包括ppar激动剂的药物的制作方法

专利名称：：包括ppar激动剂的药物的制作方法
技术领域：
：0001本发明涉及促进睑板腺上皮细胞或角膜上皮细胞增殖的试剂，包括PPAR(过氧化物酶体增殖物激活受体)a或S作为活性成分。
背景技术：
：0002睑板腺为包括在上和下眼睑内的产生脂质的腺体，通过位于眼睑睫毛的结膜侧的开口分泌脂质。构成泪液的脂质层含有睑板腺提供的液体作为组分，防止泪液从眼表面蒸发。已知，在睑板腺功能异常或睑板炎患者中，睑板腺的功能恶化，并且脂质分泌量减少，引起蒸发过强型干眼、角膜结膜上皮病症、角膜上皮糜烂和角膜溃疡(它们与干眼有关)，等等。此外，角膜由外胚层上皮和中胚层前界层(Bowman膜)/基质/后界层(Descemet膜)/内皮构成。由于角膜是眼球的最前部，其容易受到外界环境的影响，结果出现多种病症。与角膜上皮细胞的损伤或缺陷有关的疾病的实例包括干眼综合征、角膜溃疡、浅层点状角膜炎、角膜上皮糜烂、与角膜损害有关的眼变应性疾病如春季结膜炎和特应性角膜结膜炎，等等。0003另一方面，PPAR为核内受体之一，其在几乎所有的脊推动物中表达，据称是与细胞内糖-脂代谢和细胞分化紧密相关的转录因子族。作为亚型，a、5和y是已知的。一些情况下PPAR5被称为PPARP(非专利文献1)。作为PPAR在眼组织中的分布，已知PPARa和(3在兔的角膜上皮细胞中表达(非专利文献2)以前，有报道称具有PPAR激活作用的5-[4-(6-曱氧基-l-甲基-lH-苯并咪唑-2-基甲氧基)苯曱基]噻唑烷-2，4-二酮可被用作治疗角膜结膜病症的试剂(专利文献1和2),以及在治疗眼病(结膜炎、干眼综合征、角膜炎等)中给予PPARot、S或Y激动剂(专利文献3)。此外，已知PPARoc在肝、肾等中有分布，并且影响脂代谢/运输，进一步地，有报告称其激动剂可被用作治疗角膜疾病的试剂(专利文献4)。关于PPAR5激动剂，之前已有报告称该激动剂促进大鼠皮脂腺上皮细胞的增殖和分化(非专利文献3)，并促进皮肤损伤的愈合(非专利文献4)。另外，已知通过给予非蓬唑烷二酮PPAR配体和GLP-1衍生物刺激P-细胞增殖(专利文献5)和通过PPARY激动剂匹格列酮抑制白血病细胞和前列腺癌细胞的增殖(专利文献6)的方法。0004但是，PPARa、5和y在每种动物种类和每种组织或细胞中的表达和功能包括4艮多待回答的问题，并且哪种PPAR激动剂可用于人眼疾病是未知的。[专利文献1]WO2005/039574[专利文献2]日本专利申请公开(JP-A)号2001-39976[专利文献3]WO2002/076177[专利文献4]JP-ANo.2005-008570[专利文献5]WO2002/69994[专利文献6]WO1998/25598[非专利文献1]JMedChem2000,43:527-550[非专利文献2]JBiolChem2000,275:2837[非专利文献3]MolecularGeneticandMetabolism2001，74:362-369[非专利文献4]AmJClinDermatol2003，4(8):523-530
发明内容本发明要解决的问题0005本发明的目的是提供能够促进睑板腺上皮细胞和角膜上皮细胞增殖的试剂，其可为对诸如干眼等的眼病的基础治疗，以及用于诸如睑板腺功能异常、蒸发过强型干眼等的眼病的治疗剂，其含有所述的促进剂。实现目的的手段0006鉴于上述问题，本发明人进行了各种研究，结果发现PPARa或S激动剂具有促进瞼板腺上皮细胞和角膜上皮细胞增殖的活性，最终完成本发明。相应地，本发明包括至少以下内容(1)促进睑板腺上皮细胞增殖的试剂，包括PPARa或S激动剂作为活性成分。(2)促进角膜上皮细胞增殖的试剂，包括PPARa或S激动剂作为活性成分。(3)治疗睑板腺功能异常(meibomianglanddysfunction)的试剂，包括PPARoc或S激动剂作为活性成分。(4)治疗角膜上皮病症的试剂(anagentfortreatingacornealepithelialdisorder),包括PPARa或5激动剂作为活性成分。(5)治疗蒸发过强型干眼(hyperevaporativedryeye)的试剂，包4舌PPARa或5激动剂作为活性成分。(6)促进睑板腺上皮细胞增殖的试剂，包括PPARS激动剂作为活性成分。(7)促进角膜上皮细胞增殖的试剂，包括PPAR5激动剂作为活性成分。(8)治疗睑板腺功能异常的试剂，包括PPARS激动剂作为活性成分。(9)治疗角膜上皮病症的试剂，包括PPAR5激动剂作为活性成分。(10)治疗蒸发过强型干眼的试剂，包括PPARS激动剂作为活性成分。(11)根据(1)至(5)任一项的试剂，其中PPARa或5激动剂为式(I)表示的化合物或其药理学可接受的盐10007[化学式1]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>0008其中A为氢原子或碳原子数1至6的烷基基团，B为选自画CO-、-NH-、-(CH2)n-S-、醒(CH2)n-0-和-0-(CH2)n-0-的连接物，其中n为1至3的整数，X和Y相同或不同，各为碳原子或氮原子，Z为氧原子、硫原子或-CH2-，Ar!为5至6元芳环基团，任选地具有1至3个取代基，Rj和R2相同或不同，各为氢原子或碳原子数1至6的烷基基团，以及R3为氬、卤素原子或碳原子数1至6的烷基基团。(l2)根据(6)至(10)任一项的试剂，其中PPARS激动剂为式(II)表示的化合物或其药理学可接受的盐[化学式2]0010<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中A为氩原子或碳原子数1至6的烷基基团，B为选自-(CH2)n-S-和-0-(CH2)n-0-的连接物，其中n为1至3的整数，X和Y相同或不同，各为碳原子或氮原子，Z为氧原子、硫原子或-CH2-，An为5至6元芳环基团，任选地具有1至3个取代基，和R2相同或不同，各为氢原子或碳原子数1至6的烷基基团，以及R3为氢、卣素原子或碳原子数1至6的烷基基团。(13)根据(11)或(12)的试剂，其中PPARS激动剂为(4-(3-(4-乙酰基-3-羟基-2-丙基)苯氧基)丙氧基苯氧基)乙酸、(2-曱基-4-(((4-甲基-2-(4-(三氟曱基)苯基)-5_噻唑基)曱基)硫基)苯氧基)乙酸或(4-(((2-(3-氟-(4-(三氟曱基)苯基)-4-曱基-5-噻唑基)甲基)硫基)-2-曱基苯氧基)乙酸，或其药理学上可接受的盐。(14)根据(ll)的试剂，其中PPARa激动剂为2-(4-(4-氯苯曱酰基)苯氧基)-2-曱基丙酸l-甲基乙脂或((4-氯-6-((2,3-二曱基苯基)氨基)-2-嘧啶基)硫基)乙酸，或其药理学上可接受的盐。的用途。5一&、工(16)PPARa或5激动剂在生产促进角膜上皮细胞增殖的试剂中的用途。(17)PPARa或S激动剂在生产治疗睑板腺功能异常的试剂中的用途。(18)PPARa或5激动剂在生产治疗角膜上皮病症的试剂中的用途。(19)PPARa或S激动剂在生产治疗蒸发过强型干眼的试剂中的用途。(20)PPARS激动剂在生产促进睑板腺上皮细胞增殖的试剂中的用途。(21)PPAR5激动剂在生产促进角膜上皮细胞增殖的试剂中的用途。(22)PPARS激动剂在生产治疗睑板腺功能异常的试剂中的用途。(23)PPAR5激动剂在生产治疗角膜上皮病症的试剂中的用途。(24)PPARS激动剂在生产治疗蒸发过强型干眼的试剂中的用途。(25)促进睑板腺上皮细胞增殖的方法，包括向需要促进睑板腺上皮细胞增殖的个体给予有效量的PPARa或S激动剂。(26)促进角膜上皮细胞增殖的方法，包括向需要促进角膜上皮细胞增殖的个体给予有效量的PPARa或S激动剂。(27)根据(25)的方法，其被执行以治疗睑板腺功能异常。(28)根据(26)的方法，其被执行以治疗角膜上皮病症。(29)治疗蒸发过强型干眼的方法，包括向患有蒸发过强型干眼的患者给予有效量的PPARa或S激动剂。(30)促进睑板腺上皮细胞增殖的方法，包括向需要促进睑板腺上皮细胞增殖的个体给予有效量的PPAR5激动剂。(31)促进角膜上皮细胞增殖的方法，包括向需要促进角膜上皮细胞增殖的个体给予有效量的PPARS激动剂。(32)根据(30)的方法，其被执行以治疗睑板腺功能异常。(33)根据(31)的方法，其被执行以治疗角膜上皮病症。(34)治疗蒸发过强型千眼的方法，包括向患有蒸发过强型干眼的患者给予有效量的PPARS激动剂。发明效果0011根据本发明，提供了促进睑板腺上皮细胞增殖的新试剂或促进角膜上皮细胞增殖的新试剂，并且该促进剂促进了睑板腺上皮细胞和角膜上皮细胞的增殖。此外，本发明的治疗可有效地用于治疗或改善疾病，如睑板腺功能异常、角膜上皮病症和蒸发过强型干眼。附图简要说明0012图1显示了培养的人角膜上皮细胞(上列)、培养的兔角膜上皮细胞(中列)、以及培养的猴睑板腺上皮细胞(下歹'j)中PPARa、S或ymRNA的表达。实施本发明的最佳方式0013本发明提供了促进睑板腺上皮细胞增殖的试剂，包括PPARot或5激动剂作为活性成分。该促进剂促进睑板腺上皮细胞的增殖。本发明还提供了促进角膜上皮细胞增殖的试剂，包括PPARa或S激动剂作为活性成分。该促进剂促进了角膜上皮细胞的增殖。本发明中，促进细胞增殖的试剂意味着具有促进细胞分裂以增加细胞数量作用的试剂和具有抑制细胞死亡以增加细胞数量作用的试剂。0014本发明的促进剂包括PPARa或5激动剂作为活性成分。PPARa激动剂指具有结合并激活PPARa的作用的物质。另外，PPARS激动剂指具有结合并激活PPAR5的作用的物质。0015作为PPARa或S激动剂，可纟是及各种已知的PPARa或S激动剂。