三白草总有效部位及其制备方法及其药物应用的制作方法

专利名称：三白草总有效部位及其制备方法及其药物应用的制作方法
技术领域：
本发明属于制药技术领域，涉及三白草总有效部位，包括总黄酮和总木脂素及其制备方法，以其为原料制得的新药，及其在预防和治疗酒精性肝损伤、非酒精性肝损伤、酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、肝纤维化、尿路感染、盆腔炎、乳腺增生的药物中的用途。
背景技术：
加入WTO后，我国医药产业尤其是中药业面临着必须急待解决的问题，即将我国新药开发从大量低水平重复的六类、八类、九类新药开发中摆脱出来。采用国际先进制剂技术，从传统中药中提取出高纯度有效部位或有效成分，并将其开发成新药，就成为中药现代化的发展方向。此外，通过大量药理试验和临床试验，扩展传统中药的应用范围，也将是今后较长时期内中药的发展方向。
三白草系三白草科植物三白草的干燥地上部分，为民间草药，据中华人民共和国药典2005年版记载，本品具有清热解毒、利水消肿之功效，主治尿路感染、尿结石、肾炎水肿、白带过多、支气管炎等症，外敷治痈疮结肿和皮肤湿疹。有文献报道三白草全草含黄酮类成分、木脂素、挥发油、多种氨基酸等。黄酮类成分主要有槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷、金丝桃苷、萹蓄苷和芦丁等。国内曾报道三白草可用于预防和治疗神经变性疾病和防治前列腺疾病，但对三白草总有效部位的提取及其它药效学的实验研究却报道甚少。

发明内容
本发明的目的是提供三白草总有效部位及其制备方法，还提供用三白草总有效部位以及药学上可接受的载体或赋形剂制备的各种新药，还提供上述三白草总有效部位在预防和治疗酒精性肝损伤、非酒精性肝损伤、酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、肝纤维化、尿路感染、盆腔炎、乳腺增生的药物中的用途。
该三白草总有效部位是从植物三白草中提取获得的，该总有效部位中总黄酮和总木脂素之和的含量为25％～70％。总有效部位中各种成分之间的含量比例可以与天然植物中的含量比例一致，也可以与天然植物中的含量比例不尽一致。
本发明提供的三白草总有效部位的制备方法优选为，包括下列步骤(1)提取用浓度为0～95％的乙醇作溶剂，将三白草加入重量5～15倍的该溶剂中进行回流提取，合并提取液，滤过，滤液回收溶剂后浓缩；(2)纯化将该浓缩液装于已预先处理好的吸附树脂柱中，先用5～10倍树脂柱体积的水洗，再用5～10倍树脂柱体积、浓度为50～95％的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇后浓缩干燥，精制。
本发明还提供用三白草总有效部位以及药学上可接受的载体或赋形剂制备的各种新药。这些新药包括口服给药制剂、舌下片、栓剂、泡腾片、注射剂等。口服给药制剂包括口服固体制剂、口服液体制剂。口服固体制剂可以是片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、锭剂等。这些制剂中，除包括本发明总有效部位外，还可以任选含有药学上可接受的填充剂、助流剂、润滑剂、着色剂、矫味剂等。这些制剂还可以根据需要制备成缓释或控释制剂。口服液体制剂可以是溶液、混悬液、乳化液等。这些制剂中，除包括本发明总有效部位外，还可以任选含有药学上可接受的溶剂、助溶剂、增溶剂、助悬剂、乳化剂、表面活性剂、矫味剂等。
本发明提供的以三白草总有效部位为原料制得的新药不仅包括单方制剂，还包括在复方制剂中添加三白草总有效部位作为活性成分的药物。
本发明提供的以三白草总有效部位为原料制得的新药，其用途涉及对酒精性肝损伤、非酒精性肝损伤、酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、肝纤维化、尿路感染、盆腔炎、乳腺增生疾病的治疗。
本发明的有益效果是填补了制备三白草有效部位，包含总黄酮和总木脂素的空白并扩展了其在医药领域中对酒精性肝损伤、非酒精性肝损伤、酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、肝纤维化、尿路感染、盆腔炎、乳腺增生疾病的治疗的应用范围，从而提高了该类中药制剂在国际市场的竞争力。
具体实施例方式
下列具体的实施例是对本发明进行更加详细的描述，但不对本发明的范围构成任何限制。
实施例1三白草总有效部位总黄酮和总木脂素的制备取三白草药材2kg，酌予碎断，以20kg 95％乙醇回流提取2次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，回收乙醇后浓缩至体积为1L，过D101大孔树脂柱，柱床体积1L，先用5L水洗，再用5L 95％乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇后浓缩干燥，精制后得总有效部位。所制得的三白草总有效部位中总黄酮和总木脂素含量之和为68％。
实施例2取三白草药材2kg，酌予碎断，以10kg水提取3次，每次1小时，滤过，合并滤液，浓缩至体积为1L，过AB8大孔树脂柱，柱床体积1L，先用10L水洗，再用10L 50％乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇后浓缩干燥，精制后得总有效部位。所制得的三白草总有效部位中总黄酮和总木脂素含量之和为27％。
实施例3取三白草药材2kg，酌予碎断，以30kg 70％乙醇提取2次，每次2小时，滤过，合并滤液，回收乙醇后浓缩至体积为1L，过黄酮树脂柱，柱床体积1L，先用8L水洗，再用8L 70％乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇后浓缩干燥，精制后得总有效部位。所制得的三白草总有效部位中总黄酮和总木脂素含量之和为46％。
本发明提供的三白草总有效部位只规定了总黄酮和总木脂素之和的含量25％～70％，不论各成分之间的含量如何，只要是从植物三白草中提取，并且总黄酮和总木脂素之和的含量在上述定义范围内，则该有效部位就在本发明范围内。
实验例三白草总有效部位的药效学实验(一)三白草总有效部位对非酒精性和酒精性肝损伤的影响1.材料1.1动物 昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～22g，购自长春生物制品研究所动物室，合格证编号分别为2006-0001。
1.2药物三白草总有效部位为棕褐色粉末，45g生药/g粉，按实施例1方式制备，下同。北京二锅头酒(国家许可证编号XK-16-030 0360，执行标准QH122-20002二级)，北京双庆和酒业有限责任公司产品，酒精度56％(v/v)，白酒出厂日期20060120。五灵肝复胶囊上海方大药业股份有限公司产品批号051203。
1.3试剂和试剂盒硫代乙酰胺上海化学试剂公司经销，批号980401。四氯化碳为北京化工厂产品，批号20020510。扑热息痛为辽源市百康药业股份有限公司产品，批号20040112。
总胆固醇、甘油三酯、总蛋白、白蛋白试剂盒为北京中生北控生物科技股份有限公司产品，批号1800311、220031、261091、251581。谷丙转氨酶、谷草转氨酶、丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、考马斯亮兰试剂盒为南京建成生物工程研究所产品，批号20060510、20060513、20060511、20060514、20060509、20060512。
2.方法和结果2.1对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的影响取小鼠50只，随机分5组，第一组为正常对照组灌胃10ml/kg蒸馏水，第二组为模型组灌胃10ml/kg蒸馏水，第三组为阳性药组灌胃五灵肝复胶囊2.0g内容物/kg；第四～五组为三白草总有效部位高、低剂量组，分别灌胃三白草总有效部位0.33、0.17g/kg(相当于生药15、7.5g/kg)。每日1次，连续10日。末次给药前16小时禁食，除空白对照组外，均腹腔注射0.1％四氯化碳花生油溶液10ml/kg，眼静脉取血，测定丙氨酸氨基转换酶(ALT)，取整个肝脏称重，测定肝脏系数，取小鼠右叶肝，用于测定丙二醛(MDA)含量；取小鼠同一部位肝叶(左叶)作病理检查。病变程度按文献分级。-正常肝细胞；+肝细胞变性(主要是浊肿)或点状坏死；++肝细胞变性或局灶性坏死；+++肝小叶不到1/3肝细胞坏死；++++肝小叶坏死超过1/3。结果见表1。
表1 对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的影响

