专利名称：豆腐果苷－石杉碱甲缩醛亚胺,其制备方法和其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及新颖的豆腐果苷-石杉碱甲缩醛亚胺化合物，其制备方法，以化合物为活性成分的药物组合物，及它在制备抑制乙酰胆脂酶活性的药物中的应用。
背景技术：
随着世界人口平均寿命的逐年增加，老年性痴呆症的发病率也随着迅速上升，老年痴呆症中有50％-70％为阿尔茨海默氏病(AD)，阿尔茨海默氏症又称早老年性痴呆症，患者的脑功能逐渐率退，出现记忆力、抽象思维能力和语言表达能力减退、行动不便和其它功能性障碍，影响神经系统功能，最终导致死亡。AD是一种以进行性认知和记忆力损伤为主的中枢神经系统退行性疾病，估计全球世界阿尔茨海默氏病发病人数高达1200多万。在发达国家此病是继心血管病和肿瘤之后引起死亡的主要疾病。治疗AD的药物主要有胆碱能类药物、神经细胞代谢增强剂、抗氧化剂、钙离子拮抗剂、神经生长因子、雌激素、抗炎药、抗β淀粉样蛋白药物等。目前临床上治疗该病最成功的方法就是通过提高中枢神经系统内胆碱能神经递质——乙酰胆碱的水平，改善AD病人的症状。其中针对的通过抑制AChE对乙酰胆碱的降解作用而提高脑内的乙酰胆碱的水平，是改善症状的有效途径。临床上有效的药物如他克林(Cognex，tacrine)，安理申(Aricept，donepezil)，艾斯能(Exelon，rivastigmine)，加兰他敏(Reminyl，galantamine)和石杉碱甲(Hup A)均为乙酰胆碱酯酶抑制剂，它们能有效升高脑内乙酰胆碱水平，使人的认知功能得以改善。而作为乙酰胆碱酯酶抑制剂的著名天然产物石杉碱甲，其药效得到了临床的充分肯定，在此基础上中国科学院上海药物研究所合成一系列石杉碱甲的衍生物，发现了一个新型的抗老年痴呆的治疗药物“希普林”，目前在欧洲进入了三期临床，预计2-3年以后可以得到批准上市。希普林是作为前药，对AChE抑制剂活性和石杉碱甲相当，选择性略高，但生物利用度明显提高。
迄今为止，现有技术中未有豆腐果苷的石杉碱甲衍生物的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种豆腐果苷的石杉碱甲衍生物即豆腐果苷-石杉碱甲缩醛亚胺化合物，其制备方法，以化合物为活性成分的药物组合物，及它在制备抑制乙酰胆脂酶活性的药物中的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案如结构式(I)所示的豆腐果苷-石杉碱甲缩醛亚胺。
本发明同时提供了制备式(I)化合物的方法，取石杉碱甲，置于带有冷凝管的三径瓶中，加入无水乙醇搅拌并溶解；另取豆腐果苷溶于无水乙醇中，加入三乙胺混合均匀后，缓慢滴入三径瓶中，混合液磁力搅拌并在50℃-55℃加热1小时，冷却至室温，减压浓缩，经硅胶柱层析即可。
本发明的用于抑制乙酰胆脂酶活性的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1豆腐果苷-石杉碱甲缩醛亚胺化合物和/或药学上可接受的载体。
本发明还提供了豆腐果苷-石杉碱甲缩醛亚胺化合物在制备抑制乙酰胆脂酶活性药物中的应用。
本发明技术方案的提出是受到希普林化学结构的启发，凭借对天然化合物的结构及活性特点，试图制备豆腐果苷的石杉碱甲衍生物，预期应该具有显著的乙酰胆碱酯酶抑制活性，以及更加广泛的对神经系统的活性。试验结果符合预期期望。
本发明化合物用作药物时，可以加赋形剂以适当制剂直接使用，或与其他药物组成复方制剂使用。其余为药物学上可接受的对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。药用载体或赋形剂是药物学上可接受的对人和动物无毒和惰性的固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经注射(静注、肌注)和口服两种形式给药。使用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化进行一次或多次使用。对成人来说，给药量每天1～100mg比较合适。
