专利名称：千层塔石杉碱甲的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种生物碱的提取方法，特别是一种千层塔石杉碱甲的提取方法。
背景技术：
千层塔为石杉科 石杉属蕨类植物，又名蛇足石杉、救命王。主布东北、长江流域和闽、粤、桂、滇、黔等省区。民间常将全草入药，有毒，用于退热、止血、消肿散毒、跌打损伤等。千层塔中含有的生物碱石杉碱甲(HupA)是具有低毒、高效、可逆和高选择性等优点的乙酰胆碱酯酶抑制剂，对于治疗重症肌无力、中老年痴呆及提高记忆力具有良好的疗效，并对抑制有机磷酸中毒有一定的作用。由于其独特的药用价值，千层塔及其提取物正日益受到国内外市场的广泛重视。目前，千层塔石杉碱甲的提取方法很多，但均存在不同程度的缺点和不足。一般都市将千层塔粉碎后，加稀酸或有机溶剂浸泡萃取。如专利号200410052688. 4 “一种高纯度石杉碱甲的制备方法”，以及专利号200710018515. 4“一种从千层塔中提取分离石杉碱甲的方法”，只是简单的采用有机溶剂浸泡萃取，虽然纯度很高，但收率很低，且生产量小，无法推广；专利申请号200910014866. 7 “一种从千层塔中提取分离高纯度石杉碱甲的新方法”，也只是简单的采用稀硫酸浸泡萃取，这些方法只能少量的使藏在细胞壁中的生物碱析出，回收率同样很低，提取效率不高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种使原材料药物中的石杉碱甲充分析出，同时又能得到高纯度石杉碱甲的方法，为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是采用稀酸浸泡，结合超声波辅助提取，稀酸稀碱萃取，活性炭除杂，低温重结晶等工序提取石杉碱甲，具体方法如下。⑴粉碎净选千层塔药材，粉碎，粒度为10-20目，过筛。⑵提取连续两次提取，第一次提取是将千层塔粉粒用O. 8%的盐酸溶液按照固液比为I :20-25的标准浸泡60min，再用600W功率的超声波提取15min，然后再浸泡60min，接着将提取液离心，取上清液；第二次提取是将滤渣用O. 8%的盐酸溶液按照固液比为I :18-22的标准浸泡45min，再用600W功率的超声波提取lOmin，然后再浸泡45min，接着将提取液离心，取上清液，最后将两次上清液合并。⑶浓缩用旋转蒸发仪将上清液浓缩至原材料重量的10倍体积。⑷氯仿萃取加10%的氨水调ph值为9-10，加入1/6体积的氯仿与浓缩液混合，萃取4次，合并氯仿相，再萃取一次。(5)浓缩用旋转蒸发仪浓缩，即得石杉总碱氯仿浓缩液。(6)稀碱萃取加入相同体积的l%NaH0溶液，混合，萃取6次，取下层。(7)稀酸反萃取加入相同体积的1%HC1溶液，混合，反萃取6次，至萃取颜色很淡为止，取酸水层。
(8)活性炭除杂加入15倍O. 8%的盐酸溶液，调整pH值为1_2，加入相当于浓缩液3%体积的活性炭,搅拌脱色4h，滤去活性炭，留取滤液。
(9)结晶将滤液用浓氨水调至pH值为9-10。用等体积氯仿萃取I次,然后将氯仿层蒸干，得淡红色固体；然后加入适量丙酮，加热回流使之完全溶解，静置冷却，然后放入5°C冷藏室静置24h，得微红色固体。(1Φ重结晶再用少量氯仿溶解蒸干，用丙酮溶解低温重结晶，得类白色固体；然后重复一次，得白色固体。(11)干燥将所得白色固体于烘箱中干燥5h，得纯度大于99%的纯品石杉碱甲。本发明的有益效果是稀酸浸泡，可将生物碱转变为生物碱盐溶出，在提取过程中用超声波辅助提取，可以使千层塔细胞壁破裂，从而更好地让生物碱溶解在浸泡液中，提高回收率，经检验，采用这种方法提取石杉碱甲，其回收率可达98. 3% ;采用稀酸和稀碱进行萃取和反萃取，可以很好地去除杂质，再用活性炭除杂，可以更好地除去杂质，最后采用低温重结晶反复除去残留杂质，可得到高纯度石杉碱甲。
