专利名称：苏木有效部位群的药物新用途的制作方法
技术领域：
本发明属于苏木有效部位群的一种药物新用途，具体是作为抗器官移植排斥反应免疫抑制剂的应用。
背景技术：
随着医学的发展和免疫学研究的不断深入，人们逐渐认识到免疫系统异常与人类众多疾病的发生均有密切的关系。临床工作中常常需要使用大量的免疫抑制剂，尤其是接受器官移植的病人，需要终生服用。
临床开展器官移植已有40余年的历史，在早期因为排斥反应的困扰进展缓慢。自1978年环孢素A在临床上应用之后，使器官移植发生了革命性变化。现在临床常用的免疫抑制剂有4大类①化学合成细胞毒类(抗代谢剂和烷化剂)，主要代表为硫唑嘌呤、霉酚酸酯(MMF)；②抗生素类(微生物产生的制剂)；③肾上腺皮质激素类；④生物制剂类，国内外应用的免疫抑制剂是以环胞素A(CsA)、雷帕霉素、他克莫司(FK506)为代表的生物制剂类药物。这些免疫抑制剂共同的作用特点①大多数药物缺乏选择性和特异性，对正常和异常的免疫反应均有抑制作用，长期应用，除各药特有的毒性外，易降低机体抵抗力而诱发感染及肿瘤发生率增加等。②对初次免疫应答反应抑制作用较强，对再次免疫应答反应抑制作用较弱。而且常规免疫抑制剂的剂量难以控制，剂量小不足以保护移植物不受排斥，剂量大则机体难以耐受，况且有些药物目前仍需进口，价格昂贵，限制了接受器官移植的病人的长期应用。
由于我国中草药资源丰富、价格低廉、毒副作用低等特点，国内学者把研究开发新型免疫抑制剂的重点转向了中草药。自70年代末以来，对中药抗免疫排斥作用进行了大量的工作，显示了一定疗效。现主要应用的是雷公藤多甙和冬虫夏草，但都有其不足之处，如雷公滕多甙的毒副作用主要是白细胞减少、血小板减少、男性病人精子减少，少数病人可出现嗜睡、乏力等症状，有些毒副作用还有待于进一步研究。如果作为常规用药，还需进一步研究有效成分的化学结构，并加以提纯、分离。而冬虫夏草主要表现为不同的提取方法，显示出不同的药理作用，因此，应用于临床还需做大量的工作。
发明内容
本发明的目的是提供一种苏木有效部位群的药物新用途—用作抗器官移植排斥反应免疫抑制剂，与现有技术相比，它具有毒副作用小，价格低廉、可以作为常规用药的特点。
本发明的技术方案本发明是将苏木有效部位群用作抗器官移植排斥反应的免疫抑制剂。
本发明可延长移植心脏的存活时间，减轻排斥反应对器官所致的免疫损伤，毒副作用小，价格低廉，可以作为常规用药。
下面是动物实验数据一、实验材料1 实验动物C57BL/6小鼠，雄性，20～25g；BABL/C小鼠，雄性，20～25g；Wistar大鼠，雄性，160～190g；SD大鼠，雄性，250～300g。Wistar大鼠购自于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心，其余动物购自哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心。实验动物在通风、温度、湿度适宜的动物室内饲养。
2 主要仪器2k-828型真空干燥箱，上海医疗仪器总厂；超净工作台，苏州净化设备厂；300型CO2培养箱，Sheldon Manufacturing.IncAllegna 21RCentrifuge离心机，Beckman；SXP-1B型双人双目显微镜，上海光学仪器厂；SSW-3型显微手术器械包，上海医疗仪器厂3 实验用药3.1环胞素A将新山地明(瑞士山德士药厂生产，每粒含CsA25mg)溶于生理盐水，稀释至1mg/ml浓度，4℃保存备用。
苏木水提液的制备苏木，购自黑龙江省药材公司，产地云南，经生药鉴定。浸泡1小时后，水煎三次，每次40分钟，煎液混合后水浴(80℃)浓缩成1.75g/ml浓度，4℃保存备用。
3.2 苏木有效部位群的制备将苏木粗粉(40目)放入4颈烧杯中，加入75％乙醇浸泡4h，加热至85℃，连续回流提取2h，过滤；反复2次，将滤液合并，一部分抽入旋转蒸发器中水浴蒸干，转入真空干燥箱中烘干至恒重，制成乙醇提取干粉。
对剩余的75％乙醇提取物依次用乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，得到各部分萃取物，连同分离出的水层，分别按照前法制成乙酸乙酯、正丁醇和水溶性成分干粉。
此外还可以采用下述方法煎煮法将苏木粗粉(过40目)用8倍量的水浸泡4h，连续回流提取两次，每次2h，过滤，将滤液合并，将滤液浓缩至相对密度1.00-1.05，依次用醋酸乙酯、水饱和正丁醇萃取得到各部分萃取液，，分别回收溶剂制成醋酸乙酯、正丁醇、水溶性成分的干膏。