本发明化合物豆腐果苷-石杉碱甲缩醛亚胺涉及的天然产物原料及其来源1)豆腐果苷(Hel)豆腐果苷(神衰果素，Helicid)，化学结构为4-甲酰苯基-β-D-吡喃阿洛糖苷(4-formylpheny-β-D-allopyranoside)，是一种从我国云南山龙眼科植物豆腐渣果(Helicia nilagirica Beed)果实中提取分离得到的有效成分，是一种天然产物中比较罕见的阿洛糖酚苷单体化合物。经大量药理和临床研究证明豆腐果苷具有止痛、安眠和镇静作用，而被用于神经衰弱、神经衰弱综合症、失眠及血管神经性头痛等症。
豆腐果苷的提取纯化工艺豆腐渣果生药粉，用冷水浸泡数小时后，加水煎煮3次，每次1小时，过滤，合并滤液，减压蒸发成小体积，再加95％乙醇到溶液含醇量大于75％，放置5-6小时，过滤(残渣用乙醇洗涤2-3次)，取清夜与洗涤液回收乙醇后，静置，析出类白色晶体，粗晶体用90％乙醇回流，加入0.5％活性碳脱色，趁热过滤，滤液静置48个小时，析出晶体，过滤，干燥，得0.4-0.5％的豆腐果苷纯品，可作为药品原料。目前国内有数十家制药企业在生产豆腐果苷为有效成分的治疗药物。
豆腐果苷的表征豆腐果苷为白色针状结晶或结晶性粉末，无臭，味微苦；分子式C13H16O7，分子量284.27；溶于热水，水、甲醇中微溶，乙醇中溶解度极微，乙醚、氯仿中基本不溶；熔点190-198℃UVλmax280nm豆腐果苷的NMR数据1H NMRδ7.85(1H，d，J＝9.2，2-H)，7.22(1H，d，J＝8.7，3-H)，7.22(1H，d，J＝8.7，5-H)，7.85(1H，d，J＝9.2，6-H)，9.85(1H，s，7-H)，5.38(1H，J＝7.8，1’-H)，3.70(1H，m，2’-H)，3.86(1H，m，3’-H)，3.62(1H，m，4’-H)，3.88(1H，m，5’-H)，4.15(1H，m)；3.86(1H，m)(6’-2H)13C NMRδ132.6(s，C-1)，132.8(d，C-2)，117.9(d，C-3)，164.3(s，C-4)，117.9(d，C-5)，132.8(d，C-6)，192.9(s，C-7)，99.8(d，C-1’)，72.1(d，C-1’)，73.0(d，C-3’)，68.8(d，C-4’)，76.0(d，C-5’)，63.0(t，C-6’).
化学结构 化学名称4-甲酰苯基-β-D-吡喃阿洛糖苷(4-formylpheny-β-D-allopyranoside)2)石杉碱甲(HupA)石杉碱甲[(-)Huperzine A]是20世纪80年代我国学者从民间草药蛇足石杉(千层塔)(Huperzia serrata)发现的一种新型石松生物碱类有效成分单体；并于90年代一些学者成功开发成为治疗阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的天然药物，商品名为“双益平”。与国际上同类AD治疗药物相比，石杉碱甲的化学结构具有特异性，具有非常显著的抑制脑内乙酰胆碱酯酶和增强脑内胆碱能神经元的功能。同位素H3-石杉碱甲183ug/ml静脉注射到小鼠15分钟后，自显影实验结果显示在外周及各脑区均有放射性药物分布，3个小时后，主要分布在额、顶、颞叶皮质，海马，伏隔核，第四脑室基底部及腺垂体等区域，更加明显。表明石杉碱甲十分易于进入中枢，并选择性分布在与学习、记忆有关的神经通路区域，对脑内乙酰胆碱酯酶具有较高的选择性抑制活性。