PPARa或S激动剂的特定实例包括例如WO2001/00603、W099/62872、WO2002/100813、W097/28149、WO2004/022551、WO2001/79197、WO2003/099793、W02005/105736、WO2005/105726、WO2005/085235、WO2005/113600、W02005/105754、WO2005/049606、WO2004/111020、WO2006/055187、WO2006/084176、WO2005/060958、WO2005/097786、W02004/092117、WO2005/037763、WO2005/030694、WO2005/016335、WO2003/074495、WO2004/058174、JP2003-171275A、JP2005-179281A、WO2006/031969、WO2005/097763、WO2004/063165、WO2002/050048、WO2005/090966、WO2003/099793、WO2002/076959、WO2002/053547、WO2001/00603、W097/28149、WO2004/063184、WO2006/090920、WO2006/059744、WO2006/041197、WO2003/033493、WO2003/016291、WO2002/076957、WO2002/046176、WO2002/046154、WO2002/014291、WO2001/079197等等中描述的物质。0016PPARa或S激动剂化合物的特定实例包括2-(4-(4-氯苯甲酰基)苯氧基)-2-甲基丙酸l画曱基乙酉旨(非诺贝特;CAS登记号49562-28-9)、((4國氯-6-((2，3-二曱基苯基)氨基)-2-嘧啶基)硫基)乙酸(WY-14643;CAS登记号50892-23-4)、(4-(3-(4-乙酰基-3-羟基-2-丙基)苯氧基)丙氧基苯氧基)乙酸(L画165041;CAS登记号79558-09-1)、(2-曱基-4-(((4-甲基-2-(4-(三氟甲基)苯基)-5-(噻唑基)甲基)硫基)苯氧基)乙酸(0\￥-501516;CAS登记号317318-70-0)、(4-(((2-(3-氟-4-(三氟曱基)苯基)-4-曱基-5-噻唑基)曱基)硫基)-2-曱基苯氧基)乙酸(GW-0742;CAS登记号317318-84-6)、2-曱基-4-((2R)-2-(3-曱基-5-(4-(三氟曱基)苯基)-2-噻吩基)丙氧基)-苯丙酸(CAS登记号728038-95-7)、2-乙基-2-(4-(4-(4-(4-曱氧基苯基)-哌。秦-1-基)-2-(4-三氟曱基-苯基)-噻唑-5-基曱基磺酰基)-苯氧基)丁酸(GSK-677954;CAS登记号884324-15-6)、(4-(3-(3-苯基-7-丙基-苯并呋喃-6-基氧基)-丙基磺酰基)-苯基)乙酸(L-796449;CAS登记号194608-80-5)、以及2-(4-(3-(1-(2-(2-氯-6-氟-苯基)-乙基)-3-(2,3-二氯-苯基)-脲基)-丙基)-苯氧基)-2-曱基丙酸(GW-2433;CAS登记号227941-61-9)。0017知是否是PPARoc或S激动剂的物质组^中筛选得、到，并且J种物质(化合物.)可以被用作本发明的活性成分。已知PPARa或S激动剂分别结合PPARot或5的配体结合结构域(LBD)，以活化该受体，并调节PPAR靶基因的转录。为了利用这种性能并同时不影响存在于哺乳动物细胞中的其它核受体，可通过釆用LBD和酵母GAL4嵌合受体以及报告基因的筛选方法选择新的PPARoc或5激动剂。0018作为筛选方法，以PPAR-GAL4测定举例说明(参考文献，T.M.Willsonetal.,JournalofMedicinalChemistry，2000，vol.43，No.4,p.528-550和J.M.Lehmannetal.，TheJournalofBiologicalChemistry,1995，vol.270，No.22,p.12953-12956)。具体地，实例包括的方法包括(a)向细胞引入载体和报告质粒的步骤，该载体用于表达酵母转录因子GAL4的DNA结合结构域(DBD)和PPARoc或5的LBD的融合蛋白，该质粒含有GAL4的DNA结合元件和报告基因，(b)让细胞与测试物接触、测量细胞中报告基因的表达量并将该表达量与未与测试物接触的对照细胞中的表达量进行比较的步骤，以及0019土5,'、、'/在上述方法的步骤(a)中，所使用的细胞为不内源表达GAL4的细胞，优选哺乳动物细胞。报告基因可以为编码可检测的蛋白或酶的基因，其实例包括LUC(荧光素酶)基因、SPAP(分泌的胎盘碱性磷酸酶)基因、CAT(氯霉素乙酰转移酶)基因等。'制备融合蛋白表达载体和报告质粒以及将该载体和质粒引入细胞可通过上述参考文献或本身已知的方法进行。0020J在上述方法的步骤(b)中，测试物可以为任何已知的化合物或新化合物，其实例包括核酸、糖、脂、蛋白、肽、有机低分子量化合物、采用组合化学技术制备的化合物库、通过固相合成方法或噬菌体展示技术制备的随机肽库、以及源于微生物、动物和植物、海洋生物等的天然组分。此外，在步骤(b)中，由于测试物存在或不存在导致的PPARot或5转录活性通过所谓的报告物测定进行研究。取决于所使用的报告基因，净艮告物测定可通过本身已知的方法进行。在上述方法的步骤(c)中，当存在测试物时的报告物活性显著高于其不存在时的报告物活性时，则测试物可一皮确定为具有PPARoc或S激动剂活性的化合物。当通过ECso值表示时，用在本发明中的PPARa激动剂对人PPARa的活性不超过50pM、优选不超过10iaM、进一步优选不超过5fiM。当通过ECso值表示时，用在本发明中的PPARS激动剂对人PPARS的活性不超过10(iM、优选不超过1jiM、进一步优选不超过0.1fiM。EC50值为采用人PPARa或5通过PPAR-GAL4测定测量的值(参见T.M.Willsonetal.，JournalofMedicinalChemistry,2000,vol.43,No.4,p.527-550)。PPARot或S激动剂的优选实例包括具有以下式(I)表示的结构的化合物或其药理学上可接受的盐0021002200230024[化学式3]0025其中A为氢原子或碳原子数1至6的烷基基团，B为选自画CO-、-NH-、-(CH2)n-S-、隱(CH2)n-0画和-0-(CH2)n-0-的连接物，其中n为1至3的整数，X和Y相同或不同，各为碳原子或氮原子，Z为氧原子、硫原子或-CH2-,An为5或6元芳环基团，任选地具有1至3个取代基，Ri和R2相同或不同，各为氢原子或碳原子数1至6的烷基基团，以及R3为氢、卤素原子或碳原子数1至6的烷基基团。0026对于上式(I)中的A,"碳原子数1至6的烷基基团"的实例包括曱基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、l-曱基丁基、2-曱基丁基、1,2-二曱基丙基、己基、l-甲基戊基、2-甲基戊基、3-曱基戊基、4-曱基戊基、1,1-二曱基丁基、1，2-二曱基丁基、1，3-二曱基丁基、2,2-二曱基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二曱基丁基、l-乙基丁基、2-乙基丁基、l-乙基-2-曱基丙基、1，1，2-三甲基丙基等。碳原子数1至6的烷基基团优选异丙基。0027对于上述式(I)中的B,连接物优选-CO-、-NH-、《H2-S-或-0-(CH2)3-0-,更优选-CHrS-或-0-(CH2)3-0-。0028对于上述式(I)中的Ar,，5或6元芳环基团的实例包括苯基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、嗯唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、咪唑基、吡唑基、1,2,3-嗯二唑基、1,2,4-P恶二唑基、1,3,4-嚼二唑基、呋咱基、1,2，3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、1,2，3-三唑基、1，2,4-三哇基、四唑基、p比咬基、哒。秦基、嘧啶基、p比。秦基、三漆基等。该芳族环基团优选苯基或噻唑基。0029上述式(I)中可以具有的取代基的实例包括卣素原子、羟基基团、碳原子数1至6的烷基基团、碳原子数1至6的卣代烷基基团、碳原子数2至7的酰基和任选具有碳原子数1至6的烷基基团或碳原子数1至6的卣代烷基基团的苯基基团。优选的取代基为氯原子、羟基基团、甲基基团、乙酰基基团、4-三氟曱基苯基基团和3-氟-4-曱基苯基基团。0030对于上述式(I)中R,或R2，"碳原子数1至6的烷基基团"的实例包括曱基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、l-甲基丁基、2-曱基丁基、1，2-二曱基丙基、己基、l-曱基戊基、2-曱基戊基、3-甲基戊基、4-曱基戊基、1,1-二曱基丁基、1，2-二曱基丁基、1，3-二曱基丁基、2，2-二曱基丁基、2，3-二曱基丁基、3,3-二曱基丁基、l-乙基丁基、2-乙基丁基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1,2-三曱基丙基等。该碳原子数1至6的烷基基团优选曱基。0031对于上述式(I)中R3，"卤素原子"的实例包括氟原子、氯原子、溴原子等。该卣素原子优选为氯原子。0032对于上述式(I)中R3，"碳原子数1至6的烷基基团"的实例包括曱基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、l-曱基丁基、2-曱基丁基、1,2-二曱基丙基、己基、l-曱基戊基、2-甲基戊基、3-曱基戊基、4-曱基戊基、1,1-二曱基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2,3-二曱基丁基、3,3-二曱基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、l-乙基-2-曱基丙基、1,1,2-三甲基丙基等。