专利名称：番红花球茎愈伤组织的诱导与抗肿瘤有效活性成份的提取方法
技术领域：
本发明涉及番红花球茎愈伤组织的诱导方法及番红花球茎愈伤组织中抗肿瘤有效活性成份的提取方法。
背景技术：
恶性肿瘤是严重危害人类健康的重大难治性疾病，据统计每年剥夺超过600万人的生命。药物治疗在恶性肿瘤的三大疗法中占有重要的地位，如美国FDA在2003年批准的20个新分子实体药中，抗肿瘤药就占了4个。目前国内外抗肿瘤药众多，但许多药物疗效不高、毒副反应大，因此继续寻找高效低毒的抗肿瘤药物成为研究的热点。我国有丰富的药用植物资源，自70年代以来，在天然植物抗肿瘤药物的研究开发中取得了很大的进展，临床上用于冶疗肿瘤的植物已筛选出20多种。大量的事实也证明在合成的化学类抗肿瘤药物中绝大多数都是以天然抗癌活性成分为先导的化合物，包括计算机模拟和仿生设计也都是以天然抗癌活性成分为基础的，并且一般而言植物来源的抗肿瘤药物毒副作用小，因此利用天然药物资源开发拥有自主知识产权的抗肿瘤新药具有广阔前景。
番红花(Crocus sativus L.)又名西红花，番红花，是鸢尾科红花属多年生地下球茎植物，通过母球茎形成子球茎进行无性繁殖。因其红色的干燥柱头含有番红花素(crocin)、番红花酸(crocetin)、番红花醛(safranal)等多种重要的次生代谢产物，在我国医药上的应用始载于《本草纲目》。传统中医学认为生药番红花味甘，性平，具有活血化瘀，凉血解毒，解郁安神等功效，用于治疗经闭症瘕、产后瘀阻、温毒发斑、忧郁痞闷、心悸发狂等病症，是传统妇科、伤科良药。最近几年关于番红花及其提取物的抗肿瘤效应方面的科学发现令人鼓舞，研究表明番红花具有明显的抑癌抗癌能力，特别是番红花萃取物二甲基番红花酸对白血病、卵巢癌、结肠癌、横纹肌肉瘤、结肠癌、乳头肉瘤、扁平细胞瘤和软组织肉瘤等都具有较强的抑制作用。然而，番红花的可利用部分是柱头，生药产量极低，其世界年产量仅为约50吨，又因其花期短，采收耗时费工，目前国际市场价格高达US$2000/kg，素有“红色金子”之称，在我国亦被列为珍稀名贵药材，同时由于生产技术不高，繁殖过程中球茎存在退化现象，有的甚至不能开花。目前我国医药上所用的番红花也主要依赖进口，价格昂贵，且货源较缺。
利用培养植物细胞、组织、器官作为生物反应器产生生物医学感兴趣的复合物或有效成分是从19世纪50年代后期开始的科学研究目标。自1956年Routine和Nickel首次通过植物组织培养生产有用次级代谢产物以来，药用植物组织培养的研究工作取得了较大进展，已有百余种植物次生代谢产物通过细胞培养技术获得，部分已进人中试和工业化生产规模。如利用植物生物反应器生产红豆杉中的紫杉醇、人参中的人参苷、紫草中的紫草宁等。
发明内容
本发明提供一种番红花球茎愈伤组织的诱导方法及番红花球茎愈伤组织中抗肿瘤有效活性成份的提取方法。
一种番红花球茎愈伤组织的诱导方法，番红花球茎消毒后切块，在无菌条件下接种于诱导培养基中，在22±1℃暗培养，培养1～2个月，所述的诱导培养基采用MS为基本培养基，附加成份为6-苄氨基嘌呤3～6mg/L和α-萘乙酸7～10mg/L，蔗糖质量百分比浓度2～3％。
所述的附加成份优选为6-苄氨基嘌呤5.0mg/L和α-萘乙酸8.0mg/L，蔗糖质量百分比浓度3％。
为了获得大量的番红花球茎愈伤组织，可以将所述诱导方法得到的番红花球茎愈伤组织进行增殖培养，将诱导培养基上获得的愈伤组织，切成小块，转入新的培养基中，培养基配方同诱导培养基培养基，即采用MS为基本培养基，附加成分为6-BA 5.0mg/L+NAA 8.0mg/L。培养温度22±1℃，每天光照时间16h，光照强度2000-3000lx，培养1-2个月。
培养愈伤组织随着培养时间的延长，愈伤组织的诱导率呈增加的趋势。但是随着时间的延长，培养基中的营养成分被消耗殆尽，不利于愈伤组织的生长，超过2个月后，愈伤组织易褐化。
在番红花球茎的三个部分(即芽点，近根部分表皮，芽点周围表皮)中(即芽点，近根部分表皮，芽点周围表皮)，以芽点周围表皮部分的愈伤组织诱导能力最强，可达到100％，而芽点很难诱导出愈伤组织，一般只能诱导芽的伸长。
