专利名称：Pge2特异结合的噬菌体环七肽及筛选方法和合成肽的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。
背景技术：
噬菌体技术是一种非常有效的筛选技术，其作用在于模拟表位、鉴别蛋白之间相互作用的主要氨基酸以及开发新的治疗途径(CorteseR等，1994；Trends Biotechnol，1994，12(7)262-267)。此技术针对靶点进行筛选的快速性、特异性、高效性使其得到广泛应用。
前列腺素E2是由二十碳不饱和脂肪酸经环氧化酶降解而成，是前列腺素类中比较重要的一类，它与许多疾病如炎症、风湿、过敏和肿瘤的发生、发展密切相关。近来，它与受体结合之后所引起的信号转导研究受到较多生命科学工作者的重视，也是药物开发关注的靶点所在。前列腺素家族是脂源性自身分泌物，调节着生理系统如心血管系统、胃肠道系统、内分泌系统、呼吸系统以及免疫系统。前列腺素家族有五类，前列腺素E(PGE)，前列腺素D(PGD)，前列腺素F(PGF)，前列腺素I(PGI)和血栓素(TXA2)，它们分别是经过各自的合成酶转换成为稳定的形式。目前为止，前列腺素受体家族一共有九类受体，它们都属于G蛋白耦联受体家族，具有七次跨膜结构，PGE2特定结合EP1、EP2、EP3、EP4受体，PGD2结合DP、FP受体，PGF2α结合FP和EP3受体，而PGI2结合IP，TXA2结合TP受体。最近发现的第九种受体表达在Th2细胞上，称为化学趋化受体同源分子(Hata AN等，2004；Pharmacology & Therapeutics，103147-166)。前列腺素在生理和病理中的作用由多种因素决定，如细胞环境、受体表达的情况、和配基的亲和力以及不同的耦联信号转导途径有关。临床上以PGE2为靶点的治疗主要有非特异性COX阻断剂，NSAID如吲哚美锌，其应用范围主要是炎症、类风湿性关节炎、过敏等。而且现在研究发现NSAID也具有某些抗肿瘤作用，那么，以PGE2作为靶点研究具有一定的可行性及应用性。
发明内容
本发明的目的是提供一种含有特异性环七肽，可与PGE2特异性结合的噬菌体环七肽筛选方法及用途。
本发明的PGE2特异结合的噬菌体环七肽SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5。
本发明的PGE2特异结合的噬菌体环七肽均是由9个氨基酸组成，两端各有一个半胱氨酸形成二硫键，从而形成环状。
本发明PGE2特异结合的噬菌体环七肽的筛选方法a.包被将含有PGE2的乙醇溶液包被酶联板，4℃过夜待乙醇全部挥发；b.淘选以5％牛血清白蛋白于37℃封闭1h；TBST洗板5次，甩掉洗液；加入100μl噬菌体，室温摇床缓慢振荡30min，弃掉未结合的噬菌体；用200μl含0.1％Tween-20的TBST洗板3次，洗去未结合的噬菌体；c.洗脱加入100μl洗脱液，室温下作用20min，摇床温和振荡，洗脱结合于固相化PGE2的噬菌体；d.富集将噬菌体扩洗脱产物，10倍系列稀释，取100ul稀释后的噬菌体加入到250ul对数生长期的细菌BL21中，混匀后再加入到3ml预热的顶层琼脂中，快速铺于LB平皿上，37℃培养4h，对噬菌体板斑进行计数，算出噬菌体滴度；e.下一轮筛选重复步骤a-d；为得到高亲和力的噬菌体，共进行了5轮筛选，逐渐减少PGE2的用量，并逐渐增加Tween-20的量及洗脱时间；第5轮洗脱产物铺板，在固体琼脂板上挑取单个噬菌体斑制备噬菌体原种进行鉴定；f.