专利名称：：用于血液解毒的血液过滤器的制作方法用于血液解毒的血液过滤器本发明涉及用于血液解毒的负载的环糊精的使用。脓毒病综合征是由革兰氏阴性菌感染引起的严重并发症。这种综合征经常累及所有器官，导致多器官机能不全，这需要人工辅助物(自动呼吸器、人工肾脏、强心剂)的应用。脓毒病的一个特别可怕和普遍的并发症是脓毒性休克，这会导致死亡。脓毒病由来自细菌外被膜的外毒素和内毒素的释放引发。此类物质为脂多糖，其在进入循环后，会引发一系列涉及免疫系统的体液和细胞组分的反应。对于该疾病最危险的情形包括严重创伤、肠穿孔、上腹手术，尤其对于糖尿病或免疫抑制老年患者。有机体对内毒素的反应经常导致一系列累及器官微循环的响应(脓毒性级联)。此类反应尽管被认为是有机体对细菌侵入的防御，往往是异常的，诱导许多炎症介质的产生(细胞因子和其他微生物蛋白)，负责该响应的自我放大过程，这引起对器官的严重损伤。抗生素疗法和采用人工辅助物替代受损器官不能总是成功阻止脓毒性级联。因此，脓毒病的最有效治疗方法是，在细菌毒素引起脓毒级联之前，就防止细菌毒素侵入有机体内。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌的细胞膜的特征性组分；它们不存在于革兰氏阳性菌内。它们是由导致毒性的疏水脂质链、亲水中央多糖链和对于各种细菌菌株专一的亲水O-多糖侧链组成的分子。脂多糖在水溶剂中往往形成各种尺寸的聚集体，特别是约1,000KDa重量的微团。因此，通过超滤法无法将它们从血液中分离出来，因为它们不能穿过膜的孔。多年来，已开发出许多血液解毒技术，然而这些技术的缺点在于不是非常有效，并且特别是由于所采用的材料，要求非常高的成本。例如，可得到的血液过滤器包括能给血液解毒的抗生素。但是，此类过滤器成本高昂。通过使用所附权利要求书所概括的血液过滤器，解决了上述问题。下面将参考下述附图来详细解释本发明-图1显示了环糊精的截锥结构；-图2代表了^-环糊精结构的例子。在第一方面，本发明涉及血液过滤器的使用，其包括与环糊精或环糊精衍生物共价结合的固相载体。用于本发明中的固相载体可以为聚合树脂，其通过环糊精和合适交联剂进行的交联反应得到，所述交联剂为例如表氯醇、异氰酸酯、多胺、丙烯酸酯、碳酸酯；或该固相载体可以为纤维或织物载体如纤维素，或非织造织物如聚丙烯，环糊精经化学或物理处理如使用电子束而结合到所述所述固相载体上。在后面的这些材料中，优选的是天然纤维素载体。另一种优选使用的载体是二氧化硅，其涂覆有用环糊精衍生的聚氮丙啶。环糊精(CD)也被称为环状淀粉、环葡聚糖或环麦芽苷，为6至12个葡萄糖单体以4)键连接构成的环状寡糖。CD—词前的希腊字母表示环中存在的葡萄糖单体数目(a对应于6个单体，0对应于7个单体等)。环糊精是通过不同细菌(例子浸麻芽孢杆菌(BacillusMacerans)、肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumonite)、脂肪嗜热芽孢杆菌(BacilluaStearothermophilus)、巨大芽孢杆菌(BacillusMegaterium)等)产生的糖基转移酶(CGTase)酶法降解酰胺而得到的产物。CGTase酶打断了酰胺的螺旋结构，并同时引起葡萄糖分子间形成a(l，4)键，这导致生成环状寡糖。环糊精，如图1和图2所示，具有截锥结构，其羟基朝向结构外部，而碳、氢原子和杂氧化物键朝向结构内部。而且，伯羟基位于直径较小的截锥区域，而仲羟基位于直径较大的截锥区域。该结构赋予CD特殊性质由糖苷氧引起的高电子密度，使得疏水分子的空腔为非极性的，并赋予其外部亲水特性。因此，本发明的原理是将水溶性的环糊精结合到固相载体上。血液通过所述载体，特别是血浆。环糊精的疏水内部空腔可保持细菌内毒素，并因此允许进行血液解毒，然后使清洁的血液重新引入到循环中。解毒的可能性在于，内毒素或脂多糖为疏水分子，因此其与环糊精的疏水内部空腔形成稳定和可逆的络合物，称为包合络合物。在大多数情况下，CD与被寄主(hosted)分子之间的比率为1:1，它们之间没有共价键，而所建立的平衡为结合-解离类型，主要是由于被包住的分子和CD的羟基之间的范德华(Vanderwaals)相互作用和氢键。为了本发明的目的，优选使用的环糊精为a、/3、7-环糊精及其衍生物例如羟丙基、硫酸盐和乙基磺酸盐。最优选的环糊精为a-环糊精。通过使环糊精与合适的交联剂反应而进行固相聚合载体的合成。