专利名称：：一种抗肿瘤生物活性物质及其制备工艺的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物医药领域，具体涉及将心脏组织培养成具有抗肿瘤活性的心肌细胞培养液，以及其制备方法。
背景技术：
：肿瘤是人体组织细胞在内外各种有害的因素长期作用下，发生基因突变，表达紊乱，调节失控，产生过度增生及异常分化所形成的新生物或赘生物，临床上常以肿块形式出现。这种新生物并非机体所需要，不按正常规律生长或不可遏止的生长，已丧失正常组织细胞功能，并可破坏原来器官组织结构，进而危及生命.恶性肿瘤具有三个共同特征即1.自主性生长，2.浸润性生长和转移灶形成，l癌细胞的特性可传递给它的子代细胞。现有治疗肿瘤的药物一般分为七大类别，分别是烷化剂、抗代谢类、抗肿瘤抗生素、植物碱、杂类常见的药物、激素类常见的药物和生物工程生成的抗肺瘤药物。近几年生物制剂的发展特别迅速，对生物制剂中的活性物质的研究也蓬勃发展，这些活性物质一般包括l.千扰素主要应用于毛细胞白细胞、Kaposi肉瘤、低度恶性淋巴瘤；2.白细胞介素IL-2与LAK细胞联合使用，对癌细胞产生非特异性杀伤作用，IL-11升高血小板，用于化疗药物使用导致的血小板降低的临床治疗；3.单克隆抗体如抗CD20单抗美罗华用于治疗B细胞淋巴瘤；4.生长因子GM-CSF、G-CSF;促进粒细胞、巨噬细胞分化成熟，用于抗肿瘤的辅助治疗用药以及用于化疗药物使用导致的白细胞降低的临床治疗；5.肿瘤坏死因子局部应用，瘤内注射可以起到一定的局部抗肿瘤作用。生物制剂活性物质种类繁多，目前尚无任何药物有效的治疗各类恶性肿瘤，其临床应用受到限制的常见原因为l.大部分生物制剂均有发热、乏力、骨髓功能抑制等毒副作用；2.抗肿瘤作用通常为非特异性，其抗肿瘤作用较弱，部分生物制剂仅有增强或调解免疫力从而起到抗肺瘤辅助作用；3.大部分生物制剂由于受到化学工艺提取以及合成的生产成本高等原因，其生物制剂价格昂贵，从而应用于临床受到较大限制。
发明内容本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点而提供一种无毒的、广谱的、具有免疫作用的并易于获得的抗肿瘤心肌细胞裂解液，本发明的另一目的是提供这种抗肿瘤心肌细胞裂解液的制备方法。本发明的目的是这样实现的本发明的抗肿瘤活性物质是一种心肌细胞裂解液，具体的，这种心肌细胞裂解液是由心脏组织经以下步骤获得l)制细胞悬液将心脏组织制成均匀的细胞悬液，迅速置于低于-2(TC环境中冷冻；2)反复冻融冷冻24小时后取出置于室温融解，待完全融解后，再次置于-20。C环境中冷冻，如此反复三次，得到冻融裂解的匀浆液；3)离心过滤将该匀浆液在3000转/分的条件下离心30分钟，将上清液以截留量10KD的超滤过滤后，收集分子量小于10KD的滤液即为心肌细胞裂解液。更为具体的，所述的心肌细胞培养液是由以下步骤制得1)制细胞悬液将心脏组织制成的细胞悬液在2000转/分的条件下勻浆30分钟后，迅速置于低于-20。C环境中冷冻；2)反复冻融冷冻24小时后取出置于室温融解，待完全融解后，再次置于-20。C环境中冷冻，如此反复三次，得到冻融裂解的勻浆液；3)离心过滤将该勻浆液在3000转/分的条件下离心30分钟，将上清液以截留量10KD的超滤过滤后，收集分子量小于10KD的滤液即为心肌细胞裂解液。本发明通过长达三年的实-验研究，且无治疗的毒副作用。