噬菌体克隆结合活性的ELISA鉴定采用ELISA方法，将100μl的噬菌体加入酶联板，4℃过夜包被，弃去未结合的噬菌体，以0.2％明胶于37℃封闭1h，加入100μlPGE2溶液，37℃反应2h，PBST洗板3次；加1∶10稀释的兔抗PGE2单克隆抗体，37℃反应2h，同前洗板；加入1∶1000稀释的HRP标记的羊抗兔抗体，同前洗板；OPD、H2O2底物液显色10min，3mol/l硫酸终止反应，测A490nm值；以包被噬菌体孔的A值大于阴性对照孔A值的2.1倍作为阳性克隆标准；g.噬菌体克隆的测序扩增以上实验阳性的噬菌体克隆，提取单链DNA，进行PCR，连接到T载体并转化到JM109感受态细胞中，将阳性克隆进行测序。
本发明PGE2特异结合的噬菌体环七肽在治疗类风湿性关节炎药物方面的应用。
本发明利用了PGE2的固相化，在噬菌体环七肽库中筛选到能与之高亲和性、高特异性结合的环七肽。此环七肽系列是以亲和筛选为基础，逐步增加筛选强度如加大洗脱液中TWEEN-20的含量，再减少靶点PGE2用量，增加洗脱时间，并进行多轮筛选等优化措施，增加了获得高亲和力、高特异结合噬菌体克隆的概率。通过与PGE2的结合活性分析，得到的噬菌体克隆大部分都是高度特异的环七肽，并且在测序结果中发现部分克隆有重复序列，而且在不同克隆之间还有保守的氨基酸序列，说明利用噬菌体展示技术可以筛选到与PGE2高度特异行结合、并具有高度亲和力的环七肽序列。在环七肽系列中，由于其特有的环状结构，使其与PGE2的结合位置更灵活。在PBP1-PBP4中，RSK和RTSK中的赖氨酸(R)和苏氨酸(T)是PGE2和其受体结合的两个重要氨基酸，而苏氨酸(T)和丝氨酸(S)由于其相似的结构可以互相取代，那么可以得出，这四个环七肽序列具有相似的功能。而PBP5也因为具有SK结构而具有拮抗PGE2与受体结合的能力，可能会比其他四个环七肽作用稍弱。
此外，经研究发现，在PGE2受体的细胞外区域第二个环中的氨基酸序列对PGE2与受体的结合有重要的影响这样就将两者的结合从点推展到空间结构上，那么，我们通过噬菌体技术得到能够与PGE2结合的环七肽序列，为进一步证实空间上的结合区域研究奠定了基础。此外，通过佐剂性关节炎模型发现，我们得到的环七肽具有抑制类风湿性关节炎的作用。从踝关节肿胀度来看，其与阳性对照药物塞来昔布的作用相当，无论是控制原发性炎症，还是继发性炎症都有很好的疗效，且在不同时间里作用显著；病理学分析则提供了抗炎作用的直接证据。而且通过ELISA方法分析关节浸液中TNF-α和IL-β的含量，发现环七肽可以降低二者的数值，进一步说明其抗炎作用有效。此外，通过体外实验对环七肽的生物学作用进行了机制探讨，发现环七肽可以诱导兔原代滑膜细胞的凋亡，并能抑制由PGE2引起的滑膜细胞的增殖。因此以PGE2为靶点的生物治疗方法则体现了重大的学术价值及潜在的应用价值。
具体实施例方式本发明的PGE2特异结合的噬菌体环七肽SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5。
本发明的PGE2特异结合的噬菌体环七肽均是由9个氨基酸组成，两端各有一个半胱氨酸形成二硫键，从而形成环状。
本发明PGE2特异结合的噬菌体环七肽的筛选方法通过体外对PGE2进行噬菌体肽库的筛选，得到能与PGE2结合的环七肽，并通过大鼠佐剂性关节炎模型，对此药物的生物学作用做进一步鉴定。
