专利名称：一种金银花有机酸及其制备方法和检测分析方法
技术领域：
本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种金银花有机酸及其制备方法和金银花或含有金银花制剂的检测分析方法。
背景技术：
金银花为忍冬科多年生半常绿缠绕性木质藤本植物忍冬的花蕾，又名忍冬、银花、双花等。性寒、味甘；归肺、心、胃经。有清热解毒、疏散风热之功效。中医认为“金银花具有清热解毒、凉血化瘀的功效，主治外感风热、红肿热痛”等病症。自古被誉为清热解毒的良药。早在3000年前，我们祖先就开始用它防治疾病，《名医别录》把它列为上品。李时珍指出用它煮汁酿酒，服之，有“轻身长年益寿”之效。《新修本草》记载金银花常与黄芩、栀子、石膏、竹茹、芦根等同用，具有清热解毒、透邪外出、和胃止呕作用，可用于邪热壅阻，胃气不和，发热烦躁，胸隔痞闷，口渴干呕，舌红苔燥，脉象滑数。金银花既能宣散风热，还善清解血毒，主治温病发热，热毒血痢，痈疽疔毒等，为治疗痈肿疔疮阳证的要药，用于各种热性病，如身热、发疹、发斑、热毒疮疔、咽喉肿痛等症，均效果显著。
金银花有机酸是金银花的主要活性物质之一，它主要含有绿原酸chlorogenicacid、3，5-二咖啡酰奎宁酸3，5-di-O-caffeoylquinic acid、3，4-二咖啡酰奎宁酸3，4-di-O-caffeoylquinic acid等，具有抗菌抗病毒、止血、抗肝炎等作用；其抗菌谱广，对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、脑膜炎双球菌、肺炎双球菌、绿脓杆菌以及流感病毒等都有明显抑制作用，对钩端螺旋体、流感病毒及致病霉菌等多种病原微生物亦有抑制作用，并有明显的抗炎及解热作用；因此，金银花药材或含有金银花的制剂中，应对有机酸进行充分的研究，在质量检测中应以有机酸为指标进行检测分析。
现有文献、专利、药典在制备和检测金银花及其制剂时，都是以绿原酸为指标进行制备和检测分析，这种制备方法和检测分析方法并不能客观评定金银花、含有金银花制剂的工艺和质量，金银花中有机酸还含有3， 5-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸等，在制定工艺方法和检测方法中建立3，5-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸为标准品的方法是可行的，但因为3，5-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸在检测中使用量需要g级，而这两种成分提取纯化过程比较复杂，得到标准品需要大量的工作，因此，建立一种简单的工艺方法和质量分析方法并且可以客观的反应金银花有机酸质量的标准，是很多医药质量分析人员急需解决的难题。
发明内容
基于上述原因，我们科研人员通过大量的实验研究确定了金银花有机酸中绿原酸含量20％-55％，3，5-二咖啡酰奎宁酸含量为10％-20％，3，4-二咖啡酰奎宁酸含量为7％-20％，总含量以绿原酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸计大于等于50％且小于等于95％；质量分析人员通过大量的分析实验摸索，发现3，5-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸峰面积与绿原酸峰面积在高效液相色谱图中具有一定的关系，通过校正因子方法，以绿原酸为对照品，建立了一种客观的检测分析方法。
本申请金银花有机酸中主要含有绿原酸chlorogenic acid、3，5-二咖啡酰奎宁酸3，5-di-O-caffeoylquinic acid、3，4-二咖啡酰奎宁酸3，4-di-O-caffeoylquinicacid等；本申请金银花有机酸可以与具有清热解毒等作用的中药有效成分或有效部位进行组合；如金银花有机酸与黄芩苷组合，金银花有机酸与黄芩苷、鱼腥草素钠组合，金银花有机酸与黄连素组合，金银花有机酸与连翘苷组合等等；一.金银花有机酸制备方法取金银花，加水回流提取2-4次，每次15-40分钟，提取液滤过，合并滤液，浓缩，水溶液用盐酸调pH值至1-4，再用乙酸乙酯萃取1-4次，乙酸乙酯用量分别为水相量的0.5-2.0倍量，合并乙酸乙酯层，浓缩至浸膏状，干燥，得到金银花有机酸；或取金银花，用40％-90％乙醇回流提取2-4次，每次15-40分钟，减压浓缩至无醇味，水溶液用氯仿萃取2-4次，水相用盐酸调pH值至1-4，再用乙酸乙酯萃取1-4次，乙酸乙酯用量分别为水相量的0.5-2.0倍量，合并乙酸乙酯层，浓缩至浸膏状，干燥，得到金银花有机酸。
