专利名称：：登革血清型2减毒株的制作方法登革血清型2减毒林本发明涉及新型活的减毒VDV2(VERO来源的登革血清型2病毒)毒林，其通过在PDK上传代和Vero细胞消毒(sanitization)而衍生自野生型登革2型毒林16681。本发明进一步涉及包含此类VDV2毒林的疫苗组合物。登革病由黄病毒属(Gubler，1988)的4种紧密相关但抗原不同的病毒血清学类型(Gubler，1988;Kautner等人，1997;Rigau-P"ez等人，1998;Vaughn等人，1997)引起。登革病毒血清型感染可以产生一系列临床疾病，从非特异的病毒综合征到严重的致命的出血性疾病。蚊虫叮咬后登革热(DF)的潜伏期平均为4天(范围为3-14天)。DF的特征在于双相热、头痛、身体各个部分的疼痛、衰竭、疹、淋巴结病和白细胞减少(Kautner等人，1997;Rigau-P"ez等人，1998)。病毒血症期与热性疾病相同(Vaughn等人，1997)。从DF恢复通常在7-10天中完成，但长时间的虚弱是常见的。白细胞和血小板计数减少是时常发生的。登革出血热(DHF)是特征在于稳态异常和血管渗透性增加的严重热性疾病，所述血管渗透性增加可以导致血容量减少和低血压(登革休克综合征，DSS)，这通常并发严重内出血。如果不治疗，DHF的病死率可以高达10%，但在大多数具有治疗经验的中心低于1%(WHOTechnicalGuide,1986)登革热感染的常规实验室诊断基于病毒的分离和/或登革热病毒特异性抗体的检测。登革病是仅次于疟疾的第二种最重要的热带传染病，全世界有超过一半的人口(25亿)生活在处于流行传播危险中的区域。估计每年发生50，000，000-100，000，000例登革热、500，000位住院的DHF患者和25，000例死亡。登革热是亚洲、太平洋、非洲、拉丁美洲和加勒比海的地方流行病。超过IOO个热带国家具有地方流行的登革热病毒感染，并且DHF已在超过60个这些国家中得到证实(Gubler，2002;Monath，1990。许多充分描述的因素似乎涉及登革热感染人口增长，特别是与贫困相关的无计划和不受控制的都市化，空中旅行增加，缺乏有效的蚊虫控制，以及卫生和公共卫生基础恶化(Gubler，2002)。在旅行者和移居国外者中对于登革热的认识渐增(Shirtcliffe等人，1998)。登革热已证明是在具有登革热地方流行的热带区域部署期间美国军队中热性疾病的主要原因(DeFraites等人，1994)。所述病毒在涉及人和埃及伊蚊(J^/esaeg//7〃)的周期中维持，所述埃及伊蚊是更喜欢以人为食的、家里的、白天叮咬的蚊子。人感染由在受感染埃及伊蚊的血液饲喂过程中的病毒注射起始。唾液病毒主要储存于脉管外组织中。在接种后被感染的主要细胞亚群是树突状细胞，它随后迁移至引流淋巴结(Wu等人，2000)。在皮肤和引流淋巴结中进行初期复制后，病毒在急性发热期期间出现在血液中，一般持续3-5天。单核细胞和巨噬细胞与树突状细胞一起在登革热病毒的主要靶中。针对同型再感染的保护是完全的并且可能是终身的，但登革热类型之间的交叉保护持续小于12周(Sabin,1952)。因此，受试者可以经历不同血清型的第二次感染。第二次登革热感染是形成严重登革病的理论上的危险因素。然而，DHF是多因素的，包括所涉及的病毒林，以及患者的年龄、免疫状态和遗传素质。两种因素在DHF的发生中起主要作用伴随高病毒血症(该疾病的严重度与病毒血症水平相关(Vaughn等人，2000))的快速病毒复制，和伴随炎症介质高水平释i文的重要炎症应答(Rothman和Ennis，1999)。没有针对登革病的特异疗法。DF的处理由卧床休息、用退热药和镇痛药控制发热和疼痛、以及足够的流体摄入来支持。DHF的治疗需要流体丧失的校正、凝血因子的替换和肝素输注。预防措施目前依赖于媒介控制和个人防护措施，这难以执行并且昂贵。目前没有注册针对登革热的疫苗。因为登革的4个血清型在全世界流通，并且因为它们被报告涉及DHF病例，所以疫苗接种应理想地给予针对所有4种登革热病毒血清型的保护。再现天然免疫性的活的减毒疫苗(LAVs)已用于开发针对许多疾病的疫苗，包括属于与登革相同的属的几种病毒(商购可得的黄病毒活减毒疫苗的例子包括黄热病和日本脑炎疫苗)。活减毒病毒疫苗的优点是它们的复制能力以及诱导体液和细胞免疫应答的能力。此外，由针对病毒不同组分(结构和非结构蛋白)的完整病毒粒子疫苗诱导的免疫应答再现了由天然感染诱导的那些。登革热疫苗计划在泰国于CentreforVaccineDevelopment,InstituteofSciencesandTechnologyforDevelopment,MahidolUniversity开始。在实验室规模上成功开发了候选活减毒疫苗，其对于在原代犬肾(PDK)细胞中的登革血清型l(毒林16007,第13代)、血清型2(毒林16681，第53代=LAV2)和血清型4(毒林1036，第48代)病毒，以及对于在原代绿猴肾(PGMK)细胞(第30代)和胎恒河猴肺(FRhL)细胞(第3代)中的血清型3(毒林16562)。这些疫苗已在泰国志愿者中作为单价(单种血清型)、二价(两种血清型)、三价(三种血清型)和四价(所有四种血清型)疫苗进行了测试。这些疫苗被发现在儿童和成人中是安全并具有免疫原性(Gubler,1997)。这些LAVl-4毒林已在Mahido1University的EP1159968中进行描述，并保藏于CNCM(分别为CNCMI-2480;C腦I-2481;C腦1-2482和C顧1-2483)。Den-2毒林16681于1964年在曼谷从DHF(登革出血热)患者的血清中获得(Halstead等人，1970)。原始的病毒血症血清已在BSC-1细胞(非洲绿猴肾细胞)上传代4次和在连续LLC-MK2细胞(恒河猴肾细胞)上传代5次。在1977年，病毒在易感性的猴(普通猕猴(施caca齒""a))中体内传代1次，随后再次在LLC-MK2细胞中传代。于1M0年进行了在蚊子(安邦巨蚊(7bxor力7"c力/^3迈6o/z7e/7Ws))中的另外2次传代。病毒减毒通过于32。C在PDK细胞(原代犬肾细胞)上传代来进行。毒株的减毒根据几种体外和体内标记进行检查。第50代满足所有这些减毒标准，并且在第53代时被选择作为用于疫苗生产的主种子(masterseed)(1982)。DEN-2PDK53疫苗候选物在人中进行评估，并且发现是强免疫原性的，而没有不利的临床体征和症状(Bhamarapravati等人，1989)。登革2型活减毒病毒林(LAV2)的完整序列于2001年由R.Kinney等人(CDC，FortCollins)确定。亲本DEN-2毒林16681(SEQIDNo.3)和LAV2(SEQIDNo.38)毒林之间的序列差异描述在表1中。因此，野生型病毒林16681和LAV2毒林的遗传比较显示了一组9个点突变，所述点突变可以与LAV2减毒相关联。表l:DEN-216681和DEN-216681/PDK53(LAV2)的序列差异<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>修改相应密码子的核苷酸变化以斜体指出。最初于1983年建立的LAV2毒林进一步,皮迅速鉴定为潜在的疫苗候选物(Bhamarapravati和Yoksan，1997)。然而，在那时，没有意识到通过哺乳动物培养物向具有海绵状脑炎的人的传播是一种危险，并且病毒常规地维持在原代犬肾细胞(PDK)中。此外，这种LAV2毒林相应于异质群体。由于在所述组合物中存在的毒林之一的潜在体外或体内选择，这种异质性代表了另外的危险。考虑到这些渐增的担心，申请人决定建立消毒(sanitization)过程以便消除任何此类危险。通过用纯化的LAV2基因组RNA转染Vero细胞，随后为在Vero细胞中三个循环的扩增，以及病毒噬斑纯化的两个顺次步骤，申请人生产了新型Vero来源的血清型2病毒(VDV2)。通过转移至VER0细胞和生物学克隆而如此获得的这种新型VDV2毒林，在序歹ij、同质谨斑大小(homogenousplaquesize)和温度敏感性方面不同于LAV2毒林，但重要的是保留了LAV2的某些表型和基因型特征，例如减毒点(attenuationspot)、小嗟斑表型、在高温时的生长限制，并且保留了LAV2毒林的免疫原性特征。这些特征使得这种新型毒林成为用于在人中进行预防性免疫接种的有价值的疫苗候选物。定乂"登革热病毒"是属于黄病毒科黄病毒属的正义单链MA病毒。