专利名称：用于癌症治疗的抗ccr7受体的抗体的制作方法
用于癌症治疗的抗CCR7受体的抗体发明领域本发明总体上涉及癌症治疗。更具体地，本发明涉及用CCR7受 体的抗体治疗其肿瘤细胞是表达CCR7受体的细胞的癌症，该CCR7 受体的抗体能够选捧性杀伤所述肿瘤细胞、减弱所述肺瘤细胞的迁移 和/或阻断所述肿瘤细胞的扩散。发明背景癌症是由不受控制的细胞分裂(或者存活或抗凋亡性增加)以及所 述细胞侵入其它邻近组织(侵入)和扩散至在正常情况下不存在该细胞 的身体其它区域(转移)的能力所表征的疾病，所述扩散通过淋巴管和 血管，通过血流的循环，然后侵入身体其它部位的正常组织。根据它 们是否能够通过侵入和转移扩散，肿瘤被分类为良性的和恶性的两 性肿瘤是不能够通过侵入和转移扩散的肿瘤，即它们只能在局部生长； 而恶性肿瘤是能够通过侵入和转移扩散的肿瘤。根据癌症所来源的细胞类型和细胞位置可以将癌症分类为数种类 型，即癌(cacinomas)，其发生自覆盖身体外部和内部表面的细^*，例 如皮肤、消化道或腺体；白血病，其从血液形成组织例如骨髓开始， 并造成大量的异常血细胞产生并进入血流；淋巴癌，其为起源自淋巴 结和才几体免疫系统的组织的癌症；黑素瘤，其发生在黑素细^^中；肉 瘤(sarcoma)，其来自骨骼或肌肉的结締组织；及畸胎瘤，其来自生殖 细胞中。能够通过手术、化疗、放疗、免疫治疗或其它方法治疗癌症。治 疗方法的选择取决于肿瘤的位置和级别以及疾病的阶段。在肿瘤治疗方案中待解决的显著问题是期望"杀伤全部细胞"。 这指越是有效的治疗方案越接近于杀伤全部称为"克隆发生"恶性细 胞的细胞，即具有不受控制生长和导致可以通过治疗去除的肿瘤块形成的能力的细胞。另一肿瘤治疗策略是使用"免疫毒素"，其中使用抗肿瘤细胞抗 体递送毒素至肿瘤细胞。然而，与上述化疗方法相同，免疫毒素疗法 也有明显的缺点。例如，抗原阴性或抗原缺陷细胞能够存活并重建肿 瘤或导致进一步转移。即使原发癌被完全除去，恶性肺瘤也经常是转 移的。从原发肿瘤起始，在身体的或远或近的位置形成恶性肿瘤转移， 是癌症最严重的后果之一且目前没有满意的治疗方法。目前拥有的癌 症治疗方法在防止转移方面效果有限或产生严重的不期望的副作用。尽管诸如抗细胞剂、毒素和凝结因子的治疗剂向肿瘤块的特异递 送代表了癌症治疗方法中的显著进步，但依然存在另外的或甚至可选 疗法的空间。鉴定另外的允许特异体内肿瘤破坏的靶标自然会有助于 扩大靶标选择的数目。癌症治疗的新治疗策略正向使用特异治疗发展，包括抗肿瘤细胞表达的不同抗原的单克隆抗体(mAb)，其可能有希望治愈所述疾病。免疫治疗中的抗原选择必须考虑抗原的肿瘤特异性、肿瘤细胞表 面的抗原密度及抗原调节或抗原-抗体复合体的内化，其能够降低产 生细胞死亡的能力。在大多数情况下，认为补体依赖的细胞溶解(CDC) 和抗体依赖的细胞介导的细胞毒(ADCC)是造成未偶联mAbs的临床使 用的原因，尽管在其它情况中诱导凋亡或细胞周期阻滞可能也起重要 作用。癌症细胞可以表达某些分子受体。不同研究显示CC趋化因子受 体7 (CCR7)在不同胂瘤细胞中表达，例如B细胞慢性淋巴性白血病、 非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、恶性乳腺肿瘤等等。此外，看起来CCR7 受体在诸如胃癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、T细胞白血病细胞等不同 癌症的淋巴结转移中起作用。因此，能够选择所述趋化因子受体(CCR7) 作为癌症的mAb治疗的可能靶标。CCR7是7个跨膜结构域G蛋白偶联受体(GPCR)。 G蛋白偶联受 体家族(GPCRs)包括激素、神经递质、生长因子和病毒的受体[Yoshie O, Imai T， Nomiyama H. Novel lymphocyte-specific CC chemokines and their receptors (新的淋巴细胞特异性CC趋化因子及其受体).J LeukocBiol. 1997; 62:634-644; Kim CH， Pelus LM, White JR， Applebaum E， Johanson K, Broxmeyer HE. CK beta-11/macrophage inflammatory protein-3 beta/EBIl-ligand chemokine is an efficacious chemoattractant for T and B cells (CK 1/巨噬细胞炎性蛋白30/ EBI1配体趋化因子是 T细胞和B细胞的有效化学吸引物).J Immunol. 1998; 160:2418-2424; Dieu MC， Vanbervliet B, Vicari A, & a/. Selective recruitment of immature and mature dendritic cells by distinct chemokines expressed in different anatomic sites (在不同解剖位置表达的不同趋化因子选择性募 集未成熟和成熟树突状细胞).J Exp Med. 1998; 188:373-386; Willimann K, Legler DF， Loetscher M， a/. The chemokine SLC is expressed in T cell areas of lymph nodes and mucosal lymphoid tissues and attracts activated T cells via CCR7 (趋化因子SLC在淋巴结的T细 胞区域和粘膜淋巴组织表达并通过CCR7吸引活化的T细胞).Eur J Immunol. 1998; 28:2025-2034; Yoshida R， Nagira M， lmai T, " a/. EBI1 -ligand chemokine (ELC) attracts a broad spectrum of lymphocytes: activated T cells strongly up-regulate CCR7 and efficiently migrate toward ELC (EBI1配体趋化因子(ELC)吸引多种淋巴细胞活化的T 细胞强烈上调CCR7且向ELC有效迁移).Int Immunol. 1998; 10:901 -910; Sallusto F, Schaerli P， Loetscher P， W a/. Rapid and coordinated switch in chemokine receptor expression during dendritic cell maturation (树突状细胞成熟期间趋化因子受体表达的快速和协调的转变).Eur J Immunol. 1998; 28:2760-2769]。肿瘤细胞表达CCR7受体的白血病的具体例子是慢性淋巴细胞白 血病(CLL),最常见的人成年白血病类型。所述白血病是B细胞白血 病，由强烈抗凋亡的CD5 + B细胞的单一克隆的积累所表征，所述抗凋 亡是由于涉及细胞程序性死亡的细胞外或细胞内信号传导的失调造成 的。尽管其非常低的增殖指数，外周血淋巴细胞计数达到大于5x lOVjLtL的值且白血病细l包显示入侵淋巴结、胰和骨髓的明显倾向。对CLL的治疗基于使用噤呤类似物作为第一线方案，特别是氟拉 达滨，单独或联合使用。至今，仅有的导致比氟拉达滨更高完全好转率的治疗联合为利妥昔单抗， 一种抗CD20单克隆抗体，与氟拉达滨 或氟拉达滨和环磷酰胺联用。此外，在CLL患者中使用上述联合达到骨 髓吸出物的分子好转，产生了 CLL潜在地可以不通过干细胞移植而治愈 的可能性。获得最好的初始应答和除去接受自体移植的患者的接种体中 的CLL细胞构成了 CLL的一些主要治疗挑战。
套细胞淋巴瘤(MCL)是B细胞非霍奇金淋巴瘤的激进亚型。细胞 被表征为CD20+ CD5+ CD23-以及t(ll;14)和细胞周期素Dl过表达。 通常用利妥昔单抗-CHOP (环磷酰胺、羟基柔红霉素、Oncovin和泼尼松) 和随后的干细胞移植或通过利妥昔单抗-HyperCVAD (环磷酰胺、长春 新碱、盐酸阿霉素和地塞米松)。然而，在大多数情况下MCL未被治愈， 清楚表明需要新的治疗方法。
最近证实了显示临床淋巴结病变的CLL患者在体外具有较高的 CLL细胞对CCR7配体、自稳趋化因子CCL19 (MIP3-iS)和CCL21 (6Ckine)的迁移性应答。因此，利用CCR7单克隆抗体阻断CLL细胞 进入次级淋巴组织可能是另一个优势。同样，从这个角度，表达异位 CCR7的非淋巴样肿瘤具有向次级淋巴器官转移的能力，而缺乏此分 子或其它参与向次级淋巴器官归巢的趋化因子受体的肿瘤呈现最小的 结节扩散。
因此，亟需其他的癌症疗法，特别是表达CCR7受体的癌症和肿 瘤细胞。有利地，所述疗法应允许体内特异肿瘤破坏，例如通过杀伤 肿瘤细胞、减弱肿瘤细胞的迁移和/或阻断肺瘤细胞的扩散。
发明内容
本发明基于CCR7受体在某些肿瘤细胞中高度表达的发现，其在
而且它的表达限于幼稚T淋巴细胞和幼稚B淋巴细胞，以及成熟的树 突状细胞(DC)，因此在癌症、特别是肿瘤细胞表达CCR7受体的癌症 的治疗中，所述CCR7受体成为使用单克隆抗体的令人感兴趣的靶点。 发明者惊奇地观察到CCR7的单克隆抗体，即识别CCR7受体上的表 位并且能够与所述CCR7受体结合的抗体，在体外能够杀伤CLL和MCL细胞，即表达CCR7受体的肿瘤细胞，但基本上不能杀伤表达 CCR7的非肺瘤细胞，例如T淋巴细胞。
因此，本发明总体上涉及使用结合CCR7受体的抗体或其抗原结 合片段杀伤表达CCR7受体的肿瘤细胞或诱导表达CCR7受体的肿瘤 细胞的细胞凋亡，该抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗癌症的药 物组合物中的用途；在具体的实施方案中，待治疗的癌症以表达CCR7 受体的肿瘤细胞为特征。
因此， 一方面，本发明涉及与CCR7受体结合的抗体，或其抗原 结合片段在制备药物组合物中的用途，该药物组合物用于杀伤表达 CCR7受体的肿瘤细胞或诱导表达CCR7受体的肺瘤细胞的细胞凋亡。
另一方面，本发明涉及杀伤表达CCR7的肿瘤细胞或诱导表达 CCR7的肿瘤细胞凋亡的方法，该方法包括将所述细胞与结合所述 CCR7受体的抗体或其抗原结合片段接触。
另一方面，本发明涉及在需要所述治疗的个体中杀伤表达CCR7 受体的肿瘤细胞或诱导表达CCR7受体的肿瘤细胞的细胞凋亡的方 法，所述方法包括给予所述个体治疗有效量的结合CCR7受体的抗体 或其抗原结合片段。
另一方面，本发明涉及减弱表达CCR7受体的肿瘤细胞向次级淋 巴组织迁移和/或阻断肿瘤细胞扩散进入次级淋巴组织的方法，该方法 包括将所述肿瘤细胞与结合CCR7受体的抗体或其抗原结合片段接 触。