按照所述诱导方法得到的番红花愈伤组织中抗肿瘤有效活性成份的提取方法，包括如下步骤(1)将番红花愈伤组织用提取液研磨提取，所述的提取液是浓度为50mmol/L、PH值为8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)，其中还含有浓度为1mmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)中文名称、浓度为5mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)，番红花球茎的质量与提取液的体积比为1∶2(m/v)；(2)将提取液离心分离得到上清液，取上清液加入NaCl固体，使NaCl的摩尔浓度为0.4mol/L；并二次离心去除杂质，得到去除杂质的上清液；(3)将去除杂质的上清液通过层析柱(Macro-Prep DEAE柱，15×300mm)进行分离，上样10ml，层析后用90-120ml洗脱液A洗脱30min，洗脱出A组份，洗脱速度为2.0ml/min；再用100ml洗脱液B洗脱30min，洗脱出B组份，洗脱速度为2.0ml/min；洗脱液A是浓度为20mmol/L、PH值为8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)，其中还含有浓度为0.4mol/L的NaCl，洗脱液B是浓度为20mmol/L、PH值为8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)，其中还含有浓度为0.8mol/L的NaCl；(4)将步骤(3)得到B组份过滤脱盐、冷冻干燥后得白色粉末，用LC-304 C-4高效液相色谱柱进行液相色谱分离，检测到保留时间为10.3-14.2min的物质即为具有抗肿瘤效果的有效活性成份，液相色谱分离条件为流速1.0ml/min，采用波长214nm的UV检测器，流动相为乙腈和水的混合溶液。
番红花愈伤组织中抗肿瘤有效活性成份的提取方法的步骤(2)中所述的离心分离和二次离心分离的条件为13000g离心5～20min。
番红花愈伤组织中抗肿瘤有效活性成份的提取方法的步骤(3)中层析柱分离时考虑最大限度使用层析柱交换剂的交换能力，又不超出交换剂的结合能力，故上样10ml，但也可以根据BioRad MacroPrep DEAE胶填料的新旧及活化程度有关上样至30ml。洗脱速度采用2.0ml/min速度，低流速可以洗脱得更彻底，对柱影响更小，但是洗脱效率过低；高流速洗脱更快，但是会有较大的拖尾现象，浪费洗脱液，且因为是简易的层析柱装置，容易产生柱压过高而漏气，使柱床极易出现空泡。层析分离后层析柱用洗脱液C(含1.0M NaCl、pH8.0的20mM的Tris-HCl缓冲液)洗脱30min再生。
番红花愈伤组织中抗肿瘤有效活性成份的提取方法的步骤(4)中所述的液相色谱分离，采用乙腈和水的混合溶液作为流动相进行梯度洗脱。
通过本发明方法提取的有效活性成份采用SRB法来测试对各种肿瘤细胞的生长抑制作用，选用了6种常见的肿瘤细胞株系作为番红花有效活性成份的抗肿瘤活性的试验对象，表明有效活性成份粗提物以及经过高效液相色谱分离纯化的有效活性成份精品都对6种肿瘤细胞都具有良好的抑制作用，同时经过HPLC纯化过后的有效活性成份的抗肿瘤活性有一定的增强。
本发明方法通过提取的番红花愈伤组织中具有抗肿瘤效果的有效活性成份打破了采用番红花传统部位进行提取受季节和来源稀缺的限制，更利于具有抗肿瘤效果的有效活性成份的大量获得。
图1番红花愈伤组织提取液层析柱分离效果扫描图，其中B峰为番红花愈伤组织中抗肿瘤有效活性成份的提取方法步骤(3)中得到的B组份。
图2将番红花愈伤组织中抗肿瘤有效活性成份的提取方法步骤(3)中得到的B组份进行HPLC分离出峰图片，共出现4个峰，最右侧的D峰保留时间为10.3-14.2min的吸收峰的物质即为具有抗肿瘤效果的有效成份。
图3番红花球茎愈伤组织有效活性成份对HeLa细胞的相对生长率的影响图。
图4番红花球茎愈伤组织有效活性成份对S180细胞的相对生长率的影响图。
图5番红花球茎愈伤组织有效活性成份对A549细胞的相对生长率的影响图。
图6番红花球茎愈伤组织有效活性成份对MCF7细胞的相对生长率的影响图。
图7番红花球茎愈伤组织有效活性成份对SGC-7901细胞的相对生长率的影响图。
图8番红花球茎愈伤组织有效活性成份对SMMC-7721细胞的相对生长率的影响图。
具体实施例方式
产生抗肿瘤有效活性成份的番红花球茎愈伤组织的诱导培养取番红花球茎，剥皮后用自来水冲洗1-2h，剥皮后清洗也在一定程度上可以去除球茎表面的微生物。转入无菌操作台上，先用70％的酒精消毒90s，无菌水冲洗后用1.2％的升汞溶液消毒12-15min，最后用无菌水冲洗5次以上以去除残留在球茎表面的HgCl2，在预先灭好菌的滤纸上切成1.5mm×3mm左右的小块，用镊子夹放到愈伤组织培养基中，培养温度22±1℃，暗培养，培养2个月。所述的愈伤组织诱导培养基组成为普通的MS培养基中添加外源激素，每升MS培养基中外源激素添加量为6-BA 5.0mg、NAA8.0mg、蔗糖30g。诱导培养基PH值5.8，琼脂0.75％。