其剂型分为液体制剂和真空冻干粉剂两种剂型，可望广泛用于恶性肿瘤的临床治疗，使用时将心肌细胞裂解液液体制剂经静脉注射，或者将心肌细胞裂解液的真空冻干粉剂溶解于注射用水后经静脉注射给药，或者将心肌细胞裂解液的真空冻干粉剂溶解于0.9%氯化钠溶液(即生理盐水)后经静脉注射给药途径从而实现抗胂瘤治疗目的。从而该生物制剂可以弥补传统生物制剂的不足，在其抗肺瘤作用强度和毒副作用方面都优于传统生物制剂。其具体实验如下心肌细胞裂解液体内抑瘤活性研究实验，步骤为制备乳大鼠与成年大鼠心肌裂解液，收集分子量小于10KD的滤液，小鼠接种S180细胞随机分组。阴性对照组为生理盐水；阳性对照组为顺柏注射液，实验组为乳鼠心肌细胞裂解液(CMCLnr)、成年大鼠心肌细胞裂解液(CMCLar)，CMCLnr、CMCLar组相比较其接种肿瘤出现时间无显著差异，其接种生长出的肿瘤瘤重均无显著性差异，两组不同的心肌低分子抑瘤物组和顺铂组肿瘤出现时间比生理盐水组出现时间要晚，从而我们得出，两组不同的心肌低分子抑瘤物(即CMCLnr、CMCLar)和传统抗癌化疗药物顺铂都具有抗癌、抑瘤作用，CMCLnr、CMCLar均具有相同的抑瘤活性，在小鼠体内均能抑制S180肿瘤细胞的生长，其抑瘤分子量小于IOKD。同时我们观察小鼠体重及小鼠体重增加两项指标，顺铂分别与生理盐水组及CMCLnr、CMCLar比较，两项指标的差异均有统计学意义；CMCLnr、CMCLar与生理盐水组的差异均无统计学意义，且CMCLnr、CMCLar两组之间分别进行比较，其差异亦无统计学意义。实验结果表明CMCLnr、CMCLar对小鼠的正常生长无明显影响，具有抗癌、抑瘤良好的生物安全性，而没有传统抗癌化疗药物具有的影响机体正常生长等毒副作用。(注CMCLnr:乳鼠心肌细胞裂解液CMCLar成年大鼠心肌细胞裂解液)图1:新生大鼠心肌细胞裂解液及成年大鼠心肌细胞裂解液匀浆液图片；图l说明左侧匀浆管内液体为新生大鼠心肌细胞裂解液，右侧匀浆内液体为成年大鼠心肌细胞裂解液，图片中显示的裂解液为心肌组织剪碎并经过匀浆机充分匀浆后，第3次-20。C冷冻24小时后取出置于室温处于融解中的状态，两侧匀浆管内的裂解液中可见悬浮于管中的裂解液冷冻块。新生大鼠心肌细胞裂解液(左侧管)裂解液为淡黄色，管中尚未融解冷冻块颜色比裂解液稍深，呈乳黄色，未成年大鼠心肌细胞裂解液(右侧管)裂解液为淡红色，管中尚未融解冷冻块颜色比裂解液稍深，呈绛红色。图2:新生大鼠心肌细胞裂解液及成年大鼠心肌细胞裂解液超滤后图片。图2说明图中为所收集的乳鼠和成年大鼠心肌细胞充分冻融裂解的匀浆液，处理条件均以3000转/分离心30min，弃去沉淀，取上清液以截留量10KD的超滤离心管4000转/分，10min离心，收集分子量小于10KD的心肌细胞裂解液超滤液，其中图中A管为新生大鼠心肌细胞裂解液超滤液，外观颜色为淡黄色液体，图中B管为成年大鼠心肌细胞裂解液超滤液，外观颜色为淡红色液体，其余管中红色液体为心肌细胞培养液超滤液。具体实施例方式下面结合附困和具体实验对本发明作进一步的详细说明心肌细胞裂解液的作用从理论上分析为骨骼肌系统体积庞大，血流丰富，尤其是剧烈运动时，因此经血流向骨骼肌播散的恶性肿瘤数目应颇为可观，但骨骼肌转移瘤却罕见。心脏作为全身血液循环的主要器官，其血液供应非常丰富，而转移瘤较少，其中主要是心包转移，心肌转移罕见。