另一方面，本发明涉及在需要所述治疗的个体中减弱表达CCR7 受体的肿瘤细胞向次级淋巴组织迁移和/或阻断肿瘤细胞扩散进入次 级淋巴组织的方法，所述方法包括给予所述个体治疗有效量的结合 CCR7受体的抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本发明涉及鉴定用于杀伤表达CCR7受体的肿瘤细胞 或诱导表达CCR7受体的肿瘤细胞凋亡的化合物的方法，包括
a) 将表达CCR7受体的细胞和与抗CCR7受体的抗体或其片段结 合的候选化合物相接触，且
b) 确定所述候选化合物是否杀伤所述的表达CCR7受体的细胞，其中，杀伤所述的表达CCR7受体的细胞的化合物，为潜在用于 杀伤表达CCR7受体的肿瘤细胞或诱导表达CCR7受体的肺瘤细胞凋 亡的化合物。
附图简要说明
图1中，图A显示CCR7的表面表达在CLL细胞上要高于在正 常的B和T淋巴细胞上的表达。通过流式细胞计(FCM)分析11名CLL 患者和6名健康供者的外周血样品以区分不同的淋巴细胞群，其相应 的CCR7表面密度以平均荧光强度(MFI)测量。柱以平均值士标准差的 形式表示；在图B中，抗CCR7单克隆抗体并没有造成受体的胞饮。 将来自CLL患者的外周血单个核细胞(PBMC)与抗CCR7单克隆抗体 (2iiig/ml)、 IgM单克隆抗体(克隆2H4)和IgG2a单克隆抗体(克隆 150503),或与作为阳性对照的CCR7的生理受体之一的CCL19(l/ig/ml) 一同孵育30秒到60分钟的不同时间。然后，使用FCM，在电子设门 的CD19+CD5+ CCL细胞中测定CCR7 MFI。曲线代表CCR7相对于 基础CCR7MFI的表达。显示了代表性的例子。
图2显示抗CCR7单克隆抗体均介导CLL细胞的强烈和特异的补 体依赖的细胞溶解(CDC)。将来自CLL患者的PBMC与抗CCR7单克 隆抗体或其同种型对照(IC)一起孵育，然后暴露于家兔补体1小时。 通过7-AAD掺入和FCM分析在电子设门CLL细胞和正常T细胞中测 定细胞溶解。柱代表11个病例的平均值土标准差。(A)抗CCR7IgM 单克隆抗体(2/xg/mL), (B)抗CCR7IgG单克隆抗体(2/Ag/mL)。
图3A显示来自代表性套细胞淋巴瘤细胞(MCL)患者的肿瘤细胞 中的CCR7表面表达(黑线)，其通过包括相应IC (灰线)的流式细胞术 测量，且图3B显示在抗CCR7单克隆抗体或其各自的IC存在下MCL 细胞的CDC。显示了 4个病例的平均值土标准差。
图4描述CDC的剂量效应曲线。用来自CLL患者(11=5)和健康供 者(n-2)的PBMC用浓度为0.5 /ig/mL至16 /xg/mL的抗CCR7单克隆 抗体进行CDC测定。通过7-AAD掺入和FCM分析在电子设门的CLL 细胞、来自CLL患者的T细胞和来自健康供者的B和T细胞中测定CDC造成的细胞溶解的百分比。线条代表细胞溶解的平均值。(A)抗 CCR7IgM单克隆抗体，(B)抗CCR7IgG单克隆抗体。
图5显示CDC能力与CCR7表达水平相关。CLL细胞的CCR7 表面密度与在和家兔补体孵育1小时后的溶解的百分比相关0 = 0.602, P = 0.025， n = 11),该溶解是由于2 /ig/mL的抗CCR7 IgM单克隆抗体 介导的CDC。
图6显示鼠抗CCR7 IgG单克隆抗体不介导CLL细胞的ADCC。 先与抗CCR7IgG单克隆抗体(2pg/mL)、 IC或利妥昔单抗(作为阳性 对照)孵育的CLL细胞被暴露于人自然杀伤细胞(NK) 4小时。然后， 通过7-AAD掺入和FCM分析在电子设门CLL细胞中测定死亡细胞。 柱显示6个实验的平均值士标准差。
图7显示抗CCR7单克隆抗体不诱导淋巴细胞的增殖。来自健康 供者的PBMC与抗CCR7单克隆抗体、IC、抗CD3单克隆抗体加IL2 或仅与培养基一起培养72小时。通过pH]-胸苷掺入测定在培养的最后 16小时内的DNA合成。柱代表重复三次的6个病例的平均值士标准 差。
图8显示抗CCR7单克隆抗体阻断CLL和MCL细胞响应CCL19 或CCL21的迁移。在用2 /ig/mL的抗CCR7 IgG (黑色柱)、IgM (灰色 柱)单克隆抗体或无单克隆抗体(白色柱)预孵育细胞30分钟后，如方法 部分中所述进行趋化性测定。(A)比较CLL细胞响应CCL19(1 jiig/mL) 的迁移、基础迁移和在CXCL12 (100 ng/mL)存在下的迁移，CXCL12 为不受抗CCR7单克隆抗体影响的趋化因子受体CXCR4的配体。显 示了代表性病例。(B)比较MCL细胞响应CCR7配体CCL19(1 jng/mL) 和CCL21 (1 ]Lig/mL)的迁移和基础迁移。显示了代表性病例。
发明详细描述
本发明总体上涉及结合CCR7受体的抗体或其抗原结合片段在制 备用于治疗癌症，特别是肿瘤细胞表达CCR7受体的癌症的药物组合 物中的用途，所述治疗通过杀伤所述肿瘤细胞或诱导所述肿瘤细胞的 凋亡。因此， 一方面，本发明涉及结合CCR7受体的抗体或其抗原结合 片段在制备用于杀伤表达CCR受体的胂瘤细胞或诱导表达CCR受体 的肿瘤细胞凋亡的药物组合物中的用途。
待治疗癌症的肿瘤细胞是表达CCR7受体的肿瘤细胞。其肿瘤细 胞表达CCR7受体的癌症类型的说明性、非限制性实例包括慢性淋巴 细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡型淋巴瘤、大B细胞淋 巴瘤、AIDS相关'淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma).伯基特淋巴瘤、B细胞急性原始淋巴细胞性淋巴瘤、霍奇 金病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、蕈样肉芽肿病、慢性骨髓增生性疾 病的暴发、骨髓增生异常综合征的暴发、癌症例如乳腺癌、非小细胞 肺癌、黑素瘤、胃癌或头颈的鳞状细胞癌和结肠癌。
能够通过常规方法鉴定表达CCR7受体的肿瘤细胞；例如，能够 根据L印ez-Giral S.等人公开的方法(Journal of Leyukocyte Biology, Vol 76, Aug. 2004， 462-471)通过流式细胞术分析CCR7受体的表面表达。
本文所用的"治疗癌症"指抑制或控制肿瘤细胞的增殖，所述肿 瘤细胞是表达CCR7受体的肿瘤细胞。该术语包括，在其他情况中， 杀伤所述肿瘤细胞、诱导所述肿瘤细胞的凋亡、减弱所述肿瘤细胞向 次级淋巴组织的迁移和/或阻断所述肿瘤细胞扩散进入次级淋巴组织。
根据本发明，对CCR7受体特异的即结合CCR7受体的抗体或其 抗原结合片段，在本文中有时称为本发明的抗体，能够用于杀伤表达 CCR7受体的肿瘤细胞或诱导表达CCR7受体的肿瘤细胞凋亡。因此， 本发明的抗体能够用于制备用于杀伤表达CCR7受体的肿瘤细胞或诱 导表达CCR7受体的肿瘤细胞凋亡的药物组合物。因此，本发明提供 用于治疗癌症，特别是其肿瘤细胞表达CCR7受体的癌症的可选方法。
本文所用的术语"杀伤肿瘤细胞"指通过特异溶解所述细胞来特 异清除肿瘤细胞例如表达CCR7受体的肿瘤细胞的机制。所述溶解或 细胞毒性通常是由募集所述肿瘤细胞的补体蛋白(CDC)或例如NK细 胞(ADCC)的效应细胞介导的，在用抗CCR7抗体处理所述肺瘤细胞后 所述蛋白和NK细胞分别能够特异靶向所述肺瘤细胞和造成所述肿瘤 细月包的溶解。本文所用的术语"诱导肿瘤细胞凋亡"指表达CCR7受体的肿瘤 细胞在经抗CCR7抗体处理后经历凋亡即细胞程序性死亡所通过的机 制。本文所用的术语"本发明的抗体"指对靶分子，即CCR受体(抗 原)显示特异结合活性的7球蛋白或其片段。因此，本发明的抗体能够 结合CCR7的表位；通常，形成表位需要至少6、 8、 10或12个连续 氨基酸，然而，包括非连续氨基酸的表位可以需要例如至少15、 25 或50个氨基酸。术语"本发明的抗体"例如包括多克隆抗体、单克隆 抗体、工程化的或经修饰的抗体、嵌合抗体、人源化抗体、灵长动物 源化抗体、人抗体、例如Fab、 F(ab，)2、单链Fv(scFv)片段的抗体片段、 双价小分子抗体(diabodies)双特异性抗体和异源偶联抗体。此外，本发 明的抗体还可以与其它化合物偶联，例如治疗剂、毒素等等。可以通 过多种方法产生这些抗体，包括杂交瘤培养、在细菌和哺乳动物细胞 培养物中重组表达和在转基因动物中重组表达。还能够通过从表达在 展示系统中的序列文库中选择序列来产生抗体，所述展示系统例如丝 状噬菌体、细菌、酵母或核糖体。在文献中有关于选择具体产生方法 的丰富指导，例:ft口 Chadd and Chamow， Curr. Opim Biotechnol.， 12: 188-194(2001)。制备方法的选择取决于若干因素，包括期望的抗体结 构、抗体上糖部分的重要性、容易培养和纯化以及成本。使用标准表 达技术可以产生许多不同的抗体结构，包括全长抗体、抗体片段例如 Fab和Fv片段、以及包含来自不同物种的组分的嵌合抗体。不具有效 应物功能和具有有限的药代动力学活性的小分子抗体片段，例如Fab 和Fv片段，可以在细菌表达系统中产生。单链Fv片段显示低免疫原 性且被从血液中快速清除。特异结合CCR7受体的表位的本发明抗体能够被治疗性使用，也 能够用于免疫化学测定，例如免疫荧光测定、流式细胞术、Western 印迹、ELISAs、》文射免疫测定、免疫组化测定、免疫沉淀或本领域已 知的其它免疫化学测定。能够使用多种免疫测定来鉴定具有期望特异 性的抗体。本领域公知多种用于竟争性结合或免疫放射分析的实验方 案。这些免疫测定通常涉及测量免疫原和特异结合CCR7受体免疫原的抗体之间的复合物形成。本发明的抗体可以是多克隆抗体。例如能够在一次或多次注射免 疫剂优选佐剂之后在哺乳动物例如非人哺乳动物中产生这些多克隆抗 体。通常，通过一系列皮下或腹膜内注射将免疫剂和/或佐剂注射到哺乳动物中。免疫剂可以包括CCR7受体或其片段或其融合蛋白或者可 以包括表达CCR7受体的细胞。或者，富集CCR7受体或其片段的粗 蛋白制剂能够被用于产生抗体。这些蛋白、片段或制剂在适当佐剂的 存在下被引入非人哺乳动物中。免疫原给药的其它形式是作为细胞表 面的跨膜蛋白(方法描述在例如Spiller W a/. J. Immunol. Methods, 224: 51-60 (1999)中)。这些细胞可以是在其细胞膜上天然表达抗原或在其 中能够在用DNA构建体转染细胞后得到此表达的每一个，该DNA构 建体含有编码抗原的DNA序列、其在细胞中的充分表达所必需的 DNA序列以及其它DNA序列。不仅当细胞膜是抗原表达的天然位点 时此方法是可行的，甚至当抗原一旦在细胞中合成，就由被加到抗原 编码序列的信号肽指引到这些位置时此方法也是可行的。如果血清含 有针对不期望表位的多克隆抗体，那么能够通过免疫亲和层析纯化多 克隆抗体。或者，所述抗体可以是单克隆抗体。