一种防治肥胖症及其相关疾病的药物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种联合应用袋骨素和绿茶多酚防治肥胖及其相关疾病的药物及应用。该药物应用袋骨素KBF和绿茶多酚GTP组成，其中袋骨素KBF与绿茶多酚GTP的质量比例为：1～2：1。所述的袋骨素KBF与绿茶多酚GTP的比例:在用于研究骨髓间充质干细胞向定向细胞诱导的浓度比是每毫升10-20微克袋骨素KBF加每毫升1-10微克绿茶多酚GTP;在用于肥胖Zucker大鼠模型的量是每日每公斤体重200-600毫克袋骨素KBF混于食物中饮用,0.1-5克绿茶多酚GTP加入100毫升水中饮用；在肥胖症及其相关疾病病人治疗总量是每天1-5克袋骨素KBF分两次口服，每天0.5-2克绿茶多酚GTP加入100毫升温水中分两次口服冲服。该药物应用于防治肥胖症及肥胖症并发症。如高酯血症、骨质疏松症、脂肪肝和糖尿病。
【专利说明】一种防治肥胖症及其相关疾病的药物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种联合应用袋骨素和绿茶多酚防治肥胖及其相关疾病的药物，如代 谢综合征，高酯血症，骨质疏松症，脂肪肝，糖尿病等。涉及细胞学生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 随着全球人口老年化和人类生活方式的改变，肥胖症已成为人类最重要的健康问 题之一。而与之相关的代谢综合症，高血压，糖尿病，某些癌症和骨质疏松症等疾病的发病 率迅速增加，已成为主要的全球健康负担。在澳大利亚超过40%的老人有肥胖症。澳大利 亚至少600, 000人伴有骨质疏松症，大多是中年和老年人，用于治疗骨质疏松症的成本是 每年10亿美元。这个医疗费用将随着肥胖与老龄人口的增加不可避免地继续增长。除了这 些财务费用，肥胖和从骨质疏松骨折导致丧失信心和生活质量，并增加心血管疾病的风险。 防止或逆转年龄肥胖有关骨质疏松症已成为一项挑战。
[0003] -个重要的例子是肥胖症的孕妇的最新研究。美国约有三分之一的女性在怀孕期 间患有肥胖症。肥胖症的孕妇的羊水基因显示，胎儿的大脑发育与众不同。流行病学的研 究发现母亲患肥胖症与她们的孩子患孤独症和多动症紧密相关。而怀孕的肥瘦老鼠的胎儿 进行的研究也确定肥瘦老鼠的胎儿的基因与大脑结构包括细胞代谢存在不同。目前还没有 确认患有肥胖症的女性的胎儿基因异常。
[0004] 骨质疏松症的特征是骨质量和骨强度的弱化。它是由骨质丢失导致骨质脆弱而不 平衡引起的。妇女更年期由于雌激素下降，钙饮食缺乏更易引起骨质疏松症的危险。流行 病学和动物研究强烈支持脂肪积累易引起骨质疏松症。
[0005] 目前对肥胖症及与之相关疾病的防治的挫施存在许多片面性。如治疗骨质疏松症 主要重点补充钙，维生素和微量营养素但并不注重肥胖，这只能解决骨矿物成分。骨质疏松 症不仅是骨矿物损失而且骨质也损失。肥胖可导致脂肪积累在骨髓，这将引起骨质疏松症。 骨质丢失可由成骨细胞修复代偿，如通过刺激间充质干细胞分化。最佳治疗方法应该通过 靶向分子机制能够刺激骨形成。骨成型蛋白质（BMP)，它是促进干细胞生长为成骨细胞的活 性蛋白，同时BMP也抑制了脂肪细胞的生成。因此，BMP已经应用于临床治疗肥胖症相关的 骨质疏松症。
[0006] 从绿茶提取的绿茶多酚（GTP)对抗氧化，抗衰老，防治代谢性综合症等疾病虽然 已有广泛的认识，但深刻的药理机制，特别在细胞分子学水平上尚待探讨。而独特的澳大利 亚野生袋鼠产品作为营养保健品也广泛应用，然而药理机制却鲜有报道。
【发明内容】