本申请金银花有机酸与中药有效部位或有效成分组合可以制备成片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、口服液体制剂、注射液和粉针剂中的一种。
二.金银花及其金银花制剂的检测分析方法色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；梯度洗脱，流动相变化为0-70分钟时流动相0.2％磷酸二氢钠溶液乙腈体积比为94∶6-70∶30；检测波长327nm；流速1ml/min；柱温30℃；对照品溶液的配制精密称定绿原酸对照品，置容量瓶中，加无水乙醇，超声处理，再加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；供试品溶液的配制精密称取样品，加无水乙醇，超声处理，再加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；或精密称取金银花药材，加无水乙醇，超声处理，再加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；测定法精密量取对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，依法测定，按外标法以峰面积计算含量，即得；
总有机酸的峰面积以下列公式计算A总＝A绿原酸+0.78A3，5-二咖啡酰奎宁酸+0.93A3，4-二咖啡酰奎宁酸。
绿原酸含量按照A绿原酸计算。
3，5-二咖啡酰奎宁酸含量按照0.78A3，5-二咖啡酰奎宁酸计算。
3，4-二咖啡酰奎宁酸含量0.93A3，4-二咖啡酰奎宁酸计算。
绿原酸保留时间在24分钟左右，3，5-二咖啡酰奎宁酸保留时间在51分钟左右，3，4-二咖啡酰奎宁酸保留时间在55分钟左右。
实验结果见表1表1金银花有机酸含量
实验结论通过上述分析实验表明，本申请有机酸具有实际意义，本申请检测分析方法具有科学意义。
三.检测方法学的建立1.色谱条件的选择金银花有机酸主要含绿原酸，3，4-二咖啡酰奎宁酸，3，5-二咖啡酰奎宁酸，在下文中，为叙述方便，将两种异绿原酸成分(3，5-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸)的名称写为异绿原酸。
流动相10.04％磷酸溶液-乙腈(75∶25)流动相，进样，结果绿原酸峰出峰时间较早，且理论板数不高，而异绿原酸峰未出。因此，应选择梯度色谱条件进行流动相筛选。
在下述流动相筛选过程中，为保证梯度条件的稳定和可重现性，流速均为1.0ml/min，同时考虑到在试验过程中温度控制的便利，柱温均为30℃。
流动相2流动相(A)0.04％磷酸溶液；(B)乙腈，梯度洗脱，程序如下
此条件绿原酸峰与其相邻峰分离度不好。
流动相3流动相(A)0.04％磷酸溶液；(B)乙腈，梯度洗脱，程序如下
此条件绿原酸峰与其相邻峰分离度略有改善。
流动相4流动相(A)0.2％磷酸溶液；(B)乙腈，梯度洗脱，程序如下
此条件绿原酸峰与其相邻峰分离度好，其余峰的分离度也较好。
流动相5流动相(A)0.4％磷酸溶液；(B)乙腈，梯度洗脱，程序如下
此条件绿原酸峰与其相邻峰分离度较好，与条件4相比没有改善。因此选择条件4为本品的流动相条件。
2.检测波长的选择由紫外吸收知，金银花提取物中绿原酸峰在326nm，3，5-二咖啡酰奎宁酸峰在328nm，3，4-二咖啡酰奎宁酸峰在328nm，参考中国药典2000年版一部药材金银花项下含量测定的波长327nm(第177页)，且各峰在327nm处均有较大吸收，因此本品选择327nm作为检测波长。
由以上试验确定金银花提取物的检测条件为色谱条件与系统适用性试验采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Kromasil250×4.6mm，5μm)，ODS预柱；流动相(A)0.2％磷酸溶液；(B)乙腈，梯度洗脱，程序如下
流速1.0ml/min；检测波长327nm；柱温30℃.