心肌和骨骼肌同属于横紋肌系统，均具有恶性肿瘤不易转移到横紋肌系统特性，以色列的Djaldetti等国外学者，周乃康、罗成华等国内学者通过实验并证明骨骼肌条件培养液中存在低分子抑瘤活性物质，其对恶性肿瘤细胞具有广泛的抑制作用，而非肺瘤的增殖则未受到明显抑制，甚至还受到一定的促进作用，认为这可能是骨骼肌抵御转移瘤形成的主要机制。而心肌与骨骼肌同属于横紋肌，而心肌转移瘤也罕见，从理论上推测心肌的微环境中是也存在着相关的抑瘤物质。通过一系列的相关实验证明了心肌细胞裂解液具有抑瘤活性，并证明了心肌细胞裂解液存在低分子抑瘤活性物质。因此，本发明首先提出一种心肌细胞裂解液，它是由以下步骤制3曰付1)制细胞悬液将心脏组织制成的细胞悬液在2000转/分的条件下匀浆30分钟后，迅速置于低于-2(TC环境中冷冻；2)反复冻融冷冻24小时后取出置于室温融解，待完全融解后，再次置于-20。C环境中冷冻，如此反复三次，得到冻融裂解的匀浆液；3)离心过滤将该匀浆液在3000转/分的条件下离心30分钟，将上清液以截留量10KD的超滤过滤后，收集分子量小于10KD的滤液即为心fl细胞裂解液。下面通过实lHi明本发明的效果1、实验材料与仪器1.1实验动物Wistar大鼠(1~3天)由泸州医学院动物中心提供1.2实验细胞鼻咽癌细胞(CNE2)购自中山大学医学院肾小球系膜细胞(MCs)由泸州医学院传染免疫室提供1.3主要实验仪器超净工作台(苏州净化设备乂>司)倒置相差显微镜(IMT-2日本OLYMPUS公司)5%C02恒温孵育箱(TC2323美国Coulter公司)低温自动平衡离心机(LDZ5-2北京医用离心机厂)冷冻干燥机(FD-1eyelatokyorikakikaico.，ltd)电热恒温水浴箱(DSY-1-2北京爱琦霞商贸中心)酶联免疫检测仪(EXL美国)电热鼓风干燥箱(上海浦东荣丰科学仪器有限公司)电热恒温培养箱(DG-407型成都电烘厂)低温水箱(BCD-228B青岛海尔集团)细胞计数板、盖玻片、载玻片、湿盒、染色缸(江苏大仓医疗仪器厂)6孔培养板、96孔培养板(北京华美公司)2主要实验试剂2.1细胞培养试剂DMEM(北京华美/^司)新生小牛血清(北京华美公司)0.25%胰蛋白酶(沪州医学院附属医院传染免疫室提供)0.1%胶原酶(sigma产品北京华美公司提供)D-hanks液(泸州医学院附属医院传染免疫室提供)PBS(磷酸緩沖液，PH=7.0)MTT(北京华美公司)DMS0(北京华美7>司)2.2免疫组织化学试剂10%多聚赖氨酸(成都云鸿科技发展公司)O.01mol/l,PH7.2:称取NaCl8g，Na2HP041.15g，KH2P040.2g，加蒸馏7JC至1000ml溶解后，调PH值至7.2底物溶液DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有卩艮公司产品，包括浓缩緩冲液，DAB溶液，浓缩过氧化氢溶液)ABC试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司产品，包括封闭用正常血清工作液，生物素标记羊抗小鼠IgG，辣根过氧化酶标记链酶卵白素工作液S-A/HRP)小鼠抗大鼠横故肌单克隆肌动蛋白抗体MouseAnti-SarcomericActin5C5;IgM(武汉博士德试剂有限公司)3、本发明的详细工艺步骤3.1取材(1)消毒乳大鼠消毒取出生1-3天Wistar乳鼠若干只，用75%的酒精棉球全身擦洗消毒，放在无菌泡沫上，用无菌大头针固定四肢及头部，以碟酒和75%的酒精消毒胸部腹部皮肤。