所述交联剂有利地为双官能团分子，其在两端具有官能团，能与环糊精的伯羟基和仲羟基反应(例如环氧化物和卤化物)。交联剂的例子为表氯醇、异氰酸酯、多胺、丙烯酸酯和碳酸酯；优选使用表氯醇。合成方法是文献中己知的，例如下述论文E.Renard,G.Barnathan，A.Deratani和B.Sebille，"环糊精-表氯醇聚合物的鉴定禾口结构一合成参数的影响(Characterizationandstructureofcyclodextrin-epichlorohydrinpolymers-effectsofsynthesisparameters)(1996)，第乂V届国际环糊精研讨会的会议论文集。合成的聚合物为颗粒状，不溶于水和大多数溶剂(醇、氯仿、丙酮、DMF、DMSO等)。优选用于本发明目的的聚合物是由环糊精和表氯醇交联得到的聚合物，其环糊精含量在200900/miol/g、优选600-800/miol/g范围内。通过将连接单体插入到底物和环糊精之间，进行在纱或织物(如纤维素)或非织造织物上的环糊精在聚合材料(如醋酸纤维素、聚丙烯、聚乙烯或聚酯)上的接枝。有不同的单体可应用于接枝反应中，例如甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)、丙烯酸、N-乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺和醋酸乙烯酯。优选地，所用单体为甲基丙烯酸縮水甘油酯。GMA单体特别引人关注，这是由于存在极其有活性的基团，例如环氧化物。用于将单体接枝到底物上的方法已在文献中描述，例如下述论文P.LeThuaut,G.Crini，M.Morcellet，A.Naggi，U.Maschke，C.Vecchi，X.Coqueret，G.Torri禾口B.Martel，J.Appl.Polym.Sci"(1997);P.LeTh謹t，高分子禾卩有机化学博士论文(MacromolecularandOrganicChemistryDoctoralthesis),里尔禾斗技大学(UniversityofScienceandTechnologyofLille)，高分子和化学实验室(MacromolecularandChemistryLaboratory),"Fonctionnalisationdesupportstextilespour1，Elaborationdefiltresadsorbeursdepolluantsorganiques，，(2000)。该合成法典型地包括下述步骤，经化学或物理处理，例如利用电子束等来活化固相底物。优选的技术是用电子束辐射；，单体的自由基接枝反应，这导致底物的衍生和单体的聚合，生成不同长度的间隔体。一旦将间隔体接枝到底物上，后者由于环糊精而发生官能化。本发明使用的利用CD的织物官能化方法在文献中得到描述，例如下述论文K.Poulakis,H.J.Buschmann和E.Schollmeyer,德国专利4035378Al，(1992);H.Reuscher和R.Hirsenkorn,EP0697415Al,(1995);H.Reuscher和R.Hirsenkorn,德国专利19520967，(1995);P.LeTh腿t，G.Crini,M.Morcellet,A.Naggi，U.Maschke,C.Vecchi，X.Coqueret,G.Torri和B.Martel，J.Appl.Polym.Sci.(1997)。在第二方面，本发明涉及一种给血液解毒的方法，其包括下述步骤a)从罹患脓毒病风险的患者体内抽取血液；b)将血浆与血液其余部分分离，在体外循环的动脉管路上插入聚砜或其衍生物如聚醚砜的血奖过滤器；C)根据本发明将血浆在血液过滤器上过滤；d)将经过滤的血桨与先前分离的血液组分重新合并。一旦完成d)步骤，因此而解毒的血液可立刻回输到患者体内。在第三方面，本发明涉及在不当摄入几种药物种类例如巴比妥酸盐或摄入其他有毒物质后引起血液中毒的情形下，血液过滤器的使用和上述的血液解毒方法。这些物质，如脂多糖，与在载体上的环糊精形成络合物，并因此从血液中除去。实验数据聚合载体材料的合成环糊精可通过使一种羟基与表氯醇，即双官能团分子反应而被聚合。