在登革血清型2(DEN-2)毒林16681的情况下，整个序列长度为10723个核苷酸(SEQIDNo.3)。RNA基因组在5'末端处包含I型帽，但没有3'末端poly(A)尾。基因结构是5'-非编码区(NCR)、结构蛋白(衣壳(C)、前膜/膜(prM/M)、包膜(E))和非结构蛋白(NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5)以及3'NCR。病毒RNA基因组与C蛋白结合从而形成核壳体(二十面体对称)。如同其他黄病毒一样，DEN病毒基因组编码翻译成单个多蛋白的不间断开放读码框(0RF)。登革2型的强毒(致病)林的连续传代导致分离出经修饰的病毒，其是"活的且减毒的"，即有传染性但不能引起疾病。这些经修饰的病毒通常在猴中进行测试以评估其减毒。然而，人是唯一显示出临床疾病体征的灵长类。这样的病毒称为"活的且减毒的"，即其在大多数受试人中引起轻度(即就调节目的而言是可接受的，因为呈现出正的利益/风险比)至低的次级效应或者不引起次级效应(即全身事件和/或生物学异常和/或局部反应)，但仍进行感染并诱导免疫应答。术语"LAV"指活的减毒登革热病毒株。在本发明的情况下，"LAVs"是通过在原代犬肾(PDK)细胞中传代而最初来源于登革血清型2(DEN-2)毒林16681的活的减毒株。例如，"LAV2/PDK53"是毒林16681在PDK细胞中传代53次后建立的减毒林(DEN-216681/PDK53)。"LAVVPDKSO"是毒林16681在PDK细胞中传代50次后建立的减毒株(國-216681/PDK50)。LAV2/PDK53核苷酸序列显示于SEQIDNo.38中。"VDV2"意指通过本申请中公开的消毒过程可获得的LAV。因此，VDV2是生物学克隆(均质的)VERO-适应的登革血清型2病毒，其能够在灵长类特别是人中诱导特异性体液免疫应答，包括中和抗体。本发明的VDV2毒林可以容易地直接从本文公开的VDV2序列开始重建。特异性体液免疫应答的诱导可以通过ELISA测定法容易地进行测定。在已接种疫苗者血清中的中和抗体的存在通过如4.1.1.2.2节中所述的噬斑减少中和测试来进行评估。当如此测定的中和抗体滴度为至少大于或等于1:10时，血清被视为对于中和抗体的存在是阳性的。术语"突变，，意指遗传材料例如DNA、RNA、cDNA中任何可检测的变化，或者此类变化的任何过程、机制或结果。突变包括一个或多个核苷酸的置换。在本申请的情况下，在登革2型病毒基因组序列或多蛋白中鉴定的突变依照Dunnen和Antonarakis(2000)的命名法进行命名。如由Dunnen和Antonarakis限定的，在核酸水平上，置换由">"指明，例如"31A>G，，表示参考序列第31位处的核苷酸A变成G。在蛋白质水平上的变异描述了突变结果且如下报告。终止密码子由X指明(例如，R97X表示Arg96变成终止密码子)。氨基酸置换例如由"S9G，，指明，这意指第9位处的Ser被Gly替换。r朋。^源^登革J&清^2病善(^""J先前开发的登革2型疫苗候选物LAV2的组成通过消毒过程得到改善。本文公开的VER0来源的疫苗登革血清型2(VDV2)使用通过在PDK细胞上连续传代而减毒的DEN-216681病毒。VDV2包含完整活减毒DEN-2病毒的基因组序列，并且具有与在人中测试的原始LAVZ毒林相同的与减毒相关联的减毒点。LAV2疫苗的消毒通过去除蛋白质并只将纯化的病毒基因组材料导入Vero细胞中来进行。更具体而言，毒林的消毒通过纯化病毒RNA并将病毒RNA转染到Vero细胞中来进行。该过程包括下列步骤a)从噬斑-纯化的LVA2毒抹，例如DEN-216681/PDK50病毒中提取和纯化病毒RNA;b)有利地使純化的RNA与阳离子脂质结合；c)转染Vero细胞，特别是Vero细胞LS10;d)回收新合成的病毒；和e)通过噬斑纯化来纯化VDV毒林，和任选地使其在宿主细胞特别是Vero细胞中扩增。Vero细胞技术是众所周知的技术，其已用于不同的商业产品(可注射的和口服的脊髓灰质炎疫苗、狂犬病疫苗)。在本发明中，限定的Vero细胞有利地用于保证不存在可能与外来因子存在相关的任何危险。"限定的VER0细胞"意指这样的细胞或细胞系，即关于其的培养条件是已知的，并且所述细胞不含任何外来因子。这些包括例如SanofiPasteur的VER0细胞LSIO。如此分离的VDV毒林通常以冷冻组合物形式或冻干产品形式贮存。为了那个目的，VDV可以与稀释剂相混合，所述稀释剂通常是包含冷冻防护化合物例如糖醇和稳定剂的緩冲水溶液。如通过PH计于RT测定的，在冷冻或冻干前的pH有利地^:定为6-9，例如约7,例如pH7.5+/-0.2。使用前，将冻干产品与药学稀释剂或赋形剂例如无菌NaCl4%。溶液相混合，以重构液体免疫原性组合物或疫苗。在转染和克隆过程中选择出在NS3-250位置处的LAV2疫苗毒株的Glu变体，并且同样也被鉴定为对于LAV2疫苗的减毒来说关键的位置5'NC-57和NS1-53在VDV2序列中均被保留。与SEQIDNo.38相比较，在转染后回收的病毒的减毒特异性基因座处进行的测序没有显示任何突变。经生物学克隆的VDV2病毒显示出同质噬斑表型和相对于其LAV2亲本的显著遗传稳定性，因为它尤其可以由减毒基因型的保守性中推导出来。对VDV2(第11代)毒林进行测序，并且与血清型2登革活减毒病毒(LAV2)毒林序列(SEQIDNo.38)进行比较。鉴定了一组10个核苷酸差异，其引起了位于M和Env结构肽以及非结构肽NS3和NS5中的6个氨基酸置换。这些差异无一相应于任何所述LAV2减毒位置。表2:LAV2/PDK53和VDV2第11代毒林之间的序列比较。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>灰色阴影结构蛋白中的差异；斜体非结构蛋白中的差异。本发明因此提供了活的减毒登革2型病毒^^，其由野生型病毒DEN-216681获得，DEN-216681通过在PDK细胞上连续传代并随后通过在VER0细胞上消毒来进行减毒。特别地，本发明的减毒林至少包含相对于野生型DEN-216681和LAV2/PDK53毒林的核苷酸序列或多蛋白序列的鉴定出的序列突变(非沉默和任选地沉默的)。因此，本发明涉及分离的活的减毒登革2型病毒林，其包含LAV2/PDK53毒林的序列(SEQIDNo.38),或由LAV2/PDK53毒林的序列(SEQIDNo.38)组成，其中至少第736、1619、4723、5062、9191、10063和10507位的核苷酸，以及任选地第1638、2520、9222和10361位的核苷酸被突变，条件是下列核苷酸不被突变57、524、2055、2579、4018、5547、6599和8571。优选地，所述突变是置换。优选地，第736位的核苷酸是C,第1619位的核苷酸是A，第4723位的核苷酸是A,第S062位的核苷酸是A，第9191位的核苷酸是A，笫10063位的核苷酸是A，和第10507位的核苷酸是G。第5270位的核苷酸可以是A或T,优选A。更加优选地，根据本发明的分离的毒林包含序列SEQIDNo.38，其中所述序列至少包含突变736G>C、1619G>A、4723T>A、5062G>C、9191G>A、10063T〉A和10507A>G,和任选地突变1638A>G、2520G>A和/或9222A>G。因此，根据本发明的活的减毒登革2型病毒林可以包含野生型登革2型毒抹16681的序列(SEQIDNo.3)，或由野生型登革2型毒抹16681的序列(SEQIDNo.3)组成，其中所述序列至少包含突变57C>T、524A>T、736G>C、1619G>A、2055C〉T、2579G>A、4018C>T、4723T>A、5062G>C、5547T>C、6599G>C、8571C>T、9191G>A、10063T〉A和10507A〉G。优选地，相对于野生型毒林16681的核苷酸序列(SEQIDNo.3)，根据本发明的活的减毒林进一步包含突变1638A>G、2520G〉A和/或9222A>G。根据本发明的活的减毒登革2型病毒株可以包括变异林，所述变异林包含如上文限定的在第736、1619、4723、5062、9191、10063和10507位突变的序列SEQIDNo.38，并且进一步包含给定密码子位置中的一个或多个核苷酸置换，所述核苷酸置换不导致那个位置处编码的氨基酸的改变。