专利名称：甜菜碱在制备预防和治疗饮食性肥胖药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属中药技术领域，具体涉及甜菜碱的药物新用途，更具体地，本发明涉及 甜菜碱在预防和治疗饮食性肥胖中的应用。
技术背景甜菜碱是一种天然化合物，无毒、无害，且性质稳定，广泛分布于动植物中。60 年代，有研究发现甜菜碱对大鼠机体甲基代谢有显著的调控作用，于是将它作为甲基 供体治疗人先天性胱氨酸尿症的特定药物。近年来，随着对甜菜碱在动物营养上研究 的不断深入，证实了甜菜碱是动物机体内重要的甲基供体，参与氨基酸和脂肪代谢， 具有促进生长、改善胴体组成等功效。研究表明，甜菜碱的主要作用有1.抗脂肪肝大鼠长期口服，可升高血及肝 中的磷脂水平；可对抗四氯化碳引起的大鼠肝中磷脂、总胆固醇含量的减低，并有所提高；对BSP、 SGPT、碱性磷酸酯酶、胆碱酯酶等试验均有所改善作用。已知枸杞对脂质代谢或抗脂肪肝有作用，甜菜碱作为其中含有的成分之一，在体内起甲基供应体的作用；2.降压对麻醉动物有轻度降压作用，但对高血压无效；3.抗肿瘤与D-异抗坏血酸配伍用药，在体外能抑制肿瘤细胞的有丝分裂，作用较单独用药为强；4. 其它其氯化物铝盐有抗溃疡作用及治疗胃炎、促进伤口愈合。迄今，尚未见有关甜 菜碱预防和治疗饮食性肥胖的报道。
发明内容
本发明的目的是提供甜菜碱的新的药用用途。更具体地，提供甜菜碱在制备预防 和治疗饮食性肥胖药物中的应用。本发明所述的甜菜碱(Betaine)是地黄提取物中的组分之一，具有式A的结构， 与式B的左旋肉碱(^-carnitine)在结构上很相似，左旋肉碱比甜菜碱多一个次甲 基和一个羟基。3CH3 —N—CH2 —C一O本发明通过Atlantis HILIC Silica分析级色谱柱分析中药地黄各个组分，得 甜菜碱的化合物，进行了甜菜碱对脂肪细胞分化的影响以及甜菜碱对饮食性肥胖的作 用动物实验。实验结果显示，甜菜碱可以抑制脂肪细胞分化和脂肪细胞分化过程中关 键转录因子的表达。表明甜菜碱具有预防高脂饮食诱导大鼠肥胖的作用，其作用机制 包括①抑制脂肪细胞分化从而抑制脂肪组织的增生②促进7-carnitine的合成， 从而促进7-carnitine参与脂肪酸氧化。本发明所述的甜菜碱可以制备抑制脂肪细胞分化和预防饮食性肥胖的药物。本发明的技术方案通过下述方法和步骤实现1. 利用Atlantis HILIC Silica色谱柱(分析级)分析中药地黄提取物中的组 分Hx;2. 培养细胞3T3-LI前脂肪细胞，用含0.5raM甲基异丁基黄嘌吟(Mix)、 1 y M 地塞米松(Dex)和lug/ml胰岛素(Insulin)诱导分化为成熟的脂肪细胞。并用 Betaine处理细胞，Western Blotting检测C/EBPP、 C/EBPa和422/aP2的表达 水平；3. 利用脂肪细胞模型，实验研究甜菜碱抑制脂肪细胞分化；4. 甜菜碱对饮食性肥胖的作用，建立高脂饮食(HFD)大鼠模型，经Betaine和 ^ carnitine (左旋肉碱)处理，测定大鼠的体重，喂养15周后将大鼠处死，测量 脂肪组织的重量，分离血清，检测血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白和低密度 脂蛋白浓度。