图I为本发明千层塔石杉碱甲的提取方法流程示意图。图2为本发明实施例I石杉碱甲的高效液相色谱图。图3为本发明实施例2石杉碱甲的高效液相色谱图。图4为本发明实施例3石杉碱甲的高效液相色谱图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例I。净选千层塔药材100kg，粉碎，粒度为10-20目，过筛。加入2000L0. 8%的盐酸溶液，浸泡60min，然后用600W功率的超声波提取15min，然后再浸泡60min。然后用离心机离心，取上清液。再将滤渣加入1800L0. 8%的盐酸溶液，浸泡45min，然后用600W功率的超声波提取lOmin，然后再浸泡45min。然后用离心机离心,取上清液。将两次上清液合并,用旋转蒸发仪将滤液浓缩至1000L。然后加10%的氨水调ph值为9-10，加入17L氯仿与浓缩液混合，萃取4次，合并氯仿相，再萃取一次。再用旋转蒸发仪浓缩至100L，即得石杉总碱氯仿浓缩液。然后加入l%NaH0溶液100L，混合，萃取6次，取下层。然后加入1%HC1溶液100L，混合，反萃取6次，至萃取颜色很淡为止，取酸水层。接着加入1500L0. 8%的盐酸溶液，调整PH值为1-2，加入3kg活性炭，搅拌脱色4h，滤去活性炭，留取滤液。然后将滤液用浓氨水调至PH值为9-10。用等体积氯仿萃取I次，然后将氯仿层蒸干，得淡红色固体。再加入适量丙酮，加热回流使之完全溶解，静置冷却，然后放入5°C冷藏室静置24h，得微红色固体。再用少量氯仿溶解蒸干，用丙酮溶解低温重结晶，得类白色固体。再用少量氯仿溶解蒸干，用丙酮溶解低温重结晶，得白色固体。最后将所得白色固体于烘箱中干燥5h，得到白色固体16.Olg0经检测，AgilentlOO高效液相色谱仪，色谱柱为Hypersil0DS(150mmX4. 6mm，5 μ )，流动相为乙腈磷酸盐缓冲液=14:86 ;检测波长为310nm ;流速为lml/min ;进样量20 μ L。测得白色固体为石杉碱甲，纯度为99. 03%HPLC，见图2。实施例2。净选千层塔药材100kg，粉碎，粒度为10-20目，过筛。加入2500L浓度为O. 8%的盐酸溶液，浸泡60min，然后用600W功率的超声波提取15min，然后再浸泡60min。然后用离心机离心，取上清液。再将滤渣加入2200L0. 8%的盐酸溶液，浸泡45min，然后用600W功率的超声波提取lOmin，然后再浸泡45min。然后用离心机离心,取上清液。将两次上清液合并，用旋转蒸发仪将滤液浓缩至1000L。然后加10%的氨水调ph值为10，加入17L氯仿与浓缩液混合，萃取4次，合并氯仿相，再萃取一次。再用旋转蒸发仪浓缩至100L，即得石杉总碱氯仿浓缩液。然后加入l%NaH0溶液IOOL，混合，萃取6次，取下层。然后加入1%HC1溶液100L，混合，反萃取6次，至萃取颜色很淡为止，取酸水层。接着加入1500L0. 8%的盐酸溶液，调整PH值为2，加入3kg活性炭，搅拌脱色4h，滤去活性炭，留取滤液。然后将滤液用浓氨水调至PH值为10。用等体积氯仿萃取I次，然后将氯仿层蒸干，得淡红色固体。再加入适量丙酮，加热回流使之完全溶解，静置冷却，然后放入5°C冷藏室静置24h，得微红色固体。再用少量氯仿溶解蒸干，用丙酮溶解低温重结晶，得类白色固体。再用少量氯仿溶解蒸干，用丙酮溶解低温重结晶，得白色固体。最后将所得白色固体于烘箱中干燥5h，得到白色固体 16. 09g。经检测，AgilentlOO高效液相色谱仪，色谱柱为Hypersil0DS(150mmX4. 6mm，5 μ )，流动相为乙腈磷酸盐缓冲液=14:86 ;检测波长为310nm ;流速为lml/min ;进样量20 μ L。测得白色固体为石杉碱甲，纯度为99. 04%HPLC，见图3。实施例3。净选千层塔药材100kg，粉碎，粒度为10-20目，过筛。加入2200L浓度为O. 8%的盐酸溶液，浸泡60min，然后用600W功率的超声波提取15min，然后再浸泡60min。然后用离心机离心，取上清液。再将滤渣加入2000L0. 8%的盐酸溶液，浸泡45min，然后用600W功率的超声波提取lOmin，然后再浸泡45min。然后用离心机离心,取上清液。将两次上清液合并，用旋转蒸发仪将滤液浓缩至1000L。然后加10%的氨水调ph值为10，加入17L氯仿与浓缩液混合，萃取4次，合并氯仿相，再萃取一次。再用旋转蒸发仪浓缩至100L，即得石杉总碱氯仿浓缩液。然后加入l%NaHO溶液IOOL，混合，萃取6次，取下层。