在选定条件下，绿原酸和异绿原酸峰出峰时间适当，峰形对称性均良好，与其相邻色谱峰的分离度良好。理论板数按绿原酸峰计不低于10000。
3.金银花总有机酸含量测定方法的拟定金银花总有机酸主要含绿原酸，3，4-二咖啡酰奎宁酸，3，5-二咖啡酰奎宁酸，测定此三种酸的含量总和可反映金银花有机酸的含量水平。采用绿原酸对照品以外标法测定，可直接测定金银花总有机酸中的绿原酸含量，对于其他两种异绿原酸的含量测定则可通过测定绿原酸相对于两种异绿原酸的校正因子，从而用绿原酸对照品以外标法间接测定两种异绿原酸的含量。绿原酸保留时间在24分钟左右，3，5-二咖啡酰奎宁酸保留时间在51分钟左右，3，4-二咖啡酰奎宁酸保留时间在55分钟左右。
采用绿原酸对照品以外标法测定时，金银花总有机酸的峰面积可表示为A总＝A绿原酸+αA3，5-二咖啡酰奎宁酸+βA3，4-二咖啡酰奎宁酸其中α、β为绿原酸相对于两个异绿原酸的校正因子；αA3，5-二咖啡酰奎宁酸项表示3，5-二咖啡酰奎宁酸的峰面积相当于同等浓度的绿原酸的峰面积值；βA3，4-二咖啡酰奎宁酸项表示3，4-二咖啡酰奎宁酸的峰面积相当于同等浓度的绿原酸的峰面积值；通过实验测得α、β的值，即可求得A总。
4.异绿原酸含量的测定测定异绿原酸与绿原酸的校正因子，应采用符合规定的对照品来测定。其中，绿原酸对照品来源于中检所，异绿原酸对照品为在金银花提取物的基础上精制而成，并进行了结构确证的研究。不同批次异绿原酸精制品的比较研究如下。
取3，4-二咖啡酰奎宁酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸的对照品及其他各批精制品各约20mg置50ml量瓶中，以无水乙醇超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，各精密量取续滤液5ml至10ml量瓶中，以50％乙醇稀释至刻度，摇匀。精密量取上述各溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。由色谱图的归一化法计算各批异绿原酸的纯度，按外标法以各自异绿原酸对照品为对照，以峰面积计算其他各批异绿原酸的含量，见表2、3。
表2 3，5-二咖啡酰奎宁酸纯度与含量测定
表3 3，4-二咖啡酰奎宁酸纯度与含量测定
由上可知，不同批次异绿原酸精制品与各自的对照品比较，其含量相差不大，杂质含量按峰面积归一化法计算，均小于2.0％，实际上均已达到中药对照品的要求。
因中药对照品由提取精制而成，因此，不同的精制批次，其杂质会略有差别。为使测定的异绿原酸的校正因子更具科学性、代表性，采用上述异绿原酸对照品与多批次的异绿原酸精制品分别测定其校正因子，并取其平均值作为标准校正因子。
5.异绿原酸校正因子的测定绿原酸对照品溶液的配制取绿原酸对照品约10mg置50ml量瓶中，加无水乙醇25ml超声使溶解，再以水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液备用。
异绿原酸溶液的配制取3，4-二咖啡酰奎宁酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸的对照品及其他各批精制品各约20mg置50ml量瓶中，以无水乙醇超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，各精密量取续滤液5ml至10ml量瓶中，以50％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液备用。
精密量取上述各溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积计算绿原酸及各批异绿原酸的响应因子。结果见表4、5。
表4金银花提取物中3，5-二咖啡酰奎宁酸校正因子测定
表5金银花提取物中3，4-二咖啡酰奎宁酸校正因子测定
在上表中，响应因子计算公式为fi＝Ai/Ci，i对应于同一种酸；校正因子的计算公式为f异3，5＝(A绿/C绿)/(A异3，5/C异3，5)f异3，4＝(A绿/C绿)/(A异3，4/C异3，4)f异3，5校正因子的物理意义为，3，5-二咖啡酰奎宁酸的峰面积折算为同等浓度的绿原酸的峰面积的系数，即为上述公式中的α；f异3，4校正因子的物理意义为，3，4-二咖啡酰奎宁酸的峰面积折算为同等浓度的绿原酸的峰面积的系数，即为上述公式中的β；即总有机酸峰面积以下列公式计算A总＝A绿原酸+0.78A3，5-二咖啡酰奎宁酸+0.93A3，4-二咖啡酰奎宁酸由此，金银花有机酸的含量可以用绿原酸对照品以外标法测定。