有利地，根据本发明的活的减毒登革2型病毒林包含这样的序列，其通过数目有限的突变，例如不超过5个、更加优选地不超过2个突变，而不同于SEQIDNo.1。优选地，根据本发明的登革2型病毒林的基因组序列由核苷酸序列SEQIDNo.1组成。本发明还涉及活的减毒登革2型毒林，其可以通过在细胞特别是Vero细胞上进一步传代而衍生自序列SEQIDNo.1的VDV2毒林。本发明还涉及分离的核酸，其包含DNA序列SEQIDNo.l或其等价RNA序列，或由DNA序列SEQIDNo，1或其等价RNA序列组成。"核酸分子"指核糖核苷(腺苷、乌苷、尿苷或胞苷；"RNA分子")或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；"DNA分子")的磷酸酯聚合形式，或其任何磷酸酯类似物例如硫代磷酸酯和硫酯，其为单链形式或双链螺旋。如本文使用的，与SEQIDNo.1"等价"的RNA序列意指其中脱氧胸苷已被尿苷替换的序列SEQIDNo.1。因为SEQIDNo.1构成VDV2cDNA序列，因此等价的RNA序列相应于VDV2的正链RNA。本发明进一步涉及序列SEQIDNo.2的多蛋白及其片段。SEQIDNo.2是由SEQIDNo.1编码的多蛋白的序列。参考蛋白质的"片段"意指其序列包含参考蛋白质的相邻氨基酸链的多肽。片段的长度可以是至少8个、至少12个、至少20个氨基酸。序列SEQIDNo.2的多蛋白的所述片段至少包含M蛋白第9位(SEQIDNo.2的第214位)的精氨酸，和/或E蛋白第2M位(SEQIDNo.2的第508位)的谷氨酸，和/或NS3蛋白笫69位(SEQIDNo.2的第1543位)的苏氨酸，和/或NS3蛋白第181位(SEQIDNo.2的第1656位)的组氨酸，和/或NS5蛋白第541位(SEQIDNo.2的第H"位)的赖氨酸，和/或NS5蛋白第832位(SEQIDNo.2的第30"位)的苏氨酸。才艮据一个实施方案，由SEQIDNo.1编码的多蛋白的片段是M蛋白，和/或E蛋白，和/或NS3蛋白，和/或NS5蛋白，或者包含M蛋白，和/或E蛋白，和/或NS3蛋白，和/或NS5蛋白。免疫原性和疫苗组合物本发明还涉及包含根据本发明的VDV2毒林的免疫原性组合物，其适合于用作疫苗。根据本发明的免疫原性组合物引发针对登革热病毒的特异性体液免疫应答，包括中和抗体。优选地，免疫原性组合物是疫苗。夕、根据一个实施方案，免疫原性组合物是单价组合物，即，它引发针对登革2型病毒的免疫应答和/或给予只针对登革2型病毒的保护。根据另一实施方案，本发明涉及多价登革免疫原性组合物。此类得。免疫原:性或疫苗i合物;以进二步包含至少另一种血清型的活减毒登革热病毒。特別地，免疫原性或疫苗组合物可以包含与选自血清型1、血清型3和血清型4的至少一种活减毒登革热病毒相组合的根据本发明的VDV2。优选地，免疫原性或疫苗组合物可以是四价登革疫苗组合物，即包含与活的减毒登革1型病毒林、活的减毒登革3型病毒林和活的减毒登革4型病毒林相组合的根据本发明的VDV2的疫苗组合物。活的减毒登革1型、登革3型、登革4型病毒抹先前已得到描述。可以参考由MahidolUniversity开发的活减毒疫苗，通过在原代犬肾(PDK)细胞中传代登革血清型1(毒林16007，第U代；LAV1)和血清型4(毒林1036,第48代，LAV"病毒，以及在原代绿猴肾(PGMK)细胞(第30代)和胎恒河猴肺(FRhL)细胞(第3代)中传代血清型3(毒林16562)(LAV3)。LAV1(SEQIDNo.40)、LAV3(SEQIDNo.41)和LAV4(SEQIDNo.42)的核苷酸序列显示于所附序列表中。有利地，活的减毒登革1型毒林可以相应于VDV1毒林，其通过根据本发明的消毒过程而从由Mahidol开发的LAV1毒林获得。特别地，活的减毒登革1型毒株(VDV1)可以包含序列SEQIDNo.39，和有利地由序列SEQIDNo.39组成。免疫原性组合物(包括疫苗)可以制备为为注射剂，其可以相应于液体溶液、悬浮液或乳状液。活性免疫原性成分可以和与之相容的药学上可接受的赋形剂相混合。根据本发明的免疫原性组合物或疫苗可以使用本领域技术人员已知的任何常规方法进行制备。常规地，将根据本发明的抗原与药学上可接受的稀释剂或赋形剂例如水或磷酸盐緩冲盐水溶液、湿润剂、填充剂、乳化剂、稳定剂相混合。赋形剂或稀释剂将根据所选药物形式、施用方法和途径以及药学实践来进行选择。合适的赋形剂或稀释剂以及关于药物制剂的要求在Remington，sPharmaceuticalSciences中得到描述，所述参考文献是这个领域中的参考书的例子。优选地，免疫原性组合物或疫苗相应于可注射组合物，其包含緩冲水溶液以维持例如6-9的pH(于RT用pH计测定的)。根据本发明的组合物可以进一步包含佐剂，即改善或增强由VDV2毒林引发的免疫应答的物质。在人疫苗领域中常用的任何药学上可接受的佐剂或佐剂混合物可以用于这个目的。根据本发明的免疫原性组合物或疫苗可以通过在人疫苗领域中常用的任何常规途径进行施用，例如肠胃外(例如皮内、皮下、肌内)途径。在本发明的情况下，免疫原性组合物或疫苗优选是在三角肌区中皮下施用的可注射组合物。^f^瘦凝并W才法本发明进一步提供了针对登革感染对有此需要的宿主进行免疫接种的方法，其包括给宿主施用免疫有效量的根据本发明的疫苗组合物。"有此需要的宿主，，指处于登革感染危险中的人，即去存在登革热病毒感染的地区旅行的个体，以及那些地区的居民。施用途径是疫苗领域中使用的任何常规途径。施用途径的选择取决于所选择的制剂。优选地，免疫原性组合物或疫苗相应于有利地在三角肌区中经由皮下途径施用的可注射组合物。免疫原性组合物或疫苗中的LAV或VDV特别是VDV2的量可以方便地表示为病毒噬斑形成单位(PFU)单位或细胞培养半感染剂量(CCID5。)剂型，并且通过使用常规药学技术来进行制备。例如，对于单价组合物，根据本发明的组合物可以以包含10-106CCID5。，或103-105CCID5。LAV或VDV，例如4±0.5log1()CCID5。的剂量的VDV2毒林的剂型进行制备。当组合物是多价的时，为了减少病毒干扰的可能性并因此达到平衡的免疫应答(即针对组合物中包含的所有血清型的免疫应答)，在所施用的疫苗中存在的每种不同登革血清型的量可以是不相等的。"免疫有效量，，是能够诱导特异性体液免疫应答(包括在已接种疫苗者血清中的中和抗体)的量，如通过如4，1.1.2.2节中所述的谨斑减少中和测试所评估的；当如此测定的中和抗体滴度为至少大于或等于1:10时，血清被视为对于中和抗体的存在是阳性的。施用体积可以依施用途径而变。皮下注射可以为约0.1ml-1.0ml,优选0.5ml的体积。关于组合物施用的最佳时间是在最初暴露于登革热病毒之前约1-3个月。本发明的疫苗可以作为预防剂在处于登革感染危险中的成人或儿童中施用。因此，所靶向的群体包括未接触过登革热病毒的人以及接触过登革热病毒的人。本发明的疫苗可以以单次剂量进行施用，或者任选地，施用可以涉及使用致敏剂量，随后为加强剂量，所述加强剂量例如在2-6个月后施用，这由本领域技术人员确定为适当的。本发明将根据下列附图和实施例进一步进行描述。附l是VDV2种子的历史概括。图2是流程图,其概述了所开发的产生填充产品(单价)，"即用型"剂量的制备过程。图3是VDV2基因组图i普的图示。上方的箭头是多蛋白的编码序列。下方的箭头表示成熟肽的编码序列。直条表示野生型登革2型毒株16681和LAV2毒林之间的核苷酸变化。星号标明LAV2和VDV2之间的核苷酸变化。图4显示于37匸孵育7天后，对登革2型病毒LAV2、VDV2和毒林16681的噬斑大小分析。图5是图形分析，其显示了关于登革2型病毒LAV2、VDV2和毒林16681的噬斑大小分布。fil是用于在未接触过黄病毒的健康成人中评估VDV2单价疫苗的安全性的实验设计的概括。实施例实施例1:消毒1.1病毒RNA的纯化RNA纯化和转染过程如下进行。将DEN-2/PDK50悬浮液重悬浮于0.5ml水中并进行稀释，以l更包含至少3x104和直至3x107TCID50或PFU的病毒/毫升。向0.5ml病毒中加入在0.01mlWilliam's培养基中稀释的1个单位benzonase，以便消化来自细胞来源的DM或RNA分子，并使溶液于4。C在搅拌器上孵育2小时。在孵育步骤结束时，加入0.65ml包含氯化胍、去污剂(SDS)和P巯基乙醇的变性緩沖液(RTL-P巯基乙醇緩冲液，在试剂盒RNeasyMinikit,QiagenRef.74104中提供)，并且蛋白质用苯酚/氯仿(1/1，体积/体积)提取l次，再用氯仿(体积/体积)提取l次，随后于室温在14，000rpm下离心5分钟。