该碳原子数1至6的烷基基团优选曱基。0033式(I)表示的化合物药理学上可接受的盐的实例包括无机酸、有机酸和酸性氨基酸等的酸加合盐，其中无机酸例如为盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等；有机酸例如为曱酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、马来酸、苹果酸、酒石酸、甲石黄酸、乙磺酸等；酸性氨基酸例如为天冬氨酸、谷氨酸等。这些盐还包括其溶物可以含;光学异构体或几;异i勾体。、这类异构体^包括在本发明的范围内，并可根据本身已知的方法分离和纯化。其任何混合物和分离形式都可用在本发明中。0034本发明中，式(I)表示的化合物中优选的PPARa激动剂包括2-(4-(4-氯苯曱酰基)苯氧基)-2-甲基丙酸l-甲基乙酯(非诺贝特；CAS登记号49562-28-9)、((4-氯-6-((2,3-二曱基苯基)氨基)-2-嘧啶基)硫基)乙酸(WY-14643;CAS登记号50892-23-4)等。优选的PPAR5激动剂包括4-(3-(4-乙酰基-3-羟基-2_丙基)苯氧基)丙氧基苯氧基乙酸(L-165041;CAS登记号79558-09-1)、(2-甲基-4-(((4-曱基-2-(4-(三氟曱基)苯基)-5-瘗唑基)曱基)硫基)苯氧基)乙酸(GW-501516、CAS登记号317318-70-0)、(4-(((2-(3-氟-4-(三氟曱基)苯基)-4-曱基-5-噻唑基)甲基)硫基)-2-曱基苯氧基)乙酸(GW-0742;CAS登记号317318-84-6)等。0035优选的PPARS激动剂包括下式(II)表示的化合物和其药理学上可接受的盐0036[化学式4]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>其中A为氢原子或碳原子数l至6的烷基基团，B为选自-(CH2)n-S-和-0-(CH2)n-0-的连接物，其中n为1至3的整数，X和Y相同或不同，各为碳原子或氮原子，Z为氧原子、硫原子或-CH2-,Ar!为5或6元芳环基团，任选地具有1至3个取代基，R,和R2相同或不同，各为氢原子或碳原子数1至6的烷基基团，以及R3为氢、卣素原子或碳原子数1至6的烷基基团。0037对于上述式(II)中的A，"碳原子数1至6的烷基基团"的实例包括曱基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、l-曱基丁基、2-曱基丁基、1，2-二曱基丙基、己基、l-曱基戊基、2-曱基戊基、3-曱基戊基、4-曱基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二曱基丁基、1,3-二曱基丁基、2，2-二曱基丁基、2,3-二甲基丁基、3，3-二曱基丁基、l-乙基丁基、2-乙基丁基、l-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基等。0038对于上述式(II)中的B，连接物优选-CH2-S-或-0-(CH2)3-0-。0039对于上述式(II)中的Ar,,5或6元芳环基团包括苯基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、P恶唑基、异P恶唑基、噻唑基、异噻唑基、咪唑基、吡唑基、1，2,34恶二唑基、1,2,4-嗯二唑基、1,3,4-P恶二唑基、呋咱基、1,2，3画蓬二唑基、1,2,4-漆二唑基、1，3,4-噻二唑基、1，2,3-三唑基、1,2,4-三哇基、四唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡。秦基、三嗪基等。该芳族环基团优选苯基或p塞唑基。0040上述式(n)中Ar!可以具有的取代基的实例包括卤素原子、羟基基团、碳原子数1至6的烷基基团、碳原子数1至6的卣代烷基基团、碳原子数2至7的酰基基团和任选具有碳原子数1至6的烷基基团或碳原子数1至6的卣代烷基基团的苯基基团。优选的取代基为氯原子、羟基基团、曱基基团、乙酰基基团、4-三氟曱基苯基基团和3-氟-4-曱基苯基基团。0041对于上述式(II)中R,或R2,"碳原子数1至6的烷基基团"的实例包括曱基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、l-曱基丁基、2-曱基丁基、1,2-二曱基丙基、己基、l-曱基戊基、2-曱基戊基、3-甲基戊基、4-曱基戊基、1,1-二曱基丁基、1，2-二曱基丁基、1,3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2,3-二曱基丁基、3，3-二曱基丁基、l-乙基丁基、2-乙基丁基、1-乙基-2-曱基丙基、1,1，2-三曱基丙基等。该碳原子数1至6的烷基基团优选曱基。10042对于上述式(II)中R3，"卣素原子"的实例包括氟原子、氯原子、溴原子等。该囟素原子优选为氯原子。0043对于上述式(II)中R3，"碳原子数1至6的烷基基团"的实例包括曱基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、l-甲基丁基、2-甲基丁基、1,2-二曱基丙基、己基、l-曱基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-曱基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二曱基丁基、1，3-二甲基丁基、2,2-二曱基丁基、2，3-二曱基丁基、3,3-二曱基丁基、l-乙基丁基、2-乙基丁基、l-乙基-2-曱基丙基、1,1,2-三甲基丙基等。该碳原子数l至6的烷基基团优选曱基。00441式(II)表示的化合物药理学上可接受的盐的实例包括无机酸、有机酸和酸性氨基酸等的酸加合盐，其中无机酸例如为盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等；有机酸例如为曱酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、马来酸、苹果酸、酒石酸、甲磺酸、乙磺酸等；酸性氨基酸例如为天冬氨酸、谷氨酸等。这些盐还包括其溶剂化物。式(II)表示的化合物可以具有不对称碳原子或双键，这种化合物可以含有光学异构体或几何异构体。这类异构体也包括在本发明的范围内，并可根据本身已知的方法分离和纯化。其任何混合物和分离形式都可用在本发明中。0045本发明中，式(II)表示的化合物中，优选的PPARa激动剂包括4-(3-(2-丙基-3-羟基-4-乙酰基)苯氧基)丙基氧基苯氧基乙酸(L-16S(Ml;CAS登记号79558-09-1)、(2-甲基-4-(((4-曱基-2-(4-(三氟曱基)苯基)曙5-噻唑基)曱基)硫基)苯氧基)乙酸(GW-501516;CAS登记号317318-70-0)、(4-(((2-(3-氟-4-(三氟曱基)苯基)-4-曱基-5-噻唑基)曱基)硫基)-2-曱基苯氧基)乙酸(GW-0742;CAS登记号317318-84-6)等。0046在本发明的促进剂中，PPARa或S激动剂的含量通常为0.000001-1wt%，优选0.00001-1wt%,最优选0.0001-0.1wt%。0047除了上述活性成分，本发明的促进剂还可含有任何载体。载体的实例包括溶剂(例如水、醇等)、緩冲液(例如，磷酸盐緩冲液、醋酸盐緩沖液、硼酸盐緩沖液、碳酸盐緩冲液、柠檬酸盐緩沖液、Tris緩冲液、谷氨酸、s氨基己酸等)、防腐剂(例如，苯扎氯胺、苄索氯铵(benzethoniumchloride)、葡萄糖酸洗必泰、氯丁醇、苯曱醇、脱氢乙酸钠、对羟基苯曱酸盐、依地酸钠、硼酸等)、等渗剂(例如，氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇、山梨糖醇、硼酸、葡萄糖、丙二醇等)等。10048本发明的促进剂可在体外或体内用作药物或测试试剂。当本发明的促进剂被用作测试试剂时，其可在生理学和生物化学领域在多个方面用作测试试剂。10049当用作药物时，由于本发明的促进剂促进睑板腺上皮细胞的增殖，其可用做治疗与睑板腺上皮细胞的损伤或萎缩有关的疾病以及由于睑板腺上皮细胞功能恶化产生的疾病。这种疾病的实例包括睑板腺功能异常。此外，由于睑板腺上皮细胞在泪液中分泌脂质组分，并且这种脂质防止了泪液蒸发并稳定泪液层，所以本发明的治疗剂可用于伴有泪液中脂质异常(分泌量减少、组分变化)的疾病。这种疾病的实例包括蒸发过强型干眼。此外，本发明的促进剂还可用于治疗干眼、角膜溃疡、浅层点状角膜炎、角膜上皮糜烂等。00501此外，由于本发明的促进剂促进角膜上皮细胞的增殖，所以其可用作治疗与角膜上皮细胞损伤(即，创伤或缺陷)有关的疾病。本发明的促进剂可用作治疗角膜上皮病症的试剂，具体地，与内源疾病有关的角膜上皮病症如Sjogren综合征、Stevens-Johnsons综合征或干性角膜结膜炎(干眼)；手术后、药物使用、创伤或使用隐形眼镜情况下伴随外源疾病的角膜上皮病症；或伴随角膜溃疡或与角膜损害有关的眼变应性疾病的角膜上皮病症、春季结膜炎(springcatarrh)或特应性角膜结膜炎(atopickeratoconjunctivitis)。本发明的促进剂也可用于治疗浅层点状角膜炎(superficialpunctatekeratitis)和角膜上皮溃疡。此外，本发明的促进剂还可用作促进角膜伤口愈合的试剂。0051此外，由于本发明的促进剂具有角膜上皮细胞增殖促进活性和睑板腺上皮细胞增殖活性，所以其显示了直接作用于角膜组织的效果和通过作用于睑板腺细胞而改善泪液功能的效果。结果，该试剂尤其可用作蒸发过强型干眼的治疗剂。