1、从噬菌体肽库中筛选能够与PGE2结合的环七肽系列PBPs试剂PGE2为晶美公司产品，噬菌体环七肽库为本室保存(Ph.D.C7C library，库容1.6×1012)，PGE2ELISA检测试剂盒购于苏州血液研究中心，T载体及相关酶类均为TaKeRa产品，受体菌BL21及克隆菌JM109为本室保存。
1.1筛选方法(以下步骤均在超净工作台中进行)a.包被将PGE2溶于无水乙醇，将含有5.0μg PGE2的乙醇溶液包被96孔酶联板条，100μl/孔，4℃过夜待乙醇全部挥发；b.淘选加入5％牛血清白蛋白(BSA)，200μl/孔，37℃封闭1h；弃掉封闭液，每孔加入200μl含0.1％Tween-20的TBST洗板5次，每次1.5min，甩掉洗液，并在滤纸上吸干多余液体；每孔加入100μl噬菌体(1.6×1012PFU/ml)，封口膜封口，室温下摇床缓慢振荡30min，弃掉未结合的噬菌体；每孔用200μl含0.1％Tween-20的TBST洗板3次，洗去未结合的噬菌体，每次都在滤纸上吸干多余液体；c.洗脱每孔加入100μl洗脱液(1％SDS)，封口膜封口，摇床温和振荡，室温下作用20min，洗脱结合于固相化PGE2的噬菌体；d.富集将噬菌体洗脱产物(扩增产物)10倍系列稀释(101、102、103、104、105、106等)，取100ul稀释后的噬菌体加入到250ul对数生长期的细菌BL21中，混匀后再加入到3ml预热的顶层琼脂中，快速铺于LB平皿上，37℃培养4h，对噬菌体板斑进行计数，算出噬菌体滴度。
e.下一轮筛选重复步骤a-d；为得到高亲和力的噬菌体，共进行了5轮筛选，逐渐减少PGE2的用量，并逐渐增加Tween-20的量及洗脱时间；第5轮洗脱产物铺板，在固体琼脂板上挑取单个噬菌体斑制备噬菌体原种进行鉴定；五轮筛选过程中PGE2的量分别为5.0μg、2.5μg、1.0μg、1.0μg、1.0μg，噬菌体与PGE2的结合时间分别为30min、20min、17min、15min、13min；TBST浓度(即含Tween-20的量)分别为0.1％、0.2％、0.2％、0.3％、0.4％；而洗脱时间则为20min、20min、20min、23min、25min。
表1 用PGE2筛选噬菌体环七肽库的条件
f.噬菌体克隆结合活性的ELISA(酶联免疫吸附试验)鉴定采用ELISA方法，将第5轮得到的噬菌体加入酶联板，100μl/孔，4℃过夜包被，弃去未结合的噬菌体；以0.2％明胶于37℃封闭1h，200μl/孔；弃掉封闭液，每孔加入100μlPGE2溶液，37℃反应2h，每孔用200μl0.1％PBST洗板3次；每孔加入1∶10稀释的兔抗PGE2单克隆抗体，37℃反应2h，弃掉未结合的一抗，同前洗板；再在每孔中加入1∶1000稀释的HRP标记的羊抗兔抗体，弃掉未结合的二抗，同前洗板；加入OPD、H2O2底物液，100μl/孔，显色10min；每孔加入3mol/l硫酸50μl终止反应，测A490nm值(读取490nm处吸光值，从而检测出阳性噬菌体克隆)。以包被噬菌体孔的A值大于阴性对照孔A值的2.1倍作为阳性克隆标准。23个克隆中有21个为阳性克隆，说明通过此筛选过程得到了高特异性、高亲和力的环七肽。
g.噬菌体克隆的测序扩增以上实验阳性的噬菌体克隆，10mMEDTA(PH8.0)溶解噬菌体提取单链DNA，进行PCR，T7上游引物为5’GGAGCTGTCGTATTCCAGTC 3’，下游引物5’AACCCCTCAAGACCCGTTTA 3’，反应条件热启动到80℃，加入DNA聚合酶，94℃50sec，50℃1min，72℃1min，35个循环，72℃延伸6min。1％琼脂糖电泳鉴定后，将PCR产物连接到T载体转化到JM109感受态细胞中，挑取单克隆后送上海生工公司进行测序。结果发现部分克隆有重复序列，而且在不同克隆之间还有保守的氨基酸序列，最终得到5个不同的噬菌体克隆(见表2)，将其命名为PBPs(PGE2Binding Peptides)。