每次提取后，收集水相，注意不要收集界面处的材料(白色沉淀)，并且转移到干净的lmlE卯endorf管中。随后根据制造商(RNeasyminikit，QIAgen)的建议将RNA溶液施加到QIAgen柱上，以便去除痕量溶剂，并用0.06ml不含核酸酶的H20水洗脱。病毒RNA的存在通过定量RT-PCR，使用用已知量的病毒建立的参考曲线进行证实，单位为TCID5。/ml。1.2用纯化的RNA转染Vero细胞转染使用lipofectamine(LF2000Reagent,LifeTechnologies)来进行，所述lipofectamine是通过电荷相互作用与RNA结合并且允许通过与细胞膜融合而将复合物转移到细胞的细胞质内的阳离子脂质混合物。LF2000试剂的最佳量在预备实验中通过下述过程来测定使在16-24小时前铺板(在6孔平板中，0.3-0.5x106细胞/孔)的Vero细胞与剂量渐增的(5-20lipofectamine—起孵育。细胞随后于32。C和5%C02下孵育4-5小时，之后用不含FCS的新鲜培养基替换该培养基，并于32。C继续孵育过夜。在倒置显微镜下定期检查毒性(圆形、有折射力或漂浮的细胞，细胞单层的同质性)，共48小时。在这些条件下无毒的lipofectamine的最高剂量是10nil,并且被选择用于RM转染。使用1/4的RNA制备物(根据qRT-PCR为约2x104logeqTCID5。)平行地进行4次转染。将25微升的病毒RNA溶液在500jil包含15piLF2000Reagent(通过电荷相互作用与RNA结合并且允许通过与细胞膜融合而将复合物转移到细胞的细胞质内的阳离子脂质混合物)的OptiMEM培养基(GIBCO)中进行稀释。在4次反应的2次中加入200ng酵母tRNA作为载体。在加入至6孔平板的汇合Vero细胞并在361C孵育之前，允许4种转染混合物于室温沉淀10分钟。4小时后，去除转染混合物并将细胞在PBS中漂洗1次。加入3毫升转染后培养基(Williams,GIBC0),并于32。C继续孵育5天。该培养基随后用3ml登革感染培养基(补充有10mMMgS04的Williams)替换。在转染后第8天，在tRNA存在下进行转染的2个孔中的l个之中检测到呈现出典型的致细胞病变效应(圆形、有折射力的细胞)的细胞病灶。在这些细胞的上清液中病毒的释放通过qRT-PCR来证实。转染后11天，只在这个孔中检测到显著的致细胞病变效应，而其他3个经转染的孔的上清液保持阴性。将在转染后回收的病毒溶液重命名为TV100(代替16681PDK50/Vero-2)，并且在包含冷冻保护剂的緩冲水溶液中进行I/2稀释后显示出5.8logTCID5。/ml的感染滴度(pH=7.5)。1.3转染后回收的病毒的表征对减毒重要的特异性基因座的点测序由R.Kinney(CDC,FortCollins)来进行。数据呈现于表3中。表3:在减毒特异性位置处的转染病毒测序<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>VDV2保留了在5'NC-57和NS1-53处的重要的减毒基因座，以及在PDK53疫苗中的NS3-250-Glu变体的野生型16681基因座。观察到在PDK53疫苗中的NS3-250-Glu/Val混合物在PDK45和PDI[53代之间是稳定的，这暗示选择已在Vero细胞中发生。从已接种疫苗者血清中分离的DEN-2疫苗的先前分析已证明，这种选择也可以在人中发生。病毒噬斑直径在Vero细胞中进行测量。简而言之，Vero细胞以1，000，000细胞/ci^的密度在包含4%FBS的培养基中进行铺板。过夜醉育后，去除培养基，并用系列2倍或5倍稀释的病毒感染细胞。于37。C和5。/。C02下1.5小时后，去除接种物，并将细胞在包含1.26%甲基纤维素和IOo/qFBS的极限Eagle培养基(MimimalEagleMedium,MEM)中于37。C和5。/。002下进行孵育。孵育11天后，平板于-20。C在冷丙酮中固定20分钟，并通过使用稀释至2.5jug/ml的黄病毒特异性mAb的免疫染色来显示。病毒噬斑使用图像分析软件(Saisam/Microvision)来领l]量。将VDV2与LAV216681/PDK50种子进行比较(表4)，并且显示出直径1-3mm的相似的均质小噬斑。表4:LAV216681/PDK50和VDV2的嗟斑大小<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>LP/MP:在6个孔中大/中等噬斑的数目SP:在6个孔中小噬斑的数目1.4噬斑纯化对转染后回收的病毒进行3次另外的扩增传代(P2-P4)。对经P3和P4传代病毒(分别命名为LST003和LST007)进行通过噬斑纯化的生物学克隆。筒而言之，Vero细胞在6孔平板中进行铺板，并用系列稀释的病毒进行感染，以便获得每板1-20个噬斑。于37tl和5%0)2下1.5小时后，去除接种物并使细胞在3ml固体培养基中进行孵育，所述固体培养基由在42C预加热的MEM-10%FCS组成，并与在"t!进行平衡的2%熔化琼脂糖即时混合。允许培养基于室温凝固30分钟；在流动通风橱(flowhood)中，并将板以倒置位置于321C-5%0)2孵育10天。随后加入补充有0.01%中性红的第二层相同培养基，并使板于32。C再孵育l夜。在无菌条件下使用配备有0.1ml尖头(tip)的微量移液管(micro-pipet)挑取6个良好分离的小噬斑，并转移到包含0.2ffllMEM-4%FCS的无菌管内3个来自P3代(鉴定为克隆31、32和33)，和3个来自P4代(鉴定为克隆71、72和73)。该悬浮液通过涡旋振荡进行均质化，在相同培养基中进行系列稀释，并立即用于感染Vero细胞的6孔平板。重复该方案，并进行第二次挑取，在克隆32、33、71和72上挑取2个SP,和在克隆31上挑取1个SP。在Vero细胞上扩增之前，在T25ci^烧瓶中将每个被挑取的噬斑在1ml培养基中进行稀释。在感染后第6天收集培养基，用相同体积的包含冷冻保护剂的緩冲水溶液(pH7.5)进行稀释，并冷冻于-7(TC。所有这些步骤于32。C进行。经噬斑纯化的病毒分别命名为311、321、322、331、332、341、342、351、352、711、712、721和722。感染滴度在第一次扩增结束时在Vero细胞上进行测定(参见下文)克隆311:3.95LogCCID5。/ml克隆321:5.20LogCCID5。/ml克隆322:5.45LogCCID5。/ml克隆331:5.55LogCCID5。/ml克隆332:4.95LogCCID5。/ml克隆341:2.80LogCCID5。/ml克隆342:4.85LogCCID5。/ml克隆351:5.35LogCCID5。/ml克隆352:5.50LogCCID5。/ml克隆711:5.45LogCCID5。/ml克隆712:5.65LogCCID5。/ml克隆721:5.30LogCCID50/ml克隆722:5.60LogCCID5。/ml对于下列3个克隆进行在Vero细胞上的第二次扩增331、352和722。在感染后第8天收集培养物上清液，用包含冷冻保护剂的緩冲水溶液(pH7.5)作1/2稀释，并命名为TV331、TV352和TV722。1.5经克隆的病毒的表征在第一次扩增后，所有扩增的病毒显示出相同的噬斑大小表型以及等于或高于5logCCID5。/ml的滴度(除了明显较低的克隆311和341之外)。对来自笫一次扩增的6个克隆(克隆321、331、351、352、711、721)和来自第二次扩增的3个克隆进行在减毒特异性位置处的测序，并且没有显示出突变。在克隆之间不存在任何显著差异的情况下，选择TV722并在VERO细胞中进行扩增，以便产生VDV2疫苗候选毒株。表5:在DEN-2病毒的减毒特异性点处的测序<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>核苷酸位置在各自基因下指明，并且参考DEN-216681毒林的公开序列。总之，总共11次传代对于获得在VERO细胞上进行适应的DEN-2166681/PDK50的生物学克隆是必需的。然后，通过测定VDV2第11代的完整序列和表型测试来进行进一步的表征。实施例2:测序病毒全序列根据下述策略产生。纯化病毒基因组RNA。