0052本发明的治疗剂中，PPARa或5激动剂的含量通常为0.000001至1%重量比，优选0.00001至1%重量比，最优选0.0001至0.1%重量比。0053以本发明的促进剂或治疗剂向其给药的个体的实例包括哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、绵羊、猴等)。0054本发明的治疗剂可以诸如滴眼剂、粘性皮肤贴剂、软膏、洗剂、乳膏、口服制剂等的剂型使用，并且除了上述活性成分外还可含有任意载体，例如药物上可接受的载体。0055在本发明的治疗剂中，其给药途径没有特别限制，只要发挥了上述治疗效果，但是该治疗剂优选局部给药至眼。用于眼局部给药的剂型的实例包括滴眼剂和眼软膏。例如，当本发明的治疗剂被用作滴眼剂或眼软膏时，稳定剂(例如，亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、依地酸钠、柠檬酸钠、抗坏血酸、二丁基羟基甲苯等)、增溶剂(例如，丙三醇、丙二醇、聚乙二醇(macrogol)、聚环氧乙烷硬化的蓖麻油等)、助悬剂(例如聚乙烯吡咯烷酮、羟基丙基曱基纤维素、羟曱基纤维素、羧甲基纤维素钠等)、乳化剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、聚环氧乙烷硬化的蓖麻油、聚山梨醇酯80等)、緩冲液(例如，磷酸盐緩冲液、醋酸盐緩沖液、硼酸盐緩沖液、碳酸盐緩冲液、柠檬酸盐緩冲液、Tris緩冲液、谷氨酸、s-氨基己酸等)、增稠剂(例如，水溶性纤维素衍生物如曱基纤维素、羟乙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素或羧曱基纤维素，硫酸软骨素钠，透明质酸钠，羧基乙烯聚合物，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇等)、防腐剂(例如，苯扎氯胺、苄索氯铵、葡萄糖酸洗必泰、氯丁醇、苯甲醇、脱氢乙酸钠、对羟基苯曱酸酯、依地酸钠、硼酸等)、等渗剂(例如，氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇、山梨糖醇、硼酸、葡萄糖、丙二醇等)、pH调节剂(例如，盐酸、氢氧化钠、磷酸、乙酸等)、清新剂(例如l-薄荷醇、d-樟脑、d-龙脑、薄荷油等)、软膏基质(白凡士林、纯化的羊毛脂、液体石蜡、植物油(橄榄油、山茶油、花生油等)等)可作为添加剂被加入。尽管这些添加剂的量随所添加的添加剂的种类、用途等而变化，但是添加剂可以以足以实现其目的的浓度加入。当本发明的治疗剂被配制为滴眼剂或眼软膏时，它们可以根据药学领域常用的方法产生，并且例如可基于JapanesePharmacopoeia14thedition,GeneralRulesforPreparation,itemofeyedropsanditemofocularointments(日本药典第14版，一般配制规则，滴眼剂项和眼软膏项)生产。0056本发明提供了促进睑板腺上皮细胞增殖的方法，包括向需要促进睑板腺上皮细胞增殖的个体给予有效量的PPARa或S激动剂。进行该方法来治疗睑板腺功能异常是所期望的。0057本发明还提供了促进角膜上皮细胞增殖的方法，包括向需要促进角膜上皮细胞增殖的个体给予有效量的PPARa或S激动剂。进行该方法来治疗角膜上皮病症是所期望的。0058本发明还提供了治疗蒸发过强型干眼的方法，包括向患有蒸发过强型干眼的患者给予有效量的PPARa或5激动剂。0059PPARa或5激动剂的有效量不能无条件地定义，其随化合物的种类，给药个体的年龄、体重和状况，治疗目的等而变化。当本发明的促进剂或治疗剂向人给药时，例如含有通常0.000001至1%重量比、优选0.00001至1%重量比、最优选0.0001至0.1%重量比浓度的PPARa或S激动剂的溶液每次给药向每只眼给药1或2滴，即每次给药约50至200|LiL，每天1至8次。具有以上范围内浓度和体积的溶液中含有的PPARa或S激动剂的量可作为有效量的实例被给出。实施例0060下文中，参照以下测试实施例描述本发明，但是本发明绝不一皮它们所限制。0061(测试实施例1)PPAR激动剂对细胞数量增加的作用，采用角膜上皮细胞1.使用的动物使用雄性兔(日本白兔，KITAYAMALABESCo.，Ltd.)。根据InternationalGuidingPrinciplesforBiomedicalResearchInvolvingAnimals(关于使用动物进行生物医学研究的国际指导准则)使用实验动物。2.制备角膜上皮细胞从兔眼球制备角膜上皮细胞。从分离的眼球切下角膜，保存在Dulbecco磷酸盐緩冲盐水(D-PBS;Invitrogen)中，并将其转移至超净工作台。以下的细胞制备操作都是无菌进行的。将分离的角膜片段用向其中加入了1%青霉素-链霉素(Invitrogen)的D-PBS洗涤三次，并将其转移至最低基础培养基(MEM;Invitrogen)。用眼手术刀(Alcon)将浸泡在MEM中的角膜片段的角膜内皮细胞和Descemet膜剥离，并将剥离后的角膜片段(角膜基质和角膜上皮)转移至加有2.4U/mL分散酶II(RocheDiagnostics)的MEM中。将其在37。C孵育1小时，之后，将该分散酶II处理的角膜片段转移至MEM。采用眼手术刀将浸泡在MEM中的角膜片段的角膜上皮分离，并从MEM中去除角膜片段残余(角膜基质)。将剥离的角膜上皮细胞和含有它们的MEM收集在50mL离心管中，在室温下以1，500rpm离心5分钟。弃去上清以得到角膜上皮细胞层。向该角膜上皮细胞层加入1mL胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen),充分混合后，让细胞在37。C下孵育5分钟以解开细胞间的粘合。向其中加入含有100/()胎牛血清(FBS;Invitrogen)的9mLMEM以终止酶反应，再次在室温下以1,500rpm离心5分钟以获得角膜上皮细胞层。向得到的角膜上皮细胞层加入1mM的无血清液体培养基，用于正常兔角膜上皮细胞的增殖(RCGM^KuraboIndustriesLTD.)以悬浮细胞，将其接种到直径10cm的培养皿(IWAKI)以培养细胞，该培养皿中已加有9mL的RCGM2。接种的细胞培养在设置为37°C、5%C02、95%空气、和100。/。湿度的培养箱(SANYO)中。培养基每48小时用新鲜培养基替换，直至测试曰。00623.测试物和制备方法以下的化合物一皮用作测试物。PPARa激动剂WY-14643(Calbiochem)和非诺贝特(fenofibrate)(Sigma画Aldrich)PPAR5激动剂L-165041(Sigma國Aldrich)将每种测试物溶解在乙醇(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)中，浓度为培养基中终浓度的200倍，并保存在-80。C，直至使用前不久。为了研究每种测试物促进细胞增殖的作用，将从RCGM2中除去了附加至RCGM2的小鼠衍生表皮生长因子(mEGF)的培养基用作基础培养基，而作为证实促进细胞增殖作用的阳性对照，根据RCGM2制备方案的指导使用向其中添加了mEGF的培养基(基础培养基+10ng/mLmEGF)。00634.测:汰方法1)培养皿的胶原处理作为测试促进细胞增殖的培养亚，使用了96孔组织培养培养皿(Corning)。测试前一天，向培养皿的每孔加入50|iL的0.01%I型胶原(NittaGelatinInc.),在4。C进行包一皮直至测试前不久。在测试当天，在除去I型胶原溶液后，用D-PBS洗涤培养亚的底部3次，将此作为月交原处理的培养皿用在测试中。2)细胞培养和添加测试物测试中，使用在直径10cm的培养亚中已经培养至亚汇合(subconfluent)的兔角膜上皮细胞。在除去培养基后，采用D-PBS将培养皿底部洗涤两次，向其中加入1mL的胰蛋白酶-EDTA,并在37。C下孵育5分钟，由此让细胞从培养皿底部剥离。孵育后，将含有10%FBS的9mLMEM添加至培养皿以终止酶反应，并将其在室温下以1，500rpm离心5分钟，以获得角膜上皮细胞层。向得到的细胞加入适量的RCGM2,达到2xio5细胞/mL的细胞浓度以悬浮细胞。向每孔加入64faL的这种细胞悬浮液，使经胶原处理的用于组织培养的96孔培养皿单位底面积(0.32cm"的细胞数量为4x104细胞/112。结束细胞接种后，将培养皿转移至设定为37。C、5%C02、95%空气、和100%湿度的培养箱中，培养24小时。细胞接种24小时后，弃去培养基，向培养皿的每孔新加入100fiL的以下培养基。[l]仅基础培养基(无添加物组)[2]基础培养基+mEGF(终浓度10ng/mL;阳性对照组)[3]基础培养基+WY-14643(终浓度0.1pM和1pM)[4]基础培养基+非诺贝特(终浓度l!iM和10iLiM)[5]基础培养基+L-165041(终浓度0.1pM和1pM)为了让所有培养基中的乙醇浓度都等于0.5%,分别向培养基[l]和[2]加入5|uL/lmL的乙醇。3)细胞数量的测量从培养基替换起48小时后，除去每孔的培养上清，接着向每孔加入100加有10%细胞计数试剂盒-8(DOJINDO)的基础培养基。加入后，将培养皿转移至设定37。C、5%C02、95%空气、和100%湿度的培养箱中，孵育2小时。孵育2小时后，采用微孔板阅读仪(Daini卯onPharmaceuticalCo.,Ltd.)测量450nm处的吸收值，并将此用作细胞数量增加的指标。00645.统计分析假定无添加物组的吸收值均值为100%，计算无添加物组、每种测试物添加组和阳性对照组每组的值，并采用Dunnett多重比较检验法(双尾)比较无添加物组与每种测试物添加组和阳性对照组。作为测试结果，小于5%的显著性水平被确定为显著的。00656.测试结果增加每组的细胞数量的作用显示在表1中。-假定无添加物组的细胞增殖为100%,所有测试物添加组中的细胞增殖和阳性对照组中的细胞增殖显著高于无添加物组(p<0.01),并且其显示细胞增殖被增强。