高效扩增活化淋巴细胞的方法和培养系统的制作方法

专利名称：：高效扩增活化淋巴细胞的方法和培养系统的制作方法
技术领域：
：本发明涉及免疫治疗领域，且具体涉及扩增活化淋巴细胞的方法和培养系统。
背景技术：
：近年来，由于免疫学的进步，对由机体免疫监视能力的降低而产生的各种免疫缺陷症已经进行了各种各样的免疫治疗方法的尝试。由免疫监视能力的降低而产生的各种免疫缺陷症包括癌症(恶性肿瘤)、先天性免疫缺陷、后天性免疫缺陷等。免疫疗法的目的之一是恢复或/和增强免疫监视能力，从而对这些疾病进行治疗。作为癌症的免疫疗法，细胞过继免疫治疗已成为控制肿瘤生长乃至杀伤肿瘤细胞的一种重要的方法。在二十世纪八十年代，研究发现经IL-2体外剌激后，外周血单个核细胞中的部分细胞可被特异性活化、扩增，并具有杀伤肿瘤细胞的作用。这些细胞即淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK细胞)(SinkovicsJG，HorvathJC.Humannaturalkillercells:acomprehensivereview,/"fJ(9"co/.Jul2005;27(1):5-47.)。LAK细胞的主要效应细胞为IL-2活化的NK细胞。最早的研究发现，这些细胞在体外具有杀伤白血病细胞的能力。由于LAK细胞属于非B非T细胞，因此，这种杀伤是非HLA限制性的，代表了机体天然免疫系统对肿瘤细胞的监视和杀伤作用。通常情况下，NK细胞不经干扰素(IFN)、IL-2的活化、或去除抑制性单核细胞时，对自体的白血病细胞没有杀伤作用。经IL-2活化的T淋巴细胞和NK细胞可分泌Y-干扰素，导致以前对NK细胞有抗性的白血病细胞被活化的NK细胞杀伤。除白血病外，一些体外试验表明，LAK细胞对动物和人的恶性黑色素瘤、肾癌、非何杰金淋巴瘤、肺癌及结直肠癌也有一定的效果。然而，受到体外可扩增效率的限制、化疗对淋巴细胞的影响，LAK细胞在体内的抗肿瘤效果不理想。九十年代初，Schmidt-WolfIGH等人(Schmidt-WolfIG，NegrinRS，KiemHP,BlumeKG，WeissmanIL.UseofaSCIDmouse/humanlymphomamodeltoevaluatecytokine匿inducedkillercellswithpotentantitumorcellactivity.JExpMed.1991Jull;174(l):139-49.)发表了一种新的方法，其在体外培养外周血淋巴细胞，然后过继回输用于治疗肿瘤病人。与培养LAK细胞不同，这种方法使用了细胞因子IL-2、IL-4、IL-1a、IFN-Y、抗CD3抗体，经过体外培养，所获得的细胞对白血病和部分实体瘤有一定的治疗效果。为了与LAK细胞相区别，这种方法所获得的细胞被称为细胞因子活化的杀伤细胞，即CIK细胞。CIK细胞与LAK细胞不同，其发挥抗肿瘤作用的效应细胞主要是CD3+CD56+的NKT细胞(>50%)。研究表明，CIK细胞的扩增效率、肿瘤细胞杀伤能力、体内的活性比LAK细胞明显增高。传统的CIK治疗方法主要存在以下问题治疗前需要取大量病人外周血(3000—5000ml)以分离淋巴细胞，对病人自身的免疫系统损伤较大；培养效率低一般为5—10倍扩增；病人对放化疗耐受性差；细胞培养后，含有较多的CD4+CD25+的调节性(抑制性)T细胞，回输后可能对体内的淋巴细胞增殖有一定的抑制性；细胞稳定较差，必须在扩增后1一2小时内使用；由于一次大量采集外周血单个核细胞，该方法不能进行高频率治疗；病人需付出淋巴细胞分离的额外费用。