(注与模型组比较*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。)结果表明模型组小鼠肝脏系数、MDA、ALT活性与正常对照组比较极显著增高，表明模型成立。三白草总有效部位高剂量组可以明显降低四氯化碳所致急性肝损伤小鼠的肝脏系数，三白草总有效部位高、低剂量组可以明显降低四氯化碳所致急性肝损伤小鼠的ALT和MDA活性。病理组织学结查结果表明三白草总有效部位对四氯化碳所致急性肝损伤小鼠肝脏有明显的保护作用。详见下面病理报告1(CCl4小鼠急性肝损伤)。
动物名称小鼠取材部位肝脏大体检查正常小鼠肝脏被膜光滑，色泽红润，弹性好。CCl4损伤小鼠肝脏有的颜色深，有的色泽灰白，体积稍大，脆性大。
试验用药1～10号正常对照组，11～20号模型组，21～30号阳性药组，31～40号三白草总有效部位高剂量组，41～50号三白草总有效部位低剂量组。
显微镜检查石蜡切片、HE染色、光镜检查。
统计分析肝脏损害程度采用SPSS12.0软件，用非参数检验中，等级资料秩和检验。P为双侧渐近概率值。
镜下观察表2肝损伤程度分级(CCl4小鼠急性肝损伤)

与模型组比较*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001下同。
肝损伤程度分级变性-无或仅中央静脉淤血扩张+以肝细胞浆疏松化为主或脂肪变性的肝细胞占肝细胞总数的1/3以下++以肝细胞气球样变为主或脂肪变性的肝细胞占肝细胞总数的1/3～1/2内+++以肝细胞气球样变为主或脂肪变性的肝细胞占肝细胞总数的1/2以上坏死-无+坏死肝细胞占总肝细胞10％以下++肝细胞以小片坏死为主，占肝细胞总数的10～20％+++肝细胞以大片坏死为主，占肝细胞总数的20％以上结论三白草总有效部位对CCl4所致的小鼠急性肝损伤有明显的保护作用。
2.2对硫代乙酰胺所致小鼠肝损伤的影响取小鼠50只，随机分五组，第一组为正常对照组灌胃10ml/kg蒸馏水，第二组为模型组灌胃10ml/kg蒸馏水，第三组为阳性药组灌胃五灵肝复胶囊2.0g内容物/kg；第四～五组为三白草总有效部位高、低剂量组，分别灌胃三白草总有效部位0.33、0.17g/kg(相当于生药15、7.5g/kg)。每日1次，连续10日。末次给药前16小时禁食，除空白对照组外，均腹腔注射50mg/kg硫代乙酰胺，眼静脉取血，测定丙氨酸氨基转换酶(ALT)含量，并取小鼠同一部位肝叶(左叶)作病理检查。病变程度按文献分级。对硫代乙酰胺所致小鼠急性肝损伤的影响见表3。
表3对硫代乙酰胺所致小鼠急性肝损伤的影响