图1是高效液相色谱分离图谱，其中，采用Waters Atlantis HILIC Silica色谱柱，对Hx进行分离后，共得 到六个组分。图2是质谱图谱(质量范围100-900),其中，保留时间为8.90min的组分，其质谱谱图与甜菜碱标准品的质谱图相同， 表明这个组分含有甜菜碱、甜菜碱类似物或由甜菜碱形成的盐类。 图3是前脂肪细胞培养，分化图，其中，对照组细胞正常分化，而加入75mmol/L的甜菜碱溶液的细胞分化则受到 了抑制，150mmol/L的甜菜碱溶液则几乎可以完全抑制3T3-L1前脂肪细胞分化为脂 肪细胞。图4是脂肪细胞特有基因表达产物鉴定(Western Blotting),其中，脂肪细胞分化早期的标志基因的C/EBPP两种异构体中，18kD的条带并没有因为药物的加入而产生变化，38kD的条带则随着加药量的增多而表达水平逐渐降低，150mmol/L的甜菜碱溶液几乎完全可以抑制C/EBPP 38kD蛋白质的表达水平； 脂肪细胞终末分化标志基因的C/EBPa两种异构体中，30kD和42kD的条带均随加药量的增多而表达水平逐渐降低，脂肪酸结合蛋白422/aP2的表达水平也随着加药量的增多而逐渐降低。
具体实施方式
通过下述实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。 实施例l:1.利用Atlantis HILIC Silica色谱柱(分析级)分析中药地黄提取物中的组 分Hx。Waters Alliance色谱系统包括2690分离单元，2487紫外检测器，Masslynx 4.0色谱管理系统，Waters ZQ 2000质谱仪;乙腈(Fisher)，超纯水(Millipore)， 甲酸(上海化学试剂厂)。分离组分Hx的色谱条件色谱柱Atlantis HILIC Silica Column (2.1 mm i. d. x 150 mm， 4um)，流动相A: 0.1%甲酸水溶液，流动相B: 0.1%甲酸乙腈溶液， 梯度程序在第0到第10分钟内，由30% A线性上升至到50% A，在第10到第 25分钟内，再回到30%A，流速为0.2 ml/min。样品室温度和柱温分别为10'C和 20'C。 2487紫外检测器波长设定为254nm和280簡。质谱条件ES+模式毛细管 电压为4.5kV，锥孔电压110V,离子源温度100°C，脱溶剂温度200°C，气体流速 250L/hr， MS质量范围100-900。2. Betaine和7-carnitine标准品购自Sigma公司，纯度99%。3. 细胞培养:3T3-L1前脂肪细胞用含有10%小牛血清的DMEM培养基传代和培 养，当细胞生长到接触抑制两天后(Day0)，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基诱 导分化，诱导液中含0.5mM甲基异丁基黄嘌吟(Mix)、 lnM地塞米松(Dex)和 lng/ml胰岛素(Insulin)， 48小时后，换为含1 u g/ml胰岛素10%胎牛血清的 DMEM培养基，以后每隔两天，换为含有10%胎牛血清的DMEM培养基，直到分化为 成熟的脂肪细胞。在诱导脂肪细胞分化的同时加入不同浓度的甜菜碱溶液作用48hr， 终浓度为75mmol/L和150mmol/L，此后每次更换细胞培养液过程中不加入甜菜碱溶 液，在分化后第六天通过油红染色观察细胞形态。4. 油红染色油红粉末(Sigma)以0. 5 g/100ml溶于异丙醇，再与水以3:2溶 解，用0.45Pm滤膜过滤两次得油红溶液。染色前先用冰浴的PBS洗细胞3次， 然后用3.7%的甲醛固定1小时，室温下用油红溶液孵育细胞15 min，用70%的 乙醇和水分别清洗细胞，用倒置显微镜观察并拍摄染色的细胞。5. Western Blotting: C/EBPe 、C/EBP a和422/&P2第一抗体购自美国Johns Hopkins University生化研究室，第二抗体购自Jackson Immun公司。