可以通过杂交瘤产生单克隆 抗体，其中用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其它适合的宿主动物来引出产 生或能够产生特异结合免疫剂的抗体的淋巴细胞，例如Kohler and Milstein， Nature 256:495 (1975)。免疫剂通常包括CCR7受体或其片段 或其融合蛋白且任选地包括载体或富集了 CCR7受体或其片段或表达 CCR7受体的粗蛋白制剂。这些蛋白、片段或制剂在适合佐剂的存在 下被引入非人哺乳动物。免疫原给药的其它形式是作为细胞表面的跨 膜蛋白(方法描述在例如Spiller " a/. J. Immunol. Methods, 224: 51-60 (1999)中)。这些细胞可以是在其细胞膜上天然表达抗原或在其中能够 在用DNA构建体转染细胞后得到此表达的每一个，该DNA构建体含 有编码抗原的DNA序列、其在细胞中的充分表达所必需的DNA序列 以及其它DNA序列。不仅当细胞膜是抗原表达的天然位点时此方法 是可行的，甚至当抗原一旦在细胞中表达就由被加到抗原编码序列的信号肽指引到这些位置时此方法也是可行的。或者，可以在体外免疫 淋巴细胞。通常，如果非人哺乳动物来源是期望的，则使用脾细胞或淋巴结细胞，如果人源是期望的，则使用外周血淋巴细胞("PBLs")。 使用诸如聚乙二醇的合适融合试剂将淋巴细胞与永生化细胞系融合， 产生杂交瘤细胞。通常，永生化细胞系是大鼠、小鼠、牛或人源的骨 髓瘤细胞。在合适的培养基中培养杂交瘤细胞，该培养基优选含有一 种或多种抑制未融合的永生化细胞的生长或存活的物质。使用有限稀 释法分离克隆，并且可以通过常规技术分析培养杂交瘤细胞的培养基 (上清液)中抗CCR7受体的单克隆抗体的存在，例如通过细胞流式术 或通过免疫沉淀或通过其它体外结合测定，例如RIA或ELISA。还能 够作为动物体内的腹水瘤体内培养克隆。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫 沉淀或通过体外结合测定确定，例如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸 附测定(ELISA)或通过免疫荧光技术，例如焚光显微法或流式细胞术。通过常规免疫球蛋白纯化方法从培养基、腹水液或血清适当地分 离由亚克隆分泌的单克隆抗体，所述方法例如蛋白A琼脂糖、羟基磷 灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。还可以通过重组DNA方法制备单克隆抗体，例如在US 4,816,567 中描述的。能够使用常规方法从CCR7受体特异的杂交瘤细胞分离编 码本发明单克隆抗体的DNA及测序，例如通过能够特异结合编码鼠 抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针。杂交瘤为这些DNA的优 选来源。 一旦分离，DNA可以被插入到表达载体中，然后该载体^皮转 染到宿主细胞中，例如猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产 生另外免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以获得单克隆抗体在重组宿主细胞 中的合成。产生反应性抗靶分子的特异抗体或抗体片段的另一方法为筛选表 达在细菌、酵母、丝状噬菌体、核糖体或核糖体亚基及其它的展示系 统中的编码免疫球蛋白基因或其部分的表达文库。这些方法通常使用 得自诸如健康供者、患者或健康或不健康的动物的多种来源的抗体序 列或抗体片段序列的大文库。这些序列被克隆和表达在适当系统中并通过其对抗原的结合亲和性被选择。以描述了多种选择具有期望特性的抗体或片段的方法，例如中和、激动等等(Femdndez， Curr. Op. Biotech., 15: 364-373 (2004); Schmidt, Eur. J. Biochem,， 268: 1730-1738 (2001))。在一个实施方案中，还能够通过重组方法产生作为本发明杂 交瘤特征的抗体和抗体片段，所述重组方法通过提取信使RNA、构建 cDNA文库和选择编码抗体分子片,殳的克隆。工程化的或经修饰的抗体许多方法使用分子生物学和遗传学技术，例如对遗传学和免疫球 蛋白结构的良好了解，构建免疫球蛋白分子的不同修饰以改良其特性 用于临床或其它用途。它们中的 一些倾向于降低分子在要使用的物种 中的免疫原性且得到的分子具有与该物种更加同源的序列。已使用了 多种方法获得人源的单克隆抗体，避免了在健康人体中的伦理不允许 的举动。在其它方法中，减小了分子量和大小，例如为了提高分子向 实体瘤的分布。其它可能性为在分子中结合用于多于一个靶分子的结 合结构域(双特异性抗体或三特异性的等等)，或者结合抗体或片段与 具有期望功能的另一分子，例如毒性剂、激素、生长因子、免疫调节 剂(免疫抑制剂或免疫刺激剂)、细胞生长抑制剂等等。通常，所有得 到的分子保留至少一个抗体可变结构域，其赋予作为抗原-抗体结合 特征的高特异性和亲和性。这样的构建的一些实例为嵌合抗体这些指用来自某些物种(通常是产生单克隆抗体的哺乳动物)的抗 体的可变区和其它物种(将要使用嵌合抗体的物种)的恒定区构建的抗 体。这样的构建的目的是获得具有原始单克隆抗体但具有较小免疫原 性且在待治疗个体中被更好耐受的抗体，其具有增加的血清半衰期且 其能够被识別用于效应免疫机制，即补体、细胞毒细胞的Fc受体或其 它显示物种特异性的免疫球蛋白的特异受体。人源化抗体"人源化抗体"指衍生自非人抗体，通常是鼠抗体的保留母体抗 体的抗原结合特性但在人中有较小免疫原性的抗体。这可以通过多种方法达成，包括(a)嫁接完整的非人可变区到人恒定区上产生嵌合抗 体；(b)仅嫁接非人互补决定区(CDRs)到人框架和保留或未保留关键 框架残基的恒定区中；以及(c)移植完整的非人可变结构域，但通过 取代表面残基用人样部分遮盖它们。本领域已经描述了用于人源化非人抗体的方法。优选地，人源化 抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸 残基经常被称为"输入"残基，其通常取自"输入"可变结构域。基本上能够根据Winter和同事的方法(Jones Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann W a/., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen " a/., Science, 239:1534-1536 (1988))进行人源化，通过用超 变区序列替代人抗体的对应序列。实践中，人源化抗体通常是其中某 些超变区残基和可能某些框架区(FR)残基被来自啮齿动物抗体的类似 位点的残基替代的人抗体。用于制备人源化抗体的、轻链和重链的人 可变区结构域的选择对于减小免疫原性保留对抗原的特异性和亲和性 是非常重要的。根据所称的"最适"方法，用啮齿动物抗体的可变结 构域的序列筛选已知人可变区结构域序列的全部文库。与啮齿动物的 序列最接近的人序列被接受为人源化抗体的人框架区(FR) (Suns W a/., J Immunol., 151:2296 (1993), Chothia & a/.， J Mol Biol， 196:901 (1987))。另一方法使用衍生自轻链或重链的特定亚群的所有人抗体的 共有序列的特定框架区。同样的框架区可以用于若干种不同的人源化 抗体(Carter " a/.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 89:4285 (1992); Presta " a/" J. Immunol., 151:2623 (1993))。更重要的是抗体被人源化，保留对抗原的高亲和性和其它有利的 生物学特性。为达成此目的，根据优选方法，通过使用母体和人源化 序列的三维模型分析母体序列和各种概念上的人源化产物的方法制备 人源化抗体。灵长类源化的抗体此方法中使得抗体与人更加相似的进一步步骤是制备所称的灵长 类源化的抗体，即被工程化以含有猴(或其它灵长动物)抗体，特别是 食蟹猴抗体的可变重链和轻链结构域的重组抗体，且其含有人恒定结构域序列，优选人免疫球蛋白或74恒定结构(或PE变体)。在 Newman & a/.， Biotechnology, 10: 1458-1460 (1992); US 5，658，570和 US 6，113，898中描述了这些抗体的制备。已净艮道这些抗体展示与人抗 体的高度同源性，即85-98%，显示人效应功能，具有减小的免疫原性， 且可能显示对人抗原的高亲和性。Newman, Biotechnology, 10: 1455-1460 (1992)公开了产生重组抗体的另 一高效方法。人抗体"人抗体，，指含有完整人轻链和重链以及恒定区的抗体，通过任 何已知的标准方法产生。作为除人源化之外的另一选择，能够产生人抗体。例如，目前可 以产生经过免疫能够在不存在内源免疫球蛋白产生下产生人抗体的全 部库的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了在嵌合和种系突变 体小鼠中删除抗体重链连接区PH基因导致内源抗体产生的完全抑制。 在这些种系突变体小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在免 疫后产生人抗体。仿J:i口参见，Jakobovits W a/.， Proc. Mad. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits " a/.， Nature, 362:255-258 (1993)。或者，能够使用噬菌体展示技术(McCafferty e《a/., Nature 348:552-553 (1990))体外产生来自供者的免疫球蛋白可变(V)结构域基 因库的人抗体和抗体片段。根据此技术，抗体V结构域被符合读框地 克隆到诸如M13或fd的丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中， 并作为功能抗体片段被展示在噬菌体颗粒的表面上。因为丝状颗粒含 有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体功能特性的选择还 导致选择编码显示那些特性的抗体的基因。因此，噬菌体模拟B细胞 的某些特性。能够以多种形式进行噬菌体展示；关于其综述，例如参 见 Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)。还可以通过体外活化的B细胞或用人细胞重建其免疫系统的 SCID小鼠产生人抗体。一旦获得人抗体，其编码DNA序列就能够被分离、克隆并引入 到适当表达系统中，即细胞系，优选来自哺乳动物，其随后表达并释 放人抗体到培养基中，能够从该培养基中分离抗体。抗体片段抗体片段是抗体的片段，例如Fab、 F(ab，)2、 Fab，和scFv。