(与模型组比较*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。)结果表明模型组小鼠肝脏系数和ALT活性与正常对照组比较极显著增高，表明模型成立。三白草总有效部位高、低剂量组可以明显降低硫代乙酰胺所致急性肝损伤小鼠的ALT活性。三白草总有效部位高剂量组明显降低肝损伤小鼠肝脏系数。病理组织学结查结果表明三白草总有效部位对硫代乙酰胺所致急性肝损伤小鼠肝脏有保护作用。
详见下面病理报告2(硫代乙酰胺小鼠急性肝损伤)。
动物名称小鼠取材部位肝脏大体检查正常小鼠肝脏被膜光滑，色泽红润，弹性好。硫代乙酰胺损伤小鼠肝脏有的颜色深，体积稍大，脆性大。
试验用药1～10号正常对照组，11～20号模型组，21～30号阳性药组，31～40号三白草总有效部位高剂量组，41～50号三白草总有效部位低量组。
显微镜检查石蜡切片、HE染色、光镜检查。
统计分析肝脏损害程度采用SPSS12.0软件，用非参数检验中等级资料秩和检验统计。P为双侧渐近概率值。
光镜观察表4 肝损伤程度分级(硫代乙酰胺小鼠)

(与模型组比较*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。)肝损伤程度分级-正常肝细胞；+肝细胞变性(主要是浊肿)或点状坏死；++肝细胞变性或局灶性坏死；+++肝小叶不到1/3肝细胞坏死；++++肝小叶坏死超过1/3。
结论三白草总有效部位高、低量组对硫代乙酰胺所致的小鼠急性肝损伤有明显的保护作用。
2.3对扑热息痛所致小鼠肝损伤的影响取小鼠50只，随机分5组，第一组为正常对照组灌胃10ml/kg蒸馏水，第二组为模型组灌胃10ml/kg蒸馏水，第三组为阳性药组灌胃五灵肝复胶囊2.0g内容物/kg；第四～五组为三白草总有效部位高、低剂量组分别灌胃三白草总有效部位0.33、0.17g/kg(相当于生药15、7.5g/kg)。每日1次，连续10日。末次给药前24小时禁食，除空白对照组外，均腹腔注射400mg/kg扑热息痛。眼静脉取血，测定ALT、AST活性，取小鼠肝脏称重，测定脏器指数，取右叶测定MDA含量；并取小鼠肝脏左叶作病理检查。病变程度按文献分级。三白草总有效部位对扑热息痛所致小鼠急性肝损伤的影响结果见表5。
表5 三白草总有效部位对扑热息痛所致小鼠急性肝损伤的影响

(与模型组比较*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。)注造型后模型组死亡1只小鼠，采肝脏，无血样品。
结果表明三白草总有效部位可使扑热息痛中毒小鼠肝脏系数和血清中ALT、AST、MDA降低，病理组织学结查结果表明三白草总有效部位对扑热息痛所致肝损伤小鼠肝脏有保护作用。详见下面病理报告3(扑热息痛小鼠急性肝损伤)。
动物名称小鼠；取材部位肝脏大体检查正常小鼠肝脏被膜光滑，色泽红润，弹性好。扑热息痛损伤小鼠肝脏上有大小不等、颜色深浅不一的淤血和点状斑点。体积稍大，脆性大。
试验用药1～10号正常对照组，11～20号模型组，21～30号阳性药组，31～40号三白草总有效部位高剂量组，41～50号三白草总有效部位低剂量组。
显微镜检查石蜡切片、HE染色、光镜检查。
统计分析肝脏损害程度采用SPSS12.0软件，用非参数检验中等级资料秩和检验统计。P为双侧渐近概率值。
光镜观察表6肝损伤程度分级(扑热息痛)

(与模型组比较*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。)结论三白草总有效部位高、低剂量组对扑热息痛所致的小鼠急性损伤有显著的保护作用。
2.4对酒精所致小鼠肝损伤的影响取小鼠50只，随机分5组，第一组为正常对照组灌胃10ml/kg蒸馏水，第二组为模型组灌胃10ml/kg蒸馏水，第三组为阳性药组灌胃五灵肝复胶囊2.0g内容物/kg；第四～五组为三白草总有效部位高、低剂量组分别灌胃三白草总有效部位0.33、0.17g/kg(相当于生药15、7.5g/kg)。每日1次，连续10日。末次给药后禁食12小时，除空白对照组外，均灌胃15ml/kg40度北京二锅头，6小时后，眼静脉取血，测定丙氨酸氨基转换酶和天门冬氨基转换酶(AST)含量，取小鼠肝脏称重，测定脏器指数，取右叶测定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性和丙二醛(MDA)含量；并取小鼠同一部位肝叶(左叶)作病理检查。病变程度按文献分级。结果见表7。
表7三白草总有效部位对酒精所致小鼠肝损伤的影响

(与模型组比较*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。)结果表明三白草总有效部位可使酒精中毒小鼠肝脏系数和血清中ALT、AST降低，提高酒精中毒小鼠血中GSH-PX和SOD活性，降低酒精中毒小鼠肝脏中MDA含量。病理组织学结查结果表明三白草总有效部位对酒精所致肝损伤小鼠肝脏有保护作用。详见下面病理报告4(酒精小鼠急性肝损伤)。
动物名称小鼠取材部位肝脏大体检查正常小鼠肝脏被膜光滑，色泽红润，弹性好。酒精损伤小鼠肝脏颜色深，体积稍大，脆性大。
试验用药1～10号正常对照组，11～20号模型组，21～30号阳性药组，31～40号三白草总有效部位高剂量组，41～50号三白草总有效部位低剂量组。
显微镜检查石蜡切片、HE染色、光镜检查。
统计分析肝脏损害程度采用SPSS12.0软件，用非参数检验中等级资料秩和检验统计。P为双侧渐近概率值。
光镜检查表8肝损伤程度分级(酒精小鼠)