组织蛋白抽提在分化后的第一天(Dayl)和第六天(Day6)分别抽提细胞总蛋 白用预冷的PBS (pH7.4)洗细胞3次，然后加入适量含有1%SDS、 60mMTris-HCI (pH6.8)的细胞裂解液裂解细胞，置于冰上30niin，刮下细胞，收集细胞裂解液， 将裂解产物在100°C水浴10min， 5000rpm离心10min，吸取上清备用，冻存于 -20°C;用BCA试剂盒作蛋白定量稀释标准蛋白(牛血清白蛋白，BSA)，使标准蛋白 浓度分别为2000 " g/ml ， 1000 u g/ml ， 500 u g/ml ， 250 y g/ml ， 125 ii g/ml, 50 u g/ml ， 25txg/ml;将BCA反应试剂A与试剂B按照50:1的比例混合，制成工作液；酶 标板中加入5"1标准蛋白或5ul样品，再加入100nl BCA工作液，震荡混匀， 37t:孵育30min，酶标仪读取570 吸光度值。以吸光度值为纵坐标，标准蛋白浓 度为横坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线，计算样品的浓度；SDS-PAGE:分离胶(12%)，将蛋白样品与加样缓冲液混匀，IO(TC水浴5min， 在冰上冷却。在每个泳道上样等质量蛋白样品进行电泳。分析细胞中C/EBe和 C/EBPa蛋白质表达，各需要细胞总蛋白20ug;分析细胞中422/aP2蛋白质表达，蛋白上样量为5li g;采用湿转法转膜PVDF膜预先用甲醇浸泡30min，再用转移缓冲液浸泡5min， 滤纸用转移缓冲液浸泡3min;采用恒压IOOV转膜2hr;封闭转膜结束后，将膜放在TTBS (0.05% Tween-20)中漂洗，用含有5%脱 脂奶粉的TTBS (0.05% Tween-20) 4°C封闭过夜；一抗杂交:将转移完成的PVDF膜分别浸于含有相应一抗的TTBS (0. 05% Tween-20) 溶液中，室温孵育2hr;洗膜将PVDF膜用TTBS (0.05% Tween-20)洗3次，每次10_15min (脱色 摇床摇动)；二抗杂交将PVDF膜浸于含有二抗的TTBS (0.05% Tween-20)溶液中，室温 孵育lhr;洗膜同上；显影将PVDF膜与S叩erSignal Western blotting化学发光底物室温孵育5 min，曝光X.光片，然后显影定影。 6.甜菜碱对饮食性肥胖的作用实验高脂饮食(HFD)的制备在100g基础饲料(普通大鼠饲料)加入全脂甜奶粉 10g、猪油10g、鸡蛋1个、15,000国际单位Vitamin A、 1,500国际单位Vitamin D和250 g豆芽(脱水后加入)，混合后，压制成与普通饲料完全相同的型状，贮存 于-2(TC，使用前从冰箱中拿出，在50°C烘烤12小时；动物重约70g雄性SD大鼠48只(购自中国科学院上海实验动物中心)，分 别放入单独的代谢笼饲养，实验温度维持在25°C，维持日夜节律(每天早上6点开 灯，晚上8点关灯)。实验开始前，大鼠自由进食普通饲料，自由饮水。实验正式开 始时，将大鼠随机编入6组，每组6只，A组(正常饮食对照组)，给予普通饲料，B组(高脂饮食对照组)，给予高脂饮食(HFD)，C组(betaine低剂量纽)，给予高脂饮食，同时给予稀释的betaine水溶液 (0.05g/ml)，给药量为10ml/Kg体重，D组(betaine高剂量组)，给予高脂饮食，同时给予稀释的betaine水溶液 (0. 10g/ml)，给药量为10ml/Kg体重，7E组(7-carnitine低剂量组)，给予高脂饮食，同时给予稀释的/-carnitine水 溶液(0,025g/ml)，给药量为10ml/Kg体重，F组U-carnitine高剂量组)，给予高脂饮食，同时给予稀释的7-carnitine水 溶液(0.050g/ml)，给药量为lOml/Kg体重，大鼠分笼饲养，自由饮水，环境温度控制在25°C，保持其自然昼夜节律。在实 验过程中，严格控制每只大鼠的进食量，大鼠的进食量第一周和第二周13g/天， 第三周15g/天，第四周17g/天，第五周19g/天，第六周21g/天，第七周至第十五 周23g/天。