已经开 发了多种产生抗体片段的技术。传统上，通过完整抗体的蛋白水解消 化衍生这些片段，但近来能够通过重组宿主细胞直接产生这些片段。 在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv(scFv)片段，其还可以是单 特异性的或双特异性的。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为"Fab" 片段，每一个具有单一的抗原结合位点，以及剩余的"Fc"片段，其 名称反应出其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合 位点且仍然能够交联抗原的F(ab，)2片段。"Fv"是最小的含有完整抗原识别和抗原结合位点的抗体片段。 该区域由一条重链和一条轻链可变结构域的紧密、非共价连接的二聚 体组成。在这种构型下每一可变结构域的三个超变区相互作用以确定 VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。总的说来，这六个超变区赋予 抗体的抗原结合特异性。然而，甚至单一可变结构域(或包含三个对抗 原特异的超变区的半个Fv)也具有识别和结合抗体的能力，尽管比完 整结合位点的亲和性低。Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第 一'度定结构域 (CHI)。 Fab，片段与Fab片段的不同在于Fab，片段中增加了重链CH1 结构域羧基末端的包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的少数 残基。Fab，-SH是本文中对恒定结构域的半胱氨酸具有至少一个自由 巯基的Fab，的命名。F(ab，)Z抗体片段最初是作为Fab，片段对产生的， 该Fab，片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已 知的。"单链Fv，，或"scFv，，抗体片段包含抗体的VH和VL结构域， 其中这些结构域存在于单多肽链中。优选地，Fv多肽还包含VH和 VL结构域之间的多肽连接物，其使得scFv能够形成用于抗原结合的 期望结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113， Rosenburg and Moore eds.， Springer曙Verlag， N. Y" pp. 269-315 (1994)。术语"双价小分子抗体(diabodies)"指具有两个抗原结合位点的小 抗体片段，那些片段包含在同一多肽链中(VH-VL)与轻链可变结构域 (VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用足够短使得同一链上的两 个结构域不能配对的连接物，强迫该结构域与另一链的互补结构域配 对并创造出两个抗原结合位点。双价小分子抗体在例如EP 404,097、 WO 93/11161和Hollinger " a/" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)中有更详细的描述。本发明包括的结合CCR7受体的抗体的功能片段保留衍生该片段 的全长抗体的至少一种结合功能和/或调节功能。优选的功能片段保留 相应全长抗体的抗原结合功能(例如结合哺乳动物CCR7受体的能力)。 特别优选的功能片段保留抑制哺乳动物CCR7受体的一种或多种特征 功能的能力，所述特征功能例如结合活性、信号传导活性和/或刺激细 胞应答。例如，在一个实施方案中，功能片段能够抑制CCR7与一个 或多个其配体的相互作用和/或能够抑制一种或多种受体介导的功能。双特异性抗体双特异性抗体是对至少两种不同的表位具有结合特异性的抗体。 实例性双特异性抗体可以结合B细胞表面标志物的两种不同表位。其 它的这样的抗体可以结合第一B细胞标志物且进一步结合第二B细胞 表面标志物。或者，抗B细胞标志物结合臂可以与结合白细胞上触发 分子的臂组合以将细胞防御机制集中到B细胞，白细胞上的触发分子 例如T细月包受体分子(例如CD2或CD3)或IgG的Fc受体(FcyR)，例 如FcyRI (CD64)、 FcyRII (CD32)和FcyRIII (CD 16)。双特异性抗体还 可以被用于将细胞毒试剂定位到B细胞。这些抗体具有B细胞标志物结合臂和结合细胞毒试剂(例如皂草素、抗干扰素a、长春花生物碱、 蓖麻毒蛋白A链、曱氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。双特异性抗 体能够被制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab)2双特异性抗体)。本领域已知制备双特异性抗体的方法。全长双特异性抗体的传统 生产是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中所述两条链具 有不同的特异性(MillsteineM/.， Nature, 305:537-539 (1983))。由于免疫 球蛋白重链和轻链的随机搭配，这些杂交瘤(四源杂交瘤)产生10种不 同抗体分子的可能混合物，其中仅有一种具有正确的双特异性结构。 通常通过亲和层析步骤完成的正确分子的纯化是比较困难的，并且产 物产率低。在WO 93/08829和Traunecker " a/.， EMBO J， 10:3655-3659 (1991)中公开了相似的方法。根据不同的方法，具有期望结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)被融合到免疫球蛋白恒定结构域序列。优选地，该融合 是利用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构 域。优选在至少一个融合中存在含有轻链结合所必需位点的第一重链 恒定区(CHI)。编码免疫球蛋白重链融合的DNA以及，如果需要，编 码免疫球蛋白轻链的DNA被插入到分别的表达载体中，并且被共转 染到合适的宿主生物中。这提供了当在构建中使用不等比例的三种多 肽链以提供最佳产率时，调节实施方案中的三种多肽片段的相互比例 的很大灵活性。然而，当等比例表达至少两种多肽链导致高产率时或 当比例不特别重要时，有可能将两种或全部三种多肽链的编码序列插 入到一个表达载体中。双特异性抗体包括交联的或"异偶联物"抗体。例如，异偶联物 中的抗体之一能够与抗生物素蛋白耦合，另一个与生物素耦合。例如 提出这样的抗体将免疫系统细胞靶向不想要的细胞。异偶联物抗体可 以使用任何方便的交联方法制备。本领域公知合适的交联剂和许多交 联技术，且US 4,676,980公开了合适的交联剂。文献中还描述了从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，能 够使用化学键制备双特异性抗体。抗体偶联癌症的细胞毒化疗或放疗受到因为所述治疗不具有对恶性细胞的 选择性而导致对敏感正常细胞的毒性而产生的严重的、有时致命的副 作用。避免这些问题的一种方法是将治疗剂和抗体或其它识别肿瘤相 关抗原的配体偶联。这增加恶性细胞暴露于配体靶向的治疗剂并减少 正常细胞暴露于配体靶向的治疗剂。参见Allen, Nature, 2: 750-763 (2002)。治疗剂还可以是免疫抑制剂，即抑制或遮蔽本文中接受治疗的哺 乳动物的免疫系统的物质。这将会包括抑制细胞因子产生、下调或抑 制自身抗原表达或遮蔽MHC抗原的物质。治疗剂还可以是细胞毒性剂，即抑制或防止细胞的功能和/或造成 细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素、化疗剂和毒素，化 疗剂即可用于癌症治疗的化学化合物，毒素例如细菌、真菌、植物或 动物源的小分子毒素或酶活性毒素或其片段。治疗剂还可以是细胞因子、激素、生长因子、坏死因子，即由一 群细胞释放的、作为细胞间介质(mediators)作用于另 一细胞或甚至同 一细胞群的蛋白或多肽。如本文中所用，术语细胞因子包括来自天然 来源或来自重组细胞培养物和天然序列细胞因子的生物活性等价物的 蛋白和多肽。治疗剂还可以是前药，其指药物活性物质的前体或衍生形式，该 药物活性物质与母体药物相比对肿瘤细胞具有较小的细胞毒性且能够 被酶促活化或转化成更具活性的母体形式。抗体和一种或多种小分子毒素的偶联物。在本发明的一个优选实施方案中，拮抗剂与一个或多个毒素分子偶联。能够使用的酶促活化 的毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A 链(来自铜绿假单胞菌CPsewJo附owas flen/g/"o; a))、蓖麻毒蛋白A链、 相思子毒素A链、蒴莲根毒素A链、a帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石冲十素(dianthin)蛋白、美洲商陆(尸/ ;^o/aca a附en.cawa)蛋 白(PAPI、 PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻疯树 毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、mitogellin 、 restrictocin 、 酚霉素(phenomycin)、 伊诺霉素 (neomycin)和tricothecene。本发明还涉及与具有溶核活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA 内切酶例如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)或其它能够破坏细胞结构或细 胞器且因此杀伤细胞或减小细胞存活力的化合物偶联的抗体。还可以将本发明的抗体与将前药转化为活性抗癌药物的前药活化 剂偶联。这些偶联物的试剂组分包括任何能够作用于前药以便于将其 转化为其活性更强的细胞毒形式的试剂。或者，能够使用本领域公知的重组DNA技术构建至少与本发明 的酶的功能活性部分连接、至少包含本发明拮抗剂的抗原结合区的融 合蛋白(例如参见Neuberger " a/" Nature, 312:604-608 (1984))。可以用多种双功能蛋白耦合剂或连接物制备抗体和细胞毒试剂的 偶联物。该连接物可以是促进细胞毒药物在细胞内释放的"可切割连 接物"。例如，可使用易酸解连接物、肽酶敏感连接物、二曱基连接物 或含有二硫键的连接物。或者，例如可以通过重组技术或肽合成制备包含抗体和细胞毒试 剂的融合蛋白。其它潜在有用的修饰还涉及本文描述的蛋白或肽拮抗剂的氨基酸序列修饰。例如，可 能期望提高抗体的结合亲和性和/或其它生物学特性。通过向抗体编码 核酸中引入适当地核苷酸改变，或通过肽合成来制备抗体的氨基序列 变体。