专利名称：红托竹荪菌托中具有抑制肿瘤细胞生长的多糖的分离方法
技术领域：
本发明涉及一种食用菌多糖提取方法，特别是一种红托竹荪菌托中含有的多糖的分离方法。
背景技术：
恶性肿瘤是严重危害人类健康的重大难治性疾病，而药物治疗依然是肿瘤防治的重要手段。
我国有丰富的药用植物资源，利用天然药物资源开发拥有自主知识产权的抗肿瘤新药具有广阔前景。
红托竹荪(Dictyophora rubrovalvata)是一种担子菌，隶属真菌门(Eumycota)、担子菌亚门(Basidiomycotina)、腹菌纲(Gasteromycetes)、鬼笔目(Phallales)、鬼笔科(Phallaceae)、竹荪属(Dictyophora)，红托竹荪子实体高20～33cm；菌蕾卵圆形，暗红色，大小为4～5cm×4～6cm，根状菌索白色，伤后会变蓝紫色；菌托暗红色，菌盖钟形或钝圆锥形，高5～6cm，宽3.5～4.5cm，顶端平有穿孔，四周具网格，表面有暗青色至青褐色微臭的孢体；菌幕钟形、白色、质脆，自菌盖下垂达7cm，边宽4～8cm，具多角形、棱角圆形网眼，直径1～1.5cm；菌柄圆柱形，长11～20cm，直径3～5cm，白色、海绵质、中空。是中国特产的竹荪种类，主要分布于云南、贵州等高山地区的慈竹、刚竹及金竹等林下。在江西临川桂竹林中也发现有分布。
红托竹荪是竹荪中的珍品，含有多种氨基酸、维生素、多糖和多种无机盐等。除其营养价值外，同时还具有一定的防病保健作用，长期服用竹荪具有治疗慢性气管炎、降低血压和减少血液中的胆固醇含量等药用功能。但是在红托竹荪成品加工过程中，生产者常用其子实体，而将菌盖和菌托作为下脚料除去(子实体与菌盖、菌托的重量比1∶1.3)，造成了极大浪费，研究表明菌托干品中，富含多糖、氨基酸、蛋白质、维生素及有益金属元素。而目前为止，对红托竹荪菌托具有抑制肿瘤细胞生长的多糖尚未有报道。
发明内容
本发明提供一种对肿瘤细胞的生长有抑制作用的红托竹荪菌托多糖的分离方法。
一种红托竹荪菌托多糖的分离方法，包括如下步骤(1)将红托竹荪菌托干燥、粉碎后，用10～30倍体积的水浸提3～5小时后，过滤，将滤液浓缩到原体积的50％，再加入乙醇进行醇析，分离析出物并烘干；(2)析出物烘干后配成水溶液，在中加入与水溶液等体积的氯仿与异戊醇混合液，充分混合3～4小时后，离心、分层得到有机相与水相；(3)水相加入乙醇进行醇析，分离析出物并烘干，得到烘干物；(4)将步骤(3)得到的烘干物配成12mg/mL的水溶液，在层析柱中进行分离，用0.1M NaCl的Tris缓冲溶液洗脱得到红托竹荪菌托多糖DRVP1，洗脱时间为2hr，流速为3mL/min，所述的层析柱为DEAE-纤维素柱1.7cm×20.3cm。
步骤(1)和步骤(3)中所述的醇析，加入乙醇后，体系中乙醇的质量百分比浓度为50％～80％；优选70％。
步骤(1)中，将红托竹荪菌托干燥、粉碎后，用15倍体积的水浸提4小时，其得率最高，为12.03±0.23％。若加入水过少，在没有达到最佳蒸煮状态之前，浸出液已经变得很少，甚至糊锅，从而影响多糖得率；若加入水过多，则浸出液过多。
步骤(2)中所述的氯仿与异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的体积为3∶1。
通过本发明方法分离得到的红托竹荪菌托多糖，用HPLC作分子量测定，用T系列的标准的葡聚糖进行对照，可知红托竹荪菌托多糖DRVP1的平均分子量分别为1.47×104。