成年大鼠消毒取成年Wistar大鼠若干只，约200g/只，脱臼法处死，用细绳固定其四肢及头部于木板上，用剪刀剪去胸部腹部鼠毛，以碘酒和75%的酒精消毒胸部腹部皮肤。(2)心肌取材乳大鼠和成年大鼠心肌取材方法相同，先换剪刀剪开皮肤并剥离胸部，换剪刀于剑突上一肋处入剪，剪开肋骨，暴露胸腔，剪取心尖，生理盐水洗净，洗去心腔中残留的血细胞，于电子天平上称重，然后将其剪成lmn^大小的组织块，以生理盐水按20%(W/V)比例混匀。3.2匀浆将乳鼠心肌细胞混悬液和成年大鼠心肌细胞混悬液分别置于不同的匀浆瓶内，处理条件均为于匀浆机上以2000转/分，匀浆30分钟，制成乳大鼠心肌和成年大鼠心肌来源不同的匀浆液。3.3反复冻融将乳大鼠和成年大鼠心肌来源不同的匀浆液均置于-20°C冰箱中冻存24h,之后置于室温融解，待完全融解后，再次放入-2(TC冰箱中冻存，反复三次。反复冻融法的原理是将细胞在-2(TC以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内形成的水粒结晶体使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞的溶胀破碎，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被融破。3.4超滤及冷冻干燥将所收集的乳鼠和成年大鼠心肌细胞充分冻融裂解的匀浆液，处理条件均以3000转/分离心30min,弃去沉淀，取上清液以截留量10KD的超滤离心管4000转/分，10min离心，收集分子量小于10KD的滤液即为心肌细胞裂解液。进一步的是，可以将此心肌细胞裂解液制成冻干粉剂使用，具体方法为先用0.22um的滤膜过滤心肌细胞裂解液，除菌后冷冻干燥成干粉，其冻干粉剂为疏松千燥的淡黄色或黄白色粉剂，其乳鼠和成年大鼠心肌细胞裂解液的冻干粉剂均以-20。C低温保存备用。具体方法为(1)预冻将心肌细胞裂解液装入特定的磨口圓底玻璃瓶中，浸放在低温热传导液体内旋转，使其均匀的固化在瓶内壁上，以便在真空下进行升华。如果没有冻实，则抽真空时制品会溢出瓶外。(2)升华阶_^:也称一次干燥阶_度，制品装入干燥箱，启动真空泵，使干燥箱、捕水器获得必需的真空度，建立真空冻干的压力条件；给加热板升温，向制品提供水晶升华需要的热量。干燥箱的真空度以控制在10-30Pa为宜，捕水器温度应小于-4(TC;搁板温度在-10。C~+10。C之间。(3)解吸阶段也称二次干燥阶段，尽管在一次干燥中，绝大部分水能随水晶体的升华而排除，但为了获得尽可能好的干燥效果，应进行二次干燥。冻干箱真空度保持在10-30Pa范围；迅速升高搁板温度，使产品温度迅速上升到该产品允许的最高温度(<25°C),直至干燥结束，整个干燥过程约需10多个小时。4、实验l:心肌细胞裂解液体内抑瘤活性研究制备乳大鼠与成年大鼠心肌裂解液，收集分子量小于10KD的滤液，小鼠接种S18Q细胞随机分组。阴性对照组为生理盐水；阳性对照组为顺铂注射液，实验组为乳鼠心肌细胞裂解液(CMCLnr)、成年大鼠心肌细胞裂解液(CMCLar),实验结果表明CMCLnr、CMCLa在小鼠体内均能抑制S180肿瘤细胞的生长，其抑瘤分子量小于10kd。CMCLnr、CMCLa比较其肿瘤出现时间无显著差异，其瘤重均无显著性差异。