从该测试结果显然可知，PPARa激动剂和PPARS激动剂增加了角膜上皮细胞的数量。0066[表1]<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>0067PPARa激动剂或PPAR5激动剂或mEGF(阳性对照)被添加到培养的兔角膜上皮细胞中时的细胞数量变化被显示为无添加物组均值为100%时的值(均值±标准偏差，N=5)。表中的**表示与无添加物组比较有显著差异(p〈0.01)。0068(测试实施例2)PPARS激动剂对细胞数量增加的作用，采用角膜上皮细胞1.使用的动物使用雄性兔(日本白，重量约1.5kg,KITAYAMALABESCo.,Ltd.)。才艮才居InternationalGuidingPrinciplesforBiomedicalResearchInvolvingAnimals使用实验动物。2.制备角膜上皮细胞采用与(测试实施例1)中相同的方法制备兔角膜上皮细胞。00693.测试物和制备方法以下的化合物^皮用作测试化合物。PPAR5激动剂L-165041(Sigma-Aldrich)和GW-501516(Alexis)将每种测试物溶解在乙醇(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)中，浓度达到培养基中终浓度的200倍，将它们保存在-80。C,直至使用前不久。为了研究每种测试物促进细胞增殖的作用，将从RCGM2中除去了附加至RCGM2的小鼠衍生表皮生长因子(mEGF)的培养基用作基础培养基，而作为证实促进细胞增殖作用的阳性对照，根据RCGM2制备方案的指导使用向其中添加了mEGF的培养基(基础培养基+10ng/mLmEGF)。00704.测-试方法1)培养皿的胶原处理采用与(测试实施例1)中相同的方法进行培养皿的胶原处理。2)细力包培养和测试物的添加测试中，使用在直径10cm的培养皿中已经培养至亚汇合的兔角膜上皮细胞。在除去培养基后，采用D-PBS将培养皿底部洗涤两次，向其中加入lmL的胰蛋白酶-EDTA,并在37°C下孵育5分钟，由此让细胞从培养皿底部剥离。孵育后，将含有10%FBS的9mLMEM添加至培养皿以终止酶反应，并将其在室温下以1，500rpm离心5分钟，以获得角膜上皮细胞层。向得到的细胞加入适量的RCGM2，达到1x105细胞/mL的细胞浓度以悬浮细胞。向每孔加入64pL的这种细胞悬浮液，使经胶原处理的用于组织培养的96孔培养皿单位底面积(0.32cn^)的细胞数量为2x10S田胞/cm2。结束细胞接种后，将培养皿转移至设定为37。C、5%C02、95%空气、和100%湿度的培养箱中，培养24小时。细胞接种24小时后，弃去培养基，向培养皿的每孔新加入100|LiL的以下培养基。[1]仅基础培养基(无添加物组)[2]基础培养基+mEGF(终浓度10ng/mL;阳性对照组)[3]基础培养基+L-165041(终浓度0.1和1pM)[4]基础培养基+GW-501516(终浓度0.01|aM和0.1pM)为了让所有培养基中的乙醇浓度都等于0.5%，分别向培养基[l]和[2]加入5|aL/lmL的乙醇。3)细胞数量的测量从替换含有测试物的培养基起，每48小时除去每孔的培养上清，并且向每孔加入100pL新配制的培养基。从最初替换为含有测试物的培养基起120小时后，除去每孔的培养上清，接着向每孔加入IOO加有10%细胞计数试剂盒-8(DOJINDO)的基础培养基。加入后，将培养皿转移至设定37。C、5%C02、95%空气、和100%湿度的培养箱中，孵育2小时。孵育2小时后，采用微孔板阅读仪(DainipponPharmaceuticalCo.,Ltd.)测量450nm处的吸收值，并将此用作纟田月包凄史量增加的指标。00715.统计分析假定无添加物组的吸收值均值为100%，计算无添加物组、每种测试物添加组和阳性对照组每组的值，并采用Dunnett多重比较检验法(双尾)比较无添加物组与每种测试物添加组和阳性对照组。作为测试结果，小于5%的显著性水平被确定为显著的。00726.测试结果每组细胞数量增加的影响显示在表2中。假定无添加物组的细胞增殖为100%，所有测试物添加组中和阳性对照组中的细胞增殖显著高于无添加物组(p<0.01),并且其显示细胞增殖被增强。从该测试结果显然可知，具有PPAR5激动剂活性的化合物增加了角膜上皮细胞的数量。0073[表2]<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>0074PPAR5激动剂或mEGF(阳性对照)^皮添加到培养的兔角膜上皮细胞中时的细胞数量变化纟皮显示为相对于无添加物组均值为100%时的值(均值±标准偏差，N=5)。表中的**表示与无添加物组比较有显著差异(p〈0.01)。0075(测试实施例3)PPAR激动剂对增加细胞数量的作用，采用睑板腺上皮细胞1.使用的动物使用雄性食蟹猴(cynomolgusmonkey)(EnvironmentalBiologicalLifeScienceResearchCenter)。才艮据InternationalGuidingPrinciplesforBiomedicalResearchInvolvingAnimals使用实验动物。2.制备睑板腺上皮细胞从猴眼睑制备睑板腺上皮细胞。分离眼睑，并保存在Dulbecco磷酸盐緩冲盐水(D-PBS;Invitrogen)中，将其转移至超净工作台。以下的细胞制备操作都无菌进行。在分离的眼睑被浸泡在80%乙醇中30秒后，将该眼睑用向其中加有P/。青霉素-链霉素(Invitrogen)的D-PBS洗涤三次，并将其转移至最^f氐基石出培养基(minimumessentialmedium)(MEM;Invitrogen)。在立体显微镜下除去围绕睑板腺组织的脂肪组织和肌肉组织，并将其转移至含有0.475U/mL胶原酶A(RocheDiagnostics)和2.4U/mL分散酶II(RocheDiagnostics)的MEM中，在37°C孵育过夜。孵育结束后，将经酶处理的组织再次置于立体显^f鼓镜下，除去睫毛和眼睑结締组织，并分离出睑板腺组织。向分离的腺体组织加入1mL胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)，在37。C下孵育5分钟。孵育后，添加9mL含有10%FBS的MEM以终止酶反应，接着采用10mL移液管重复抽排五次，并进一步采用配备有21G注射针头的注射器抽排五次，以分散构成组织的细胞。将细胞分散体经100|^im、然后40jim尼龙滤器(CellStrainer;Falcon),以除去包含在分散体中的未经酶处理的细胞团。在50mL离心管中回收已滤过滤器的细胞分散体，并在室温下以1,500rpm离心5分钟。向含有通过离心获得的目的细胞的细胞层添加80fiL含有0.5%牛血清白蛋白(BSA;Sigma-Aldrich)的D-PBS，以充分悬浮细胞，向其中添加20的抗成纤维细胞微珠(MilitenyiBiotec),让其在室温下静置30分钟。完成与抗体的反应后，向其中加入2mL含有0.5%BSA的D-PBS,并再次在室温下以1，500rpm离心5分钟。向含有通过离心获得的目的细胞的细胞层添加1mL含有0.5%BSA的D-PBS以充分悬浮细胞，将其滴加至预先采用柱洗液(含有2mMEDTA(DojindoLaboratories)和0.5%BSA的D-PBS)平tf的LD牙主(MilitenyiBiotec)。然后，向LD柱滴加2mL的柱洗液。从滴加细胞悬液后开始到完成滴加柱洗液，在50mL离心管中回收未被吸附至柱上的未被抗体标记的目的细胞(非成纤维细胞)。使回收在离心管中的细胞再次在室温下以1,500rpm离心5分钟，以除去上清液。向沉淀加入1mL的成分明确的角质细胞无血清培养基(DK-SFM;Invitrogen)以悬浮细胞，由此制备了睑板腺上皮细胞悬液。将制备的细胞接种在直径3.5cm的用于细胞培养的培养皿(IWAKI)中，该培养i预先经I型胶原溶液(NittaGelatinInc.)包被，并加入了3mL的DK-SFM。接种的细胞在设定37。C、5%C02、95%空气、和100。/。湿度的培养箱(SANYO)中培养，培养基每48小时以新鲜培养基替换，直至测试日。00763.测试物和制备方法以下化合物用作测试物PPARa激动剂非诺贝特(Sigma-Aldrich)PPAR5激动剂L-165041(Sigma-Aldrich)PPARy激动剂曲格列酮(Calbiochem)将每种测试物溶解在乙醇(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)中，浓度达到培养基中终浓度的200倍，将它们保存在-80。C,直至使用前不久。为了研究每种测试物的促进细胞增殖效果，根据DK-SFM制备方案的说明，将从DK-SFM去除附加至DK-SFM的补充物而得到的培养基用作基础培养基，而作为用于证实促进细胞增殖效果的阳性对照，使用向其中加入了补充物的培养基(基础培养基+补充物)。00774.测试方法1)培养皿的胶原处理将用于组织培养的96孔培养皿(Corning)用作细胞增殖促进测试的培养皿。在测试前一天，向培养皿的每孔加入50IliL的0.01%I型胶原(NittaGelatinInc.),在4°C进行包被直至测试前。在测试当天，在除去I型胶原溶液后，用D-PBS洗涤培养皿的底部3次，将此作为胶原处理的培养皿用在测试中。2)细力包培养和加入测试物在测试中，使用猴睑板腺上皮细胞，其已经在培养皿中培养至亚汇合，直径3.5cm,并且在液氮中冷藏保存。将已悬浮在细胞banker(NipponZenyakuKogyoCo.,Ltd.)并已;令藏寸呆存的纟田月包融解，專争移至50mL离心管，加入10-倍量的DK-SFM。