这样的修饰例如包括拮抗剂氨基酸序列中残基的删除和/或插入 和/或替代。进行删除、插入和替代的任意组合以完成最终构建体，条 件是最终构建体具有期望的特征。氨基酸变化还可以改变拮抗剂的翻 译后加工，例如改变糖基化位点的数目或位置。氨基酸序列插入包括长度从一个残基到含有一百或更多残基的多 肽的氨基和/或羧基末端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列内插 入。末端插入的实例包括具有N末端蛋氨酸基残基的拮抗剂或与细胞 毒多肽融合的拮抗剂。拮抗剂分子的其它插入变体包括与酶的拮抗剂的N或C末端的融合，或增加拮抗剂的血清半衰期的多肽。另一类型的变体是氨基酸替代变体。这些变体中，拮抗剂分子的 至少一个氨基酸残基被不同的残基取代。抗体拮抗剂的用于替代诱变 的最感兴趣位点包括超变区，但也考虑FR的改变。抗体的另一类型的氨基酸变体是改变拮抗剂的原始糖基化模式。 改变指删除在拮抗剂中发现的一个或多个糖部分，和/或添加在拮抗剂 中不存在的一个或多个糖基化位点。多肽的糖基化通常是N连接或O 连接的。N连接指糖部分连接到天冬酰胺的侧链上。三肽序列天冬酰 胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸之外的 任何氨基酸，是糖部分酶促连接到天冬酰胺侧链的识别序列。因此， 在多肽中存在这些三肽序列的任何一个创造出潜在的糖基化位点。O 连接糖基化指单糖或单糖衍生物N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一 连接到羟基氨基酸上，最常见丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟 脯氨酸或5-羟赖氨酸。通过改变氨基酸序列使得其含有一个或多个上 述的三肽序列(用于N连接糖基化位点)方便地完成向抗体中加入糖基 化位点。还可通过向原始抗体的序列添加或用一个或多个丝氨酸或苏 氨酸替代来进行改变(用于O连接糖基化位点)。通过多种本领域已知 的方法制备编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但 不限于从天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)或通 过寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和拮抗剂的较早制备变体 或非变体版本的盒式诱变。可能期望修饰本发明使用的抗体以提高效应物功能，例如，以便 于增强抗体的ADCC和/或CDC。这可以通过向抗体的Fc区中引入一 个或多个氨基酸替代完成。通过若千单糖或单糖衍生物形成加入到例如抗体的糖蛋白的氨基 酸骨架上的糖基基团，导致能够在来自不同哺乳动物或组织的细胞中 产生的同一抗体上不同的组成。此外，已经显示糖基的不同组成能够 影响介导抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)和/或补体依赖 的细胞毒(CDC)的效力。因此有可能通过研究不同来源的抗体的糖基 化模式来提高那些特性。这类方法的实例是Niwa e, a/.， Cancer Res.2004 Mar 15;64(6):2127-33。或者或另外地，可以将半胱氨酸引入Fc区中，由此允许在此区域 中形成链间二硫键。由此产生的同型二聚体抗体可能具有提高的内化 能力和/或增强的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖的细胞性细胞毒 (ADCC)。参见Caron"a/.，J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992)和Shopes， B.J. Immunol. 148:2918-2922(1992)。还可以使用异双功能交联剂制备 具有增强的抗肿瘤能力的同型二聚体抗体，如Wolff" a/. Cancer Research 53:2560-2565 (1993)所述。或者，具有双Fc区的抗体能够祐: 工程化且可能因此具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson & a/. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)。为了增加抗体的血清半衰期，可以例如如US 5,739,277所述将补 救受体结合表位并入抗体(特别是抗体片段)中。如本文中所用，术语 "补救受体结合表位"指IgG分子(例如IgGl、 IgG2、 IgG3或IgG4) 的Fc区的负责提高IgG分子的体内血清半衰期的表位。优选地，本发明的抗体，例如单克隆抗体、Fv片段、Fab片段或 其它衍生自本发明的单克隆抗体的结合组合物，对CCR7具有高亲和 性。可以通过常规技术测量单克隆抗体和相关分子对CCR7受体的亲 和性。抗体对抗原的亲和性能够被定义为抗体结合所述抗原的有效性。 抗原-抗体结合是可逆结合，因此当两种分子在同一溶液中稀释足够 时间后，此溶液达到平衡，其中抗原-抗体复合物(AgAb)、游离抗原 (Ag)和游离抗体(Ab)的浓度恒定。因此比例[AgAb]/[Ag"[Ab]也是常 数，定义为称为Ka的结合常数，其能够被用于比较一些抗体对其各 自表位的亲和力。测量亲和力的通常方法为实验测定结合曲线。这包括测量抗体-抗原复合物的量，其为游离抗原浓度的函数。有两种进行该测量的常 见方法(i)使用Scatchard分析的经典平4軒透析以及(ii)表面等离子 体振子(plasmon)共振方法，其中抗体或抗原被结合到导电表面上且抗 原或抗体分别影响此表面的电特性。经常只需要测定结合同一表位的两种或更多种单克隆抗体的相对亲和力。在该情况下，可以进行竟争测定，其中单克隆抗体之一的系 列稀释与恒定量的配体醉育，然后加入用适合示踪剂标记的第二单克隆抗体。结合此单克隆抗体并洗涤未结合抗体后，测量第二单克隆抗体的浓度并对第一单克隆抗体的浓度作图，用Scatchard方法分析。实 例是Tamura " a/,， J. Immunol. 163: 1432-1441 (2000)。此外，本发明的抗体能够用于检测CCR7受体。这些检测方法有 利地应用于肿瘤细胞是表达CCR7受体的细胞的癌症的诊断和/或预 后。此外，本发明的抗体能够用于通过诸如免疫荧光、流式细胞术、 亲和层析或免疫沉淀的标准技术鉴定表达CCR7受体的细胞。例如， 本发明的抗体能够有助于表达CCR7受体的肿瘤细胞的鉴定。此外， 本发明的抗体能够用于鉴定表达CCR7受体的肿瘤细胞以评价其在特 定组织中的水平。因此，本发明的抗体能够诊断地用于检测组织中表 达CCR7受体的细胞的水平，其作为临床检查过程的一部分，例如为 了确定给定治疗方案的效果。能够通过耦合(即物理地连接)抗体与标 记基团辅助检测。如下文所述，在特定实施方案中，本发明的抗体能够用于与诸如 细胞因子、止痛剂、免疫抑制剂和/或化疗剂的另外的治疗活性化合物 组合。联合给药包括使用分开的配方或单一药物配方的共给药和以任 何顺序的连续给药，其中优选地存在两种(或全部)活性剂同时发挥其 生物学活性的时间阶段。在其它方面，本发明涉及用于对个体给药的药物组合物，有时称 为本发明的药物组合物，包括本发明的抗体或其药物衍生物或前药以 及药物可接受的载体、佐剂或媒介物，所述本发明的抗体即结合CCR7 受体的抗体或其抗原结合片段。所述药物组合物通过被给予患有癌症 的个体能够用于杀伤表达CCR7受体的肿瘤细胞或诱导表达CCR7受 体的肿瘤细胞凋亡。本文所用的术语"个体"指被分类为哺乳动物的 所有动物，包括但不限于家畜或农场动物、灵长类和人。该个体优选 为任何年龄或种族的男性或女性人类。本文所用的术语"药物可接受的载体"旨在包括与药物给药相容散介质、包被物、抗细菌剂和抗真菌剂、等张 剂和吸收延迟剂等等。本领域公知将这些介质和试剂用于药物活性物 质。除了与活性化合物不相容的任何常规介质或试剂外，预期其在组 合物中的使用。可接受的载体、赋形剂或稳定剂是在所用的剂量和浓 度下对受者无毒的，且包括緩沖液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如氯化十八烷基二 曱基苯基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、千索氯铵；苯酚、丁醇或卞醇； 对羟基苯甲酸烷基酯例如对羟基苯曱酸曱酯或对羟基苯曱酸丙酯；儿茶 酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间曱酚)；小分子量(小于约10个残 基)多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物例 如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨 酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和包括葡萄糖、甘露糖或糊精在内 的其它糖；螯合剂例如EDTA;糖类例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山 梨醇；成盐抗衡离子例如钠；金属配合物(例如Zn-蛋白配合物)；和/ 或非离子表面活性剂例如TWEEN 、 PLURONICStm或聚乙二醇 (PEG)。可以在同 一 制剂中给予本发明的抗体，或者可以在不同制剂中给 予本发明的抗体。给药可以是同时的或顺序的，并且可以在任意顺序 下有效。还可以将补充活性成分掺入到本发明的药物组合物中。因此，在 特定实施方案中，本发明的组合物还可以根据接受治疗的特定适应症 的需要含有多于 一种的活性化合物，优选那些具有不负面相互影响的 补充活性的化合物。例如，可能期望进一步提供化疗剂、细胞因子、 止痛剂或免疫抑制剂。这些其它活性剂的有效量依赖于存在于药物组 合物中的本发明的抗体的量、疾病或病症的类型或治疗方法及其它因 素等等。在实施方案中，本发明的抗体与保护所述化合物不从身体中被快 速清除的载体一起制备，该载体例如控释制剂，包括植入物和微包嚢 的递送系统。能够使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯 乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙二醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这些制剂的方法对于本领域技术人员是明显的。还能够从Alza Corporation 和Nova Pharmaceuticals, Inc购得材料。脂质体混悬液(包括利用针对 病毒抗原的单克隆抗体被靶向受感染细胞的脂质体)也能够被用作药 物可接受的载体。能够根据本领域技术人员已知的方法制备这些，例 如U.S. 4,522,811中所述。