超声振荡提取将苏木粗粉(过40目)用8倍量的75％乙醇浸泡2h，连续超声振荡提取两次，＜50℃每次2h，过滤，将滤液合并，减压回收乙醇，并干燥至恒重，制成75％乙醇提取物。
取75％乙醇提取物，水混悬后依次用醋酸乙酯、水饱和正丁醇萃取得到各部分萃取液，连同剩余的水层，分别回收溶剂制成醋酸乙酯、正丁醇、水溶性成分的干膏。
渗漉法将苏木粗粉(过40目)用75％乙醇连续渗漉提取，收集渗漉液，减压回收乙醇，并干燥至恒重，制成75％乙醇提取物。
取75％乙醇提取物，水混悬后依次用醋酸乙酯、水饱和正丁醇萃取得到各部分萃取液，连同剩余的水层，分别回收溶剂制成醋酸乙酯、正丁醇、水溶性成分的干膏。
超临界萃取法苏木粗粉(过80目)SFE条件萃取罐温度70℃，萃取压力45MP，CO2流量25kg/h，萃取时间2.5h，夹带剂为95％乙醇比例不超过15％。提取物待测。
3.3 苏木乙醇提取干粉灌服液的制备将乙醇提取干粉60g加入双蒸水200ml混悬，制成30％的苏木灌服液备用。
二、试验方法1 药品的制备乙醇、乙酸乙酯、正丁醇和水溶性成分干粉水溶，浓缩配成每毫升含主药1g。
2 混合淋巴细胞反应试验(MLR)
2.1 脾细胞悬液的制备①小鼠放血处死，取脾称重，放入盛有冷的5～10ml HBS平皿中不绣钢网上，剔除脂肪组织和结缔组织。
②将脾剪成两段，轻轻碾碎，使单个脾细胞经不锈钢网进入溶液中，再经不锈钢网过滤至离心管。
③离心1500r，5分钟后弃上清，低渗处理除去红细胞。
④用HBSS液洗涤细胞2～4次，加入10％NBS-RPMI-1640培养液1～2ml，细胞计数及测定细胞的存活率。
2.2 MLR实验①刺激淋巴细胞制备C57BL/6小鼠脾细胞做刺激细胞，将淋巴细胞1×106/ml加入丝裂霉素C处理，最终浓度为25μg/ml，于37℃水浴下作用30min，1000r/min离心10min，弃上清，沉淀细胞用Hanks液洗涤3次。用BALB/c小鼠脾细胞做应答细胞，调整细胞浓度为1×106/ml。
②将4种药物离心2000rpm，无菌过滤，备用。
③将4种药液分别用1640培养液作倍比稀释1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048。
④取刺激细胞和反应细胞各50μl加入96孔培养板上，加入100μl含药20％NBS-RPMI-1640培养液中，每组均设3各复孔。另以不含药物的1640培养液作为空白对照组。混合细胞在CO2培养箱中培养72h。
⑤收集前4h加入氚标记的胸苷2μCi。
⑥反应终溶液收集到纤维滤纸上，干燥后用液体闪烁器记cpm值。
3 苏木乙醇提物抗大鼠同种异位心脏移植的模型制备大鼠同种异位心脏移植术，采用Ono氏改良术式，将供心的升主动脉和肺主动脉分别与受体的腹主动脉和下腔静脉行端侧吻合，为移植心脏提供血液循环。虽然供体心脏不具有心脏本身的功能，但由于有充分的血液供应，并能存活一定的时间，可以作为研究急性排斥反应的发生机制、以及对其进行防治等方面较理想的动物模型。
3.1 实验分组及处理将术后清醒(约2h内)能站立，移植心跳有力且24h内不停跳着作为实验动物模型。将上述大鼠随机分为5组，每组5只。第一组为SD对照组，除正常喂养外，灌服同体积生理盐水。第二组环孢素组，术后24h后按40mg/kg灌服环孢素溶液。第三组为苏木水提组，术后24h后按生药17.5g/kg灌服苏木水提液。第四组为苏木乙醇提物组，术后24h后灌服苏木乙醇提取干粉配制成30％灌服液(按生药17.5g/kg)。第五组为模型对照组，手术后24h给同体积的生理盐水，连续灌服11d后，消毒、铺分别处死动物。
3.2 标本的采集实验期满，将动物经戊巴比妥钠40mg/kg麻醉，常规固定、巾等处理。沿正中线剪开腹壁，快速用180℃、12h处理过的手术剪剪取心肌约400mg左右，分别用液氮速冻，-70℃低温冰箱保存备检。
三、实验结果1、苏木有效部位群免疫抑制作用的筛选研究结果表明苏木各部位群均有一定的免疫抑制作用，除水提物组外，其余各组随浓度的增高而免疫抑制作用加强。其中乙醇组和正丁醇组呈现良好的平行关系，乙酸乙酯组也表现出明显的免疫抑制作用，水提物组虽然具有一定的作用，但是高浓度组与低浓度组的差异性未能显示出有统计学意义。见表1。