而石杉碱甲的神经保护作用也十分明显，研究表明细胞凋亡和氧化应激参与了AD和VD的病理过程，自由基引起的氧化损伤被认为是不同原因诱发神经退行性变的最后通路，除了AD和VD之外，动脉粥样硬化、脑缺血、癫痫、肌肉萎缩侧索硬化、帕氏金森综合症等，都提示对抗细胞凋亡和氧化应激药物可能阻止这些疾病的发展。石杉碱甲是通过提高抗氧化酶活力，具有显著抗β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)毒性作用，能够明显改善老年大鼠衰老导致的氧化应激，其抗氧化作用有助于延缓、阻止AD发展。石杉碱甲不但可以提高超氧化歧化酶(SOD)的活力加速体内自由基的清除，减少氧自由基导致的损伤。提示石杉碱甲不但与抑制乙酰胆碱酯酶活性有关，还与其改善抗氧自由基功能、减少自由基导致的损伤有关。说明石杉碱甲抗老年痴呆作用不但与抑制乙酰胆碱酯酶活性有关，与改善抗氧自由基功能、减少自由基导致的损伤有关。Aβ前体蛋白APP(分泌型APP)被认为具有神经保护作用，大鼠侧脑室内注射Aβ后能够导致分泌型APP与PKC水平下降。石杉碱甲能够明显上调PKC水平，增加分泌型APP的表达，而起到神经元保护作用，改善由于Aβ引起的学习、记忆障碍。
石杉碱甲对成年、老年猴有促智作用，对东莨菪碱、电击、还已酰亚胺、亚硝酸钠或二氧化碳诱发的认知障碍，脑内注射胆碱能选择性毒剂AF64A诱发的记忆障碍，侧脑室内注射Aβ1-40片段后诱发的大脑空间学习、记忆障碍，石杉碱甲均有改善作用。
石杉碱甲1994年应用于临床之后，在改善中老年良性衰老性记忆减退和早老性痴呆导致的记忆和认知能力减退，及提高青少年记忆和学习成绩提高取得明显效果。
石杉碱甲的表征石杉碱甲，为白色或微黄色结晶性粉末，无臭，味微苦；C15H18N2O，分子量242.32易溶于甲醇、氯仿，溶于乙醇，不溶于水；熔点224-229℃；比旋光度[α]24.5D-150.4°(c＝0.498甲醇)；UVλmax231，313nm石杉碱甲的NMR数据1H NMRδ(400MHz，CDCl3)6.41(1H，d，J＝9.4，2-H)，7.86(1H，d，J＝9.4，3-H)，2.71(2H，ddd，ddd，J6α，6β＝16.8，J6α，7＝1.16，J6β，7＝0.52，6-H)，3.60(1H，brs，7-H)，5.39(1H，J＝4.6，8-H)，1.66(3H，d，J＝6.7，10-H)，5.47(3H，d，J＝6.7，11-H)，2.11(2H，s，14-H)，1.54(3H，s，16-H)，13.15(1H，s，NH).
13C NMRδ(100MHz，CDCl3)165.4(s，C-1)，116.9(d，C-2)，140.2(d，C-3)，122.8(s，C-4)，142.5(s，C-5)，35.2(t，C-6)，32.8(d，C-7)，124.2(d，C-8)，12.3(q，C-10)，111.2(d，C-11)，143.1(s，C-12)，54.3(s，C-13)，49.1(t，C-14)，134.1(s，C-15)，22.6(q，C-16).
化学结构 化学名(5R，9R，11E)-5-氨基-11-亚乙基-5，6，9，10-四氢-7-甲基-5，9-亚甲环芳辛并-2(1H)-吡啶酮，(英文[5R-(5α，9β，11E)]-5-amino-11-ethylid-ene-5，6，9，10-tetrahydro-7-methyl-5，9-Methanocycloocta[b]pyridine-2(1H)-one)
具体实施例方式下面的实施例可以使本专业人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1豆腐果苷-石杉碱甲缩醛亚胺化合物的制备豆腐果苷与石杉碱甲缩醛反应制备豆腐果苷衍生物(1)，反应式 取48.4mg(0.2mmol)HupA置于带有冷凝管的三径瓶中，加入8ml的无水乙醇搅拌并溶解。豆腐果苷71.1mg(0.25mmol)溶于8ml的无水乙醇中，并加入0.5ml的三乙胺混合均匀后，缓慢滴入三径瓶中。混合液磁力搅拌并加热，温度维持在55℃左右，1小后通过TLC检测，表明反应已经结束。反应物冷却至室温后，减压浓缩，残余物硅胶柱层析(CHCl3/CH3OH 40∶1，20∶1)，得到产物1，80mg，收率79.2％。白色固体。
通过希夫碱制备豆腐果苷衍生物。实验中用的石杉碱甲(95％)购自长沙拓康生物技术有限公司。其余试剂购自百灵威化学试剂有限公司。