[0007] 发明目的：本发明的目的是提供应用袋骨素和绿茶多酚防治肥胖及其相关疾病的 一种新药物，本发明的另一个目的是提供上述袋骨素和绿茶多酚的联合应用方法。本发明 是利用间充质干细胞特有的定向诱导分化的生理学特征，以其为研究平台，在细胞分子学 水平上阐述了袋骨素（KangarooBonefactors，KBF)和绿茶多酚GTP对间充质干细胞诱导分 化为脂肪细胞和成骨细胞的作用，特别揭示了袋骨素KBF和绿茶多酚GTP联合应用防治肥 胖及与之相关的骨质疏松症的细胞学和药理学基础。并通过动物试验和临床试验得到验 证。
[0008] 技术方案：为实现上述目的，本发明提供了一种联合应用袋骨素和绿茶多酚防治 肥胖及其相关疾病的药物及应用。这种药物通过细胞分子生物学，动物模型研究和临床试 验治疗得到支持。
[0009] -种防治肥胖症及其相关疾病的药物，该药物应用袋骨素KBF和绿茶多酚GTP组 成，其中袋骨素KBF与绿茶多酚GTP的质量比例为：1?2 :1。
[0010] 优选地，所述的袋骨素KBF与绿茶多酚GTP的比例，在用于研究骨髓间充质干细 胞向定向细胞诱导的浓度比是每毫升10-20微克袋骨素KBF加每毫升1-10微克绿茶多酚 GTP。
[0011] 优选地，所述的袋骨素KBF与绿茶多酚GTP的比例，在用于肥胖Zucker大鼠模型 的量是每日每公斤体重200-600毫克袋骨素KBF混于食物中饮用，0. 1-5克绿茶多酚GTP 加入100毫升水中饮用；
[0012] 优选地，所述的袋骨素KBF与绿茶多酚GTP的比例，在肥胖症及其相关疾病病人治 疗总量是每天1-5克袋骨素KBF分两次口服，每天0. 5-2克绿茶多酚GTP加入100毫升温 水中分两次口服冲服。
[0013] 一种防治肥胖症及其相关疾病的药物的应用，该药物应用于防治肥胖症及肥胖症 并发症。
[0014] 优选地，所述肥胖症并发症为代谢综合征、高酯血症、骨质疏松症、脂肪肝和糖尿 病。
[0015] 对于本发明涉及的袋骨素是从澳大利亚东部独特天然来源的野生灰色袋鼠 (Macropusgiganteus)骨中通过改良的蛋白质提取方法提取。袋骨素KBF是所有提取蛋 白质的混合物，用于研究和治疗。进一步通过Tris-HCl/1%SDSSDS-PAGE电泳作蛋白质 组学分析：将凝胶上分级的蛋白质确定分子量大小，分割切下然后进行凝胶中胰蛋白酶的 消化。消化的多肽用与纳升电喷雾质谱法（nan〇LC/MS/MS)相接的纳升级反相液相色谱 (nanoflowreversedphasechromatographyinterfacedwithnanoelectrospraymassspectr ometry)进一步分割和定性。通过Bradford方法测定每1克袋鼠骨可提取到8. 2毫克蛋白 质。数据库搜索揭示蛋白提取物含有骨成型蛋白质2/4(BMP2/4)和骨化三醇、和骨钙素等 刺激骨组织生长和修复的活性因子。
[0016] 已知BMP通过与细胞表面的丝氨酸-苏氨酸激酶BMP受体刺激骨髓间充质干细胞 (MSCs)分化为成骨细胞和软骨细胞。BMP2促进成骨分化和抑制脂肪形成。缺乏BMP导致 骨丢失和涉及骨质疏松症的发展。然而，当前治疗骨质疏松症的侧重于各种类型的钙、维生 素和微量营养素，这只能解决骨矿物成分。骨中无BMPs，间充质干细胞不能被激活而分化为 成骨细胞。骨质疏松症缺乏的不仅是骨矿物质而且是骨基质或组织，而只有BMP才使间充 质干细胞产生新的骨基质组织。
[0017] 这个专利的特点是袋骨素KBF和绿茶多酚GTP的联合应用。在细胞分子生物学研 究方面，实时定量反转录PCR显示单独使用GTP主要抑制骨髓间充质干细胞脂肪细胞的分 化，表现为降低了脂肪细胞特异性生物学标记Pparg基因的表达；而KBF刺激骨髓间充质干 细胞分化成成骨细胞，表现为增加了成骨细胞特异性生物学标记Runx2基因的表达。而两 者联合应用表现为更显著的协同作用。