本发明的抗体(或其片段)的给药途径可以是口服、肠胃外、通过 吸入或局部的。本文所用的术语"肠胃外"包括静脉、腹膜内、肌内、皮下、直 肠或阴道给药。皮下和肌内形式的肠胃外给药通常是优选的。"吸入"指鼻内和口腔吸入给药。这些给药的适合剂型，例如气雾 制剂或定量吸入器，可以通过常规技术制备。此外，"局部的，，指非全身性给药并包括向表皮外部、口腔应用本 发明的抗体，以及向耳、眼和鼻中以及不显著进入血流的部位滴注抗体。 "全身性给药"指口服、静脉、腹膜内和肌内给药。当然，治疗或预防 作用所需的抗体的量根据所选择的抗体、接受治疗的疾病状态的性质和 严重性以及患者而变化。此外，抗体可以通过脉动注射适当地给药，例如使用逐渐减少剂 量的抗体。优选地，通过注射给予制剂，最优选静脉或皮下注射，部 分依赖于给药是短时的还是长期的。因此，在特定实施方案中，本发明的药物组合物可以是适于口服 给药的给药形式，固体或液体。适于口服给药的适合剂型可是是片剂、 胶嚢剂、糖浆剂或溶液，并且可以含有本领域已知的常规赋形剂，例 如结合剂例如糖浆、阿拉伯树胶、明胶、山梨醇或聚乙烯吡咯烷酮； 填料，例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸4丐、山梨醇或甘氨酸；压片润 滑剂，例如硬脂酸镁；崩解剂，例如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟基乙 酸淀粉钠或微晶纤维素；或药物可接受润湿剂例如十二烷基硫酸钠。 可以通过混合、填充或压片的常规方法制备固体口服组合物。可以使 用重复的混合操作使活性剂遍布使用大量填充剂的组合物中。这样的 操作在本领域中是常规的。例如通过湿法或干法成粒及任选地包被来 制备片剂，该包被根据通常制药实践中公知的方法，特别是使用肠溶27包衣。在另一实施方案中，可以使本发明的药物组合物适合于肠胃外给 药，例如适当单位剂型的无菌溶液、混悬液或冻干产品。适于注射用 途的药物组合物包括无菌水溶液(当水适合时)或分散物以及用于无菌 注射溶液或分散物的当场制备的无菌粉末。对于静脉给药，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、CremophorEM (BASF， Parsippany， N丄)或磷 酸盐緩冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的且流动性应 达到容易注射的程度。组合物在生产和储存条件中必须是稳定的且使 其保存不受到例如细菌和真菌的微生物的污染。载体能够是溶剂或分 散介质，其含有例如水、乙醇、例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇的 药物可接受多元醇，及其适当的混合物。例如能够通过使用例如卵磷 脂的包衣和使用表面活性剂来保持适当的流动性，包衣的使用通过在 分散物的情况下保持需要的颗粒大小来保持流动性。对微生物作用的 防止能够通过多种抗细菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯曱酸酯、 氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等等。在许多情况下，优选在组合物 中包括等张剂，例如糖、例如甘露糖醇、山梨醇的多元醇、氯化钠。 能够通过在组合物中包括例如单硬脂酸铝和明胶的延迟吸收的试剂来 达到注射组合物的延长吸收。能够通过将需要量的活性化合物(例如多肽或抗体)并入适当溶剂 中及随后的过滤灭菌来制备无菌注射溶液，该适当溶剂根据需要含有 上文列举的成分中的一种或组合。通常，通过将活性化合物并入无菌 媒介物中来制备分散物，该无菌媒介物含有来自上文所列举的基本分 散介质和必需的其它成分。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况 下，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生来自之前无菌过 滤溶液的活性成分加上任何另外的期望成分的粉末。在特定实施方案中，所述药物组合物被通过静脉(IV)或皮下(SC) 给药。可以使用足够的赋形剂例如填充剂、緩冲剂或表面活性剂。将 使用西班牙药典和美国药典以及类似参考文献中描述或指出的标准方法制备上述制剂。将药物组合物，即口服或肠胃外组合物组方为易于给药和剂量一致的单位剂型是特别有利的。本文所用单位剂型指适于作为用于待治 疗个体的单位剂量的物理上不连续的单位；每一单位含有与必需的药物载体联合的、经计算产生期望治疗效果的预定量的活性化合物。本 发明的单位剂型的规格受到活性化合物的独特特征和要达到的特定治 疗效果以及复合这些活性化合物用于治疗个体的领域中固有限制的控 制并直接依赖于这些因素。通常本发明抗体的有效给药量取决于所选化合物的相对效力、接 受治疗的疾病的严重性和患者的体重。然而，通常每日给予活性化合物一次或多次，例如每日1、 2、 3或4次，通常日总剂量为0.001 mg/kg 体重/日至1000 mg/kg体重/日，优选约0.01 mg/kg体重/日至约100 mg/kg体重/日，最优选约0.05 mg/kg体重/日至10 mg/kg体重/日。除了对患者给予抗体，本发明预期通过基因治疗给予抗体。 WO96/07321涉及使用基因治疗产生细胞内抗体。所述药物组合物能够与说明书一起被包括在容器、包装或分配器 中用于给药。本发明的抗体和药物组合物可以与其它药物联用以提供联合治 疗。所述其它药物可以组成同一组合物的一部分，或作为用于在同一 时间或不同时间给药的分开的组合物。本发明的抗体和药物组合物将会用于治疗医学状态，例如与癌症 相关的病症或疾病，具体地，用于治疗癌症，所述癌症的特征为肿瘤 细胞表达CCR7受体，更具体地，用于杀伤表达CCR7受体的肿瘤细 胞或诱导表达CCR7受体的肿瘤细胞凋亡。对本发明的治疗易感的、 肺瘤细胞表达CCR7受体的说明性非限制性癌症包括慢性淋巴细胞白 血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡型淋巴瘤、大B细胞淋巴瘤、 AIDS相关淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、B细胞急性 原始淋巴细胞性淋巴瘤、霍奇金病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、蕈样 肉芽肿病、慢性骨髓增生性疾病的暴发、骨髓增生异常综合征的暴发、 乳腺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、胃癌或头颈的鳞状细胞癌和结肠癌。 在优选实施方案中，对本发明的治疗易感的癌症包括乳腺癌、非小细 胞肺癌、黑素瘤、胃癌或头颈的鳞状细胞癌和结肠癌。在最优选的实施方案中，对本发明的治疗易感的癌症包括滤泡型淋巴瘤、成人T细 胞白血病/淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、慢性骨髓增生性疾病的暴发和骨髓 增生异常综合征的暴发。在其它最优选的实施方案中，根据本发明治 疗的癌症包括CLL和MCL。在特定实施方案中，本发明的抗体可以与本文所述的医学状态的 其它治疗联合，例如化疗、放疗、免疫疗法或手术方法，包括烷基化 剂、抗代谢药、抗激素、用于多种症状的治疗剂，例如镇痛剂、利尿 剂、抗利尿剂、抗病毒剂、抗生素、细胞因子、营养补充剂、贫血治 疗剂、凝血治疗剂、骨治疗剂、精神病学和心理学治疗剂等等。为了实现自体骨髓或干细胞移植，可以在用抗CCR7抗体治疗后 从所述患者收集骨髓或外周血干细胞。还可使用细胞因子治疗患者，为了在给予本发明的抗体之前上调 CCR7或癌性B细胞表面上的其它靶蛋白的表达。为了刺激免疫效应 物功能，还可以在给予清除抗体或放射标记的抗体的同时或之前或之 后给予细胞因子。在一个实施方案中，化疗方案可用来补充本文公开的疗法，且可 以与所述放射标记的抗体同时或以任意顺序来顺序给药。化疗方案可 以选自CHOP (环磷酰胺、多柔比星(也称为羟基柔红霉素)、长春新碱(也 称为硫酸长春新碱)和泼尼松)、ICE (去甲氧基柔红霉素、阿糖胞苷和 依托泊甙)、Mitozantrone、阿糖胞苷、DVP (柔红霉素、长春新碱和泼 尼松)、ATRA(全反式视黄酸)、去曱氧基柔红霉素、hoelzer化疗方案、 La化疗方案、ABVD (博来霉素、达卡巴嗪、多柔比星和长春新碱)、 CEOP(环磷酰胺、表柔吡星、长春新碱和泼尼松龙)、2-CdA(l氯脱氧 腺苷)、FLAG & IDA (氟拉达滨、阿糖胞苷、非格司亭和去曱氧基柔红 霉素)、(有或没有随后的G-CSF(粒细胞集落刺激因子)治疗)、VAD(长 春新碱、多柔比星和地塞米松)、M&P(左旋溶肉瘤素和泼尼松)、C(环 磷酰胺)-每周一次、ABCM(盐酸阿霉素、博来霉素、环磷酰胺和丝裂霉 素-C)、 MOPP(氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼)和DHAP (地塞米 松、阿糖胞苷和顺铂)。优选的化疗方案是CHOP。因此，在其它方面，本发明涉及治疗癌症特别是肺瘤细胞表达CCR7受体的癌症的方法，其包括对需要所述治疗的个体给予治疗有 效量的本发明抗体，即结合CCR7受体的抗体或其抗原结合片段，或 给予治疗有效量的本发明的药物组合物。在特定实施方案中，所述癌 症的特征为肿瘤细胞表达CCR7受体。根据本发明治疗的说明性非限 制性癌症包括CLL、 MCL、滤泡型淋巴瘤、大B细胞淋巴瘤、AIDS 相关淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、B细胞急性原始 淋巴细胞性淋巴瘤、霍奇金病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、蕈样肉芽 肿病、慢性骨髓增生性疾病的暴发、骨髓增生异常综合征的暴发、乳 腺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、胃癌或头颈的鳞状细胞癌和结肠癌。 在优选实施方案中，根据本发明治疗的癌症包括乳腺癌、非小细胞肺 癌、黑素瘤、胃癌或头颈的鳞状细胞癌和结肠癌。在最优选的实施方 案中，根据本发明治疗的癌症包括滤泡型淋巴瘤、成人T细胞白血病 /淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、慢性骨髓增生性疾病的暴发和骨髓增生异常 综合征的暴发。在其它最优选的实施方案中，根据本发明治疗的癌症 包括CLL和MCL。在其它方面，本发明涉及杀伤表达CCR7受体的肿瘤细胞或诱导 表达CCR7受体的肿瘤细胞凋亡的方法，其包括将所述细胞接触本发 明的抗体，即结合CCR7受体的抗体或其抗原结合片段。