测量指标每周测量大鼠的体重，喂养15周后将大鼠处死，测量脂肪组织的重 量，分离血清，检测血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白浓度。 7.统计学分析实验数据以均值标准误(X±S)表示，组间比较采用卜test。结果显示1. 从Hx中获得类似甜菜碱的物质从地黄中分离Hx采用的方法是通过C18色谱柱，不保留的部分被命名为Hx。 Hx属于极性大、水溶性较好的一类物质，无法用反相色谱柱进行分离。采用Waters Atlantis HILIC Silica色谱柱。对Hx进行分离后，共得到六个组分，其中保留时 间为8.90min的组分，其质谱谱图与甜菜碱标准品的质谱图相同，确定组分Hx中 含有甜菜碱、甜菜碱类似物或由甜菜碱形成的盐类。2. 甜菜碱对脂肪细胞分化的抑制作用3T3-Ll前脂肪细胞经0.5mM甲基异丁基黄嘌吟(Mix) 、 1 y M地塞米松(Dex) 和lug/ml胰岛素(Insulin)诱导后，分化为脂肪细胞。正常分化的3T3-L1前脂肪细胞在分化的第3天开始出现脂滴，随着分化的进 行，脂滴增多，到第6-8天，分化程度最完全，以后分化细胞的数量不再增多，而 形成更多的融合脂滴。在诱导脂肪细胞分化的同时加入不同浓度的甜菜碱溶液作用 48hr，此后每次更换细胞培养液过程中并不加入甜菜碱溶液，在分化后第六天通过油 红染色观察细胞形态，结果显示，对照组细胞正常分化，而加入75mmol/L的甜菜碱 溶液的细胞分化则受到了抑制，150mmol/L的甜菜碱溶液则几乎可以完全抑制 3T3-L1前脂肪细胞分化为脂肪细胞。为验证是否存在甜菜碱溶液直接抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖，可能会产生 类似于抑制分化的假阳性结果的这种假设，本发明采用MTT法检测甜菜碱溶液对前 脂肪细胞增殖能力的影响，结果显示甜菜碱溶液不抑制细胞的增殖，从形态学上可见 在有效浓度75mmol/L和150mmol/L，用甜菜碱溶液处理的细胞和对照组细胞没有区 别，说明甜菜碱溶液不通过抑制前脂肪细胞的增殖产生抑制分化的结果。3. 甜菜碱对脂肪细胞分化的关键基因表达的影响 在脂肪细胞诱导分化后的第1天和第6天，分别提取正常和经甜菜碱溶液处理细胞的总蛋白，用Western Blotting方法检测分化后第1天的细胞总蛋白中 C/EBPP和第6天的细胞总蛋白中C/EBPa和422/aP2的表达水平。结果显示，作为脂肪细胞分化早期的标志基因的C/EBPe两种异构体中，18kD 的条带并没有因为药物的加入而产生变化，38kD的条带则随着加药量的增多而表达水 平逐渐降低，150mmol/L的甜菜碱溶液几乎完全可以抑制C/EBPP 38kD蛋白质的表 达水平；作为脂肪细胞终末分化标志基因的C/EBPa两种异构体中，30kD和42kD 的条带都随着加药量的增多而表达水平逐渐降低。脂肪酸结合蛋白422/aP2的表达水 平也随着加药量的增多而逐渐降低。4. 甜菜碱对高脂饮食诱导的肥胖大鼠的作用本发明建立了高脂饮食诱导的肥胖大鼠模型。在高脂饮食诱导的肥胖大鼠模型 中，将/-carnitine作为阳性对照，观察甜菜碱在预防饮食性肥胖中的作用。实验结束时，称量大鼠体重的结果表明高脂饮食喂养SD大鼠的体重，超过普 通饲料喂养SD大鼠体重的25% (426.2 ± 16.9 vs 326.1 ± 28.3)，而且高脂饮食 组大鼠的体重指数和脂肪组织重量显著高于普通词料喂养的大鼠，说明本发明成功构 建了高脂饮食诱导的肥胖大鼠模型。实验第15周时高脂饮食对照组(B组)大鼠的体重(426.2 ± 16.9)，显著高 于betaine低剂量组(C组)大鼠的体重(360.8 ± 25.1)和betaine高剂量组 (D组)大鼠的体重(352.9 ± 3.7)，差异具有统计学意义(p 〈 0. 