[0018] 本发明利用Zucker肥胖大鼠模型研究，发现KBF-GTP有效抑制了大鼠模型糖耐量 受损（IGT)相关联的高血脂症及骨质疏松症；治疗显著降低血清甘油三酯和改善糖耐量； 减少大鼠脂肪组织中炎性细胞因子（TNF-a和白细胞介素-6)的表达，从而减少由循环和 组织炎性细胞因子产生的对骨质生成的负面影响和破骨细胞作用；研究还表明通过调节肥 胖相关基因和抗氧化能力促进骨代谢而提高骨质形成；
[0019] 本发明公开了近五年来KBF-GTP临床治疗效果，发现单独使用GTP降低了肥胖病 人的身体质量指数（BMI)，总胆固醇，甘油三酯，低密度脂蛋白和丙氨酸转氨酶。两者联合 应用除了加强了GTP的作用，还降低了血压和天门冬氨酸转氨酶。特别值得注意的是天门 冬氨酸转氨酶，与丙氨酸转氨酶不同的是，天门冬氨酸转氨酶存在于多种组织细胞中，其中 心肌细胞中含量最高，其次为肝脏。血清中天门冬氨酸转氨酶性上升有助于对心脏病变的 诊断，如心肌梗塞。此酶可用以协助肝炎，肝硬化，脂肪肝，酒精的诊断和观察慢性肝病的预 后。
[0020] 有益效果：本发明在细胞分子生物学，动物试验和临床试验三个层次上揭示了袋 鼠骨提取物的生理学和药理学意义。提供了联合应用袋骨素（KBF)和绿茶多酚（GTP)的药 物，不但加强了绿茶多酚GTP的作用，而且产生了增强协同作用。具体如下：
[0021] ?抑制了骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化的能力；
[0022] ?刺激了骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力；
[0023] ?改善了Zucker肥胖大鼠模型代谢性综合症，包括血糖；
[0024] ?降低了肥胖病人的身体质量指数；
[0025] ?稳定了肥胖病人的血压；
[0026] ?降低了肥胖病人的血脂值，特别是甘油三酯和低密度脂蛋白；
[0027] ?降低了肥胖病人的血清转氨酶，预示对脂肪肝的防治作用；
[0028] ?降低了肥胖病人的血清中天门冬氨酸转氨酶，预示对肥胖病人心脏疾病的防治 作用。
[0029] 本发明的联合应用袋骨素（KBF)和绿茶多酚（GTP)的药物对防治肥胖及与其相 关的代谢性综合症，骨质疏松症，心血管，肝疾病等提供了一种有效的新药物。
【专利附图】
【附图说明】 图1为本发明实时定量反转录多肽链反应（Real-timequantitativeRT-PCR)分析KBF和GTP对骨髓间充干细胞选择性脂肪细胞生物标志物/^<3作?和骨细胞生物标志物 表达的影响图。 其中：(A) :KBF和GTP对骨髓间充干细胞脂肪细胞特异性生物标记/?基因的表 达。（B) :KBF和GTP对骨髓间充干细胞成骨细胞特异性生物标记基因的表达。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
[0031] 本发明应用袋骨素KBF和绿茶多酚GTP组成KBF-GTP。
[0032] 实施例1实时定量反转录多肽链反应（Real-timequantitativeRT-PCR)分析 KBF和GTP对骨髓间充干细胞向脂肪和成骨细胞诱导的影响。
[0033] 如图1所示，实时定量反转录多肽链反应（Real-timequantitativeRT-PCR)分 析袋骨素KBF和绿茶多酚GTP对骨髓间充干细胞向脂肪和成骨细胞诱导的影响。其中，（A): KBF和GTP对骨髓间充干细胞脂肪细胞特异性生物标记Pparg基因的表达。骨髓间充干细 胞在基本培养液（DS-)和刺激诱导脂肪细胞的特殊培养液（DS+)中培养第一天和第14天， 特殊培养液中也可加入5微克/晕升绿茶多酚GTP，或1-10微克/晕升袋骨素KBF，或两 者。aP〈0. 001比较相应治疗组的第一天的表达量。aP〈0. 05比较相应治疗组无GTP治疗的 表达量：eP〈0. 01，比较相应治疗组无KBF治疗的表达量.（B) :KBF和GTP对骨髓间充干细 胞成骨细胞特异性生物标记Runx2基因的表达。骨髓间充干细胞在基本培养液（DS-)和刺 激诱导成骨细胞的特殊培养液（DS+)中培养第一天和第7天，特殊培养液中也可加入5微 克/毫升GTP，或1-10微克/毫升KBF，或两者。aP〈0. 001，比较相应治疗组的第一天的表 达量：eP〈0. 05,与特殊培养液组相比较：dP〈0. 001，与加入1-10微克/毫升KBF的相应治 疗组相比较。