此后在室温下以1,500rpm离心5分钟以回收细l包层，加入合适量的DK-SFM以悬浮细胞，使得到的细胞浓度为3x106细胞/mL。向每孔加入64的这种细胞悬浮液，使得用于组织培养的经胶原处理的96-孔培养皿单位底部面积(0.32cm,的细胞数量为6x10S田胞/cm2。细胞接种结束后，将培养皿转移至设定了37。C、5%C02、95%空气和100%湿度的培养箱，培养24小时。自细胞接种起24小时后，弃去培养基，向培养皿的每孔新加入100pL的以下培养基。[1]仅基础培养基(无添加物组)[2]基础培养基+补加物(阳性对照组)[3]基础培养基+非诺贝特(终浓度1iaM和10|uM)[4]基础培养基+L-165041(终浓度0.1(aM和1pM)[5]基础培养基+曲格列酮(终浓度0.1fiM和1|iM)为了使所有培养基中的乙醇浓度都等于0.5%,向培养基[1]和[2]力口入5|uL/lmL的乙醇。3)细胞数的测量从开始培养基转换起48小时后，用上述[1]至[4]的每种新制备的培养基替换培养基。此外，自此48小时后，除去每孔的培养上清，接着向每孔加入100pL含有10%细胞计数试剂盒-8(DOJINDO)的DK-SFM。加入后，将培养皿转移至设定37。C、5%C02、95%空气、和100%湿度的培养箱中，孵育两小时。孵育两小时后，采用微量板阅读4义(DainipponPharmaceuticalCo.,Ltd.)测量450nm处的吸收，将此用作细胞数量增加的指标。00785.统计分析，支定无添加物组的吸收值均值为100%,计算无添加物组、每种测试物添加组和阳性对照组每组的值，并采用Dunnett多重比较检验法(双尾)比4交无添加物组与每种测试物添加组和阳性对照组。作为测试结果，小于5%的显著性水平被确定为显著的。00796.测试结果每组细胞数量增加的影响显示在表3中。假定无添加物组的细胞增殖为100。/。，PPARot激动剂非诺贝特添加组和PPAR5激动剂L-165041添加组，以及阳性对照组中的细胞增殖显著高于无添加物组(p〈0.01),并且其显示细胞增殖被增强。另一方面，PPARY激动剂曲格列酮未显示出细胞增殖促进活性。乂人该测试结果显然可知，PPARot激动剂和PPAR5激动剂增加了睑板腺上皮细胞的数量。0080[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>0081PPARot激动剂、PPAR5激动剂或PPARy激动剂或补加物(阳性对照)被添加到培养的猴睑板腺上皮细胞中时的细胞数量变化被显示为当无添加物组均值为100%时的值(均值±标准偏差，N=5)。表中的**表示与无添加物组比较有显著差异(p<0.01)。0082(测试实施例4)PPAR在角膜上皮细胞和睑板腺上皮细胞中的表达1.-使用的细胞将通过与(测试实施例l)相同方法制备并培养的细胞用作兔角膜上皮细胞。将通过与(测试实施例3)相同方法制备并培养的细胞用作猴睑板腺上皮细胞。将在设定37°C、5%C02、95%空气、和100%湿度的培养箱中采用用于正常人角膜上皮细胞增殖的无血清基础培养基(EpiLife;KuraboIndustriesLTD.)培养的细胞用作人角膜上皮细胞(humancornealepithelialcell)。00832.测-汰方法1)A人细胞纟是取总RNA根据TRizol试剂(Invitrogen)常规方法从每种细胞提取总RNA2)从提取的RNA制备cDNA根据DNA-free(Ambion)常规方法在37°C进行总提取RNA的DNA酶处理30分钟，以除去基因组DNA。根据SuperscriptII逆转录酶(Invitrogen)常规方法从提取的RNA制备cDNA。即，釆用随机引物(Invitrogen)从1jag的经DNA酶处理的总RNA制备与其互补的cDNA。3)扩增PPAR基因(聚合酶链式反应；PCR)根据PlatinumPCRSuperMix(Invitrogen)常规方法进行PPAR基因的PCR。参考人、猩猩、食蟹猴、牛和小鼠的已知序列，PPAR引物被设计为使得PCR产物为约200bps。PPARoc:GTAGAATCTGCGGGGACAAG(有义)(SEQIDNo.:1):GTTGTGTGACATCCCGACAG(反义)(SEQIDNo.:2)PPARS:TTCCTTCCAGCAGCTACACA(有义)(SEQIDNo.:3):GATCGTACGACGGAAGAAGC(反义)(SEQIDNo.:4)PPARy:CTCCGTGGATCTCTCCGTAA(有义)(SEQIDNo.:5):GATGCAGGCTCCACTTTGAT(反义)(SEQIDNo.:6)通过在94°C反应2分15秒后，重复94°C30秒、55°C30秒和72°C30分钟的三阶段反应35次，完成该PCR反应。使PCR反应后的样品经采用2%琼脂糖的电泳，然后采用SYBRGold(MolecularProbes)对在胶中分离的DNA染色。让染色的DNA在UV透射仪上发光，图像被存储为数字数据。00843.测试结果电泳后染色的DNA带显示在图1中。作为该测试的结果，其证实所有PPARa、PPAR5和PPARy都在人角膜上皮细胞和猴睑板腺上皮细胞中表达。此外，在兔角膜上皮细胞中，仅证实有PPARS的表达。Bonazzi等人报道，PPAR中PPARa和PPARP(=S)在兔角膜上皮细胞中表达(BonazziA.etal.，J.Biol.Chem.(2000);275(4):2837-2844)，在他们的报告中，他们使用了检测PPARoc的特殊方法。如测试实施例1中所显示的，显然PPARa激动剂促进了兔角膜上皮细胞的增殖，既然Bonazzi等人的报告中采用特殊的检测方法检测到了PPARot，就提示PPARa在兔角膜上皮细胞中的表达量很小。0085(测试实施例5)PPAR5激动剂对细胞数量增加的作用，采用人角膜上皮细胞1.-使用的细月包使用了正常人角膜上皮细胞(KURABO)。2.测试物和制备方法将以下的化合物用作测试物。PPAR5激动剂L-165041(Sigma画Aldrich),GW-501516(Alexis)将每种测试物溶解在乙醇(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)中，终浓度为培养基中终浓度的200倍，保存在-80。C,直至使用前不久。为了研究每种测试物促进细胞增殖的作用，将这样的培养基(基础培养基)用作细胞培养基向EpiLife(KURABO)中添加了包含在HCGS增殖添加剂组合(KURABO)中的胰岛素、氢化可的松、和转铁蛋白。此外，作为证实细胞增殖促进作用的阳性对照，使用了向基础培养基中添加了包含在HCGS增殖添加剂组合(KURABO)中的小鼠衍生上皮生长因子(mEGF)的培养基(基础培养基+lng/mLmEGF)。00863.测:汰方法1)细力包i告养和测试物的添加融解在液氮中冷藏保存的正常人角膜上皮细胞、对细胞计数，并且将其总量转移至向其中添加了所有HCGS增殖添加剂组合(胰岛素、小鼠衍生上皮生长因子、氢化可的松、转铁蛋白、牛垂体腺提取物)的4mLEpiLife(完全培养基)中，以将它们充分悬浮。将该细胞悬浮液接种在纤维蛋白包被的多孔板(24孑L,BECTONDICKINSON)上，使得细胞数为2x].O4细胞/500^L/孔(由于底面积为2cm2,数量为1x104细胞/cm2)。在完成细胞接种后，在设定37°C、5%C02、95%空气、和100%湿度的培养箱中培养24小时，接着培养基每个以400nL的基础培养基替换。另外，此后24小时，培养基被各400nL的以下培养基替换。[1]仅基础培养基(无添加物组)[2]基础培养基+mEGF(终浓度1ng/mL;阳性对照组)[3]基础培养基+L-165041(终浓度0.01|aM和0.1,[4]基础培养基+GW-501516(终浓度0.001|uM和0.01pM)为了使所有培养基中的乙醇浓度都等于0.5%,向培养基[1]和[2]分别加入5jaL/1mL的乙醇。2)细胞数量的测量在开始用测试物刺激起24小时后，除去每孔的培养上清，将其中加有10。/。细胞计数试剂盒-8(a10%CellCountingKit-8)(DOJINDO)的200iaL基础培养基加入至每孔。加入后，将培养皿转移至设定37。C、5%C02、95%空气、和100%湿度的培养箱中，孵育2小时，在完成该反应后，从上清液各取出100|iL至用于组织培养的培养皿(Corning)。已转移至96孔培养皿的反应溶液在450nm处的吸收值通过微量板阅读4义(DainipponSumitomoPharmaceuticalCo.,Ltd.)观'J量,并将此用作细胞数量增加的指标。00874.统计分析假定无添加物组的吸收值的均值为100%,计算无添加物组、每种测试物添加组和阳性对照组每组的值，并采用Dunnett多重比较检验法(单尾)比4交无添加物组与每种测试物添加组和阳性对照组。作为测试结果，小于5%的显著性水平被确定为显著的。5.测试结果每组细胞数量增加的影响显示在表4中。假定无添加物组的细月包增殖为100%,测试物添加组(<0.01)，以及阳性对照组(p〈0.05)中的细胞增殖显著高于无添加物组，并且其显示细胞增殖被增强。从该测试结果显然可知，PPARS激动剂增加了正常人角膜上皮细胞的数量。00891[<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>PPARS激动剂或mEGF(阳性对照)被添加到培养的正常人角膜上皮细胞中时的细胞数量变化被显示为相对于无添加物组均值为100%时的值(均值±标准偏差，N二3至4)。表中的*表示与无添加物组比4交有显著差异(p<0.05)，表中的"表示与无添加物组比较有显著差异(p<0.01)。0091(测试实施例6)PPARS激动剂对细胞数量增加的作用，采用正常人角膜上皮细胞1.4吏用的细月包使用正常人角膜上皮细胞(KURABO)。2.测试物和制备方法将以下化合物用作测试物。