通过16次重叠RT-PCR反应而扩增出完整基因组。每次PCR被这样设计，即使得在每条DNA链上添加测序标签。这使得测序反应更简单，所有测序反应均由单对通用测序引物来驱动。每种PCR产物在2条DNA链上进行个别测序。所有结果被重新装配以重建完整的VDV卩基因组。2.1材料2.1.1病毒此处涉及的病毒是DEN-216681;LAV-2/PDK53;VDV2，其序列在所附的序列表中给出。这些病毒的完整基因组序列长度为10723个核苷酸。2.1.2引物所有引物已在Seqweb生物信息学软件包(Accelrys),引物设计模块中进行了设计(表6)。表6:RT-PCR和测序引物列表<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>2.2方法2.2.1病毒RNA的纯化根据以前的经验，需要最低限度1000DICC5。以在接下来的步骤中获得阳性RT-PCR反应。这意味着需要最低限度104DICC5。/mL的病毒滴度。病毒基因组RNA使用QIAamp病毒RNA小试剂盒(Qiagen)根据制造商的建议进行纯化。简而言之，将来自粗制病毒样品的140体积在裂解溶液存在下进行孵育，并加载到试剂盒柱上。洗涤步骤后，纯化的病毒RM通过60ju1包含1ju1(40个单位)RM酶抑制剂(RNAseOut,Sigma)的、不含核酸酶的无菌水进行洗脱。2.2.2反转录病毒RM通过来自ABGene的反转录酶(反向iT)反转录成cDNA。再次应用标准操作条件，在20jli1的最终反应体积中使用10jul纯化的RNA。反应通过负链引物的杂交来起始。每次PCR进行1次RT反应。cDNA合成通过于47'C孵育45分钟来获得。2.2.3PCR所有PCR采用ExpandHighFidelityPCR系统(Rochediagnostics)，使用来自表6的所有16对引物(+)和(-)来进行。PCR条件如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>所有PCR产物通过在琼脂糖凝胶上进行电泳来检查。2.2.4测序测序反应的主要部分已夕卜包给GenomeExpress。基因组末端、错读(ambiguities)、某些内部PCR接头以及用于4支术原因而未由GenomeExpress测序的区域在机构内部(in-house)进行。.在GenomeExpress的测序PCR产物于+4。C进行运输，并且测序结果作为信息序列文件被接受。关于每个单个序列，可获得文本文件、质量文件(qualityfile)和色镨图。序列比对后，在色语图上检查所有差异，并且如果鉴定为序列算法误差则进行校正。机构内部测序测序反应使用SequithermExcellIILC试剂盒(Epicentre)在热循环仪PTC-200(MJResearch)上进行。每种PCR产物在单个反应中独立地对2条链进行测序。将反应体系加载到测序电泳凝胶上。测序运行和分析在自动化测序仪GeneReadIR4200(Li-Cor)上进行。2.3结果所有PCR片段使用共同的PCR添加尾从2个末端开始进行测序，所述PCR添加尾即在所有引物的5'末端处添加的特异性基序5'引物M13SEQ-GTTTTCCCAGTCACGAC(SEQIDNo.36)3'引物:M13REV-AACAGCTATGACCATG(SEQIDNo.37)M13-SEQ和M13-REV序列相应于通用M13引物基序(NewEnglandBiolabs标准)。对于最终重叠群装配，在VectorNTi中，在ContigExpress才莫块26测序反应DM高达200/250ng反应緩冲液7.2pi引物(1-2pM)各1.5Ml酶1^1H20高达20pi添加3Ji1变性/加样緩沖液。样品于95。C变性3分钟，并紧在样品加载前用水冷却。测序电*氺电泳参数_凝胶参数_1500V凝胶高度41cm35mA凝胶厚度0.2mm40W温度45'C时间9H00扫描速度330个循环92。C50"C70"C70X:PCR程序压流率行电电功i中中4少少.*>-少CJ\<J乂>*JSi性交伸伸n杂延延(Informax)中进行快速分析。将LAV2参考序列与所有单个测序结果进行比较。在此类条件下，所有结果可以在完整基因组上的右侧位置处进行比对，甚至当某些区域仍缺少重叠群装配时，从而产生总基因组比对的快速显现。2.3.1完整的VDV2序列的装配最终序列比对在VectorNTi,AlignX模块(Informax)中进行。通过软件将常规多重序列比对算法ClustalW(Thompson等人，1994)用于建立总体比对。所有序列结果连同LAV2参考序列一起比对，从而允许更好地重建基因组。关于参考而言在序列中的任何差异需要在另一次独立测序反应上进行证实。VDV2的完整序列显示于SEQIDNo.1中。通常在单个序列中发现某些错读，特别是在序列末端附近。这是在任何PCR片段的2个末端处一定程度的反应质量差的内在原因。此类质量差的序列被排除在比对之外，直至可从其他PCR产物获得2个其他独立的测序反应。当在至少2个独立的与共有序列相匹配的其他PCR序列中未得到证实时，相对于参考的差异在最终比对中不加以考虑。相反地，在2个独立序列上证实的任何差异在最终序列中保留。表7概括了每个单独测序反应的特征，指出了起点、终点和长度。还指出了邻近PCR之间的重叠，以及指出了在最后一列中与参考序列的差异。表7:登革VDV2单独序列的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>基因組的2个末端不能由PCR扩增进行测序，因为cDNA合成和PCRDNA反应需要与基因组末端互补的寡核苷酸。在扩增步骤过程中，这些寡核普酸被掺入PCR片段中。序列结果是合成的寡核苷酸的序列，而不是病毒自身的序列。来自病毒基因组2个末端的PCR确实正确地运转，这暗示病毒序列与所述寡核普酸序列并无显著不同(如果有显著不同，那么PCR扩增应当已失败或至少应当具有差的质量)。我们不能将它们与所有其他PCR扩增区分开。因此，在重建的基因组中，2个基因组末端被视为等同于寡核苷酸序列(并且还等同于参考)。在5'末端，所述序列是核苷酸1-32的序列。在3'末端，所述序列是核苷酸10695-10723的序列。2.3.2序列比较已检测到相对于亲本LAV2基因组序列的IO个核苷酸差异。VDV2疫苗毒林通过病毒消毒和从犬到猴细胞的传代而衍生自LAV2。LAV2和VDV2之间的差异可以具有几个来源。首先，克隆步骤可以选出与LAV2中先前检测的主要序列并非100%—致的病毒亚群。其次，LAV2在PDK细胞上产生，而VDV2在Vero细胞上制备。此类从犬到猴细胞的传代已知可能诱导病毒变化，其反映了对新细胞系的适应。第三，对于所有RNA病毒，较低的病毒RNA聚合酶保真度触发了比DM聚合酶更高的基因组突变率。就序列而言，与LAV2病毒减毒相关的所有9个核苷酸位置在VDV2第ll代中被保留。此外，VDV2笫9代和第11代之间的序列比较显示，在第9和11代之间发生2个突变，所述突变与表型、病毒血症和免疫原性的差异相关联。表8:LAV2/PDK53毒林与VDV2第9和11代毒林之间的序列比较<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>斜体VDV2第9代和第11代之间的序列差异当在所有可获得的Genbank血清型2登革基因组序列之间进行序列比对时，看起来只有2个位置由其他登革2毒株(1638和2520)共享，两者在氨基酸水平上都是沉默的。所有其他位置对于VDV2第11代毒林是特异的，这触发了氨基酸置换(表8)。关于氨基酸变化，非结构肽中的4个变化从生物化学观点来看是相对保守的，而M和包膜中的2个变化产生电荷和疏水性中的修饰。实施例3:表征这些研究的目的是评估减毒标记中的变化是否通过传代而出现。图2中显示的流程图概述了所开发的产生填充产品(单价)，"即用型"剂量的制备过程。简而言之，VDV2第8代在Vero细胞上2次连续传代后，获得各自的工作种子(workingseed)。最终病毒培养也通过感染Vero细胞悬浮液来实施。随后收获产生的病毒。脱氧核糖核酸(DNA)根据酶处理进行消化。杂质通过超滤来去除。感染滴度通过浓缩步骤而得到增强。加入包含冷冻保护剂的緩冲水溶液(pH-7.5)，并且随后将这种经0.22-jum过滤的混合物在相同溶液内稀释至靶定的剂量。然后将活性物质填充到玻璃管形瓶内，冷冻干燥，并在使用前进行贮存。