(与模型组比较*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。)结论三白草总有效部位高、低剂量组对酒精所致的小鼠急性损伤有明显的保护作用。
3.结论三白草总有效部位对非酒精性和酒精性肝损伤有明显的保护作用。
(二)三白草总有效部位对大鼠实验性酒精性和非酒精性脂肪肝的治疗作用1.材料1.1动物Wistar大鼠，体重180～200g雄性，动物等级贰级。购自吉林大学基础医学院动物中心，合格证编号为2003-0001。实验室温度21～23℃，相对湿度50％～60％。
1.2药物三白草总有效部位为棕褐色粉末，45g生药/g粉。北京二锅头酒(国家许可证编号XK-16-030 0360，执行标准QH122-20002二级)，北京双庆和酒业有限责任公司产品，酒精度56％(v/v)，白酒出厂日期20060120。五灵肝复胶囊上海方大药业股份有限公司产品批号051203。绞股蓝总甙片为广州白云山中药厂生产，含绞股蓝总甙20mg/片，批号0504016。
1.3试剂盒和试剂 总胆固醇、甘油三酯、总蛋白、白蛋白试剂盒为北京中生北控生物科技股份有限公司产品，批号1800311、22003l、26109l、251581。谷丙转氨酶、谷草转氨酶、丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、考马斯亮兰试剂盒为南京建成生物工程研究所产品，批号20060510、20060513、20060511、20060514、20060509、20060512。胆固醇为中国新兴化工试剂研究所产品，批号981008。牛胆盐为包头市生物化学制药厂产品，批号960101。蔗糖为北京化工厂产品，批号870211。甲基硫氧嘧啶为广州光华制药厂产品，批号20050802。
1.4数据处理 试验数据以 表示，结果进行组间t检验。
2.方法和结果2.1三白草总有效部位对大鼠实验性酒精性脂肪肝的治疗作用取大鼠60只，随机分2组，空白对照组(10只)，每日灌胃10m1/kg蒸馏水；模型对照组(50只)，每日灌胃56℃白酒，每次5ml/kg；每日2次。连续4周。第15日和29日，取模型组各3只大鼠肝脏，做病理检查，观察模型是否成立。造型期间大鼠死亡4只。等待病理结果期间模型组大鼠继续灌胃白酒。
病理结果给予白酒2周大鼠，肝脏汇管区有炎细胞浸润，肝细胞水肿。4周大鼠肝脏汇管区大量炎细胞浸润，肝细胞明显脂肪变性坏死。证明酒精性脂肪肝模型成立。
分组给药将模型40只大鼠，随机分四组。模型组每日灌胃56℃白酒5ml/kg；阳性药组每曰灌胃2.0g/kg五灵肝复胶囊内容物和56℃白酒5ml/kg；三白草总有效部位高、低剂量组，分别灌胃0.22、0.11(相当于生药10.0、5.0g/kg)三白草总有效部位，同时灌胃56℃白酒5ml/kg，每日一次，连续4周。末次给药后，禁食12小时，戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉采血，离心，取血清，测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总蛋白、白蛋白含量。取肝脏称重，计算肝脏指数(g/l00g体重)。取肝脏左叶，测定甘油三酯、总胆固醇、丙二醛含量、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性(均按试剂盒上方法进行)。取肝脏右叶，放入福尔马林中固定，做病理检查。
结果见表9和表10。
表9 三白草总有效部位对酒精性脂肪肝大鼠的影响(血清中指标)

与模型组比较*表示P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001表10三白草总有效部位对大鼠酒精性脂肪肝的影响(肝脏中指标)

与模型组比较*表示P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001结果模型组大鼠肝脏系数有增加趋势，血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、含量显著增加，白蛋白含量降低，总蛋白含量无显著变化。肝脏中甘油三酯、总胆固醇、丙二醛含量显著增加，超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性明显降低。三白草总有效部位高、低剂量组显著降低酒精肝大鼠肝脏系数、肝脏中甘油三酯、总胆固醇含量和血清中谷草转氨酶活性，显著提高血清中白蛋白含量和谷胱甘肽过氧化物酶活性。病理检查结果经过药物治疗后，大鼠肝细胞脂肪变性明显减少。正常对照组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐，肝细胞核清晰可见核仁。模型组大鼠肝细胞广泛脂变，形成大小不等空泡状，有的大鼠肝中央静脉扩张，肝窦扩张，小叶界限不清，有小坏死灶大鼠2只，轻度肝细胞脂肪变性大鼠4只，中度肝细胞脂肪变性大鼠4只，重度肝细胞脂肪变性大鼠2只。阳性药组大鼠肝小叶结构基本清晰，肝细胞索排列整齐，但仍可见中央静脉扩张，个别肝组织仍可见空泡变性。基本正常大鼠3只，轻度肝细胞脂肪变性大鼠5只，中度肝细胞脂肪变性大鼠2只。三白草总有效部位高剂量组大鼠肝小叶结构基本正常，肝细胞索排列整齐，个别中央静脉扩张淤血。基本正常大鼠5只，轻度肝细胞脂肪变性大鼠5只。三白草总有效部位低剂量组大鼠大部分肝小叶结构正常，肝细胞索排列整齐，个别有肝窦淤血和轻度扩张。基本正常大鼠3只，轻度肝细胞脂肪变性大鼠5只，中度肝细胞脂肪变性大鼠2只。
2.2三白草总有效部位对大鼠实验性非酒精性脂肪肝的治疗作用2.2.1脂肪乳剂的制备取猪油20克，放在200ml的烧杯里，加热溶化后，加入4g胆固醇，溶化，再加入0.4g甲基硫氧嘧啶、1g牛胆盐，20ml吐温-80，充分搅匀，30ml蒸馏水和1-2丙二醇20ml，放在电炉上加热至60℃，最后加温水至200ml，即制成脂肪乳剂。即含10％猪油、2％胆固醇、0.2％甲基硫氧嘧啶、0.5％牛胆盐。
2.2.2动物模型制备大鼠随机分为两组，模型组45只，对照组10只。模型组每天给予脂肪乳剂灌胃(10ml·kg-1)每天一次，连续8周。对照组给予等量蒸馏水灌胃。实验7周后取模型组4只大鼠肝脏，作病理检查，判断非酒精性脂肪肝模型是否成立。其余大鼠继续给予高脂乳剂。病理结果4只大鼠肝细胞均出现不同程度的脂肪变性，肝细胞体积增大，内含大小不一的脂肪空泡，汇管区周围可见大量炎细胞，3只有坏死灶。证明非酒精性脂肪肝模型成立。
2.2.3分组给药模型组大鼠随机分四组，模型对照组，灌胃10ml/kg蒸馏水，阳性药组灌胃50mg/kg绞股蓝总甙，三白草总有效部位高、低剂量组，分别灌胃0.22、0.11三白草总有效部位(相当于生药10.0、5.0g/kg)，每日1次，连续4周。末次给药后，禁食16小时，不禁水。
2.2.4.观察指标实验结束时称量体重取血，取肝。肝脏称湿重。取血清测定TG、TC、AST、ALT、SOD、MDA测定按试剂盒规范操作。在相同部位取肝脏精确称取0.3g，在冰水中制成10％的匀浆，4℃4000r·min-1离心10min，提取上清液，测定TG、TC、MDA、SOD含量。组织学检查HE染色，在光镜下观察肝脂肪变性情况。肝细胞脂肪变性分级标准重度肝细胞脂肪变性超过肝小叶2/3；中度肝细胞脂肪变性占肝小叶1/3～2/3；轻度肝细胞脂肪变性呈散在分布；无肝小叶结构完好，基本无脂变。结果见表11、12、13。
表11 三白草总有效部位对非酒精性脂肪肝大鼠的影响(血清中指标)