表1 各组对单向混合淋巴细胞培养试验的影响(x±S，n＝3)cpm值组别药物浓度 1∶2048 1∶1024 1∶512 1∶256 1∶128乙醇组3065±14141589±6661581±6331014±350*822±193*乙酸乙酯组1805±207 1069±429*1138±121*1120±169*966±185**正丁醇组 2334±336 1737±8041590±2521119±553*1015±315*水提物组 2230±880 1316±4251252±4381191±3471317±256各组组内与12048组相比，*P＜0.05；**P＜0.012 苏木乙醇提物对大鼠同种异位心脏移植的影响2.1 心肌病理形态学改变实验模型组的移植心一般在5-7天时，心搏触及不明显，待11天处死动物时，可见心脏肿大，呈花斑状，低倍镜下心肌细胞水肿明显，并有片状坏死和出血；高倍镜下大量炎细胞浸润，心肌纤维化，大量单核细胞浸润。提示排斥反应较重，且体液免疫排斥反应也参与了急性排斥反应，这种结果与人类的排斥反应相似。
CsA组的移植心处死时，心搏仍然有力，且表面光滑红润，低倍镜下可在心内膜下见有局灶性炎细胞浸润，周围无明显水肿；高倍镜下心肌细胞结构完整，横纹清晰。说明CsA可以明显减轻排斥反应，延长移植物的存活时间，是目前抑制排斥反应的良药。然而动物的一般状态较面光差，可见CsA对动物的损伤和毒副作用也较明显。
苏木水提组的移植心在11天时，仍可见有力的心搏，且表滑，光镜下虽可见较明显炎细胞和淋巴细胞的浸润、心肌细胞变性和周围水肿，而未见有心肌细胞的坏死，提示中药苏木水煎剂对急性排斥反应的发生、发展有一定的抑制作用，对心肌的损伤也有一定的保护作用。动物的一般状态尚可，未见有明显的毒副作用。
苏木乙醇提物组移植心在11天时，仍可见心搏有力，移植心处死时，心脏表面光滑红润，低倍镜下心肌细胞结构轻微改变，心内膜下有炎细胞浸润；高倍镜下见有少量淋巴细胞、单核细胞浸润，部分心肌横纹模糊。说明苏木乙醇提物对急性排斥反应具有一定的抑制作用，对心肌损伤也有一定的保护作用。动物的一般状态较好，未见有明显的毒副作用。
SD大鼠组仅见有炎细胞的浸润，心肌和血管均未发生明显的改变，提示同种SD个体之间心脏移植后不发生急性排斥反应，但由于手术的过程也有创伤，故可见有一定的炎性反应。
2.2 心肌凋亡的影响实验各组均可见到不同程度的心肌细胞凋亡。模型组可见大量胞核呈棕黄色的凋亡细胞；苏木水提组、苏木乙醇提物组、CsA组也有一定数量的细胞凋亡。SD大鼠组仅有极少量的细胞凋亡。各组凋亡指数见表2。
各组心肌细胞凋亡指数表2(x±S)模型CsA 苏木乙醇提物组 苏木水提组N 5 5 55AI 54±4.1114.8±2.91*23.0±2.4*#27.6±2.1*#*与模型组相比，P＜0.01；#与CsA组相比，P＜0.01从上表可以看出，CsA组、苏木水提组、苏木乙醇提物组与模型组相比心肌细胞凋亡水平明显下降，而CsA组又低于苏木水提组、苏木乙醇提物组；CsA组、苏木水提组、苏木乙醇提物组与模型组相比心肌凋亡水平差异有显著性(P＜0.01)；而CsA组疗效又要优于苏木水提组、苏木乙醇提物组(P＜0.01)。
本实验研究结果表明，与模型组相比，苏木水提组、苏木醇提物组可以显著抑制心肌细胞凋亡，但是与CsA相比效果略差。提示苏木乙醇提物可以抑制移植心肌的细胞凋亡。
四、实验结论1、苏木的乙醇提取部分(有效部位群)及其经有机溶剂提取得到的乙酸乙酯部分、正丁醇部分、水部分均具有明确的免疫抑制作用，其中乙醇部分与正丁醇部分作用最强。
2、苏木乙醇提取部分可减轻大鼠心肌组织细胞凋亡，这可能是苏木减轻大鼠心脏移植后排斥反应的程度机制之一。
3、苏木乙醇提取部分可延长大鼠同种异位移植物的存活天数，减轻其病理组织学损害，未见有明显的毒副作用。
权利要求
1.一种苏木有效部位群的药物新用途，其特征在于是用作抗器官移植排斥反应的抑制制剂。
全文摘要
本发明是一种苏木有效部位群的药物新用途，具体是作为抗器官移植排斥反应抑制制剂的应用，本发明可延长移植心脏的存活时间，减轻排斥反应对器官所致的免疫损伤，毒副作用小，价格低廉，可以作为常规用药。
文档编号A61P37/00GK1593469SQ0313260
公开日2005年3月16日 申请日期2003年9月10日 优先权日2003年9月10日
发明者周亚滨, 王振月 申请人:周亚滨, 王振月