3.1表型标记表9呈现了来自对DEN-216681wt毒林、DEN-216681/PDK53疫苗毒林、VDV2第9代和VDV2第11代(最后的适应传代物)进行的3种表型测定法的数据温度敏感性(Ts)，在猴细胞(Vero)和蚊子细胞(C6/36)上的生长曲线，和在新生小鼠中的神经毒力(数据在CDC获得)。减少的小鼠神经毒力(减少的死亡率和更长的平均存活时间(AST))、于39'C的受限制的生长和在C6/36上的受限制的复制目前被科学界认为是登革热病毒的减毒标准。Vero-适应的传代物显示出清楚的Ts特性，并且比DEN2/PDK53更受限制。最后的适应传代物在这种测定法中被限制约3log。温度敏感性还通过病毒生长曲线来证实。在Vero细胞上，对于所有受试病毒观察到相似的复制水平。在蚊子细胞上，Vero-适应的病毒的病毒生长与wtDEN2相比较明显被限制(约3log),和与DEN2/PDK53相比较稍微被限制(约0.5log)。令人惊讶的是，Vero-适应的病毒的小鼠神经毒力接近于wtDEN2的神经毒力，并且显著高于DEN2/PDKS3疫苗的神经毒力。这些数据指出相关于病毒林减毒来说这种说法的低预测值(参见临床数据)。图5比较了VDV2第9和11代、DEN2/PDK53以及wtDEN2的噬斑大小分布。WtDEN2显示出异质特性95%的噬斑具有大小均质特性，主要群体(81%)具有<0.6mm的噬斑和次要群体(12%)具有1-2mm的噬斑。这种特性接近于，但不同于DEN2-PDK53的特性。值得注意的是，中间适应传代物VDV2P9显示出更异质的特性，主要群体(70%)具有1-2咖的噬斑，和次要群体(25%)具有<0.6mm的噬斑。这些数据证明，VDV2毒株在第9代时仍未完全适应，并且需要2次另外传代以获得在Vero细胞中稳定复制的均质群体。表9:DEN-卩病毒表型的概括<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>N:动物数目实施例4:在猴中的免疫原性、病毒血症和毒理学可以在猴中获得的最可靠和众多的数据涉及免疫原性和病毒血症。特别地，病毒血症已被鉴定为与人中的毒力和疾病严重度有关的因素之一，并随后构成了所考虑的重要参数。很显然，免疫原性是测试疫苗时的关键参数。发明人已确定了关于病毒血症和免疫原性的最小/最大值。表10:对于在猴中由登革疫苗候选物诱导的应答的最低要求，如在Vero或LLC-MK2细胞(这些细胞在此类测定法中视为等价的)中通过噬斑测定法测量的_<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>pfu:谨斑形成单位PRNT50:噬斑减少中和滴度50(相应于噬斑数目减少50%的滴度)4.1在动物中的临床前药理学、药物动力学和产物代谢4.1.1材料和方法4人丄7凝,發猴实验根据关于动物实验的欧洲指南来进行。对来自毛里求斯(CRPLeVallon)的恒河猴(食蟹猴(施caca/^c/c"/ar"))进行免疫接种。在免疫接种前，猴在SanofiPasteur的动物研究所隔离检疫6周。猴通过皮下(SC)途径在臂中用体积0.5ml的疫苗进行免疫(参见各个分别的部分)。在用氯胺酮(Imalgene,Merial)轻度麻醉后，通过刺破腹股沟静脉或隐静脉来收集血液。在第0和28天，抽取5ml血液用于评估抗体应答，而在第2和10天之间只抽取1ml血液用于评估病毒血症。在冰上收集血液并保持在冰上直至血清分离。为了做到这点，血液于4C离心20分钟，并且收集血清并贮存于-80。C直至在RichKinney，s实验室中进行测试。在干冰中装运到美国。《人7,2病#益症和哞和戎##吝f哞希^试，户^7V所有分析在CDC，FortCollins,USA的R.Kinney实验室中进行。装运血清样品并贮存于-80。C直至测试时。在第一次解冻时，就病毒血症测试样品，并对血清作1:5稀释。在就中和抗体进行测试之前，使1:5血清稀释物于56"C灭活30分钟。4.1.1.2.1病毒血症将0.125ml血清加入至在96孔平板的第1个孔中的0.1"ml稀释剂(RPMI培养基)之中，并进行10倍系列稀释，对于每次稀释将0.025ml转移到0.225ml稀释剂中。将0.2ml10°3-105'3稀释系列在Vero细胞的6孔平板中进行铺板(病毒于37'C吸附1.5小时，用4ml不含中性红的琼脂糖覆盖，6-7天后用2ml包含中性红的琼脂糖覆盖，并计数噬斑)。病毒检测极限是-10PFU/ml。关于对照，将原液DEN-16681PDK-53(LAV2)疫苗进行铺板。4.1.1.2.2PRNT(噬斑减少中和测试)中和抗体如Huang等人(2000)中所述进行定量。简而言之，将0.2ml热灭活的经1:5稀释的血清加入96孔平板的第一个孔中，并进行2倍系列稀释，对于每次稀释将0.1ml转移到0.1ml稀释剂(RPMI培养基)中。这导致产生1:10-1:320的血清稀释系列。将0，1mlDEN病毒("-:^0PFU;亲本DEN2l"81病毒)加入至每个血清稀释孔中，得到总共0.2ml血清-病毒混合物。96孔平板于4X:孵育过夜。将0.1ml血清-病毒混合物(包含30-80PFU的输入病毒)在6孑LVero平板中进行铺板(如上文在"病毒血症"部分所指明的)，并且在用中性红染色后计数噬斑。在2倍、l倍和0.5倍测试浓度下输入病毒的多次反向滴定(backtitration)提供了输入PFU的直接实验测定，这是用于测定50%(PRNT5Q)和70%(PRNT7。)终点抗体滴度的基础。阴性血清结果应当具有〈1:10的中和抗体滴度。显示出320的中和滴度的血清在1:80-1:2560的稀释度进行再次测试，以确定终点滴度。4,1.2在猴中对在第9代时的单价VDV2候选物的评估VDV2候选物的纯化/选择已如实施例1中所述进行。在SanofiPasteur中，在细胞培养中9次传代后，所选择的克隆(基于表型标记和序列)对来自CRPLeVallon,毛里求斯的雄性恒河猴(食蟹猴，平均重量3.1kg)进行了测试。在第0天免疫接种后，从第2天到第10天追踪病毒血症，并且在第0天和第28天测量免疫原性。当以液体形式时，所有病毒和疫苗保存于-70。C。LAV2:滴度10393DICC5。/ml;冻干的，重悬浮于0.5mlPBS(包含Ca"和Mg2+;CaCl2.2H2。0.133g/l;MgCl2.6,，0.lg/1)中，并且全部施用。传代物VDV2DEN2-TV722(2次噬斑纯化+1次扩增)滴度10"DICC5。/ml;液体，在PBS(包含Ca"和Mg2+;CaCl2.2H200.133g/l;MgCl2.6H2。，0.1g/l)中稀释至1053pfu/ml;施用0.5ml。通过SC途径在臂中用23Gl针进行注射，对于VDV2采用105DICC5。的剂量。结果呈现于表11中。第28天时的滴定对于PRNT。和PRNL。均一式三份地进行。VDV2和LAV2之间的比较显示了病毒血症方面的明显差异，对于VDV2在3/4的猴子中与LAV2相比较具有短持续时间的高病毒血症，以及对于2种类型均具有显著的免疫原性(对于VDV2更加低)。在Vero细胞上只传代数次后，在这个前主(pre-master)水平上，这种病毒血症可以视为对于VDV2太高。然而，野生型DEN-2(以及还有其他类型)诱导更长持续时间(6-7天)和强度(高达5logs噬斑形成单位[pfu])的病毒血症(Monath等人，2000;Bray等人，l"6)。表11:VDV2第9代的免疫原性<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>4.1.3在第11代时的单价VDV2候选物的评估因为所述疫苗的免疫原性已在第9代时进行了测试，所以设计了进一步的实验来在2次另外传代后测试所述单价传代物(第IO代)。如前面一样使用来自C.R.P.LeVallon，lieMaurice的雄性食蟹猴(24只猴，平均重量3.4kg)。第11代VDV2:批次滴度8.07loglODICC50/ml安慰剂含Ca"和Mg"的PBSVDV3:VERO来源的疫苗登革血清型3毒抹，通过LAV3在Vero细胞上进行消毒而获得。VDV4:VERO来源的疫苗登革血清型4毒林，通过UV4在Vero细胞上进行消毒而获得。疫苗在PBS(包含Ca'+和Mg2+;CaCl2.2H200.133g/l;MgCl2.6H20，0.lg/1)中稀释至105'3DICC5。/ml;通过SC途径在臂中用23G1针施用0.5ml，相应于105DICC5。