PPAR5激动剂GW-501516(Alexis),GW-0742(Sigma画Aldrich)将每种测试物溶解在乙醇(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)中，终浓度为培养基中终浓度的200倍，保存在-80。C,直至使用前不久。为了研究每种测试物对促进细胞增殖的影响，将这样的培养基(基础培养基)用作细胞培养基向EpiLife(KURABO)中添加了包含在HCGS增殖添加剂组合(KURABO)中的胰岛素、氢化可的松、和转铁蛋白。00923.测i式方法1)纟田胞培养和测试物的添力口融解在液氮中冷藏保存的正常人角膜上皮细胞，对细胞计数，并且将其总量转移至向其中添加了所有HCGS增殖添加剂组合(胰岛素、小鼠衍生上皮生长因子、氢化可的松、转铁蛋白、牛垂体腺提取物)的4mLEpiLife(完全培养基)中，以将它们充分悬浮。将该细胞悬浮液接种在用于组织培养的96孔培养皿(Corning)上，使得细胞数为1.28x104细胞/100nL/孔(由于底面积为0.32cm2,数量为4x1()4细胞/cm2)。在完成细胞接种后，在设定37°C、5%C02、95%空气、和100%湿度的培养箱中培养24小时，接着培养基以100pL的基础培养基(EpiLife,向其中加入了HCGS增殖添加剂的胰岛素、氢化可的松和转铁蛋白)替换。另外，此后24小时，培养基被各100的以下培养基替换。[1]基础培养基(无添加物组)[2]基础培养基+GW-501516(终浓度0.01|iM)[3]基础培养基+GW-0742(终浓度0.01^M)为了使所有培养基中的乙醇浓度都等于0.5%，向培养基[l]加入5|iL/lmL的乙醇。2)细胞数量的测量在开始用测试物刺激起48小时后，除去每孔的培养上清，将其中加有10%细胞计数试剂盒-8(DOJINDO)的100[iL基础培养基加入至每孔。加入后，将培养皿转移至设定37。C、5%C02、95%空气、和100%湿度的培养箱中，孵育2小时。每孔在450nm处的吸收值通过微量板阅读4义(DainipponSumitomoPharmaceuticalCo.,Ltd.)测量，并^l夺jt匕用作细胞数量增加的指标。00934.统计分析假定无添加物组的吸收值的均值为100%,计算无添加物组和每种测试物添加组的值，并采用Dunnett多重比较检验法(单尾)比较无添加物组与每种测试物添加组和阳性对照组。作为测试结果，小于5%的显著性水平被确定为显著的。00945.测试结果每组细胞数量增加的影响显示在表5中。假定无添加物组的细胞增殖为100%，两测试物添加组中的细胞增殖显著高于无添加物组，并且其显示细;9包增殖^:增强(p<0.01)。^v该测试结果显然可知，PPARS激动剂增加了正常人角膜上皮细胞的数量。0095[表5]<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>0096PPARS激动剂被添加到培养的正常人角膜上皮细胞中时的细胞数量变化被显示为相对于无添加物组均值为100%时的值(均值±标准偏差，N=4至5)。表中的"表示与无添加物组比较有显著差异(p〈0.01)。0097(测试实施例7)PPARy激动剂对细胞数量增加的影响，采用正常人角膜上皮细胞1.使用的细胞使用正常人角膜上皮细胞(KURABO)。2.测试物和制备方法采用以下化合物作为测试化合物。PPARy激动剂曲格列酮(Calbiochem)将测试物溶解在乙醇(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)中，终浓度为培养基中终浓度的200倍，保存在-80。C,直至使用前不久。为了研究每种测试物对正常人角膜上皮细胞的影响，将这样的培养基(EpiLife基础培养基)用作细胞培养基向EpiLife(KURABO)中添加了包含在HCGS增殖添加剂组合(KURABO)的添加剂中的胰岛素、氬化可的松、和转铁蛋白，除了小鼠衍生上皮生长因子(mEGF)。00983.测i式方法1)细胞培养和添加测试物正常人角膜上皮细胞融解在液氮中冷藏保存的正常人角膜上皮细刀包，对细胞计数，并且将其总量转移至向其中添加了所有HCGS增殖添加剂组合(含有mEGF)的EpiLife(完全培养基)中，以将它们充分悬浮。将该细胞悬浮液接种在如测试实施例1中所述被胶原包被的多孔板(96孑L,Costar)中，使得细胞数为1.28x104细胞/64(aL/孔(由于底面积为0.32cm2,数量为4x1()4细胞/cm2)。在完成细胞接种后，在设定37°C、5%C02、95%空气、和100%湿度的培养箱中培养24小时，接着培养基以100(iL的含有以下测^式物的培养基替换，并继续培养。[1]仅EpiLife基础培养基(无添加物组)[2]EpiLife基础培养基+曲格列酮(终浓度0.1fiM)为了使所有培养基中的乙醇浓度都等于0.5%,向培养基[l]加入5pL/1mL的乙醇。在测试物添加起始日和细胞数量测量日之间，每两天将培养基以含有前述测试物的培养基替换。2)细胞数量的测量在开始用测试物刺激起6天后，除去每孔的培养上清，将其中加有10%细胞计数试剂盒-8(DOJINDO)的100pLEpiLife基础培养基加入至每孔。加入后，将培养皿转移至设定37。C、5%C02、95%空气、和100%湿度的培养箱中，孵育2小时，完成反应后该培养i每孔在450nm处的吸^lj直通过樣i:量氺反阅"i卖^义(DainipponSumitomoPharmaceuticalCo.,Ltd.)测量，并将此用作细胞数量增加的指标。00994.统计分析假定无添加物组的吸收值的均值为100%,计算无添加物组和每种测试物添加组的值，并采用Dunnett多重比较检验法(单尾)比较无添加物组与每种测试物添加组。作为测试结果，小于5%的显著性水平纟皮确定为显著的。01005.测试结果PPARy激动剂对正常人角膜上皮细胞的影响显示在表6中。从该测试结果可知，没有看出PPARy激动剂增加角膜上皮细胞数量的作用。0101[表6]<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>0102PPARr激动剂被添加到培养的正常人角膜上皮细胞中时的细胞数量变化被显示为相对于无添加物组均值为100%时的^直(均值±标准偏>差，N=3或4)。表中的**表示与无添加物组比较有显著差异(p<0.01)。0103(测试实施例8)PPAR5激动剂对睑板腺上皮细胞数量增加的作用1.制备猴睑板腺上皮细胞从猴眼睑制备睑板腺上皮细胞按测试实施例3进行。采用成分明确的角质细胞无血清培养基(DK-SFM;Invitrogen,根据制备方案添加了附加的补加物)在设定37。C、5%C02、95%空气、和100%湿度的培养箱中培养细胞，并且培养基每48小时用新鲜培养基替换，直至达到亚汇合。01042.测试物和制备方法将以下化合物用作测试化合物。PPAR5激动剂L-165041(Sigma-Aldrich)和GW-501516(Alexis)将每种测试物溶解在乙醇(NacalaiTesque，Inc.)中，浓度达到培养基中终浓度的200倍，将它们保存在-80。C,直至使用前不久。为了研究每种测试物的促进细胞增殖效果，根据DK-SFM制备方案的说明，将从DK-SFM去除附加至DK-SFM的补充物而得到的培养基用作基础培养基，而作为用于证实促进细胞增殖效果的阳性对照，使用向其中加入了补充物的培养基(基础培养基+补充物)。01053.测试方法1)培养jm的胶原处理采用I型胶原(NittaGelatinInc.)包被用于细胞增殖促进测试的培养皿，如测试实施例3中所述。2)细胞培养和测试物的添加在测试中，使用猴睑板腺上皮细胞，其已经被培养至亚汇合，悬浮在细胞banker(NipponZenyakuKogyoCo.，Ltd.)中并冷藏保存在液氮中。将冷藏保存的细胞融解，转移至50mL离心管，并加入10-倍量的DK-SFM。此后在室温下以1,500rpm离心5分钟以回收细胞层，力口入合适量的DK-SFM以悬浮细胞，使得到的细胞浓度为2x106细胞/mL。向每孔加入64|aL的这种细胞悬浮液，使得用于组织培养的经月交原处理的96-孔培养皿单位底部面积(0.32cm"的细胞数量为4x104细胞/cm2。细胞接种结束后，将培养皿转移至设定37。C、5%C02、95%空气和100%湿度的培养箱，培养24小时。自细胞接种起24小时后，弃去培养基，向培养皿的每孔新加入100(iL的以下培养基。[1]仅基础培养基(无添加物组)[2]基础培养基+补加物(阳性对照组)[3]基础培养基+L-165041(终浓度0.1(iM和1pM)[4]基础培养基+GW-501516(终浓度0.01和0.1一)为了使所有培养基中的乙醇浓度都等于0.5%,分别向培养基[l]和2]加入5fiL/1mL的乙醇。3)细胞数量的测量从最初培养基替换起48小时后，培养基以新制备的培养基[1]至[4]之一替换。此外，自此48小时后，培养基再次用新制备的培养基[l〗至[4]之一替换。此外，自此48小时后，除去每孔的培养上清，接着向每孔加入100|aL加有10%细胞计数试剂盒-8(DOJINDO)的基础培养基。加入后，将培养皿转移至设定37。C、5%C02、95%空气、和100%湿度的培养箱中，并孵育2小时。孵育2小时后，采用微量板阅读仪(DainipponPharmaceuticalCo.,Ltd.)测量450nm处的吸收值，并3寻jt匕用作细胞数量增加的指标。4.统计分析假定无添加物组的吸收值的均值为100%，计算无添加物组、每种测试物添加组和阳性对照组的值，并采用Dunnett多重比较检验法(单尾)比较无添加物组与每种测试物添加组和阳性对照组。作为测试结果，小于5%的显著性水平被确定为显著的。01075.测试结果每组的促进细胞增殖作用显示在表7中。假定无添加物组的细月包增殖为100%,PPARS激动剂L-165041(l(T6M)添加组和PPAR5激动剂GW-501516(l(T7M)添加组，以及阳性对照组中的细胞增殖显著高于无添加物组，并且其显示细胞增殖被增强。