当采用5-6月份的番红花球茎时，在无菌条件下培养，污染率为12％；而采用7-8份的番红花球茎，按同样的消毒方法消毒、培养，污染率达57％。说明使用不同季节的番红花，培养效果是不同的，5-6月份尤佳。
采用5-6月份的番红花球茎，利用本发明方法培养，2-3周可诱导出淡黄绿色的颗粒状愈伤组织，其诱导率达100％，且诱导出的愈伤组织生长良好，不易褐化。而利用MS+6-BA 0.5mg/L+2，4-D 2.0mg/L作为愈伤组织诱导培养基，4周内才可诱导出淡黄绿色的愈伤组织，其诱导率可达70％以上。但是通过这种诱导培养基获得的愈伤组织结构致密，呈现出玻璃化的趋势，且生长缓慢，极易在继代培养中发生。易褐化。
番红花愈伤组织中具有抗肿瘤效果的有效活性成份的提取取番红花愈伤组织，用提取液研磨提取，所述的提取液是浓度为50mmol/L、PH值为8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)，其中还含有浓度为1mmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)、浓度为5mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)，番红花球茎的质量与提取液的体积比为1∶2(m/v)；将提取液离心分离得到上清液，取上清液加入NaCl固体，使NaCl的摩尔浓度为0.4mol/L；并二次离心去除杂质，得到去除杂质的上清液；离心分离和二次离心分离的条件为13000g离心5～20min。
将去除杂质的上清液通过层析柱进行分离，上样10ml层析后分别用90-120ml洗脱液A洗脱30min洗脱出A组份，再用100ml洗脱液B洗脱30min洗脱出B组份，洗脱速度均为2.0ml/min洗脱液A是浓度为20mmol/L、PH值为8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)，其中还含有浓度为0.4mol/L的NaCl，洗脱液B是浓度为20mmol/L、PH值为8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)，其中还含有浓度为0.8mol/L的NaCl；将B组份，用30kD的超滤离心管(millipore公司)进行过滤脱盐，同时也达到了浓缩的效果，后用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，得白色粉末，以番红花球茎重量计，步骤(3)得到B组份的得率为0.198％-0.264％。将得到的白色粉末用蒸馏水溶解为100mg/ml，上样100μl，用LC-304 C-4高效液相色谱柱(SUPELCOSILTMLC-304，5μm，5cm)进行分离，waters液相色谱仪，waters996型二极管全频检测器，得到4个物质峰，积分面积分别占总体积的38.48％、40.96％、2.61％和17.95％，分别进行收集，其中第4个峰在214nm左右处有最高吸收。4个吸收峰，保留时间分别为1.1-5.8min、5.8-9.3min、9.3-10.3min和10.3-14.2min，其中保留时间为10.3-14.2min的物质即为具有抗肿瘤效果的有效活性成份。
液相色谱分离条件为流速1.0ml/min，采用UV检测器(波长214nm)，流动相为乙腈和水的混合溶液，采用乙腈和水的混合溶液作为流动相进行梯度洗脱。进行梯度洗脱时乙腈和水的用量比(体积比)随时间变化见表1表1
番红花球茎中具有抗肿瘤效果的有效活性成份体外抗肿瘤试验采用SRB法来测试不同纯度的有效活性成份对各种肿瘤细胞的生长抑制作用。
96孔板按每孔5×103～1×104个细胞接种，100μL。吹打均匀后于孵箱内放置过夜，待细胞贴壁并融合度达60～80％时开始加药物。先吸去培养液，用PBS洗几次后，加入含药培养液，每孔120μL(其中20μL药物溶液，100μL培养液)。继续在孵箱培养24h后，细胞培养结束后，取出培养板，每孔加入50％(质量/体积)的三氯乙酸(TCA)30μL固定细胞.TCA的终浓度为10％，轻柔地加在每孔液面上，然后在4℃冰箱中放置1h.若培养的是悬浮细胞，则加80％的冷TCA30μL，TCA的终浓度为16％，先静置5min，再入4℃冰箱中.培养板各孔用去离子水洗涤5遍，以去除TCA.在空气中干燥后，每孔加0.4％的SRB100μL，室温下放置10～30min，弃去各孔内液体后用1％乙酸洗涤5遍，去除未结合的染料，空气中干燥后用pH为10.5，10mmol/L unbufered Tris base(三羟甲基胺基甲烷)溶解，在平板振荡器上振荡5min，在酶标仪测定OD值，用空白对照调零，所用波长为490nm。将处理组OD与对照组OD比值作为评价有效活性成份对肿瘤细胞生长影响的指标。