表2 利用噬菌体展示技术筛选到的环七肽序列
本发明PGE2特异结合的噬菌体环七肽在治疗类风湿性关节炎药物方面的应用。
1、环七肽在治疗类风湿性关节炎中的作用(以环七肽PBP3为例，环七肽PBP1、PBP2、PBP4、PBP5在治疗类风湿性关节炎中的作用均与PBP3完全相同)1.1获得环七肽PBP3的实现方法是根据目前的文献报道，通过分析PGE2受体的结构，PGE2与受体结合的主要氨基酸为精氨酸(R)和苏氨酸(T)，因此我们选择了能够与受体竞争结合PGE2的环七肽序列进行合成，序列为PBP3。
1.2PBP3抑制大鼠佐剂性关节炎的形成实验Wistar大鼠于左后足跖内皮下注射0.1ml完全弗氏佐剂致炎，给予0.5ml的环七肽水溶液40μg/kg、20μg/kg、10μg/kg，并设阴性对照(生理盐水)和阳性对照(塞来昔布)。每天一次，连续21天。每三天量取后足踝关节周径，以前后差值作为肿胀度。并通过大鼠右侧踝关节病理HE染色切片分析炎症的变化情况。
1.3PBP3抑制炎性细胞因子TNF-α和IL-β的分泌实验ELISA方法检测大鼠右足关节浸液中TNF-α和IL-β的含量，根据标准曲线计算TNF-α和IL-β的量。
2、PBP3诱导滑膜细胞凋亡实验取原代兔滑膜细胞，培养至3-5代，收集细胞，调细胞数为7×104，接种于6孔板中，2ml/孔，贴壁24h后，加入环七肽40μM，以塞来昔布和地塞米松为对照，37℃，5％CO2孵箱培养72h后，Hoechst染色30min，PBS洗两次，4％多聚甲醛固定10min，PBS洗两次，滴加一滴甘油封片后荧光显微镜观察拍照。
3、PBP3抑制滑膜细胞增殖实验收集原代兔滑膜细胞，调细胞数为1×104，接种于96孔板中，100μl/孔，贴壁24h后，加入环七肽10μM、20μM、40μM、80μM，并加入相同浓度的塞来昔布作为对照，37℃，5％CO2孵箱培养72h后，采用MTT法观察环七肽对滑膜细胞增殖的抑制作用。
环七肽可抑制类风湿性关节炎的形成试剂细胞因子ELISA试剂盒购于深圳达克为公司，完全弗氏佐剂为北京鼎国公司产品，塞来昔布为辉瑞制药有限公司产品，其余为实验室常用试剂。
1、环七肽抑制大鼠佐剂性关节炎的形成Wistar大鼠随机分为6组，每组6只。其中5组为模型组，于左后足跖内皮下注射0.1ml完全弗氏佐剂，另一组为正常对照组，注射等量的生理盐水。7天后，模型组中，三组分别给予0.5ml的环七肽水溶液40μg/kg、20μg/kg、10μg/kg，阳性对照组腹腔注射celecoxib水溶液0.5ml，12.5mg/kg，阴性对照组为腹腔注射等量生理盐水。每天一次，连续21天。每三天量取后足踝关节周径，以前后差值作为肿胀度。环七肽可以抑制大鼠炎症的继续发展，在控制原发性和继发性病变上具有很好的作用。
2、病理学改变常规方法制备大鼠右侧踝关节病理切片，在有代表性的标本中，通过HE染色可见右侧关节结构已经肿胀并且在模型组中表现明显，而在治疗组中则被很好的抑制。模型组表现了明显的关节炎病理学改变，包括纤维沉积在滑膜的表面，淋巴细胞和巨噬细胞浸润，滑膜下层有小血管扩张，内皮细胞肿胀、细胞间隙增大，间质有水肿和中性粒细胞浸润。当病变进入慢性期，滑膜变得肥厚，形成许多绒毛样突起，又称血管翳，它具有很强的破坏性，突向关节腔内或侵入到软骨和软骨下的骨质。相比之下，由环七肽和塞来昔布治疗组则没有表现血管翳的形成和关节的破坏。因此通过病理学HE染色发现环七肽具有抑制关节炎形成的作用。