从该测试结果显然可知，PPARS激动剂增加了睑板腺上皮细胞的数量。0108[表7]<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>0109PPAR5/p激动剂或补充物(supplement)!阳性对照.)被添加到培养的猴睑板腺上皮细胞中时的细胞数量变化被显示为相对于无添加物^L均值为100%时的值(均值±标准偏差，N=5)。表中的*表示与无添力口物组比较有显著差异(p<0.05),表中的**表示与无添加物组比较有显著差异(p〈0.01)。0110(测试实施例9)研究PPARS激动剂对角膜上皮损伤的愈合促进活性1.使用的动物使用雄性兔(日本白兔，KITAYAMALABESCo.,Ltd.)。根据InternationalGuidingPrinciplesforBiomedicalResearchInvolvingAnimals使用实验动物。2.测试物和制备滴眼剂溶液的方法将PPARS激动剂GW-501516(AlexisBiochemicals)用作测试物。其中GW-501516以0.05%悬浮在以下载体中的溶液3皮用作滴眼剂溶液。无水磷酸二氢钠0.05g氯化钠0.45g超纯水q.s.聚山梨醇酯80(Polysorbate80)0.05mLNaOH__总量50mL(pH7.0)作为测试物给药组的对照，设置了不含药物的上述载体给药组。01113.实,险方法1)角膜上皮细胞刮除在通过肌肉注射(0.9mL/kg)selactar(2%曱苯蓬口秦Bayer):ketalar(5%氯胺酮Sankyo)=0.5:1混合溶液使动物全身麻醉后，给予盐酸丁氧普鲁卡因滴眼剂溶液(Benoxil滴眼剂溶液0.4%;SantenPharmaceuticalCo.,Ltd.),^吏眼球暴露。采用直径6mm的环钻在角月莫中心部分的角膜上皮上钻出直径6mm的痕迹，并在立体显微镜下将钻出圆周内的整个角膜上皮层刮除。刮除后，采用生理盐水(OtsukaPharmaceuticalFactoryInc.)洗涤角膜表面，让眼球返回到眼眶以完成角膜上皮刮除处理。2)给药采用微量移液管向处理眼给予测试物滴眼剂溶液或滴眼剂溶液载体，每次50iuL,在角膜上皮刮除当天给药两次，第二天和之后，每天四次，直至完成测试。3)评估将完成所有个体双眼角膜上皮刮除的时间点定义为测试起始时间(0小时)，通过在其后24、38和48小时定量角膜上皮缺损面积，评估角膜上皮的恢复。即，在每个时间点，向经处理眼给予10fiL的0.1%焚光素钠(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)溶液，采用配备了钴滤光片的裂隙灯立即对动物眼前端照相，由此记录经染色的角膜上皮缺损面积。将显影的照片作为数字图像存储在计算机中，采用图像分析软件(Image-ProPlus)测量经染色的角膜上皮缺损部分的面积。01124.统计分析关于在每个时间点测量的角膜上皮缺损面积，计算每个个体的值，假定其起始值为100%,将此采纳为剩余角膜上皮缺损的比例。关于每个时间点剩余角膜上皮缺损的比例，通过t检验进行载体给药组和测试物给药组的比较，少于5%的显著性水平被确定为显著的。01135.测试结果载体给药组和0.05%GW-501516给药组在每个测量时间点时剩余角膜上皮缺损的比例显示在表8中。其显示0.05%GW-501516给药组在角膜上皮刮除后24小时和38小时时角膜上皮缺损比例显著降低。48小时后，所有个体中角膜上皮缺损消失。由此检验结果显然可知，通过向眼给予PPARS激动剂促进了缺损的角膜上皮的恢复。0114[表8]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>0115对于每个个体，假定起始值为100%,显示了通过计算在兔眼的角膜上皮刮除处理后剩余的角膜上皮缺损比例(％)而获得的值(均值±标准偏差，N二4)。表中的f表示与载体给药组相比有显著差异(p<0.05),**表示与载体给药组相比有显著差异(p<0.01)。工业实用性0116根据本发明，提供了促进睑板腺上皮细胞增殖的新试剂或促进角膜上皮细胞增殖的新试剂，该促进剂促进了睑板腺上皮细胞和角膜上皮细胞的增殖。此外，本发明的治疗剂可有效用于治疗/改善诸如睑板腺功能异常、角膜上皮病症或蒸发过强型干眼的疾病。0117本发明基于2005年11月28日提交的日本专利申请2005-342025，在此通过参考将其内容整体并入本文。权利要求1.一种促进睑板腺上皮细胞增殖的试剂，包括作为活性成分的PPARα或δ激动剂。2.—种促进角膜上皮细胞增殖的试剂，包括作为活性成分的PPARot或5激动剂。3.—种治疗睑板腺功能异常的试剂，包括作为活性成分的PPARoc或S激动剂。4.一种治疗角膜上皮病症的试剂，包括作为活性成分的PPARa或5激动剂。5.—种治疗蒸发过强型干眼的试剂，包括作为活性成分的PPARa或5激动剂。6.—种促进睑板腺上皮细胞增殖的试剂，包括作为活性成分的PPARS激动剂。7.—种促进角膜上皮细胞增殖的试剂，包括作为活性成分的PPA&S激动剂。8.—种治疗睑板腺功能异常的试剂，包括作为活性成分的PPARS激动剂。9.一种治疗角膜上皮病症的试剂，包括作为活性成分的PPAR5激动剂。10.—种治疗蒸发过强型干眼的试剂，包括作为活性成分的PPARS激动剂。11.如权利要求1至5中任一项所述的试剂，其中所述PPARot或5激动剂为式(I)表示的化合物或其药理学上可接受的盐其中A为氢原子或碳原子数1至6的烷基基团，B为选自-CO-、-NH-、-(CH2)n-S-、-(CH2)n-C-0-(CH2)i^接物，其中n为1至3的整数，X和Y相同或不同，各为碳原子或氮原子，Z为氧原子、硫原子或-CH2-,Ar,为5至6元芳环基团，任选地具有1至3个取代基，R,和R2相同或不同，各为氢原子或碳原子数1至6的烷基基团，以及R3为氢、卣素原子或碳原子数1至6的烷基基团。12.如权利要求6至10中任一项所述的试剂，其中所述PPARS激动剂为式(II)表示的化合物或其药理学上可接受的盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中A为氢原子或碳原子数l至6的烷基基团，B为选自-(CH2)n-S-和-0-(CH2)n-0-的连接物，其中n为1至3的整数，X和Y相同或不同，各为碳原子或氮原子，Z为氧原子、硫原子或-CH2-，Ar，为5至6元芳环基团，任选地具有1至3个取代基，R,和R2相同或不同，各为氢原子或碳原子数1至6的烷基基团，以及R3为氢、卣素原子或碳原子数1至6的烷基基团。13.如权利要求11或12所述的试剂，其中所述PPAR5激动剂为(4-(3-(4-乙酰基-3-羟基-2-丙基)苯氧基)丙氧基苯氧基)乙酸、(2-甲基一4-(((4-曱基-2-(4-(三氟曱基)苯基)-5-噻唑基)曱基)硫基)苯氧基)乙酸或(4-(((2-(3-氟-(4-(三氟曱基)苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)硫基)-2-曱基苯氧基)乙酸，或它们药理学上可接受的盐。14.如权利要求11所述的试剂，其中所述PPARoc激动剂为2-(4-(4-氯苯曱酰基)苯氧基)-2-曱基丙酸1-甲基乙酯或((4-氯-6-((2，3-二曱基苯基)氨基)-2-嘧啶基)硫基)乙酸，或它们药理学上可接受的盐。15.PPARoc或S激动剂在生产促进睑板腺上皮细胞增殖的试剂中的用途。16.PPARot或S激动剂在生产促进角膜上皮细胞增殖的试剂中的用途。17.PPARa或S激动剂在生产治疗睑板腺功能异常的试剂中的用途。18.PPARoc或5激动剂在生产治疗角膜上皮病症的试剂中的用途。19.PPARot或S激动剂在生产治疗蒸发过强型干眼的试剂中的用途。20.PPAR5激动剂在生产促进睑板腺上皮细胞增殖的试剂中的用途。21.PPARS激动剂在生产促进角膜上皮细胞增殖的试剂中的用途。22.PPARS激动剂在生产治疗睑板腺功能异常的试剂中的用途。23.PPARS激动剂在生产治疗角膜上皮病症的试剂中的用途。24.PPAR5激动剂在生产治疗蒸发过强型干眼的试剂中的用途。25.—种促进睑板腺上皮细胞增殖的方法，包括向需要促进睑板腺上皮细胞增殖的个体给予有效量的PPARot或5激动剂。26.—种促进角膜上皮细胞增殖的方法，包括向需要促进角膜上皮细胞增殖的个体给予有效量的PPARa或S激动剂。27.如权利要求25所述的方法，其被执行以治疗睑板腺功能异常。28.如权利要求26所述的方法，其被执行以治疗角膜上皮病症。29.—种治疗蒸发过强型干眼的方法，包括向患有蒸发过强型干眼的患者给予有效量的PPARa或5激动剂。30.—种促进睑板腺上皮细胞增殖的方法，包括向需要促进睑板腺上皮细胞增殖的个体给予有效量的PPARS激动剂。31.—种促进角膜上皮细胞增殖的方法，包括向需要促进角膜上皮细胞增殖的个体给予有效量的PPAR5激动剂。32.如权利要求30所述的方法，其被执行以治疗睑板腺功能异常。33.如权利要求31所述的方法，其被执行以治疗角膜上皮病症。34.—种治疗蒸发过强型干眼的方法，包括向患有蒸发过强型干眼的患者给予有效量的PPARS激动剂。全文摘要本发明的目的是提供促进睑板腺上皮细胞和角膜上皮细胞增殖的试剂，以及提供治疗诸如睑板腺功能异常或蒸发过强型干眼的眼病的治疗剂。本发明提供了促进睑板腺上皮细胞或角膜上皮细胞增殖的试剂，其含有PPARα或δ激动剂作为活性成分，以及用于治疗诸如睑板腺功能异常或蒸发过强型干眼的眼病的试剂，其含有PPARα或δ激动剂作为活性成分。文档编号A61K31/216GK101336113SQ200680051899公开日2008年12月31日申请日期2006年11月27日优先权日2005年11月28日发明者中村义邦,井上淳,花野郁子申请人:千寿制药株式会社