在碱性环境中，表氯醇可与CD反应(交联反应)和/或与其自身反应(均聚反应)，如反应图解l所示，导致聚合物合成，如图解2所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>在热稳定的反应器中，机械搅拌器将不同比例的环糊精(Wacker)和NaOH(CarloErba)混合在水溶液中。搅拌1小时后，缓慢滴入所需量的表氯醇(Fluka)，立刻可观察到高粘度的带白色的糊状物的形成，按表1所述，对其进行不同时间的剧烈搅拌。然后添加丙酮(Acros)，通过古氏(gooch)过滤来回收产物。通过在索格利特(Soxhlet)中利用热水和乙醇(Girelli)冲洗聚合物，从而除去过量的未反应的表氯醇和环糊精。最后，经冷冻干燥法来干燥所回收的产物。为了确定合成产物中存在的CD,利用比色测量(使用苯酚)来量化经聚合物总水解得到的葡萄糖。为此，将20mg的聚合物悬浮在5ml的1M三氟乙酸(Fluka)中，在剧烈搅拌下，将该悬浮液于12(TC加热8小时。之后，蒸发该溶液以除去三氟乙酸。在lOml蒸馏水中回收产物。通过比色测量，利用苯酚和硫酸来确定葡萄糖含量。该方法需要校准线为此，如表所示，制备具有不同葡萄糖浓度的溶液(Fluka)，初始母液为lwt。/。葡萄糖(lg/1)。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>对水解的聚合物溶液重复相同的步骤。实际上，从10ml中性溶液中吸取不同的体积，再以不同量的水稀释，如表中所示<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>将这些溶液放置在试管内，向其中添加0.5ml的5wty。的苯酚水溶液(CarloErba)。10分钟后，添加2.5ml的98%H2S04(CarloErba)，剧烈搅拌。在这次添加后的另外IO分钟后，读取480nm处的吸光度。采用朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律，有可能建立起校准线，并因此确定在水解的聚合物溶液中的葡萄糖含量。通过这种方式，获得环糊精的含量，其以jumol或pg/g材料表示。在合成的聚合物中环糊精含量的计算允许将材料分成两组低(~300/imol/g)CD含量和高(600/800/rniol/g)CD含量。表1所得聚合物的描述<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表格中表示为0-20的材料通过使用文献中已知的方法来合成(E.Renard，G.Barnathan,A.Deratani和B.Sebille，"环糊精-表氯醇聚合物的鉴定和结构——合成参数的影响(Characterizationandstructureofcyclodextrin-epichlorohydrinpolymers-effectsofsynthesisparameters)"，(1996)，第八届国际环糊精研讨会的会议论文集)。在鉴定和计算研究络合能力的过程中，将该材料作为参照。根据合成中所用实验条件的分析，据推断，获得高环糊精含量材料的基本参数为反应混合物中存在的溶剂的量。织物和非织造织物中的固相载体的合成根据在"将环糊精接枝到聚丙烯非织造织物上用于制造活性滤器.II鉴定(Graftingofcyclodextrinsontopolypropyleneno而ovenfabricsforthemanufactureofreactivefilters.IICharacterization)"B.Martel，P.LeTh腿t,G.Crini，M.Morcellet，A.Naggi，U.Maschke，S.Bertini，C.Vecchi，X.Coqueret，禾口G.TorriJ.Appl.Polym.Sci"78:2166-2173,(2000)中描述方法，根据图3中描述的图表，制备织物。米用通过50KGy(5Mrad)电子束来提供基本活化剂量的器械，以530Mmd来物理活化非织造织物，为了得到更大剂量，重复辐射。将活化的织物浸入在含有1-70%浓度单体的水浴中，并在惰性气氛中7(TC下加热20200分钟，从而进行甲基丙烯酸縮水甘油酯的接枝反应。在延长的洗涤和干燥后，根据织物重量的增加来计算结合GMA的量。将官能化的织物浸入到环糊精在DMF/H20中的溶液中，加热到80°C，持续8-24小时，进行环糊精的衍生化。所引入的环糊精的量根据在延长的洗涤和干燥后织物重量的增加而计算得到。