3、ELISA方法检测大鼠右足关节浸液中TNF-α和IL-β的含量按试剂盒所示方法进行检测，测A450nm和A570nm值，以两者差值作为吸光度，绘制标准曲线，根据标准曲线计算TNF-α和IL-β的量。发现环七肽组均有抑制关节炎的作用，关节肿胀度与模型组比较均有统计学差异，P＜0.05。而在剂量组中，三组效果均显著，但没有剂量依赖性。此外，在关节浸液中前炎症性细胞因子IL-1β也由原来的1133.89pg/ml降到了534.35pg/ml，几乎达到正常水平。而对于TNF-α，虽没有IL-1β那样明显，但也能看到有降低现象，与模型组比较均有统计学差异，P＜0.05，在此均没有体现剂量依赖性(见表3)表3关节浸液中细胞因子的浓度(x±s，n＝6)
▲P＜0.05 compared with normal control group；*P＜0.05 compared withmodel control group环七肽生物学活性的体外检测试剂地塞米松(5mg/ml江苏扬州制药厂)，Hoechst33342染料为Sigma公司产品。
1、环七肽诱导滑膜细胞凋亡实验取原代兔滑膜细胞，培养至3-5代，收集细胞，调细胞数为7×104，接种于6孔板中，2ml/孔，贴壁24h后，分别加入环七肽40μM，塞来昔布80μM，并以5μl地塞米松作为阳性对照。以80μM塞来昔布为对照并以不加任何药物的培养孔为阴性对照，37℃，5％CO2孵箱培养72h后，弃掉培养液，加入2ml新鲜培养液，再加入Hoechst33342染料，终浓度为10ug/ml，染色30min，PBS洗两次，4％多聚甲醛固定10min，PBS洗两次，滴加一滴甘油封片后荧光显微镜观察拍照。我们可以观察到特异性环七肽可以诱导兔原代滑膜细胞的凋亡，荧光图片中可见核变形、核固缩等现象，与阴性对照组比较具有明显的差异，而地塞米松作则具有明显的诱导凋亡作用。
2、环七肽抑制滑膜细胞增殖实验收集原代兔滑膜细胞，调细胞数为1×104，接种于96孔板中，100μl/孔，贴壁24h后，加入环七肽10μM、20μM、40μM、80μM，并加入相同浓度的塞来昔布作为对照，37℃，5％CO2孵箱培养72h后，采用MTT法观察环七肽对滑膜细胞增殖的抑制作用。可以发现环七肽可以抑制兔原代滑膜细胞的增殖，并呈一定的剂量依赖性，而且与阳性对照组即塞来昔布组作用相当；而且我们用了外源性PGE2，浓度100pg/ml，再加入环七肽溶液，浓度为20μM、40μM、80μM，可以发现环七肽中和了一部分外源的PGE2，而阻断内源性PGE2的促增殖作用减弱。
<110>长春博泰医药生物技术有限责任公司<120>PGE2特异结合的噬菌体环七肽及筛选方法和合成肽的用途<130>5<160>5<170>PatentIn version 3.4<210>1<211>9<212>PRT<213>T7phage<400>1Cys Asp Gly Asp Arg Arg Ser Lys Cys1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>T7phage<400>2Cys Lys Gly Ser Gly Arg Ser Lys Cys1 5<210>3<211>9<212>PRT<213>T7phage<400>3Cys Ala Asn Arg Thr Ser Lys Asn Cys1 5<210>4<211>9<212>PRT<213>T7phage<400>4Cys Ala Asn Arg Thr Ser Lys Ala Cys1 5<210>5