实施例2取120mg(～0.5mmol)HupA置于带有冷凝管的三径瓶中，加入25ml的无水乙醇搅拌并溶解。豆腐果苷200mg(～0.7mmol)溶于25ml的无水乙醇中，并加入1.3ml的三乙胺混合均匀后，缓慢滴入三径瓶中。混合液磁力搅拌并加热，温度维持在55℃左右，1小后通过TLC检测，表明反应已经结束。反应物冷却至室温后，减压浓缩，残余物硅胶柱层析(CHCl3/CH3OH 40∶1，20∶1)，得到产物1，210mg，收率83.3％。白色固体。
豆腐果苷衍生物1的表征白色针状结晶，mp.198-200℃.旋光比[α]20D-2.42(c＝1.24，CHCl3)；1H NMRδ(500MHz，CDCl3)6.32(1H，d，J＝9.4，2-H)，7.22(1H，d，J＝9.4，3-H)，2.80(2H，ddd，J＝16.8，3.5，1，6-H)，3.68(1H，brs，7-H)，5.34(1H，d，J＝7.2，8-H)，1.65(3H，d，J＝6.5，10-H)，5.12(1H，q，J＝6.8，11-H)，(2H，d，J＝16.0，14-H)，1.28(3H，s，16-H)，7.81(1H，d，J＝8.6，2’-H)，7.17(1H，d，J＝8.6，3’-H)，7.81(1H，d，J＝8.6，6’-H)，8.43(1H，s，7’-H)，5.50(1H，s，1”-H)，3.69(1H，m，2”-H)，3.86(1H，m，3”-H)，3.61(1H，m，4”-H)，3.86(1H，overlap，5”-H)，4.14(1H，brs，6”-H)，3.89(1H，overlap，6”-H).
13C NMRδ(125MHz，CDCl3)165.7(s，C-1)，118.0(d，C-2)，142.9(d，C-3)，122.7(s，C-4)，144.7(s，C-5)，36.0(t，C-6)，34.2(d，C-7)，125.3(d，C-8)，12.6(q，C-10)，115.6(d，C-11)，140.8(s，C-12)，65.7(s，C-13)，46.7(t，C-14)，135.5(s，C-15)，23.0(q，C-16)；131.4(s，C-1’)，131.1(d，C-2’)，117.8(d，C-3’)，161.9(s，C-4’)，117.8(d，C-5’)，131.1(d，C-6’)，163.8(d，C-7’)；99.7(d，C-1”)，72.1(d，C-2”)，73.0(d，C-3”)，68.7(d，C-4”)，75.8(d，C-5”)，62.9(t，C-6”).
(+)FAB-MS m/z(％)509(M+1，100)，347(M+1-A11，78)，331(7)，243(14)，226(242-NH2，77)，211(13)，198(12)，122(19)根据起始原料的反应过程，及以上波谱数据化合物1的结构可以被推定。
化合物1的化学名称由于系统命名复杂，按天然产物习惯，命名化合物1为豆腐果苷-石杉碱甲缩醛亚胺。
下述的制剂实施例是按实施例1的方法先制得豆腐果苷-石杉碱甲缩醛亚胺，按常规制成注射液、粉针剂、口服液以及加入赋形剂的粉剂、制粒压片、胶囊。
片剂按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有下述成分式(I)化合物 50mg乳糖 70mg硬脂酸镁 3mg聚乙烯吡咯烷酮7mg合计 130mg
如果需要，片剂可用羟丙基甲基纤维素、滑石和着色剂进行膜包覆。
胶囊按照本领域已知的方法制备胶囊剂，每个胶囊中含有下述成分式(I)化合物50mg乳糖 70mg玉米淀粉 25mg硬脂酸镁 1mg聚乙烯吡咯烷酮 4mg合计 150mg[制剂实施例3]注射剂按实施例1的方法先制得本发明式(I)化合物，按本领域已知的方法制备注射剂，加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
下述的试验例可进一步说明本发明所述豆腐果苷-石杉碱甲缩醛亚胺及其药物组合物的有益效果，试验例包括了本发明的药效学试验等。