与模型组比较*表示P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001表12 三白草总有效部位对大鼠非酒精性脂肪肝的影响(肝脏中指标)

与模型组比较*表示P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001表13 大鼠肝细胞脂肪变性病理统计结果

与模型组比较*表示P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0012.2.5结果模型组有少数大鼠出现腹泻现象，在实验第6周，模型组死亡1只大鼠。模型组肝指数(肝湿重/体重×100％)明显升高。模型组TG、TC、MDA、ALT、AST含量明显增加，SOD活性明显降低。三白草总有效部位能够明显降低非酒精性脂肪肝大鼠肝脏系数，降低血清中和肝脏中TG、TC、MDA含量，降低血清中AST、ALT含量，提高血清中和肝脏中SOD活性。病理结果模型组肝细胞仍有大量脂肪变性。经三白草总有效部位治疗的大鼠肝细胞脂肪变性程度明显减轻。
3.结论三白草总有效部位灌胃给药，对大鼠实验性酒精性和非酒精性脂肪肝有明显的治疗作用。
(三)三白草总有效部位对大鼠实验性肝纤维化的影响1.实验材料1.1动物Wistar大鼠，体重180～220克，雄性，购自吉林大学基础医学院动物中心。动物合格证号为2003-0001。
1.2药物三白草总有效部位为棕褐色粉末，45g生药/g粉。绞股蓝总甙片为广州白云山中药厂生产，含绞股蓝总甙20mg/片，批号0504016。
1.3试剂 四氯化碳为北京化工厂产品，批号20020510。总胆固醇(T-CHO)、甘油三脂(TG)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)试剂盒为北京中生北控生物科技股份有限公司产品，批号1800311、220031、261091、251581，谷丙转氨酶(ALT)谷草转氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、羟脯氨酸(Hyp)试剂盒为南京建成生物工程研究所产品，批号20060510、20060513、20060511、20060509、20060510。透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、IV型胶原(IV-C)试剂盒均为北京市福瑞生物工程公司产品。
2.实验方法2.1造模型留10只大鼠做为正常对照组，其余大鼠62只均采用CCl4高脂低蛋白等复合因素致大鼠肝纤维化模型。首次皮下注射40％CCl4花生油溶液5ml/kg，以后每周2次皮下注射40％CCl4花生油溶液3ml/kg，连续4周，再每周皮下注射40％CCl4花生油溶液一次，连续2周，每次3ml/kg。前4周每日以10％胆固醇、20％猪油、55％玉米面、24％正常大鼠饲料混合均匀，压缩成块饲养大鼠，后2周以单纯玉米面饲喂大鼠。另外每日用25％乙醇做为大鼠饮用水，正常对照组每日喂以正常饲料和饮用自来水。6周后，取模型4只大鼠肝脏，作病理检查，观察肝纤维化模型是否已经建立。造型期间死亡8只大鼠。
2.2分组及给药 将大鼠随机分5组、正常对照组10只，造型大鼠分模型组(14只)、阳性药组(12只)、三白草总有效部位高、低两个剂量组(12只)。正常对照组和模型组每日灌胃给予蒸馏水10ml/kg，阳性药组灌胃给予绞股蓝总甙50mg/kg，三白草总有效部位高低剂量组分别按0.22、0.11g/kg灌胃给药(相当于生药10、5g/kg)，每日1次，连续8周。除正常对照组外，其余大鼠仍每周皮下注射40％CCL4花生油溶液3ml/kg一次，每日用12.5％乙醇做为大鼠饮用水，高脂饲料和玉米面交替饲喂。
2.3检测项目取血清测定MDA、SOD、ALB、TP、ALT、AST、HA、LN和IV-C含量。取肝一部分测定TG、TC、HYP并计算胶原蛋白含量，另一部份做病理组织学检查。肝纤维化程度分级(一)汇管区无明显的纤维组织；(+)汇管区有较多纤维组织增生，局限性；(++)汇管区有大量纤维组织增生，呈窄带状，并向肝小叶周围伸展；(+++)汇管区有大量纤维组织增生，呈宽带状，并伸展包绕肝小叶且可见中央静脉偏位。
表14三白草总有效部位对实验性肝纤维化大鼠血清中生化指标的影响