05)，说明betaine 具有预防高脂饮食诱导的大鼠体重增加的作用；高脂饮食对照组(B组)大鼠的体重 (426.2 ± 16.9)，显著高于7-carnitine低剂量组(E组)大鼠的体重(350.7 ± 26.8)和/-carnitine高剂量组(F组)大鼠的体重(339.6 ± 14.9)，差异具有 统计学意义(p〈0.05)，说明7-carnitine具有预防高脂饮食诱导的大鼠体重增加的作用。体重指数的测量结果:高脂饮食对照组大鼠的体重指数显著高于Betaine低剂量 组和高剂量组的大鼠，差异具有统计学意义(P < 0.05)。脂肪组织(包括大网膜脂 肪组织、附睾脂肪组织和腹壁脂肪组织)的称量结果是，高脂饮食对照组大鼠的脂肪 组织重量高于Betaine低剂量组大鼠，显著高于Betaine高剂量组大鼠，差异具有 统计学意义(P < 0.05)。 Betaine低剂量和高剂量组大鼠的TG和TO低于高脂饮 食组大鼠。Betaine低剂量组大鼠的HDL高于高脂饮食组大鼠，而且Betaine高剂 量组大鼠的高密度脂蛋白(HDL)显著高于高脂饮食组大鼠，差异具有统计学意义(p 〈0.05)。 Betaine低剂量组大鼠的LDL低于高脂饮食组大鼠，而且Betaine高剂 量组大鼠的低密度脂蛋白(LDL)显著低于高脂饮食组大鼠，差异具有统计学意义(p < 0. 05)。综上，Betaine预防饮食性肥胖的作用表现为本Betaine具有预防高脂饮食诱 导的大鼠体重增加的作用和提高血浆HDL水平，降低LDL水平的作用。作为阳性对照的7-carnitine治疗组，体重指数的测量结果是高脂饮食对照 组大鼠的体重指数显著高于7-carnitine低剂量组和高剂量组的大鼠，差异具有统 计学意义(P 〈 0.05)。脂肪组织(包括大网膜脂肪组织、附卑脂肪组织和腹壁脂肪 组织)的称量结果是高脂饮食对照组大鼠的脂肪组织重量高于7-carnitine低剂 量组大鼠，显著高于7-carnitine高剂量组大鼠，差异具有统计学意义(p < 0. 05)。 7-carnitine低剂量和高剂量组大鼠的TG显著低于高脂饮食组大鼠。7-carnitine 低剂量组大鼠的TC显著低于高脂饮食组大鼠，而高剂量组大鼠的TC也是低于高脂 饮食组的大鼠。7-carnitine低剂量组和高剂量组大鼠的HDL低于高脂饮食组大鼠。 7-carnitine低剂量组大鼠的LDL低于高脂饮食组大鼠，而7-carnitine高剂量组 大鼠的LDL等于高脂饮食组大鼠。说明，在对血脂的调节上，Betaine和7-carnitine 的作用并不完全一致。
权利要求
1、甜菜碱在制备预防和治疗饮食性肥胖药物中的应用。
2、 甜菜碱在制备抑制脂肪细胞分化药物中的应用。
3、 甜菜碱在制备降低脂肪细胞关键基因表达水平药物中的应用。
4、 根据权利要求3的应用，其中所述的关键基因是C/EBPP。
5、 根据权利要求l的应用，其中所述的饮食性肥胖是高脂饮食诱导的体重增加。
6、 甜菜碱在制备提高血浆高密度脂蛋白水平药物中的应用。
7、 甜菜碱在制备降低低密度脂蛋白水平药物中的应用。
全文摘要
本发明属中药技术领域，涉及甜菜碱的药物新用途，具体涉及甜菜碱在预防和治疗饮食性肥胖中的应用。本发明所述的甜菜碱(Betaine)是地黄提取物中的组分之一。动物实验证实，甜菜碱能抑制脂肪细胞分化和脂肪细胞分化过程中关键转录因子的表达，抑制脂肪细胞分化，从而抑制脂肪组织的增生，具有预防高脂饮食诱导的体重增加和提高血浆高密度脂蛋白水平和降低低密度脂蛋白水平的作用，可制备预防和治疗饮食性肥胖的药物。
文档编号A61P3/00GK101322698SQ20071004219
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月15日 优先权日2007年6月15日
发明者宋后燕, 霖 江, 炜 莫 申请人:复旦大学