)JohanssonSG,BennichH.Immunologicalstudiesofanatypical(myeloma)immunoglobulin.Immunology1967;13:381-94.5)LowensteinH.Physico-chemicalandimmunochemicalmethodsforthecontrolofpotencyandqualityofallergenicextracts.ArbPaulEhrlichInt1980;75:122-32.6)CeskaM，ErikssonR，VargaJM.Radioimmunosorbentassayofallergens.JAllergyClinImmunol1972;49:1—9.7)LombarderoM，CarreiraJ，Duffort0.Monoclonalantibodybasedradioimmunoassayforthequantitationofthemaincatallergen(尸e/dIorCat-l).JImmunolMeth1988;108:71-6.8)CalabozoB，Duffort0，CarpizoJA，BarberD，PoloF.Monoclonalantibodiesagainstthemajorallergenof/7ai3fflgo/a/ceo/"apollen,Pla11.AffinitychromatographypurificationoftheallergenanddevelopmentofanELISAmethodforPla11measurementJ//erg/2001;56:429-35.9)CarreiraJ，LombarderoM,VeritasP.Newdevelopmentsininvitromethods.Quantificationofclinicallyrelevantallergensinmassunits.ArbPaulEhrlichInstBundesantSeraImpstoffeFrankAM1994;87:155-64.10)BousquetJ,LockeyRF，MailingHJ.Allergenimmunotherapy:therapeuticvaccinesforallergicdiseases.AWHOPositionPaper.JAllergyClinImmunol1998;102:558-62.11)LowensteinH.Quantitativeimmunoelectrophoreticmethodsasatoolfortheidentificationandanalysisofallergens.ProgrAllergy1978;25:1-62.12)MacchiaL，CaiaffaMF，D'AmatoG，TursiA.AllergenicsignificanceofOleaceaepollen.In:D'AmatoG，SpieksmaFTM，BoniniS，editors.AllergenicpollenandpollinosisinEurope.Oxford:Blackwell;1991.p.87-93.13)D'AmatoG，LiccardiG.Theincreasingtrendofseasonalrespiratoryallergyinurbanareas.Allergy2002;57Suppl71:35-6.14)RodrfguezR，VillalbaM.，BataneroE，Gonz"ezEM，MonsalveRI，HuecasS，TejeraML,LedesmaA.Allergenicdiversityoftheolivetreepollen.Allergy2002;57Suppl71:6-16.15)BarralP，BataneroE，Palomares0，QuiralteJ，VillalbaM，Rodr〖guezR.Amajorallergenfrompollendefinesanovelfamilyofplantproteinsandshowsintra-andinterspeciecroos-reactivity.JImmunol2004;172:3644-51.16)LauzuricaP，MaruriN，GalochaB,Gonz在lezJ，DfazR，PalominoP，HernandezD，Garc〖aR，LahozC.Olivetree(Oleaeuropaea)-pollenallergens.II.Isolationandcharacterizationoftwomajorallergens.MolImmunol1988;25:337—44.17)VillalbaM，L6pez-0tfnC，Martfn-0rozcoE，MonsalveRI，PalominoP，LahozC，Rodr〖guezR.IsolationofthreeallergenicfractionsofthemajorallergenfromOleaeuropaeapollenandN-terminalaminoacids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抗过敏试剂盒，所述试剂盒包括-诊断工具，用于剖析过敏对象，以便测定来自过敏原物质的哪些过敏原在所述对象体内是过敏性的，——组不同的过敏原组合物，其中，所述不同的过敏原组合物的每一种包括来自所述过敏原物质的过敏原，所述不同的过敏原组合物是相对过敏群体确定的，以便每一种过敏原组合物包括在每一个这样的群体中有反应性的主要过敏原，以便i)在所述群体中有反应性的最丰富的主要过敏原和任何其他主要过敏原之间的重量比不超过30:1，和ii)任何次要过敏原和最丰富的主要过敏原之间的比例不超过1:50或次要过敏原的浓度在限定范围内。39.如权利要求38的试剂盒，其中，所述过敏原是分离的过敏原或重组生产的过敏原。40.如权利要求37-39中任意一项的试剂盒，它包括所述过敏原物质的所有主要过敏原。41.如权利要求37-40中任意一项的试剂盒，其中，主要和次要过敏原之间的比例如权利要求18或19所限定。42.如权利要求35-39中任意一项的试剂盒，其中，主要过敏原之间的比例如权利要求19-24中任意一项所限定。全文摘要本发明披露了用于相对主要和次要过敏原的含量标准化过敏原提取物的方法。该方法包括测定特定提取物中过敏原的相对含量，然后调整主要和次要过敏原的含量，以便满足预定极限。还披露了抗过敏试剂盒，它包括用于剖析过敏对象的装置和按照本发明制备的提取物或系列提取物。文档编号A61P37/08GK101115504SQ200680004023公开日2008年1月30日申请日期2006年2月3日优先权日2005年2月3日发明者D·B·埃尔南德斯,F·P·科拉莱斯,M·L·维加申请人:阿尔克-阿贝洛有限公司