的剂量。病毒血症和免疫原性已照例在CDC中由RKinney进行测量。结果显示于表12中。VDV2第11代单价疫苗诱导了显著的免疫应答，而病毒血症很低或不存在。根据其中第9代VDV2诱导高的早期病毒血症的先前实验，将考虑这种不存在的/很低的VDV2-诱导的病毒血症。第9和11代之间的某些进化抑制了这种高的病毒血症，而免疫原性被维持。因此，VDV2构成了可接受的候选物。应当指出，在相同实验中，4只猴子用涉及相同VDV2第11代疫苗的四价制剂进行疫苗接种；对于VDV1和VDV2没有检测到病毒血症，而VDV3和VDV4+秀导了病毒血症。另外2个实验涉及单独地或与其他血清型相组合地施用VDV2。在第一个实验(四价研究；5-log的每种血清型)中，对于VDV2和VDV1没有检测到病毒血症，而对于VDV3和VDV4检测到高水平的病毒血症。在第二个实验中，将VDV2第ll代单独施用，或在包括VDV1的四价组合内施用。当单独施用时，VDV2第11代仅在4只猴子的1只中诱导了低的病毒血症(峰值40)，而另外3是阴性的。当存在于四价制剂中时，VDV2没有诱导病毒血症，或诱导了与VDV3和VDV4相比明显更低的病毒血症，即使VDV2以4log进行施用，而VDV3和VDV4以21og进行施用。这证明了在病毒血症方面VDV2具有较高的安全性。因此，单价VDV2满足在猴中最初限定的成功标准。表12:第11代VDV2的免疫原性和病毒血症<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>4，2VDV2的毒理学4.2.1在猴中的神经毒力测试这种测试的目的是证实由SanofiPasteur生产的减毒的2型登革热病毒种子在猴中没有向神经特性(Ph.Eur.2.6.18)。10只来自毛里求斯的恒河猴通过大脑内途径(在每个半球的丘脑中1071°CCID5。/mL)用VDV2笫9代进行接种。在测试结束时，将猴处死并用福尔马林溶液灌注。组织样品取自每只猴的脑(延髓、脑桥和小脑、中脑、丘脑(包括左和右部)、大脑皮层的左和右侧)。切下厚度为8jum的切片并通过曙红和掊花青进行染色。在用血清型2原代病毒种子注射的猴脑中没有观察到病原性的组织病理学征兆。4.2.2在皮下施用1次VDV2并随后经过28天的观察期之后，在恒河猴中的GLP毒性研究这项GLP研究的目的是评估VDV2第9代与其他登革疫苗候选物之间的相互作用。该研究的笫一个步骤是在施用另一种疫苗候选物之前，评估VDV2的安全性和免疫原性。在第0天时给恒河猴(4只雄性和4只雌性)皮下施用1个人剂量的VDV2(大约104CCIDs。/剂)。2只雄性和2只雌性的对照组接受媒介物(4%。NaCl)。在整个研究过程中监控死亡率、临床病状、体重和食物消耗。体温在测试前测量1次，并从每次施用的那天起及其后2天期间每天测量一次。在测试前以及第8和27天时各获取1次血样用于临床实验室测定。不存在对临床体征、体重、食物消耗、皮肤反应、体温、血液学、临床化学或器官重量的影响。在研究期间没有报告死亡。总之，如通过生活(in-life)临床观察和临床病理学所评估的，给恒河猴(食蟹猴)皮下施用测试剂量的VDV2不会不利地影响猴的健康。实施例5:单价VDV2在未接触过黄病毒的年龄为18-40岁的健康成人中的安全性这个1期试验的目的是证明在未接触过黄病毒的成人中与SUmaril(用作对照组)相比较，单价VDV2第11代在104CCID5。的病毒浓度下的安全性、病毒血症和免疫原性特性。给予单次注射，在6和12个月时随访。对于安全预防措施，在研究中进行顺次包括。参与和疫苗接种因此是交错的第l个群组(n-4/组，总数n-12)进行了疫苗接种。在决定继续对剩余受试者(n-8/组，总数n-16)进行疫苗接种之前，一直到第28天收集的安全性数据由独立数据监察委员会(IndependentDataMonitoringCommittee)(IDMC)和皇家阿德雷德医院研究药物小组委员会(RoyalAdelaideHospitalInvestigationalDrugsSubcommittee)(IDSC)进行评审。试验设计的图示在图6中提供。施用疫苗后，患者定期接受各种临床检查和测试。这个随访的概括在下表13中给出。参与的群体由在入选当天时年龄为18_40岁(即18岁生日那一天至41岁生日前那一天)的成人组成，所迷成人是未接触过黄病毒的[存在针对黄病毒疾病(例如黄热病、日本脑炎、登革热)的疫苗接种；或黄病毒感染史(经临床、血清学或微生物学证实)，或以前居住在具有高度的登革感染地方流行性的地区或去具有高度的登革感染地方流行性的地区旅行(无论持续时间多长)，或居住在NorthQueensland2周或更长时间或去NorthQueensland旅行2周或更长时间的人被排除]。表13:关于随访的流程图<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>口就诊之间的时间间隔将由研究疫苗接种日期进行计算，所述研究疫苗接种日期可能不同于就诊日期(例如在符合临时排除标准的情况下)。V06和V07必须以至少1天的间隔进4亍。测试的产品是评估的疫苗是管形瓶中的冻干产品，所述冻千产品用分开提供的稀释剂即时重构活性成分4±0.51og!。CCID5。的单价Vero登革热病毒血清型2(VDV2第11代)/0.5mL剂量;稀释剂无菌NaCl4%。溶液，用于疫苗重构。重构的疫苗，即0.5mL单价VDV2的NaCl4%。溶液，应当立即使用或维持于+2。C""+8。C直至使用。在三角肌区中皮下施用0.5mL疫苗剂量。对照疫苗Stamaril⑥是由AventisPasteur生产的黄热病疫苗。Stamaril⑥表现为冻干的、不含禽白血病的、稳定化的产品，其紧在使用前用稀释剂进行重构。(活性成分活的减毒黄热病病毒(17D毒林)>1,000小鼠半致死剂量(LD5。)/稀释剂无菌NaCl4%0溶液)。在三角肌区中皮下施用对照疫苗。没有受试者具有与疫苗接种有关的临床显著综合征。1个受试者具有暂时的发热(〈38X:)。l个受试者具有局部反应(硬结)。没有观察到与疫苗接种有关的严重不利事件。在针对登革2的疫苗接种后28天，所有受试者具有抗体应答(滴度为1888-6393)。参考文献Bhamarapravati，N和YoksanS,(1997).DengueandDengueHemorrhagicFever.Liveattenuatedtetravalentdenguevaccines,CABIPublishing,367-379.BurkeDS和MonathTP.Flaviviruses(2001)InKnipeDMandHowleyPM，eds.FieldsVirology第4版，第1巻，1043-1125DeFraitesRF,SmoakBL，TrofaAF，HokeCH，Kanesa-thasanN，KingA，MacArthyP0，等人DenguefeveramongU.S.militarypersonnel-Haiti,September-November,1994.MMWR1994;43:845—848.Dunnen和Antonarakis(2000)Mutationnomenclatureextensionsandsuggestionstodescribecomplexmutations:adiscussion.HumMutation.15:7-12;Erratumin:HumMutat2002;20(5):403GublerDJ.Dengue.(1988)In:Epidemiologyofarthropod—borneviraldisease.MonathTPM，editor,BocaRaton(FL):CRCPress:223-60GublerDJ，KunoDengue和DengueHemorrhagicFever.CABInternationalPublishing1997GublerD.Epidemicdengue/denguehemorrhagicfeverasapublichealth,socialandeconomicprobleminthe21stcentury.