四.药理实验1.抗菌实验研究实验动物Wistar大鼠，体重190-230g；
菌种金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌；实验方法大鼠分组，雌雄各半，本申请金银花有机酸及其组合物灌胃给药2次/日，每次给药量为200mg/kg，共5次，末次给药后2小时，ip戊巴比妥钠35mg/kg麻醉，腹主动脉无菌采血，注入无菌负压采血管，凝固后离心分离血清，新华1号滤纸片制备无菌的小圆片，分装于无菌小瓶内，取上述血清加入小瓶中，浸泡1小时，置零下20℃冰箱保存。
菌种复活后，分别在MHA平板及MHA血平板上纯培养15小时，用无菌生理盐水洗取菌落，用无菌棉签取菌液均匀涂布于平板表面，待平板略干后，在标记位置上贴上上述不同方案的滤纸片，放入37℃温箱24小时取出，摄像机摄像，图象分析仪测量抑菌圈直径，实验结果见表6表6金银花有机酸及其组合物血清纸片抗菌实验结果
注与空白血清组比较**P＜0.01，*P＜0.05；与阳性对照组方案1-11组比较##P＜0.012.采用半体内法作抗病毒作用试验(1)对甲型流感病毒的影响实验采用半体内法，不同方案组、正常对照组及空白对照组，将不同药物相同浓度分别与病毒直接作用，立即接种于鸡胚尿囊腔中，用石蜡封接种孔，置37℃孵箱培养48h，收取每胚之尿液，用0.5％鸡红血球凝集试验，判断药物的抗病毒活性，结果见表3
(2)对乙型流感病毒的影响接种方法、药物剂量同甲型流感病毒实验。结果见下表7。
表7对流感病毒的作用比较
注-代表无病毒生长，+-代表少量病毒生长，++代表较多病毒生长，+++代表大量病毒生长3.对内毒素致兔发热的解热作用实验动物大耳白兔，级别健康一级，月龄4月，性别雄性，体重1.95±0.25kg。
实验方法雄性大耳白兔随机分为正常对照组、模型组、本申请金银花有机酸组。称取动物空腹体重，以计算给药量。除空白对照组和模型组给予等量的蒸馏水外，其余各组动物灌胃给予相应的药物，给药量为500mg/kg。除空白对照组以1.0ml/kg的生理盐水代替内毒素外，其余各组供试大耳白兔给药40min时耳缘静脉注射内毒素1200Eu/ml/kg造模，造模后0.5h、1h、2h、3h、4h和5h各测量一次肛温。每次抓取兔的动作要轻柔，体温计插入肛门的深度与时间基本相同，实验结果见表6表6不同制剂对对细菌内毒素致兔发热的解热作用
注与模型组比较**P＜0.01，*P＜0.05。
4.对CCl4致大鼠肝纤维化的影响实验动物选择雄性健康Wistar大鼠，体重180-200g。
实验方法将大鼠均随机分正常组、模型组、本申请金银花有机酸组(2.2g/kg)，除正常对照组外，其余各组大鼠首次于皮下注射CCl45ml/kg，以后每周2次背部皮下注射40％CCl4橄榄油3ml/kg，共6周。在试验期间除正常组外，第1～2周各组均给予20％猪油加0.5％胆固醇的玉米粉饲料，第3～6周饲以普通饲料。各给药组在造模开始时即同时灌胃给予相应剂量的药液，给药体积1ml/100g，给药时间共6周。各组用药周期完成后，乙醚麻醉下剖腹，经下腔门静脉采血，分别检测血清ALT、AST、Alb。实验结果见7表7对肝纤维化模型大鼠血清生化指标的影响
注与模型组比较**P＜0.01，*P＜0.05。
实验结论通过上述实验表明，本申请金银花有机酸具有实际意义。
注金银花有机酸与黄芩苷组合，金银花有机酸与黄芩苷、鱼腥草素钠组合，金银花有机酸与黄连素组合，金银花有机酸与连翘苷组合等等组合在抗病毒、解热、抗炎、抗氧化、保肝方面，也具有很好的药理作用。
五.制备实施例实施例1取金银花，加水回流提取4次，每次40分钟，提取液滤过，合并滤液，浓缩，水溶液用盐酸调pH值至4，再用乙酸乙酯萃取4次，乙酸乙酯用量分别为水相量的2.0倍量，合并乙酸乙酯层，浓缩至浸膏状，干燥，得到金银花有机酸；有机酸中绿原酸含量55％，3，5-二咖啡酰奎宁酸含量为20％，3，4-二咖啡酰奎宁酸含量为20％，总含量为95％。
或取金银花，用90％乙醇回流提取4次，每次40分钟，合并提取液，减压浓缩至无醇味，水溶液用氯仿萃取4次，水相用盐酸调pH值至4，再用乙酸乙酯萃取4次，乙酸乙酯用量分别为水相量的2.0倍量，合并乙酸乙酯层，浓缩至浸膏状，干燥，得到金银花有机酸。有机酸中绿原酸含量55％，3，5-二咖啡酰奎宁酸含量为20％，3，4-二咖啡酰奎宁酸含量为20％，总含量为95％。