与模型组比较*表示P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001表15 三白草总有效部位对实验性肝纤维化大鼠肝中生化指标的影响

与模型组比较*表示P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001表16 三白草总有效部位对实验性肝纤维化大鼠血中HA、LN和IV-C含量的影响

与模型组比较*表示P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
表17 三白草总有效部位对实验性肝纤维化大鼠肝细胞的影响

2.4结果在给药期间正常对照组大鼠无死亡，模型组死亡4只，阳性药组死亡2只，三白草总有效部位高剂量组死亡1只，低剂量组死亡2只。三白草总有效部位可以显著降低肝纤维化大鼠血清中ALT和AST活性，降低MDA、HA、LN、IV-C含量，显著增加ALB含量和SOD活性。三白草总有效部位可以显著降低肝纤维化大鼠肝中TG、Tc、HYP和胶原蛋白含量。明显抑制肝纤维组织增生。
3.结论三白草总有效部位对复合型大鼠肝纤维化有明显的治疗作用。
(四)三白草总有效部位对大鼠盆腔炎的治疗作用1.试验材料1.1动物wistar大鼠雌雄；体重180～220g，购自吉林大学医学院动物室。动物等级II级。合格证编号为2003-000l。
1.2药物与试剂三白草总有效部位为棕褐色粉末，45g生药/g粉。妇炎泰颗粒，远达药业集团哈尔滨一洲制药有限公司产品，批号060401023，10g/袋。功能主治清热解毒，活血化瘀，行气止痛，除湿软坚。用于慢性盆腔炎属于湿热瘀毒蕴结证者，可改善下腹胀痛或刺痛。一次2袋，一日2次。
2.方法和结果2.1对异物置入子宫致大鼠盆腔炎的治疗作用取大鼠50只，留取10只作为空白对照组，其余40只大鼠均戊巴比妥钠皮下麻醉，腹部消毒，于腹部正中线切一小口，找出右侧子宫，在右侧子宫中间剪一小口，置入直径2mm、长0.5cm、重2mg塑料环，缝合子宫。将子宫放回腹腔中，分层关闭腹腔。术后正常饲养3日后，分组给药。模型大鼠，随机分四组，第二组模型对照组，每日灌胃10ml/kg蒸馏水，第三组阳性药组，每日灌胃妇炎泰颗粒10g/kg，第四组三白草总有效部位高剂量组，每日灌胃10.0g(生药)/kg三白草总有效部位，第五组三白草总有效部位低剂量组，每日灌胃5.0g(生药)/kg三白草总有效部位。每日灌胃给药1次，连续四周(28)天。末次给药后禁食12小时，称重，戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，肝素抗凝，测定血液流变学指标，取双侧子宫，分别称重，减去塑料环重量。计算肿胀度。子宫肿胀程度＝右侧子宫重量-左侧子宫重量。取右侧子宫作病理检测。结果见表18、19、20。
病理分级按组织学改变的严重程度分为正常、轻度、中度及重度4级，特制订半定量标准，“-”表示，无明显的实质性变性、坏死，无明显的炎症细胞浸润，无间质结缔组织增生等病理改变；“+”表示，细胞由柱状变为立方状，纤毛部分消失，结缔组织少量增生，有少量炎细胞浸润，管腔少量粘连；“++”表示细胞由柱状变为扁平状，纤毛进一步消失，结缔组织部分增生，有部分炎细胞浸润，管腔部分粘连；“+++”表示细胞上皮和纤毛完全消失，大量纤维细胞增生和炎细胞浸润，管腔严重粘连。
表18三白草总有效部位对大鼠子宫肿胀程度的影响

表19三白草总提取物对盆腔炎大鼠血液流变学指标的影响

与模型组比较*表示P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001表20病理统计表

与模型组比较*表示P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001结果表明三白草总有效部位灌胃给药明显减轻盆腔炎大鼠子宫肿胀程度，降低全血比黏度和血浆比黏度，明显减轻病理损害。
2.2结论三白草总有效部位对置入异物所致的盆腔炎大鼠有明显的治疗作用。
(五)三白草总有效部位对尿路感染的治疗作用1试验材料1.1动物wistar大鼠雄性；体重180～220g，购自吉林大学医学院动物室。动物等级II级。合格证编号为2003-0001。新西兰家兔，雌性，体重2.4±0.2kg，购自中国人民解放军208医院，生产许可证编号为SCXK(军)-2005-005。
1.2药物与试剂三白草总有效部位为棕褐色粉末，45g生药/g粉。尿感宁颗粒(功能主治清热解毒、通淋利尿、用于急性尿路感染，或慢性尿路感染急性发作，属湿热下注证者)为正大青春宝药业有限公司产品，批号0511006。注射用环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司产品，批号0604052l。
1.3菌株O111B4为标准菌株，吉林大学基础医学院提供。108个/ml。
1.4统计学处理数掘均以 表示，用SPSS11.5.0软件包统计，组问比较采用t检验。
1.5仪器XZK-202标准型净化工作台，苏州净化设备厂。YXQ·S646-280S压力蒸汽消毒器，上海博讯实业有限公司产品。(所有试验器具均高压消毒)。
2.试验方法与结果2.1对大鼠尿路感染的治疗作用2.1.1试验方法模型制备取雄性大鼠55只，留10只作为下常对照组。禁水24小时。戊巴比妥钠皮下注射麻醉，解剖台上仰位固定，挤压膀胱后，剪去腹部毛，强力碘消毒，铺无菌巾，用细线结扎大鼠阴茎，无菌条件下，沿腹正中线切开，暴露膀胱，模型组用lml细针头注射器向膀胱内注射O111B4大肠杆菌0.5ml(108/ml)。正常对照组(10只)向膀胱内注射生理盐水。关闭腹腔，2小时后松开结扎阴茎细线。手术后恢复正常饮水。模型大鼠苏醒后，剔除麻醉过量或针头穿透膀胱的大鼠。取40只随机分四组。分别为模型组(10只)，灌胃给予10ml/kg蒸馏水。阳性药组(10只)，灌胃给予尿感宁颗粒2.5g/kg。三白草总有效部位高、低剂量组(各10只)。分别灌胃给予三白草总有效部位10、5.0g(生药)/kg。给药体积均为10ml/kg。每日1次，连续7日。末次给药前，用细线结扎大鼠阴茎，给药体积均为40ml/kg(给药剂量同前)。1小时后处死大鼠。称重。强力碘消毒腹部，剪开腹部，用一次性注射器从膀胱抽取尿液，做尿细菌培养。取两侧肾脏称重，计算脏器指数。取左侧肾和膀胱放入10％甲醛中固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，进行光学显微镜检查。肾脏和膀胱损害程度采用SPSS11.5.0软件，用非参数检验中，等级资料秩和检验统计。P为双侧渐近概率值。结果见表2l、22。
2.1.2结果
表21 三白草总有效部位对大鼠尿液大肠杆菌阳性率的影响