发明内容在第一方面，本发明提供一种扩增活化淋巴细胞的方法，所述方法包括(a)淋巴细胞活化步骤，其中将含有淋巴细胞的生物学样品与淋巴细胞活化剂相接触，接触的时间和条件足以使得所述生物学样品中的淋巴细胞发生活化；(b)第一个扩增步骤，其中将步骤(a)中得到的活化淋巴细胞在含有高浓度IL-2的第一培养基中进行培养；(c)第二个扩增步骤，其中将步骤(b)中得到的淋巴细胞在含有低浓度IL-2的第二培养基中进行培养；(d)第三个扩增步骤，其中将步骤(c)中得到的淋巴细胞在含有中等浓度IL-2的第三培养基中进行培养；和(e)收集步骤(d)中得到的扩增的活化淋巴细胞(ExpandedActivatedLymphocyte,艮卩EAL)。在本发明的方法的一个实施方式中，淋巴细胞活化步骤与第一个扩增步骤在同一个培养容器中同时进行。优选地，本发明的方法中使用的淋巴细胞活化剂是固定化的抗CD3抗体。优选地，在本发明的方法中，步骤(b)中的第一培养基的IL-2的浓度可以是例如1000U/ml至6000U/ml，步骤(c)中的第二培养基的IL-2的浓度可以是例如1U/ml至500U/ml，步骤(d)中的第三培养基的IL-2的浓度可以是例如300U/ml至750U/ml。在本发明的方法中，步骤(b)和/或(c)和域(d)的培养基中还可以含有其他细胞因子，例如IL-7禾口/或IL-15。优选地，步骤(b)和/或(c)和域(d)的培养基中IL-7的浓度可以是例如l-100ng/ml，而IL-15的浓度可以是例如l-200ng/ml。在本发明的方法中，步骤(b)、(C)、和(d)的培养基可以是相同的或者不同的。优选地，所述第一培养基是RPMI-1640培养基，所述第二培养基是AIM-V培养基，所述第三培养基是DMEM培养基。所述第一、第二、和第三培养基也可以是混和培养基。在本发明的方法中，优选地可以通过瓶式扩增进行步骤(b)中所述的第一个扩增步骤，并通过袋式扩增进行步骤(c)中所述的第二个扩增步骤和步骤(d)中所述的第三个扩增步骤。优选地，步骤(b)中所述的第一个扩增步骤进行7-14天，步骤(c)中所述的第二个扩增步骤进行3至7天，且步骤(d)中所述的第三个扩增步骤进行3至7天。在本发明的方法中，在进行步骤(e)之前，可以将步骤(d)重复一或多次。使用本发明的扩增活化淋巴细胞的方法，所述生物学样品中的淋巴细胞可被扩增100至1000倍。优选地，其中扩增后的细胞主要为CD8+T细胞和NK细胞，例如，所扩增的活化淋巴细胞中，CD8+T细胞可>50%。在第二方面，本发明还提供一种用于扩增活化淋巴细胞的培养系统，其包括(a)用于活化生物学样品中的淋巴细胞的活化培养容器，其含有淋巴细胞活化剂；(b)用于对活化淋巴细胞进行第一个扩增步骤的第一扩增容器，其含有第一培养基，所述第一培养基含有高浓度的IL-2;(c)用于对活化淋巴细胞进行第二个扩增步骤的第二扩增容器，其含有第二培养基，所述第二培养基含有低浓度的IL-2;和(d)用于对活化淋巴细胞进行第三个扩增步骤的第三扩增容器，其含有第三培养基，所述第三培养基含有中等浓度的IL-2。本发明还提供另一种用于扩增活化淋巴细胞的培养系统，其包括(a)用于活化生物学样品中的淋巴细胞并同时进行第一个扩增步骤的第一扩增容器，其含有淋巴细胞活化剂和第一培养基，所述第一培养基含有高浓度的IL-2;(b)用于对活化淋巴细胞进行第二个扩增步骤的第二扩增容器，其含有第二培养基，所述第二培养基含有低浓度的IL-2;和(C)用于对活化淋巴细胞进行第三个扩增步骤的第三扩增容器，其含有第三培养基，所述第三培养基含有中等浓度的IL-2。