<211>9<212>PRT<213>T7phage<400>5Cys Ser Lys Pro Val Lys Thr Ala Cys1 5<110>长春博泰医药生物技术有限责任公司<120>PGE2特异结合的噬菌体环七肽<160>5<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>9<212>DNA<221>gene
<222>(1)..(9)<400>1C D G D R R S K C
权利要求
1.一种PGE2特异结合的噬菌体环七肽SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5。
2.根据权利要求1所述的PGE2特异结合的噬菌体环七肽，其特征在于由9个氨基酸组成，两端各有一个半胱氨酸形成二硫键，从而形成环状。
3.一种PGE2特异结合的噬菌体环七肽SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5的筛选方法，其特征在于a.包被将含有PGE2的乙醇溶液包被酶联板，4℃过夜待乙醇全部挥发；b.淘选以5％牛血清白蛋白于37℃封闭1h；TBST洗板5次，甩掉洗液；加入100μl噬菌体，室温摇床缓慢振荡30min，弃掉未结合的噬菌体；用200μl含0.1％Tween-20的TBST洗板3次，洗去未结合的噬菌体；c.洗脱加入100μl洗脱液，室温下作用20min，摇床温和振荡，洗脱结合于固相化PGE2的噬菌体；d.富集将噬菌体扩洗脱产物，10倍系列稀释，取100ul稀释后的噬菌体加入到250ul对数生长期的细菌BL21中，混匀后再加入到3ml预热的顶层琼脂中，快速铺于LB平皿上，37℃培养4h，对噬菌体板斑进行计数，算出噬菌体滴度；e.下一轮筛选重复步骤a-d；为得到高亲和力的噬菌体，共进行了5轮筛选，逐渐减少PGE2的用量，并逐渐增加Tween-20的量及洗脱时间；第5轮洗脱产物铺板，在固体琼脂板上挑取单个噬菌体斑制备噬菌体原种进行鉴定；f.噬菌体克隆结合活性的ELISA鉴定采用ELISA方法，将100μl的噬菌体加入酶联板，4℃过夜包被，弃去未结合的噬菌体，以0.2％明胶于37℃封闭1h，加入100μlPGE2溶液，37℃反应2h，PBST洗板3次；加1∶10稀释的兔抗PGE2单克隆抗体，37℃反应2h，同前洗板；加入1∶1000稀释的HRP标记的羊抗兔抗体，同前洗板；OPD、H2O2底物液显色10min，3mol/l硫酸终止反应，测A490nm值；以包被噬菌体孔的A值大于阴性对照孔A值的2.1倍作为阳性克隆标准；g.噬菌体克隆的测序扩增以上实验阳性的噬菌体克隆，提取单链DNA，进行PCR，连接到T载体并转化到JM109感受态细胞中，将阳性克隆进行测序。
4.PGE2特异结合的噬菌体环七肽在治疗类风湿性关节炎药物方面的应用。
全文摘要
一种PGE
文档编号A61K38/08GK101041687SQ200710055379
公开日2007年9月26日 申请日期2007年2月28日 优先权日2007年2月28日
发明者朱迅, 闫东梅, 杜柏榕 申请人:长春博泰医药生物技术有限责任公司