注用SSPS11.5四表格卡方检验统计表22 三白草总有效部位对感染大肠杆菌大鼠肾脏指数的影响

病理检查正常对照组肾脏皮质和髓质界线清晰，小球未见增生或萎缩，小管上皮完好，间质无炎细胞浸润。膀胱由粘膜、肌层和浆膜构成，粘膜层为6～7层移型上皮细胞组成。
模型组肾脏皮质、髓质、间质均可见不同程度炎细胞浸润。膀胱粘膜、肌层均可见不同程度炎细胞浸润，血管也有不同程度的扩张，有的血管充血，个别的有出血。
阳性药组肾盂粘膜及间质炎症较模型组有明显好转。膀胱炎症基本消失，恢复正常。但个别大鼠膀胱仍可见炎细胞浸润。与模型组比有明显好转。
高剂量组31-40号肾盂粘膜及间质炎症较模型组有明显好转。膀胱炎症基本消失，粘膜基本正常，但个别大鼠膀胱仍可见少量的炎细胞浸润和血管充血，与模型组比明显的好转。
低剂量组肾盂粘膜和间质炎症较模型组比有明显好转，但个别鼠肾脏仍可见间质性炎症。膀胱有的炎症基本消失，有的仍有较多的炎细胞浸润，与模型组比有一定的好转。
三白草总有效部位高、低剂量组能明显减少大肠肝菌感染的大鼠尿液中细菌数。对大鼠肾脏指数无明显影响。减轻对大鼠肾脏和膀胱的病理损害。
2.2对家兔尿路感染的影响2.2.1试验方法取雌性家兔40只，随机分5组。每组8只。除正常对照组外所有家兔均耳缘静脉注射环磷酰胺80mg/kg。随后正常对照组灌胃2ml/kg生理盐水，模型对照组灌胃2ml/kg生理盐水，阳性药组灌胃尿感宁颗粒1.25g/kg，三白草总有效部位高、低剂量组分别灌胃5.0、2.5g(生药)/kg三白草总有效部位。禁食禁水6小时后，用导尿管排空家兔尿液，每只家兔用导尿管导入O11184108/ml大肠杆菌1ml，用动脉夹夹住尿道口2小时，再次灌胃给药一次。正常饲养，次日灌胃给药1小时后，记录12小时家兔排尿次数，处死前1小时每只家兔灌胃10ml生理盐水。气栓处死家兔。取两侧肾脏称重，计算脏器指数。取肾脏和膀胱做病理检查。结果见表23。
2.2.2结果表23对感染大肠杆菌家兔肾脏指数和排尿次数的影响

病理检查正常对照组肾脏皮质、髓质清晰，小球未见增生和萎缩，小管未见变性坏死，间质未见炎细胞浸润。膀胱由粘膜、肌层和浆膜组成，粘膜一般由6～7层细胞组成。
模型组肾脏间质有程度不等的炎细胞浸润，炎症模型成立。膀胱粘膜下可见血管充血和少量炎细胞浸润。
阳性药组肾脏间质炎症与模型组比较有明显好转。膀胱基本恢复正常。
高剂量组肾脏间质炎症与模型组比较有明显好转。与模型组比较膀胱恢复正常。
低剂量肾脏间质炎症与模型组比有一定程度好转，个别肾脏仍可见间质炎症。与模型组比膀胱明显恢复，但仍可见少量炎细胞浸润。
三白草总有效部位5.0、2.5g(生药)/kg灌胃给药能够减少大肠杆菌所致尿路感染家兔排尿次数，明显降低家兔肾脏指数，减轻对家兔肾脏和膀胱的病理损害，表现在充血明显减轻，炎细胞数量明显减少。
2.3.结论三白草总有效部位对大肠杆菌所致的大鼠和家兔尿路感染有明显的治疗作用。
(六)三白草总有效部位对乳腺增生的治疗作用1.材料1.1动物昆明种小鼠，体重18～20g，雌雄各半，动物等级贰级。长春生物制品研究所动物室，合格证编号为2006-0001。Wistar大鼠，雌性体重180～220g，动物等级贰级。购自吉林大学基础医学部动物室，2006-0001。
1.2.药物三白草总有效部位45g生药/g粉，棕褐色粉末。芬必得胶囊为中美史克制药有限公司产品，批号06100098。0.3g/粒。苯甲酸雌二醇注射液，天津金耀氨基酸有限公司产品，批号0410051。黄体酮注射液，浙江仙琚制药股份有限公司产品，批号050501。乳癖消片为辽宁好护士药业集团有限责任公司产品，批号060601。每片重0.67g。口服，一日3次，每次3片。主要成份鹿角、蒲公英、昆布、夏枯草、鸡血藤、三七、赤芍、海藻、漏芦、木香、玄参、牡丹皮等15味。功能主治软坚散结，活血消痛，清热解毒。用于痰热互结所致的乳癖、乳痈、症见乳房结节、数目不等、大小形态不一、质地柔软，或产后乳房结块、红热疼痛；乳腺增生、乳腺炎早期见上述症侯者。
1.3试剂盒雌二醇、孕酮、睾酮、泌乳素、促黄体生成激素和促卵泡生成激素同位素试剂盒为北京市福瑞生物工程公司产品。
2.实验方法与结果2.1.三白草总有效部位对冰醋酸所致小鼠扭体次数的影响小鼠按体重随机分四组。第一组正常对照组，灌胃10ml/kg蒸馏水；第二组为阳性药组，灌胃300mg/kg芬必得，第三组三白草有效部位组低剂量组，按7.5g生药/kg灌胃给药；第四组三白草有效部位高剂量组按15g生药/kg灌胃给药；每日一次，连续七日。末次给药后1小时，0.6％冰醋酸腹腔注射，记录15分钟内扭体次数。结果见表24。
表24.三白草总有效部位对冰醋酸所致小鼠扭体次数的影响