在特定实施 方案中，所述肿瘤细胞是表达CCR7受体的肿瘤细胞，例如CLL和 MCL细胞。在其它方面，本发明涉及在需要所述治疗的个体中杀伤表达 CCR7受体的肿瘤细胞或诱导表达CCR7受体的肿瘤细胞凋亡的方法， 其包括对所述个体给予治疗有效量的本发明的抗体，即结合CCR7受 体的抗体或其抗原结合片段。在其它方面，本发明涉及减弱表达CCR7受体的肿瘤细胞向次级 淋巴组织迁移和/或阻断肿瘤细胞扩散进入次级淋巴组织的方法，其包 括将所述肿瘤细胞接触本发明的抗体，即结合CCR7受体的抗体或其 抗原结合片段。在其它方面，本发明涉及在需要所述治疗的个体中减弱表达 CCR7受体的肺瘤细胞向次级淋巴组织迁移和/或阻断肺瘤细胞扩散进入次级淋巴组织的方法，其包括对所述个体给予治疗有效量的结合CCR7受体的抗体或其抗原结合片段。关于易于用本发明方法治疗的表达CCR7受体的肿瘤细胞、抗体、 给药方案和剂量的信息在前文已述及。在特定实施方案中，易于用上 述方法治疗的表达CCR7受体的肿瘤细胞是CLL或MCL细胞。在所有情况下，短语"治疗有效量"指如前所述定义的对治疗癌 症有效的量；所述量能够是足以实现期望反应或改善例如转移或原发 肿瘤进展、大小或生长的症状或指征的量。针对特定个体的治疗有效 量可以根据例如接受治疗的疾病状态、个体的整体健康状况、给药方 法、途径和剂量以及副作用的严重程度等因素变化。例如，效果会导 致定量上至少约10%，优选至少20%、 30%、 50%、 70%或甚至90% 或更多的变化。当在组合中时，治疗有效量是相对组分组合的比例且 效果不限于单一组分。治疗有效量通常将调节症状至少约10%;通常至少约20%;优选 至少约30%;或更优选至少约50%。或者，迁移的调节指多种细胞类 型的迁移或运行受到影响。这些将导致例如受影响细胞数目的统计学 显著的和可定量的变化。这可能是在一段时间内或靶区域内受影响的 靶细胞数目的减少。还可以监测原发肿瘤进展的速度、大小、扩散或 生长。上述任何治疗方法可用在需要这些治疗的任何个体中，例如包括 诸如犬、猫、牛、马、兔、猴，且最优选人的哺乳动物。在其它方面，本发明涉及鉴定用于杀伤表达CCR7受体的肿瘤细 胞或诱导表达CCR7受体的肿瘤细胞凋亡的化合物的方法，其包括a) 将表达CCR7受体的细胞与偶联至抗CCR7抗体或其片段的候 选化合物接触，以及b) 确定所述候选化合物是否杀伤表达CCR7受体的所述细胞， 其中杀伤表达CCR7受体的所述细胞的化合物是潜在可用于杀伤表达CCR7受体的肿瘤细胞或诱导肿瘤细胞凋亡的化合物。事实上，任何表达CCR7受体的细胞，肿瘤细胞或非肿瘤细胞， 均能够用于进行上述方法。在特定实施方案中，所述表达CCR7受体的细胞是CLL或MCL细胞。能够通过任何常规方法测定表达CCR7受体的细胞的死亡，例如 根据此说明书中实施例所公开的方法。以下实施例用来i兌明本发明。实施例针对CCR7的抗体作为治疗CLL的工具 I.材料和方法样品、试剂和流式细胞术(FCM)在告知同意后获得来自CLL (慢性淋巴细胞白血病)和MCL (套细 胞淋巴瘤)患者和健康供者的外周血样品。通过标准四色FCM进行全 血细胞的最初免疫表型表征，该标准四色FC1VM吏用针对下列人表面抗 原的单克隆抗体(mAbs): CD45、 CD19、 k轻链、入轻链、CD20、 CD23、 CD5和CD3 (全部购自BD Biosciences, San Jose， CA)。弃去单核亚群 中CLL或MCL细胞少于60%的样本。随后在电子设门的肿瘤B细胞 或正常T和B淋巴细胞中进行CCR7表达分析。藻红蛋白(PE)-偶联的小鼠抗人CCR7购自R&D Systems (McKinley Place, MN)。在所有情况中均包括适当的同种型对照。在 FACScalibur流式细胞仪上使用CellQuest软件(BD Biosciences)分析免 疫荧光染色。通过聚蔗糖(Ficoll)密度梯度离心(Histopaque-1077， Sigma-Aldrich， Madrid, Spain)分离外周血单个核细胞(PBMC)。纯化的鼠抗人CCR7mAbs(此后称为"抗CCR7 mAbs")是从BD Biosciences (150503克隆，IgG2a同种型)和R&D Systems (2H4克隆， IgM同种型)获得。在细胞周期分析和细胞存活力测定中使用的DNA 染料7-氨基》文线菌素D (7-AAD)得自BD Biosciences,重组人趋化因 子CCL19和CXCL12购自R&D Systems 。受体胞吞测定为了研究抗CCR7 mAbs的结合是否造成趋化因子受体(CCR7)的 内化，用2/ig/mL的抗CCR7mAbs在37。C、5。/oC02空气下衅育5 x 105 CLL细胞不同时间(从30秒至1小时)。CCR7的生理配体之一且造成 其内吞的CCL19被用作阳性对照。在使用酸洗(O.l M甘氨酸、0.15M NaCl、 pH-2.5)清除结合的mAb或CCL19之后，如上所述通过FCM 分析测定CLL细胞上的CCR7表达。补体依赖的细胞毒(CDC)将含有105细胞的50 gL PBMC悬浮物和0.5 mg/mL至16 mg/mL 的所需浓度的纯化抗CCR7 mAbs或同种型对照(IC)接种在96圆底孔 板中。在37。C孵育30分钟后，离心并洗涤细胞。然后，加入在RPMI 1640培养基中稀释到25。/。的幼兔补体(Serotec， Oxford, UK)。 37°C下 1-2小时后，用异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗CD 19、别藻蓝蛋白 (APC)偶联的抗CD5 mAb和7- AAD对细胞进行染色。两种表面标志 物均允许FCM分辨CLL细胞、MCL细胞和T细胞群，且7-AAD用 作存活力排除染料。在每一群中分别测量非存活细胞的百分比，且使 用热灭活补体的溶解百分比根据公式[l]计算特异溶解#縣铜=100 x [ 1 ]其中A:使用补体的死亡细胞％B:使用灭活补体的死亡细胞％抗体依赖的、细胞介导的细胞毒(ADCC)自然杀伤(NK)细胞分离自从血沉棕黄层(buffy coats)获得的后的使用抗PE耦合的孩(珠(Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany)的磁性细胞分选进行。通过FCM测量的NK细胞的纯度为 95%至98°/。。在使用NK细胞(作为细胞溶解的效应物)、在5至40之 间的不同效-靶(E/T)比下、在存在或不存在抗CCR7 mAb或其同种型对照下孵育CLL细胞(耙细胞)4小时后，用FCM测量抗CCR7依赖 的、细胞介导的细胞毒。然后，用FITC偶联抗CD19 mAb、 PE偶联 抗CD56 mAb和7-AAD对细胞进4亍染色以分辨CLL细胞和效应NK 细胞，并分析CLL细胞的存活力。孵育中未使用NK细胞的CLL细 胞用作自发死亡的对照，并且如CDC测定计算特异溶解。趋化作用测定之前使用2 /ig/mL抗CCR7 mAbs孵育30分钟的CLL和MCL细 胞响应CCL19、 CCL21和CXCR4的配体CXCL12的趋化作用在 Transwell(跨井)细胞培养室(直径6.5 mm、厚度10 /mi、孔直径5 /mi， Costar, Cambridge, MA)中测定。对于趋化作用测定，将5乂105肿瘤 细胞悬浮在100 pi的含0.5% BSA的RPM1 1640中，净皮加入到培养室 的上部隔室中且趋化因子以最适浓度(对于CXCL12为100 ng/mL且 对于CCL 19和CCL21为1 /ig/mL)被加入到下部小室中的600pl相同 培养基中。允许迁移在37。C、 5% C02空气下进行4小时。从下部隔 室中回收迁移的细胞，用FITC偶联的抗CD19 mAb染色，并且在用 Trucount管(BD Biosciences)校准流速后用FCM计数60秒。在设门的 B细胞群中分析事件并与细胞的初始悬浮物中的细胞数目进行比较， 以计算输入的百分比(100 x迁移细胞的数目/在初始悬浮物中计数的 细胞数目)。每一样品重复测量两次。凋亡和细胞周期分析在某些实验中，将抗CCR7 mAbs以2 pig/mL稀释在50 pL含有105 CLL细;!包的培养悬浮物中。在其它实验中，通过在RPMI 1640中孵育 过夜使抗CCR7mAbs附着到96平底孔板中。然后，洗涤该板并加入 105 CLL细胞。在两种情况下，细胞均在37。C下孵育最长48小时。 细胞用冷磷酸盐緩沖盐水(PBS)洗涤，用FITC偶联的抗CD 19 mAb 染色，重悬在0.5 mL PBS中并稀释在5mL冰冷的70%乙醇中用于在 -20。C下固定过夜。第二天，离心固定的细胞，洗涤并用20/xg/mL的 7-AAD染色用于DNA含量分析。获得最少10,000个总事件并用Cell-Quest Pro软件(BD Bioscences)分析。简而言之，使用7-AAD焚 光的脉冲区域和脉沖宽度对CD 19阳性事件设门并弃去双重谱线。在 7-AAD荧光柱状图中分析作为凋亡细胞的亚Gi峰的百分比。增殖测定从健康供者分离PBMC并在事先用抗CCR7mAbs及其相应的同 种型对照包被的96孔板中培养72小时。还包括例如抗CD3加IL2的 阳性对照。所有的测量均重复三次。在培养的最后16小时中用每孔1 gCi的[3H]-胸脊(Amersham Biosciences GmbH， Freiburg, Germany)才示i己 细胞。然后收集细胞并进行闪烁计数。统计分析所有的统计检验均在SPSS version 8.0进行。Wilcoxon和Kendall's W非参数检验用于比较大多数测定中不同处理的结果。对于[311]-胸苷 增殖测定，进行ANOVA用于组间比较。计算Pearson相关系数以研 究CCR7平均荧光强度(MFI)和CDC中溶解百分比之间的关系。II.结果抗CCR7 mAbs不诱导其标乾的内化使用非偶联形式的治疗性mAbs不仅需要高密度的靶抗原，还需 要在细胞表面存在抗原-抗体复合物以活化补体或结合细胞毒细胞的 Fc受体，即mAb与抗原的结合不诱导其内化是重要的，因为这可能 降低mAb的治疗效果。就此方面，已经暗示了抗体与某些趋化因子受 体的结合能够导致受体的胞吞及随后在抗体降解后受体的蛋白水解或 再表达。发明人分析了 mAbs与CCR7的结合是否产生其在CLL细胞 的内吞。CLL细胞表面的CCR7表达在CLL细胞中比在正常B细胞 或T细胞中高2-4倍(图IA)且在与抗CCR7 mAbs —起孵育长至60分 钟的不同时间不下降(图1B)。相反，其在与1 pg/mL作为阳性对照的 CCL19一起孵育，前5分钟下降了约60%。36在体外抗CCR7 mAbs介导CLL和MCL细胞的强烈和特异的CDC由补体蛋白(CDC)或例如NK细胞的效应细胞(ADCC)的募集介导 的细胞毒是所提出的通过非偶联治疗性mAbs体内清除肿瘤细胞的主 要机制。因此，用来自不同患者的CLL和MCL样本测试了抗CCR7 mAbs介导CDC的效能。