金银花有机酸与中药有效部位或有效成分组合可以制备成片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、口服液体制剂、注射液和粉针剂中的一种。
实施例2取金银花，加水回流提取2次，每次15分钟，提取液滤过，合并滤液，浓缩，水溶液用盐酸调pH值至1，再用乙酸乙酯萃取1次，乙酸乙酯用量分别为水相量的0.5倍量，合并乙酸乙酯层，浓缩至浸膏状，干燥，得到金银花有机酸；有机酸中绿原酸含量20％，3，5-二咖啡酰奎宁酸含量为10％，3，4-二咖啡酰奎宁酸含量为20％，总含量为50％。
或取金银花，用40％乙醇回流提取2次，每次15分钟，合并提取液，减压浓缩至无醇味，水溶液用氯仿萃取2次，水相用盐酸调pH值至1，再用乙酸乙酯萃取1次，乙酸乙酯用量分别为水相量的0.5倍量，合并乙酸乙酯层，浓缩至浸膏状，干燥，得到金银花有机酸；有机酸中绿原酸含量20％，3，5-二咖啡酰奎宁酸含量为10％，3，4-二咖啡酰奎宁酸含量为20％，总含量为50％。
金银花有机酸与中药有效部位或有效成分组合可以制备成片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、口服液体制剂、注射液和粉针剂中的一种。
实施例3
取金银花，加水回流提取3次，每次30分钟，提取液滤过，合并滤液，浓缩，水溶液用盐酸调pH值至2，再用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯用量分别为水相量的1.5倍量，合并乙酸乙酯层，浓缩至浸膏状，干燥，得到金银花有机酸；有机酸中绿原酸含量47.5％，3，5-二咖啡酰奎宁酸含量为16.9％，3，4-二咖啡酰奎宁酸含量为15.7％，总含量为80.1％。
或取金银花，用60％乙醇回流提取3次，每次30分钟，合并提取液，减压浓缩至无醇味，水溶液用氯仿萃取3次，水相用盐酸调pH值至2，再用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯用量分别为水相量的1.5倍量，合并乙酸乙酯层，浓缩至浸膏状，干燥，得到金银花有机酸；有机酸中绿原酸含量43.2％，3，5-二咖啡酰奎宁酸含量为16.4％，3，4-二咖啡酰奎宁酸含量为14.9％，总含量为74.5％。
金银花有机酸与中药有效部位或有效成分组合可以制备成片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、口服液体制剂、注射液和粉针剂中的一种。
实施例4取金银花，加水回流提取4次，每次35分钟，提取液滤过，合并滤液，浓缩，水溶液用盐酸调pH值至3，再用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯用量分别为水相量的2.0倍量，合并乙酸乙酯层，浓缩至浸膏状，干燥，得到金银花有机酸；有机酸中绿原酸含量53.8％，3，5-二咖啡酰奎宁酸含量为19.3％，3，4-二咖啡酰奎宁酸含量为19.7％，总含量为92.8％。
或取金银花，用85％乙醇回流提取3次，每次35分钟，合并提取液，减压浓缩至无醇味，水溶液用氯仿萃取3次，水相用盐酸调pH值至3，再用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯用量分别为水相量的2.0倍量，合并乙酸乙酯层，浓缩至浸膏状，干燥，得到金银花有机酸。有机酸中绿原酸含量52.1％，3，5-二咖啡酰奎宁酸含量为18.7％，3，4-二咖啡酰奎宁酸含量为18.2％，总含量为89.0％。
金银花有机酸与中药有效部位或有效成分组合可以制备成片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、口服液体制剂、注射液和粉针剂中的一种。
实施例5取金银花，加水回流提取2次，每次20分钟，提取液滤过，合并滤液，浓缩，水溶液用盐酸调pH值至1，再用乙酸乙酯萃取2次，乙酸乙酯用量分别为水相量的1.0倍量，合并乙酸乙酯层，浓缩至浸膏状，干燥，得到金银花有机酸；有机酸中绿原酸含量32.5％，3，5-二咖啡酰奎宁酸含量为14.7％，3，4-二咖啡酰奎宁酸含量为7.9％，总含量为55.1％。
或取金银花，用45％乙醇回流提取2次，每次20分钟，合并提取液，减压浓缩至无醇味，水溶液用氯仿萃取4次，水相用盐酸调pH值至1，再用乙酸乙酯萃取1次，乙酸乙酯用量分别为水相量的1.0倍量，合并乙酸乙酯层，浓缩至浸膏状，干燥，得到金银花有机酸；有机酸中绿原酸含量35.7％，3，5-二咖啡酰奎宁酸含量为14.0％，3，4-二咖啡酰奎宁酸含量为7.1％，总含量为56.8％。