(2002)TRENDSinMicrobiology.10:100-103HalsteadSB和SimasthienP(1970).ObservationsrelatedtopathogenesisofDenguehaemorrhagicfever.II.Antigenicandbiologicalpropertiesofdenguevirusesandtheirassociationwithdiseaseresponseinthehost.YaleJ.Biol.Med;42:261-275.Huang等人(2000).J.Virol74;3020-3028.JirakanjanakitN，KhinMM，YoksanS，BhamarapravatiN.(1999)Dynamicsofsusceptibilityandtransmissibilityofthelive,attenuated,candidatevaccinesdengue-1PDK13,dengue-3PGMK30F3,anddengue-4PDK48afteroralinfectioninAedesaegypti.AmJTropMedHyg.，61(4):672-676KautnerI，RobinsonMJ,KubnleU.(1997)DengueVirusinfection:Epidemiology,pathogenesis,clinicalpresentation,diagnosis,andprevention.JofPediatrics;131:516-524Monath，TP.(1994)Dengue:therisktodevelopedanddevelopingcountries.ProcNatlAcadSci;91:2395-2400.MonathTP,LevenbookI，SoikeK,ZhangZX，RatterreeM，DraperK等人(2000)Chimericyellowfevervirus17D-Japaneseencephalitisvirusvaccine:dose-responseeffectivenessandextendedsafetytestinginrhesusmonkeys.JournalofVirology;74(4):1742-1751BrayM，MenR,LaiCJ.(1996)Monkeysimmunizedwithintertypicchimericdenguevirusesareprotectedagainstwild—typeviruschallenge.JVirol;70(6):4162-4166Rigau-P6rezJG，ClarkGG，GublerDJ，ReiterP，SandersEJ，VorndamAV.(1998)Dengueanddenguehaemorrhagicfever.Lancet;352:971-977.RothmanAL，EnnisFA.(1999)Immunopathogenesisofdenguehemorrhagicfever.Virology;257:1—6SabinAB.(1952)ResearchondengueduringWorldWarII.AmJTropMedHyg;1:30-50ShirtcliffeP，CameronE，NicholsonKG,WiselkaMJ.(1998)Don'tforgetdengue!Clinicalfeaturesofdenguefeverinreturningtravellers.JRoyCollPhysLond.;32:235-237.ThompsonJD，HigginsDG和GibsonTJ.(1994)CLIJSTALW:improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,position-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice.Nucl.Acids.Res.，22(22)，4673-4680VaughnDW，GreenS，KalayanaroojS，InnisBL，NimmannityaS，SimtayakornS，RothmanAL，ErniisFA,NisalakA.(1997)Dengueintheearlyfebrilephase:viremiaandantibodyresponse.JInfectDis;176:322-30.VaughnDW，GreenS,KalayanaroojS，InnisBL，NimmannityaS，SuntayakornS，EndyTP,RaengsakulrachB，RothmanAL，EnnisFA，NisalakA.(2000)Dengueviremiatiter,antibodyresponsepattern,andvirusserotypecorrelatewithdiseaseseverity.JInfDisj181:2-9.WHOTechnicalGuide,1986.Denguehaemorrhagicfever:diagnosis:treatmentandcontrol,pl-2.WorldHealthOrganization,Geneva,SwitzerlandWuS，Grouard-VogelG,SunW，MascolaJ，BrachtelE，PutvatanaR.(2000)HumanskinLangerhanscellsaretargetsofdenguevirusinfection.NatureMed;7:816-820KhinMM,JirakanjanakitN，YoksanS，BhamarapravatiN.(1994)Infection,dissemination,transmission,andbiologicalattributesofdengue-2PDK53candidatevaccinevirusafteroralinfectioninAedesaegypti.AmJTropMedHyg.，51(6):864—869权利要求1.活的减毒登革2型病毒株，其包含序列SEQIDNo.38，其中至少第736、1619、4723、5062、9191、10063和10507位的核苷酸被突变，条件是下列核苷酸不被突变57、524、2055、2579、4018、5547、6599和8571。2.根据权利要求1的登革2型病毒林，其中选自第1638、2520、9222和10361位的位置处的至少一个核苷酸进一步被突变。3.根据权利要求1或2的登革2型病毒林，其中SEQIDNo.38包含突变736G>C、1619G>A、1638A>G、2520G>A、4723T>A、5062G>C、9191G>A、9222A>G、10063T〉A和10507A>G。4.根据权利要求l-3中任一项的登革2型病毒林，其进一步包含在给定密码子位置中的一个或多个核苷酸的置换，所述置换不导致那个位置处所编码的氨基酸的改变。5.根据权利要求1-4中任一项的登革2型病毒林，其包含SEQIDNo.1。6.免疫原性组合物，其在药学上可接受的载体中包含根据权利要求1-5中任一项的活的减毒登革2型病毒林。7.疫苗组合物，其在药学上可接受的载体中包含根据权利要求1-5中任一项的活的减毒登革2型病毒林。8.根据权利要求7的疫苗组合物，其是单价疫苗组合物。9.根据权利要求7的疫苗组合物，其是多价登革疫苗组合物。10.根据权利要求9的疫苗组合物，其包含含有序列SEQIDNo.39的活的减毒登革2型病毒林。11.根据权利要求7-10中任一项的疫苗组合物，其包含10-105CCIDs。的根据权利要求1-4中任一项的活的减毒登革2型病毒林。12.分离的核酸，其包含DNA序列SEQIDNo.l或其等价RNA序列。13.由SEQIDNo.l或其片段编码的分离的多蛋白，其至少包含M蛋白第9位的精氨酸，和/或E蛋白第228位的谷氨酸，和/或NS3蛋白第69位的苏氨酸，和/或NS3蛋白第181位的組氨酸，和/或NS5蛋白第541位的赖氨酸，和/或NS5蛋白第832位的苏氨酸。14.根据权利要求13的多蛋白的片段，其包含M蛋白，和/或E蛋白，和/或NS3蛋白，和/或NS5蛋白。全文摘要本发明涉及活的减毒VDV2(VERO来源的疫苗登革血清型2)毒株，其通过在PDK和Vero细胞上传代而衍生自野生型登革2型毒株16681。本发明进一步涉及包含VDV2毒株的疫苗组合物。文档编号A61K39/12GK101238209SQ200680028515公开日2008年8月6日申请日期2006年6月7日优先权日2005年6月17日发明者B·盖伊,C·黄,J·朗,R·奇尼,V·巴班申请人:赛诺菲巴斯德有限公司;病害控防中心