试验例1豆腐果苷-石杉碱甲缩醛亚胺的乙酰胆碱酯酶抑制实验实验原理乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)的主要生理功能为通过快速水解神经传递介质乙酰胆碱(ACh)，中止胆碱能突触中的脉冲传递，故AChE又称乙酰胆碱水解酶(acetylcholine hydrolase)12。
CH3COOCH2CH2N+(CH3)3+ACh E→
CH3CO-ACh E+HOCH2CH2N+(CH3)3→CH3COO-+H++ACh E乙酰胆碱酯酶与碘化硫代乙酰胆碱生成的产物，与5，5-二硫双硝基苯甲酸生成一种黄色物质，本模型利用该颜色反应，来测定待测样品对乙酰胆碱酯酶的抑制程度。
材料乙酰胆碱酯酶(AChE)、阳性对照他克林(Tacrine)购于SIGMA公司，碘化硫代乙酰胆碱购于FLUKA公司，5，5-二硫双硝基苯甲酸购于ACROS公司，其它均为国产分析纯。
豆腐果苷-石杉碱甲缩醛亚胺对乙酰胆碱酯酶的抑制活性测定取5支磷酸盐缓冲溶液的梨型管，依次加入不同的1.0mM的样品DMSO溶液，使其用DMSO补齐至刻度体积后，将浓度控制为50.0，25.0，12.5，6.25，3.13(×10-9M)。分别加入一定量的4mg/mL 5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)和乙酰胆碱酯酶溶液(0.1mg/ml)，并在37℃保温15min后。立即加入一定量2mg/mL硫代乙酰胆碱溶液，摇匀后测其在λ＝412nm处的A值(An)。参比用0.1MpH 8.0磷酸盐缓冲溶液。以未加样品所测得的Acontrol值作为100个活力单位相对酶活力＝(An/Acontrol)×100然后以酶的相对活力对抑制剂浓度作图，根据抑制曲线求得各种化合物的IC50值(抑制酶活力50％时的抑制剂浓度)。豆腐果苷-石杉碱甲缩醛亚胺对乙酰胆碱酯酶的抑制活性(表1)。
表1 化合物1的初步筛选活性结果
他克林为阳性对照，具体的浓度和抑制率为浓度1×10-3M，抑制率97.36％％；浓度1×10-4M，抑制率94.46％；浓度1×10-5M，抑制率90.93％；浓度1×10-6M，抑制率71.91％；浓度1×10-7M，抑制率17.25％；浓度1×10-8M，抑制率0。
可见，化合物1在1×10-5mol/L的浓度下，对乙酰胆碱酯酶的抑制率到达93.4％，而在同一实验中同一浓度下，石杉碱甲(HupA)对乙酰胆碱酯酶的抑制率到达81.9％，而豆腐果苷(Hel)在1×10-3mol/L的浓度下，对乙酰胆碱酯酶的抑制率仅达24.8％。鉴于化合物1对乙酰胆碱酯酶的抑制活性较强，进一步重复实验测定了IC50(表2)表中阳性对照用较他克林活性更强的p0407(乙酰水杨酸毒扁豆碱)。
表2说明化合物豆腐果苷-石杉碱甲缩醛亚胺具有较强的乙酰胆碱酯酶的抑制活性。
表2 化合物1对乙酰胆碱酯酶的抑制活性(IC50)
权利要求
1.如结构式(I)所示的豆腐果苷-石杉碱甲缩醛亚胺
2.制备权利要求1式(I)化合物的方法，取石杉碱甲，置于带有冷凝管的三径瓶中，加入无水乙醇搅拌并溶解；另取豆腐果苷溶于无水乙醇中，加入三乙胺混合均匀后，缓慢滴入三径瓶中，混合液磁力搅拌并在50℃-55℃加热1小时，冷却至室温，减压浓缩，经硅胶柱层析即可。
3.用于抑制乙酰胆脂酶活性的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1豆腐果苷-石杉碱甲缩醛亚胺化合物和/或药学上可接受的载体。
4.权利要求1豆腐果苷-石杉碱甲缩醛亚胺化合物在制备抑制乙酰胆脂酶活性药物中的应用。
全文摘要
如结构式(I)所示的豆腐果苷－石杉碱甲缩醛亚胺，其制备方法，其作为有效成分的药物组合物，以及其在制备抑制乙酰胆脂酶活性药物中的应用。
文档编号A61P25/28GK101045708SQ20071006582
公开日2007年10月3日 申请日期2007年4月20日 优先权日2007年4月20日
发明者邱明华, 颜健, 杨付梅, 杨小生, 周琳, 易平 申请人:中国科学院昆明植物研究所