金银花有机酸与中药有效部位或有效成分组合可以制备成片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、口服液体制剂、注射液和粉针剂中的一种。
六.分析实施例实施例1金银花药材的检测分析色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；梯度洗脱，流动相变化为0-70分钟时流动相0.2％磷酸二氢钠溶液∶乙腈体积比为94∶6-70∶30；检测波长327nm；流速为1.0ml/min；柱温30℃；对照品溶液的配制精密称定绿原酸对照品，置容量瓶中，加无水乙醇，超声处理，再加水，超声处理，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
供试品溶液的配制精密称取金银花药材粉碎过筛，加无水乙醇，超声处理，再加水，超声处理，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；测定法精密量取对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，依法测定，按外标法以峰面积计算含量，即得；总有机酸的峰面积以下列公式计算A总＝A绿原酸+0.78A3，5-二咖啡酰奎宁酸+0.93A3，4-二咖啡酰奎宁酸。
测定结果金银花原药材中有机酸含量为8.12％。
实施例2金银花组分有效部位有机酸的检测分析色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；梯度洗脱，流动相变化为0-70分钟时流动相0.2％磷酸二氢钠溶液∶乙腈体积比为94∶6-70∶30；检测波长327nm；流速为1.0ml/min；柱温30℃；对照品溶液的配制精密称定绿原酸对照品，置容量瓶中，加无水乙醇，超声处理，再加水，超声处理，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；供试品溶液的配制精密称取样品，加无水乙醇，超声处理，再加水，超声处理，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；测定法精密量取对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，依法测定，按外标法以峰面积计算含量，即得；总有机酸的峰面积以下列公式计算A总＝A绿原酸+0.78A3，5-二咖啡酰奎宁酸+0.93A3，4-二咖啡酰奎宁酸。
测定结果金银花有机酸的含量为88.3％。
实施例3银黄口服液的检测分析(原料药为金银花、黄芩)色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；梯度洗脱，流动相变化为0-70分钟时流动相0.2％磷酸二氢钠溶液∶乙腈体积比为94∶6-70∶30；检测波长327nm；流速为1.0ml/min；柱温30℃；对照品溶液的配制精密称定绿原酸对照品，置容量瓶中，加无水乙醇，超声处理，再加水，超声处理，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；供试品溶液的配制精密称取制剂，加无水乙醇，超声处理，再加水，超声处理，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；测定法精密量取对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，依法测定，按外标法以峰面积计算含量，即得；总有机酸的峰面积以下列公式计算A总＝A绿原酸+0.78A3，5-二咖啡酰奎宁酸+0.93A3，4-二咖啡酰奎宁酸。
测定结果每1ml含金银花有机酸为5.2mg。
实施例4黄金鱼片剂的检测分析(原料药为金银花、黄芩、鱼腥草素钠)色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；梯度洗脱，流动相变化为0-70分钟时流动相0.2％磷酸二氢钠溶液∶乙腈体积比为94∶6-70∶30；检测波长327nm；流速为1.0ml/min；柱温30℃；对照品溶液的配制精密称定绿原酸对照品，置容量瓶中，加无水乙醇，超声处理，再加水，超声处理，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；供试品溶液的配制精密称取制剂，加无水乙醇，超声处理，再加水，超声处理，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；测定法精密量取对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，依法测定，按外标法以峰面积计算含量，即得；总有机酸的峰面积以下列公式计算A总＝A绿原酸+0.78A3，5-二咖啡酰奎宁酸+0.93A3，4-二咖啡酰奎宁酸。