本研究选用了6种常见的肿瘤细胞株系作为番红花有效活性成份的抗肿瘤活性的试验对象。表2表明愈伤组织中获得的有效活性成份堆6种肿瘤细胞都具有良好的抑制作用。
表2
图3-8表示了番红花球茎愈伤组织有效活性成份对6种细胞的毒性作用，其中横坐标中5-FU为500μg/ml的5-氟尿嘧啶，D为1000μM的地塞米松，1、10、100、1000分别为1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml和1000μg/ml的愈伤组织抗肿瘤有效活性成份，纵坐标为相对的细胞生长率，单位为％。图3-8表明番红花有效活性成份对肿瘤细胞的毒性作用具有广谱性，即对多种肿瘤细胞都有良好的毒性作用，而从对照药品来看，5-FU仅对HeLa细胞有强毒性，而对其他的5种细胞的毒性作用不强，另外一种对照药品地塞米松对6种肿瘤细胞的毒性都很弱。
权利要求
1.一种番红花球茎愈伤组织的诱导方法，其特征在于番红花球茎消毒后切块，在无菌条件下接种于诱导培养基中，在22±1℃暗培养，培养1-2个月，所述的诱导培养基采用MS为基本培养基，附加成份为6-苄氨基嘌呤3～6mg/L和α-萘乙酸7～10mg/L，蔗糖质量百分比浓度2～3％。
2.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于所述的附加成份为6-苄氨基嘌呤5.0mg/L和α-萘乙酸8.0mg/L，蔗糖质量百分比浓度3％。
3.一种按照权利要求1或2所述诱导方法得到的番红花愈伤组织中抗肿瘤有效活性成份的提取方法，包括如下步骤(1)将番红花愈伤组织用提取液研磨提取，所述的提取液是浓度为50mmol/L、PH值为8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，其中还含有浓度为1mmol/L的苯甲基磺酰氟中文名称、浓度为5mmol/L的二硫苏糖醇，番红花球茎的质量与提取液的体积比为1∶2；(2)将提取液离心分离得到上清液，取上清液加入NaCl固体，使NaCl的摩尔浓度为0.4mol/L；并二次离心去除杂质，得到去除杂质的上清液；(3)将去除杂质的上清液通过层析柱进行分离，上样10ml，层析后用90-120ml洗脱液A洗脱30min，洗脱出A组份，洗脱速度为2.0ml/min；再用100ml洗脱液B洗脱30min，洗脱出B组份，洗脱速度为2.0ml/min；洗脱液A是浓度为20mmol/L、PH值为8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，其中还含有浓度为0.4mol/L的NaCl，洗脱液B是浓度为20mmol/L、PH值为8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，其中还含有浓度为0.8mol/L的NaCl；(4)将步骤(3)得到B组份过滤脱盐、冷冻干燥后得白色粉末，用LC-304C-4高效液相色谱柱进行液相色谱分离，检测到保留时间为10.3-14.2min的物质即为具有抗肿瘤效果的有效活性成份，液相色谱分离条件为流速1.0ml/min，采用波长214nm的UV检测器，流动相为乙腈和水的混合溶液。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述的离心分离和二次离心分离的条件为13000g离心5～20min。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(4)中所述的液相色谱分离，采用乙腈和水的混合溶液作为流动相进行梯度洗脱。
全文摘要
本发明公开了一种番红花愈伤组织的诱导培养方法，番红花球茎消毒后切块，在无菌条件下接种于诱导培养基中，在22±1℃暗培养，培养2个月，所述的诱导培养基采用MS为基本培养基，附加成份为6－BA5.0mg/L+NAA 8.0mg/L，蔗糖浓度3％。该诱导方法得到的番红花愈伤组织中可大量提取抗肿瘤有效活性成份。
文档编号A61K36/88GK101045912SQ20071006753
公开日2007年10月3日 申请日期2007年3月7日 优先权日2007年3月7日
发明者潘薛波, 赵凯, 朱诚, 王飞娟, 高建青, 陈文莉 申请人:浙江大学