非常高比例的用抗CCR7 IgM mAb预孵育的 CLL细胞在用兔补体处理1小时后被杀伤(图2A)。类似地，IgG同种 型的抗CCR7 mAb也介导显著的CDC (图2B)。与CLL相似，MCL细胞也表达显著水平的CCR7 (图3A)，并且 CDC实验显示两种抗CCR7 mAbs均有效地杀伤CCR7阳性MCL细胞 (图3B)。当使用同样同种型的无关免疫球蛋白时没有观察到显著的 CDC(图2A、图2B和图3B)。尽管IgG同种型的抗CCR7 mAb造成CDC的效能相对较低，但 动力学测定证明其补体活化能力能够通过延长与补体源孵育的时间而 显著提高(数据未显示)。这可能是由于IgG2a同种型的mAb对补体级 联的活化较慢。CCR7并不限于CLL或MCL细胞，还表达在某些正常淋巴亚群， 主要是幼稚B细胞和幼稚T细胞中，其可能对由抗CCR7 mAbs介导 的细胞毒易感。有趣的是，由抗CCR7mAbs介导的CDC在CLL细胞 中比在来自同一患者的T细胞中显著增高(对于IgMmAbs， P=0.001， 对于IgGmAbs， P=0.016)。类似地，当用与上述相同的实验条件处理 时，甚至在用更高剂量的两种抗CCR7 mAbs处理时，来自健康供者 的B细胞和T细J包对补体活性耐受，如剂量-效应测定所证明(图4A 和4B)。对于来自CLL患者的几乎不遭受溶解的T细胞更是如此(图 4A和4B)，可能由于在这些样品中存在的CLL细胞对补体的高和快的 消耗。另 一方面，浓度低至1 pg/mL的两种抗CCR7 mAbs均足以介导 CLL细胞的CDC (图4A和4B)。一种可能的解释是存在对CDC活性的不同敏感性，由于CCR7 在正常T和B细胞中的表达比在CLL细胞中要低得多(图1A)。事实 上，CCR7在CLL细胞中的表达水平与不同样品对CDC的敏感性(图5)显著(F 0.602， P=0.025, n-ll)相关，证实了抗原密度在选择免疫治疗 的靶标中的重要性。此外，看起来CDC活性的差异不与例如CD55或CD59的补体调 节蛋白的差异表达有关，因为它们的表达水平在不同的CLL样本之间 以及在来自这些患者的CLL细胞和T细胞之间非常相似(数据未显示)。CIX细胞的体夕卜ADCC介导治疗性mAbs的有益作用的其它主要机制是由细胞介导的细 胞毒(ADCC)。因此，发明人测试了 NK细胞造成用抗CCR7IgGmAb 预先处理的CLL细胞溶解的能力。在用5至40的E/T比进^f亍的6个 实验中，当与相同同种型的无关免疫球蛋白相比(平均溶解=12% ±5， n=6)，在此抗CCR7 mAb的存在下(平均溶解=13% ±1， n-6)未观察到 显著的ADCC(图6)。这可能与人Fc受体对鼠mAbs的低亲和性有关。 相反，利妥昔单抗， 一种公知的嵌合抗CD20mAb， IgGl同种型，介 导针对CLL细胞的ADCC，其平均溶解=34%±2(n=6)( 6)。未测 试抗CCR7IgMmAb存在下的ADCC，因为此同种型不有效介导这种 类型的细胞毒。响应抗CCR7 mAbs的凋亡和增殖不断增加的证据表明治疗性mAbs的很大部分的有益反应是由于 对细胞周期或靶细胞存活的直接作用。通过细胞DNA的7-AAD染色 和亚G,峰分析来研究抗CCR7mAbs对CLL细胞的凋亡的作用。用可 溶抗CCR7 IgM mAb处理24小时的CLL细胞的凋亡速率与用IC处理 的CLL细胞的凋亡没有显著不同(数据未显示)。类似地，通过施加抗 CCR7 mAbs的结合至48小时所产生的CCR7的交联未诱导凋亡(数据 未显示)。为了研究细胞响应抗CCR7 mAbs的增殖，用来自健康供者的 PBMC进行了的经典pH]-胸苷摄取增殖测定，因为CLL细胞在孵育 48-72小时后具有高自发凋亡速率。这些测定揭示了在用IgM同种型的抗CCR7mAb孵育后，[3司-胸香向细胞中的掺入中度增加，这与用 IgMIC得到的结果无显著不同。相反，IgG同种型的抗CCR7mAb或 其IC均不诱导增殖(图7)。作为阳性对照，PBMC响应使用抗CD3 mAb 加IL2的孵育增殖。抗CCR7 mAbs抑制CLL和MCL细胞的体外迁移CCR7不仅在幼稚淋巴细胞和成熟树突状细胞的生理归巢中起主 要作用，还在表达其的肿瘤(癌)细胞特别是CLL和MCL细胞的转移 性迁移中起主要作用。为了阻断这些疾病向淋巴组织扩散，中和此趋 化因子受体的功能可能是CLL和MCL患者中感兴趣的。就此方面， 发明人分析了抗CCR7 mAbs中和CLL和MCL细胞响应CCL19或 CCL21的体外迁移。IgG同种型的抗CCR7mAb非常有效地阻断这些 细胞向CCL19或CCL21的迁移，而IgM同种型的抗CCR7 mAb略微 减少迁移(图8A-B)。在这些测定中，CLL细胞响应CXCL12 (趋化因子受体CXCR4的 配体)的迁移不受到所使用的两种mAbs的影响。III.讨论来自发明人的前述数据显示B细胞淋巴组织增生性病症中的趋化 因子受体CCR7、 CXCR4和CXCR5的表达水平根据组织学亚型是非 常异质的，并且与淋巴结(LN)参与显著相关，因为这些分子介导淋巴 细胞向次级淋巴组织的进入和定位。CCR7的表达在CLL和套细胞淋 巴瘤中特别高，解释了这些疾病入侵LNs的高倾向。类似地，近期的 研究报道了 CCR7在来自其它血液肿瘤或非血液实体瘤的恶性细胞上 的表达，该血液肿瘤例如霍奇金病、成人T细胞白血病/淋巴瘤和蕈样 肉芽肿病，该非血液实体瘤例如乳腺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、胃 癌或头颈的鳞状细胞癌或结肠癌。有趣的是，在所有情况下，此表达 与向淋巴组织的迁移和转移的特征性模式相关。这些数据表明使用CCR7作为免疫治疗中的治疗靶标的可能性，不仅因为其在某些恶性细胞中的高密度及其在正常组织中的有限表 达，还因为其在疾病进展和致病性中的关键作用。已经接受CDC为当靶抗原高度表达时非偶联治疗性mAb作用的 主要机制，因为相信CDC比ADCC需要多约IO倍的表面抗原密度。 因此，发明人分析了抗CCR7 mAbs固定补体和介导抗来自CLL患者 的CLL细胞、MCL细胞和正常T细胞的细胞毒的能力。他们的结果 显示CLL和MCL细胞的重要溶解是由于补体固定造成的，而几乎无 T细胞破坏，甚至在饱和浓度的抗CCR7mAbs和补体的条件下。这可 能是由于与CLL细胞相比，CCR7在T细胞上的表达较低。就此方面， 发明人发现了在相同实验条件下，CLL细胞表面的CCR7密度和溶解 细胞的百分比紧密相关^=0.025, r=0.602)。重要的是，这些结果表明 用抗CCR7mAbs治疗CLL或MCL，甚至在j氐浓度下，可能导致有效 清除肿瘤细胞而不溶解表达该分子(CCR7)的正常淋巴细胞。有可能假 设由于抗CCR7mAbs治疗的次级免疫缺陷不会非常重要，因为CCR7 阴性效应淋巴细胞保持不被扰乱。对作为从CCR7缺陷小鼠到用抗 CCR7 mAbs治疗的CLL或MCL患者的特征的免疫缺陷的推断在某种 方式上是困难的，因为这些个体已经发展出了在CCR7敲除中缺乏的 免疫记忆。与关于CDC的发现不同，IgG同种型的抗CCR7 mAb不是ACDD 的活化物，可能由于其鼠来源。尽管如此，公知分子工程技术使得开 发嵌合或人源化抗体以提高临床特点是可能的，该临床特点例如mAb 介导通过单核细胞、中性粒细胞和NK细胞的Fc受体的细胞毒的能力。 在任何情况下，目前都在讨论ADCC在CLL的免疫治疗中的重要性， 由于这些患者中恶性细胞的强烈扩增和T细胞和NK细胞的功能缺陷。 就此方面，最近发表了若干方法以扩增和活化来自健康供者或CLL患 者的细胞毒淋巴细胞和NK细胞以利用该治疗性mAbs的作用机制。阻断靶抗原的功能组成了治疗性mAbs的另一作用机制。在本发 明中，阻断性抗CCR7 mAbs可能具有另外的优势抑制涉及淋巴肿 瘤和表达其的其它非血液肿瘤的可能的主要分子的功能。就此方面， 公知利妥昔单抗(rituximab)或阿来组单抗(alemtuzumab)均不能非常有效地在CLL患者中减少淋巴结病。这些结果为阻断性抗CCR7 mAbs可以减弱向LN迁移并因此除通 过CDC或ADCC杀伤细胞外还阻断肺瘤扩散的那些病理学开辟了新 的治疗机会。
权利要求
1. 结合CCR7受体的抗体或其抗原结合片段在制备用于杀伤表达CCR7受体的肿瘤细胞或诱导表达CCR7受体的肿瘤细胞凋亡的药物组合物中的用途。
2. 根据权利要求1或2所述的用途，其中所述肿瘤细胞是慢性淋 巴细胞白血病(CLL)细胞或套细胞淋巴瘤(MCL)细胞。
3. 根据权利要求1或2中任一权利要求所述的用途，其中结合 CCR7受体的抗体或其抗原结合片段与另外的治疗活性化合物联合使 用。
4. 用于杀伤表达CCR7受体的肿瘤细胞或诱导表达CCR7受体的 胂瘤细胞凋亡的方法，其包括将所述细胞接触结合所述CCR7受体的 抗体或其抗原结合片段。
5. 用于在需要所述治疗的个体中杀伤表达CCR7受体的肿瘤细胞 或诱导表达CCR7受体的肿瘤细胞凋亡的方法，其包括对所述个体给 予治疗有效量的结合所述CCR7受体的抗体或其抗原结合片段。
6. 根据权利要求4或5所述的方法，其中所述肿瘤细胞是慢性淋 巴细胞白血病(CLL)细胞或套细胞淋巴瘤(MCL)细胞。
7. 用于减弱表达CCR7受体的肿瘤细胞向次级淋巴组织迁移和/ 或阻断紳瘤细胞扩散进入次级淋巴组织的方法，其包括将所述肺瘤细 胞接触结合CCR7受体的抗体或其抗原结合片段。
8. 用于在需要所述治疗的个体中减弱表达CCR7受体的肿瘤细胞 向次级淋巴组织迁移和/或阻断肿瘤细胞扩散进入次级淋巴组织的方法，其包括对所述个体给予治疗有效量的结合CCR7受体的抗体或其 抗原结合片段。
9. 根据权利要求7或8所述的方法，其中所述肿瘤细胞是慢性淋 巴细胞白血病(CLL)细胞或套细胞淋巴瘤(MCL)细胞。
10. 鉴定用于杀伤表达CCR7受体的肿瘤细胞或诱导表达CCR7 受体的肿瘤细胞凋亡的化合物的方法，其包括a) 将表达CCR7受体的细胞接触与抗CCR7抗体或其片段偶联的 候选化合物，以及b) 测定所述候选化合物是否杀伤所述表达CCR7受体的细胞， 其中杀伤所述表达CCR7受体的细胞的化合物是潜在可用于杀伤肿瘤细胞或诱导肿瘤细胞凋亡的化合物。
11. 根据权利要求IO所述的方法，其中所述细胞是慢性淋巴细胞 白血病(CLL)细胞或套细胞淋巴瘤(MCL)细胞。
全文摘要
本发明公开了结合CCR7受体的抗体或其抗原结合片段能够选择性杀伤表达CCR7受体的肿瘤细胞、减弱表达CCR7受体的肿瘤细胞的迁移和/或阻断表达CCR7受体的肿瘤细胞的扩散。公开了所述抗体用于杀伤或诱导所述肿瘤的凋亡的用途，因此提供用于治疗其肿瘤细胞表达CCR7受体的癌症的可选疗法。
文档编号A61K39/395GK101257923SQ200680032303
公开日2008年9月3日 申请日期2006年7月5日 优先权日2005年7月6日
发明者塞西莉亚·穆尼奥斯卡列哈, 曼努埃尔·赫苏斯·阿方索佩雷斯, 索尼亚·洛佩斯希拉尔 申请人:马德里自治大学