[0034] 实时定量反转录多肤链反应（Real-timequantitativeRT-PCR)分析KBF和GTP 对骨髓间充干细胞选择性脂肪细胞生物标志物Pparg和骨细胞生物标志物Runx2表达的影 响。
[0035] ?骨髓间充干细胞（BM-MSCs)从SD大鼠按目前公开的常用方法收集；
[0036] ?骨髓间充干细胞在含10%小牛血清（FBS)的DMEM完全培养基（购于Stem cell Techonlogies，加拿大）以5000/cm2密度接种扩增传代；
[0037] ?使用流式细胞术鉴定BM-MSC的免疫表型表征生物标志物，BM-MSC表达C44， ⑶90,⑶29但不表达⑶45,⑶14和⑶35 ;
[0038] ? 4- 6代骨髓间充干细胞含脂肪细胞或成骨细胞诱导剂（Differentiation Stimulators,DS)的培养基（购于StemcellTechonlogies，加拿大）中培养进行脂肪细 胞和成骨细胞的分化诱导研究。分化为脂肪细胞和骨细胞分别通过油红0(0ilRed0)和碱 性磷酸酶染色证实；
[0039] *KBF-GTP对脂肪细胞分化诱导研究的方案是：骨髓间充干细胞在DMEM完全培养 基（无诱导剂，DS-)或加脂肪细胞诱导剂的培养基（含诱导剂，DS+)。在DS+培养基中加 入5微克GTP/毫升或1-10微克KBF/毫升或5微克GTP/毫升加10微克KBF/毫升。骨髓 间充干细胞培养14天。
[0040]
【权利要求】
1. 一种防治肥胖症及其相关疾病的药物，其特征在于：该药物应用袋骨素 KBF和绿茶 多酚GTP组成，其中袋骨素 KBF与绿茶多酚GTP的质量比例为：1-2 :1。
2. 根据权利要求1所述的一种防治肥胖症及其相关疾病的药物，其特征在于所述的袋 骨素 KBF与绿茶多酚GTP的比例，在用于研究骨髓间充质干细胞向定向细胞诱导的浓度比 是每毫升10-20微克袋骨素 KBF加每毫升1-10微克绿茶多酚GTP。
3. 根据权利要求1所述的一种防治肥胖症及其相关疾病的药物，其特征在于所述的 袋骨素 KBF与绿茶多酚GTP的比例，在用于肥胖Zucker大鼠模型的量是每日每公斤体重 200-600毫克袋骨素 KBF混于食物中饮用，0.1-5克绿茶多酚GTP加入100毫升水中饮用。
4. 根据权利要求1所述的一种防治肥胖症及其相关疾病的药物，其特征在于所述的袋 骨素 KBF与绿茶多酚GTP的比例，在肥胖症及其相关疾病病人治疗总量是每天1-5克袋骨 素 KBF分两次口服，每天0. 5-2克绿茶多酚GTP加入100毫升温水中分两次口服冲服。
5. -种防治肥胖症及其相关疾病的药物的应用，其特征在于：该药物应用于防治肥胖 症及肥胖症并发症。
6. 根据权利要求5所述的防治肥胖症及其相关疾病的药物的应用，其特征在于：所述 肥胖症并发症为代谢综合征、高酯血症、骨质疏松症、脂肪肝和糖尿病。
【文档编号】A61P1/16GK104257888SQ201410209435
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年5月16日 优先权日:2014年5月16日
【发明者】金星亮, 屈贤琴, 郑菊芬, 杨五宁 申请人:南京优而生物科技发展有限公司