红托竹荪菌托多糖DRVP1样品经FT-IR光谱仪扫描，位于3400～3500cm-1的特征峰是糖分子O-H的伸缩振动，3000～2800cm-1的一组峰是糖分子C-H的伸缩振动，1400～1200cm-1的一组峰则是糖分子C-H的变角振动。由此可确认红托竹荪菌托多糖DRVP1为多糖化合物。红托竹荪菌托多糖DRVP1具有-OH、COOR、C-O-C醚键、-CHO/C＝O、COOH、C-O-H、-CH2-、-CH3、，应属β-型吡喃糖苷键。
红托竹荪菌托多糖DRVP1分别在50，100，200，500，1000μg/ml的浓度下在体外分别作用于S180(小鼠腹水型肝癌)肿瘤细胞，观察它们对该肿瘤细胞的生长抑制作用。实验中发现DRVP1对S180(小鼠腹水型肝癌)肿瘤细胞具有抑制作用。
本项研究利用其废物菌托提取生物活性物质，并且采用了比较简洁方便的方法，研究其结构成份和抑肿瘤的作用，为开发低成本的抗肿瘤药物制剂提供基础与技术平台，同时可增加竹荪的附加值，达到综合开发利用的目的。
图1为DEAE-纤维素柱(Cl-)分离图谱图2为红托竹荪菌托多糖DRVP1在的Sephadex G-75上的分离图谱图3为红托竹荪菌托多糖DRVP1经FT-IR光谱仪扫描图谱图4为红托竹荪菌托多糖DRVP1对S180细胞生长的抑制作用图，横坐标为DRVP1的浓度，纵坐标为相对细胞生长率具体实施方式
红托竹荪菌托多糖的分离(1)将红托竹荪菌托干燥、粉碎后，用15倍体积的水浸提4小时后，过滤，将滤液浓缩到原体积的50％，再加入乙醇进行醇析，分离析出物并烘干，得到烘干物；(2)用Sevag法脱蛋白将烘干物配成水溶液，加入与水溶液等体积的Sevag剂(氯仿∶异戊醇＝3∶1，体积比)摇床摇4小时后，离心、分层得到有机相与水相。通过此法去蛋白，效果明显，不仅去除率高，而且工艺简单，无需大的动力和设备，大大降低了运转成本。
(3)将步骤(2)得到的水相加入乙醇进行醇析，加入乙醇后，体系中乙醇的质量百分比浓度为70％，分离析出物并烘干得到的烘干物。经检测，此烘干物中多糖含量为81.20％。
(4)将步骤(3)得到的烘干物配成12mg/mL的水溶液，在层析柱中进行分离，用0.1M NaCl的Tris缓冲溶液洗脱得到红托竹荪菌托多糖DRVP1，洗脱时间为2hr，流速为3mL/min，所述的层析柱为DEAE-纤维素柱(1.7cm×20.3cm)。
红托竹荪菌托多糖DRVP1的纯化及鉴定红托竹荪菌托多糖DRVP1经过Sephadex G-75的进一步纯化，得到多糖精品以用来以下实验的研究。
红托竹荪菌托多糖DRVP1的水溶液(1mg/ml)，经过UV-Vis分光光度计扫描，波长范围为200～400nm。结果显示，DRVP1组分在260nm处没有吸收峰，说明不含核酸；在280nm处，曲线基本上平滑，表明此不含蛋白质。DRVP1水溶液样品经过苯酚-硫酸法显色后，再经UV-Vis分光光度计扫描，波长范围为200～600nm。结果表明该组分显色反应后在490nm处有显著吸收峰，曲线整体上平滑，表明已基本不含杂质。
用HPLC对红托竹荪菌托多糖DRVP1作分子量测定，流动相0.1MNaNO3，流速0.8mL/min，检测器Waters 2410示差折光，泵Waters 515，柱子Waters uktrahydrogel.1000，500，120串联，柱温40℃。用T系列的标准的葡聚糖进行对照，可知红托竹荪菌托多糖DRVP1的平均分子量为1.47×104。