(见表l、表2、表3)'表l:心肌低分子抑瘤物对S180小鼠移植瘤肺瘤出现时间的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注CMCLnr:乳鼠心肌细胞裂解液CMCLar成年大鼠心肌细胞裂解液可见，两组不同的心肌低分子抑瘤物和顺柏组肿瘤出现时间比生理盐水组出现时间要晚(P<0.05)表2:心肌低分子抑瘤物对S180小鼠移植瘤瘤重的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注Pi为各组与生理盐水组的比较，P2为各组与顺铂组的比较。表3:实验前后各组小鼠体重变化<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注实验前各组小鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)。实验结束后小鼠体重及小鼠体重增加两项指标，顺铂分别与生理盐水组及CMCLnr、CMCLar比4交，两项指标的差异均有统计学意义(P<0.05);CMCLnr、CMCLar与生理盐水组的差异均无统计学意义(P〉0.05)，且CMCLnr、CMCLar两组之间分别进行比4交，其差异亦无统计学意义(P>0.05)。实验结果1.新生大鼠成年大鼠心肌细胞裂解液在小鼠体内均能抑制S180肿瘤细胞的生长，抑瘤分子量小于10KD，且对小鼠的正常生长无明显影响。2.新生大鼠心肌细胞裂解液及成年大鼠心肌细胞裂解液之间的抑瘤活性无明显差异，均显示出有效的抑瘤活性。权利要求1、一种抗肿瘤生物活性物质，其特征在于，其为心肌细胞裂解液，所述心肌细胞裂解液由心脏组织经以下步骤获得1)制细胞悬液将心脏组织制成均匀的细胞悬液，迅速置于低于-20℃环境中冷冻；2)反复冻融冷冻24小时后取出置于室温融解，待完全融解后，再次置于-20℃环境中冷冻，如此反复三次，得到冻融裂解的匀浆液；3)离心过滤将该匀浆液在3000转/分的条件下离心30分钟，将上清液以截留量10KD的超滤过滤后，收集分子量小于10KD的滤液即为心肌细胞裂解液。2、一种抗肿瘤生物活性物质的制备工艺，其特征在于由心脏组织反复冻融裂解制成心肌细胞裂解液，所述心肌细胞裂解液由以下步骤获得1)制细胞悬液将心脏组织制成的细胞悬液在2000转/分的条件下匀浆30分钟后，迅速置于低于-2Gi:环境中冷冻；2)反复冻融冷冻24小时后取出置于室温融解，待完全融解后，再次置于-20。C环境中冷冻，如此反复三次，得到冻融裂解的匀浆液；3)离心过滤将该匀浆液在3000转/分的条件下离心30分钟，将上清液以截留量10KD的超滤过滤后，收集分子量小于10KD的滤液即为心^I几细胞裂解液。全文摘要本发明公开了一种抗肿瘤生物活性物质，它是将心脏组织培养成具有抗肿瘤活性的心肌细胞培养液，具体步骤为制细胞悬液、反复冻融、离心过滤，本发明通过长达三年的实验研究，证明这种心肌细胞裂解液抑瘤(抗癌)作用确切，且无治疗的毒副作用，其剂型分为液体制剂和真空冻干粉剂两种剂型，其抗肿瘤作用强度和毒副作用方面都优于传统生物制剂，可望广泛用于恶性肿瘤的临床治疗。文档编号A61K35/34GK101167746SQ200710050378公开日2008年4月30日申请日期2007年11月2日优先权日2007年11月2日发明者吴敬波申请人:泸州医学院附属医院