测定结果每片含金银花有机酸为73.2mg。
注本发明所要求保护的具体技术方案，不限于上述实施例所表达的技术方案的具体组合。
权利要求
1.一种金银花有机酸，其特征在于有机酸中绿原酸含量20％-55％，3，5-二咖啡酰奎宁酸含量为10％-20％，3，4-二咖啡酰奎宁酸含量为7％-20％，总含量以绿原酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸计大于等于50％且小于等于95％。
2.根据权利要求1所述的一种金银花有机酸，其制备方法为取金银花，加水回流提取2-4次，每次15-40分钟，提取液滤过，合并滤液，浓缩，水溶液用盐酸调pH值至1-4，再用乙酸乙酯萃取1-4次，乙酸乙酯用量分别为水相量的0.5-2.0倍量，合并乙酸乙酯层，浓缩至浸膏状，干燥，得到金银花有机酸；或取金银花，用40％-90％乙醇回流提取2-4次，每次15-40分钟，合并提取液，减压浓缩至无醇味，水溶液用氯仿萃取2-4次，水相用盐酸调pH值至1-4，再用乙酸乙酯萃取1-4次，乙酸乙酯用量分别为水相量的0.5-2.0倍量，合并乙酸乙酯层，浓缩至浸膏状，干燥，得到金银花有机酸。
3.根据权利要求1所述的一种金银花有机酸的检测分析方法，包括金银花药材、含有金银花的药物制剂的高效液相色谱法检测分析，其特征在于色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；梯度洗脱，流动相变化为0-70分钟时流动相0.2％磷酸二氢钠溶液∶乙腈体积比为94∶6-70∶30；检测波长327nm；流速1ml/min；对照品溶液的配制精密称定绿原酸对照品，置容量瓶中，加无水乙醇，超声处理，再加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；供试品溶液的配制精密称取样品，加无水乙醇，超声处理，再加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；或精密称取金银花药材粉碎过筛，加无水乙醇，超声处理，再加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；测定法精密量取对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，依法测定，按外标法以峰面积计算含量，即得；总有机酸的峰面积以下列公式计算A总＝A绿原酸+0.78A3，5-二咖啡酰奎宁酸+0.93A3，4-二咖啡酰奎宁酸。
4.根据权利要求1或2所述的一种金银花有机酸作为药物活性成分的药物组合物。
5.根据权利要求4所述一种金银花有机酸作为药物活性成分的药物组合物，其药物制剂形式选自片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、口服液体制剂、注射液和粉针剂中的一种。
6.根据权利要求4所述的一种金银花有机酸作为药物活性成分的药物组合物在制备抑菌抗病毒、解热、抗炎、抗氧化、保肝药物方面中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种金银花有机酸及其制备方法和检测分析方法，其特征在于有机酸中绿原酸含量20％－55％，3，5－二咖啡酰奎宁酸含量为10％－20％，3，4－二咖啡酰奎宁酸含量为7％－20％，总含量以绿原酸、3，4－二咖啡酰奎宁酸、3，5－二咖啡酰奎宁酸计大于等于50％且小于等于95％；有机酸采用水提、调pH值、乙酸乙酯萃取的方法得到，该工艺方法简单可行，适于工业化生产；有机酸采用绿原酸为标准品，异绿原酸以绿原酸为标准进行校正的方法进行质量检测，该分析方法易于操作，减少了操作步骤，降低了标准品的使用量。
文档编号A61P39/06GK101019912SQ20071008655
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月14日 优先权日2007年3月14日
发明者顾群, 李志刚, 米长江, 李桂芹, 阮爱华 申请人:北京本草天源药物研究院