反应图解3初始反应和增长<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>本发明的在载体上的环糊精的生物活性的实施例实施例1.从水溶液的间歇吸收测试下述材料类型与表氯醇(P1776:Gel(凝胶)beta(/3)CD;P1780:Gelgamma(7)CD;P1793:Gelalpha(ce)CD)交联的环糊精、用以CD衍生的聚氮丙啶涂覆的二氧化硅(SiPEICD)、以/3-环糊精(P1708)衍生的聚丙烯载体。使含有再水合的并经洗涤的CD的lOOmg每种材料与5ml(10mg/L)LPS在蒸馏水中的溶液搅拌2ore。使222mg的P1708与3ml的溶液搅拌2小时。通过在5000rpm下离心5分钟来回收溶液。通过在1.6juc玻璃纤维过滤器上过滤，从上清液中抽取不同的等分部分。将第一份(0.5ml)用苯酚/硫酸方法分析，将第二份(5ml)冻干，并在1.6ml中处理后，按照羰花青染料分析方法进行计量。苯酚/硫酸方法对于等分样品(500/il)，其被添加到的5%苯酚水溶液中，与环糊精的官能化反应<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>添加2ml的浓硫酸；在培育20分钟后，经小心搅拌，于480nm波长处读取吸光度。羰花青染料分析方法试剂1)羰花青染料2)pH4的0.03M的醋酸钠缓冲液3)1，4-二氧杂环己垸pH4的0.03M的醋酸钠缓冲液(1:1体积比)4)0.1M的抗坏血酸为了制备染料溶液，将试剂1以1:2的比率(w/vo1)添加到试剂3中；当溶解完成时，以1:4(vol/vol)的比率添加试剂2，最后以1:0.01(vol/vol)的比率添加试剂4。为了化验，将冻干的等分部分在0.4ml的试剂2中进行处理，加水至lml体积。搅拌后，添加0.6ml的染料溶液，并于室温下培育5分钟。在460nm波长下进行吸光度的读取(JohnsonK.G."Methodsincarbohydratechemistry(碳水化合物化学中的方法)"中的"Isolationandpurificationoflip叩olysaccharides(脂多糖的分离和纯化部分)"，由BeMillerJ.N.WhistlerR丄.ShawD.H.编辑)。作为比较，将在类似条件下获得的材料样品以相同的条件测试，但没有环糊精的衍生化(P1458;SiPEI;)。表2记录了保留的LPS数据。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实施例2.通过0.15MNaCl溶液进行的间歇吸收基于所得的结果，在LPS水溶液中和在0.15MNaCl溶液中再次测试树脂P1776、P1780、P1793和P1708。在这种情况下，处理200mg的P1793,与用5ml(lOmg/L)LPS的蒸馏水溶液搅拌2小时的100mg的P1776和P1780相比。至于P1708，称取228mg，用3ml50〃g/ml的LPS在0.15MNaCl中的溶液搅拌2小时。同样在这种情况下，通过在5000rpm下离心5分钟来回收溶液。根据实施例1中描述的苯酚/硫酸方法，分别测量两个等分部分(500/11)。表3(在0.15MNaCl中的溶液)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>基于与表氯醇交联的环糊精的材料表现出良好的吸收值，通过交联的白色CMC(P1458)所显示出的吸收能力的缺乏，可以设想其中没有来自于交联剂交联的贡献。观察到下列吸收能力等级/3<7<a，材料中的CD量相同。在离子力存在时，也观察到类似的结果。实施例4.低压柱中的吸收将200mg的树脂P1793再水合过夜，然后用300ml的水在柱中洗涤。将20ml的10ptg/mlLPS溶液通过树脂，收集3ml(实验I)和lml(实验II)部分。冻干每个部分，并在羰花青存在下进行测量，如实施例1所述。表4和5中分别记录了第一实验和第二实验中在各个部分中以Mg/ml表示的LPS的浓度。观察到柱的初始有效性和逐渐的饱和。表4部分LPS(Atg/ml)13223647表5部分LPS(/xg/ml)02162233405262748394106113125133144154162173184193实施例5.