结果三白草总有效部位两个剂量组均能明显抑制冰醋酸所致小鼠扭体次数。
2.2.三白草总有效部位对小鼠棉球肉芽肿的影响全部小鼠用35mg/kg戊巴比妥钠麻醉，在每只小鼠下腹中部强力消毒，剪开皮肤，用眼科直镊子将10mg/只高压灭菌棉球植入左右两侧蹊部皮下，缝合皮肤，随机分四组。第一组正常对照组，灌胃10ml/kg蒸馏水；第二组为阳性药组，灌胃300mg/kg芬必得，第三组三白草总有效部位组低剂量组，按7.5g生药/kg灌胃给药；第四组三白草总有效部位高剂量组按15g生药/kg灌胃给药。每日一次，连续10日。第十日拉颈处死小鼠，取出棉球称重后，置烘箱中烘干，70℃、24小时。称干重。干重量减去棉球重量即肉芽组织重量。结果见表25。
表25三白草总有效部位对小鼠棉球肉芽肿的影响

结果三白草总有效部位对小鼠棉球肉芽肿有明显的抑制作用。
2.3.三白草总有效部位对大鼠乳腺增生的影响(1)造模型 留下8只作空白对照组，其余大鼠肌注苯甲酸雌二醇0.5mg/kg，连续21天，继而改为肌肉注射黄体酮5mg/kg，连续5天。
(2)造模型后，取4只大鼠，拉颈处死，取第2、3对乳腺做病理检查，验证模型是否成功。
(3)剩余大鼠，随机分五组，第二组模型对照组，每日灌胃10ml/kg蒸馏水，第三组阳性药组，每日灌胃2.0g/kg乳癖消片，第四组三白草总有效部位高剂量组，每日灌胃10.0g/kg三白草总有效部位，第五组三白草总有效部位低剂量组，每日灌胃5.0g/kg三白草总有效部位。每日灌胃给药1次，连续四周(28)天。末次给药后禁食12小时，称重，戊巴比妥钠麻醉，取2、3对乳腺作病理组织学检查。腹主动脉采血，取血清用于雌二醇、孕酮、泌乳素含量测定。结果见表26。
表26三白草总有效部位对乳腺增生大鼠性激素水平的影响

与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001三白草总有效部位能明显降低乳腺增生大鼠血清中雌二醇含量，增加孕酮含量，对泌乳素有降低趋势。
病理结果模型组大鼠乳腺增生明显，表现在小叶内和小叶间纤维组织增多，腺泡和导管上皮增多，腺腔内可见大量红染的分泌物。经三白草总有效部位治疗的大鼠乳腺腺泡数目和分泌物明显减少，腺泡开始萎缩，导管腔变小，体积变小，表明对乳腺增生大鼠有明显的治疗作用。
3.结论三白草总有效部位灌胃给药对大鼠乳腺增生有较好的治疗作用，同时对慢性增生性炎症有一定的治疗作用。对化学试剂造成腹腔刺激症状有一定的预防作用。
权利要求
1.一种三白草总有效部位，其特征在于该三白草总有效部位是从植物三白草中提取获得的，该总有效部位中总黄酮和总木脂素之和的含量为25％～70％。
2.如权利要求1所述的三白草总有效部位的制备方法，包括下列步骤(1)提取用浓度为0～95％的乙醇作溶剂，将三白草加入重量5～15倍的该溶剂中进行回流提取，合并提取液，滤过，滤液回收溶剂后浓缩；(2)纯化将该浓缩液装于已预先处理好的吸附树脂柱中，先用5～10倍树脂柱体积的水洗，再用5～10倍树脂柱体积、浓度为50～95％的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇后浓缩干燥，精制。
3.如权利要求1所述的三白草总有效部位在制备治疗酒精性肝损伤、非酒精性肝损伤、酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、肝纤维化、尿路感染、盆腔炎、乳腺增生的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及三白草总有效部位及其制备方法及其药物应用，属于制药技术领域，以其为原料制得的新药，及其在预防和治疗酒精性肝损伤、非酒精性肝损伤、酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、肝纤维化、尿路感染、盆腔炎、乳腺增生的药物中的用途。该发明的有益效果是填补了制备三白草总有效部位的空白并扩展了其在医药领域的应用范围，从而提高了该类制剂在国际市场的竞争力。
文档编号A61P15/14GK101019958SQ20071005542
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月19日 优先权日2007年3月19日
发明者王隶书, 刘永宏, 程东岩, 邸琳, 季红, 刘新宇 申请人:王隶书