取1mg红托竹荪菌托多糖DRVP1样品，和KBr粉末按1∶20(W∶W)的比例研磨均匀，然后压片。(注意压出的薄片以较透明为佳)经Nexus670型傅立叶变换红外光谱仪扫描分析，扫描范围4000cm-1～400cm-1。
红托竹荪菌托多糖DRVP1样品经FT-IR光谱仪扫描，从扫描图中可以看出，位于3400～3500cm-1的特征峰是糖分子O-H的伸缩振动，3000～2800cm-1的一组峰是糖分子C-H的伸缩振动，1400～1200cm-1的一组峰则是糖分子C-H的变角振动。由此可确认红托竹荪菌托多糖DRVP1为多糖化合物。红托竹荪菌托多糖DRVP1具有-OH、COOR、C-O-C醚键、-CHO/C＝O、COOH、C-O-H、-CH2- -CH3、，应属β-型吡喃糖苷键。
红托竹荪菌托多糖DRVP1的体外细胞毒性试验(SRB法)将红托竹荪菌托多糖DRVP1分别在50，100，200，500，1000μg/ml的浓度下在体外分别作用于S180(小鼠腹水型肝癌)肿瘤细胞，观察它们对该肿瘤细胞的生长抑制作用。实验中发现DRVP1对S180(小鼠腹水型肝癌)肿瘤细胞具有一定的抑制作用，而红托竹荪菌托多糖DRVP2并未显示抑制作用，结果见图4。
权利要求
1.一种红托竹荪菌托中具有抑制肿瘤细胞生长的多糖的分离方法，包括如下步骤(1)将红托竹荪菌托干燥、粉碎后，用10-30倍体积的水浸提3～5小时后，过滤，将滤液浓缩到原体积的50％，再加入乙醇进行醇析，分离析出物并烘干；(2)析出物烘干后配成水溶液，并加入与水溶液等体积的氯仿与异戊醇混合液，充分混合3～4小时后，离心、分层得到有机相与水相；(3)水相加入乙醇进行醇析，分离析出物并烘干，得到烘干物；(4)将步骤(3)得到的烘干物配成12mg/mL的水溶液，在层析柱中进行分离，用0.1M NaCl的Tris缓冲溶液洗脱得到红托竹荪菌托多糖DRVP1，洗脱时间为2hr，流速为3mL/min。
2.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于步骤(1)和步骤(3)中所述的醇析，加入乙醇后，体系中乙醇的质量百分比浓度为50％～80％。
3.如权利要求2所述的分离方法，其特征在于步骤(1)和步骤(3)中所述的醇析，加入乙醇后，体系中乙醇的质量百分比浓度为70％。
4.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于步骤(1)中所述的浸提是将红托竹荪菌托干燥、粉碎后，用15倍体积的水浸提4小时。
5.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于步骤(2)中所述的氯仿与异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的体积为3∶1。
全文摘要
本发明公开了一种红托竹荪菌托中具有抑制肿瘤细胞生长的多糖的分离方法，包括将红托竹荪菌托干燥、粉碎后，水提醇沉，分离析出物并烘干；将烘干的析出物配成水溶液，用Sevag法脱蛋白后进行醇析，分离析出物并烘干后配成12mg/mL的水溶液，在层析柱中进行分离，得到红托竹荪菌托多糖DRVP1。本发明方法得到红托竹荪菌托多糖DRVP1对肿瘤细胞的生长有明显的抑制作用。
文档编号A61P35/00GK101029087SQ20071006753
公开日2007年9月5日 申请日期2007年3月7日 优先权日2007年3月7日
发明者王飞娟, 潘薛波, 赵凯, 朱诚, 高建青, 陈文莉 申请人:浙江大学