然后加入1%HC1溶液100L，混合，反萃取6次，至萃取颜色很淡为止，取酸水层。接着加入1500L0. 8%的盐酸溶液，调整PH值为2，加入3kg活性炭，搅拌脱色4h，滤去活性炭，留取滤液。然后将滤液用浓氨水调至PH值为10。用等体积氯仿萃取I次，然后将氯仿层蒸干，得淡红色固体。再加入适量丙酮，加热回流使之完全溶解，静置冷却，然后放入5°C冷藏室静置24h，得微红色固体。再用少量氯仿溶解蒸干，用丙酮溶解低温重结晶，得类白色固体。再用少量氯仿溶解蒸干，用丙酮溶解低温重结晶，得白色固体。最后将所得白色固体于烘箱中干燥5h，得到白色固体 16. 20g。经检测，AgilentlOO高效液相色谱仪，色谱柱为Hypersil0DS(150mmX4. 6mm，5 μ )，流动相为乙腈磷酸盐缓冲液=14:86 ;检测波长为310nm ;流速为lml/min ;进样量20 μ L。测得白色固体为石杉碱甲，纯度为99. 11%HPLC，见图4。
权利要求
1.千层塔石杉碱甲的提取方法，包括稀酸浸泡、超声波和微波辅助提取、稀酸稀碱萃取、活性炭除杂、低温重结晶等工序，其特征在于具体步骤如下 ⑴粉碎净选千层塔药材，粉碎，粒度为10-20目，过筛； ⑵提取连续两次提取，第一次提取是将千层塔粉粒用O. 8%的盐酸溶液按照固液比为I 20-25的标准浸泡60min，再用600W功率的超声波提取15min，然后再浸泡60min，接着将提取液离心，取上清液；第二次提取是将滤渣用O. 8%的盐酸溶液按照固液比为I :18-22的标准浸泡45min，再用600W功率的超声波提取lOmin，然后再浸泡45min，接着将提取液离心，取上清液，最后将两次上清液合并； ⑶浓缩用旋转蒸发仪将上清液浓缩至原材料重量的10倍体积； ⑷氯仿萃取加10%的氨水调ph值为9-10，加入1/6体积的氯仿与浓缩液混合，萃取4次，合并氯仿相，再萃取一次； (5)浓缩用旋转蒸发仪浓缩，即得石杉总碱氯仿浓缩液； (6)稀碱萃取加入相同体积的l%NaH0溶液，混合，萃取6次，取下层； 00稀酸反萃取加入相同体积的1%HC1溶液,混合,反萃取6次,至萃取颜色很淡为止，取酸水层； ⑶活性炭除杂加入15倍O. 8%的盐酸溶液，调整pH值为1-2，加入相当于浓缩液3%体积的活性炭，搅拌脱色4h，滤去活性炭，留取滤液； ⑶结晶将滤液用浓氨水调至PH值为9-10，用等体积氯仿萃取I次，然后将氯仿层蒸干，得淡红色固体；然后加入适量丙酮，加热回流使之完全溶解，静置冷却，然后放入5°C冷藏室静置24h，得微红色固体； (10)重结晶再用少量氯仿溶解蒸干，用丙酮溶解低温重结晶，得类白色固体；然后重复一次，得白色固体； (ID干燥将所得白色固体于烘箱中干燥5h，得纯度大于99%的纯品石杉碱甲。
2.根据权利要求I所述的提取方法，其特征在于步骤⑵所述的综合提取方法为首先将千层塔粉粒用O. 8%的盐酸溶液按照固液比为I :22的标准浸泡60min，再用600W功率的超声波提取15min，然后再浸泡60min，接着将提取液离心，取上清液；然后再将滤渣用O. 8%的盐酸溶液按照固液比为I :20的标准浸泡45min，再用600W功率的超声波提取lOmin，然后再浸泡60min，接着将提取液离心，取上清液，最后将两次上清液合并。
全文摘要
千层塔石杉碱甲的提取方法，包括稀酸浸泡、超声波辅助反复提取、稀酸稀碱反复萃取、活性炭除杂、多次低温重结晶等工序，其有益效果是稀酸浸泡可将生物碱转变为生物碱盐溶出，在提取过程中用超声波辅助提取，可以使千层塔细胞壁破裂，从而更好地让生物碱溶解在浸泡液中，提高回收率，经检验，采用这种方法提取石杉碱甲，其回收率可达98.3%；采用稀酸和稀碱进行萃取和反萃取，可以很好地去除杂质，再用活性炭除杂，可以更好地除去杂质，最后采用低温重结晶反复除去残留杂质，可得到高纯度石杉碱甲，经实施例检测，所提取的石杉碱甲纯度达99.11%HPLC。
文档编号C07D221/22GK102617469SQ20121010058
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月9日 优先权日2012年4月9日
发明者何全慧, 向廷军, 杨再江, 祝利, 赵勇彪 申请人:重庆市秀山红星中药材开发有限公司