高压下的吸收将790mg的P1780树脂填充到HPLC柱中，用蒸馏水洗涤和再水合5小时。将5ml的20pg/ml的LPS溶液通过树脂，连续再循环30分钟，然后按照实验方法1中所述的苯酚/硫酸方法，以加倍剂量测量等分部分(500/xl;溶液2)。为了比较，在再循环(溶液l)前，还测量了LPS溶液的等分部分。表6记录了以/ig/ml表示的所测LPS浓度。显示了60。/。的LPS吸收。表6溶液LPS(Atg/ml)124214.51按照LAL-测试方法(CAMBREX)测试相同的溶液。制备"最佳"稀释物以利用该方法的灵敏度阈，预计为0.125EU/mL。表7给出了该结果。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>观察两种制剂之间的比较表明了对于两种比例稀释物进行试验的不同阳性结果；因此可假设，在用TCD处理的样品中，其LPS的除去率等于约60%。优点使用在载体上的环糊精生产用于从血液中选择性除去脂多糖的血液过滤器，这显著降低了单个血液过滤器的成本，对于罹患脓毒病的患者的健康是非常有利的；环糊精是能容易因而经济地供应的化合物。而且，血液解毒的有效性比其他当前现有的过滤器高得多。在载体上的环糊精的使用允许进行血浆的单次过滤以完全除去内毒素，这不同于现有技术的解毒系统，该解毒系统需要反复应用才能达到相同结果。权利要求1.负载于固相载体之上的环糊精用于制备血液过滤器的用途，所述血液过滤器用于除去血液中的脂多糖。2.如权利要求1所述的用途，其中所述固相载体为聚合树脂。3.如权利要求2所述的用途，其中所述聚合树脂为与交联剂交联的环糊精，所述交联剂选自表氯醇、异氰酸酯、多胺、丙烯酸酯、碳酸酯。4.如权利要求2或3所述的用途，其中所述聚合树脂为与表氯醇交联的环糊精，其中环糊精含量在200900/miol/g的范围内。5.如权利要求4所述的用途，其中所述环糊精含量在600800Atmol/g的范围内。6.如权利要求15中任一项所述的用途，其中所述固相载体为覆盖有聚氮丙啶的二氧化硅。7.如权利要求l所述的用途，其中所述固相载体为纱、或织物或非织造织物。8.如权利要求7所述的用途，其中所述织物为纤维素，所述非织造织物为聚丙烯、聚乙烯、聚酯、醋酸纤维素。9.如权利要求7或8所述的用途，其中所述非织造织物为聚丙烯。10.如权利要求19中任一项所述的用途，其中所述环糊精通过连接单体结合到所述纱、或织物或非织造织物。11.如权利要求IO所述的用途，其中所述连接单体选自甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)、丙烯酸、N-乙烯基吡咯垸酮、丙烯酰胺和醋酸乙烯酯。12.如权利要求ll所述的用途，其中所述连接单体为甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)。13.如权利要求112中任一项所述的用途，其中所述环糊精选自a-环糊精、/3-环糊精和7-环糊精，优选a-环糊精。14.如权利要求113中任一项所述的用途，用于由不当摄入有毒物质和/或药物所引起的中毒情况。15.用于血液解毒的方法，包括下述步骤a.从罹患脓毒病风险的患者体内抽取血液；b.将血浆与血液其余部分分离；c.如权利要求114中任一项所述，用负载的环糊精过滤所述血浆；d.将经过滤的血浆与先前分离的血液部分重新合并。16.如权利要求15所述的方法，其包括在步骤d)后，将纯化血液回输给患者的步骤。17.如权利要求15或16所述的方法，其中从血液中除去细菌内毒素和外毒素。18.如权利要求17所述的方法，其中所述细菌内毒素和外毒素为革兰氏阴性菌的脂多糖。19.如权利要求1518中任一项所述的方法，其用于预防脓毒病综合征。20.如权利要求1519中任一项所述的方法，用于将有毒物质和/或药物如巴比妥盐从血液中除去。全文摘要本发明涉及用于从血液中除去细菌毒素(脂多糖)的血液过滤器的用途，所述血液过滤器包括与环糊精共价结合的固相载体。所述固相载体可以是织物或非织造织物或聚合树脂，所述聚合树脂通过用合适的交联剂如表氯醇对环糊精进行交联而得到。文档编号A61M1/36GK101247841SQ200680027598公开日2008年8月20日申请日期2006年7月27日优先权日2005年7月28日发明者乔治·格拉齐亚尼,安娜玛丽亚·纳吉,詹贾科莫·托里申请人:仁爱米拉索莱有限公司;朱利亚纳龙佐尼化学和生化研究院