优选地，本发明的培养系统中使用的淋巴细胞活化剂是固定化的抗CD3抗体。优选地，在本发明的培养系统中，所述第一培养基中的IL-2的浓度可以是例如1000U/ml至6000U/ml，所述第二培养基中的IL-2的浓度可以是例如1U/ml至500U/ml，所述第三培养基中的IL-2的浓度可以是例如300U/ml至750U/ml。在本发明的培养系统中，所述第一和/或第二和/或第三培养基中还可以含有其他细胞因子，例如IL-7和/或IL-15。优选地，所述第一和/或第二和/或第三培养基中IL-7的浓度可以是例如l-100ng/ml，而IL-15的浓度可以是例如l-200ng/ml。在本发明的培养系统中，所述第一、第二、和第三培养基可以是相同的或者不同的。优选地，所述第一培养基是RPMI-1640培养基，所述第二培养基是AIM-V培养基，所述第三培养基是DMEM培养基。所述第一、第二、和第三培养基也可以是混和培养基。本发明还提供一种免疫治疗方法，包括给个体施用通过上述本发明的扩增活化淋巴细胞的方法而获得的扩增的活化淋巴细胞(EAL)。在本发明的免疫治疗方法的一个实施方式中，通过上述扩增方法所获得的淋巴细胞是扩增的活化自体淋巴细胞(ExpandedActivatedAutologousLymphocytes,S卩EAAL)，且所述免疫治疗方法包括以下步骤(i)从个体获得含有淋巴细胞的生物学样品；(ii)采用上述本发明的扩增活化淋巴细胞的方法扩增所述淋巴细胞，由此获得扩增的活化自体淋巴细胞；和(m)将所述扩增的活化自体淋巴细胞回输给所述个体。本发明的免疫治疗方法可用于治疗患有例如肿瘤、感染性疾病、先天性或后天性免疫缺陷症的个体。可使用本发明的免疫治疗方法进行治疗的肿瘤例如为肺癌、贲门癌、结肠癌、乳腺癌、髓母细胞瘤、胃癌、肾癌、和恶性黑色素瘤，且患有肿瘤的个体可以是正在接受放疗和/或化疗的个体。可使用本发明的免疫治疗方法进行治疗的感染性疾病例如为病毒感染，特别是乙型和丙型肝炎病毒感染。图1:30例2周活化/扩增培养的细胞培养前后细胞扩增倍数分析。图2:25例2周活化/扩增培养的细胞培养前后淋巴细胞表型分析。图3:EAAL回输后，病人体内分泌IFN-Y的外周血淋巴细胞比例明显增多。图4:EAAL回输后，病人外周血中CD8+T细胞的比例明显升高(p=0.0036)。图5:EAAL回输后，病人外周血中CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例明显下降(p-0.0333)。图6:复发的乳腺癌，以本发明的EAAL治疗后(5次回输)肿瘤标志物水平下降。具体实施例方式本发明提供了一种高效扩增活化淋巴细胞的方法和用于所述方法的培养系统，所述培养系统也称为高效扩增活化淋巴细胞的试剂盒(ExpandedActivatedLymphocyteKit,EALKit)。本发明的扩增方法基于传统CIK方法改良产生，是一种高效CIK细胞培养方法。培养/扩增方法
技术领域：
：本发明的扩增活化淋巴细胞的方法包括(a)淋巴细胞活化步骤，其中将含有淋巴细胞的生物学样品与淋巴细胞活化剂相接触，接触的时间和条件足以使得所述生物学样品中的淋巴细胞发生活化；(b)第一个扩增步骤，其中将步骤(a)中得到的活化淋巴细胞在含有高浓度IL-2的第一培养基中进行培养；(c)第二个扩增步骤，其中将步骤(b)中得到的淋巴细胞在含有低浓度IL-2的第二培养基中进行培养；(d)第三个扩增步骤，其中将步骤(c)中得到的淋巴细胞在含有中等浓度IL-2的第三培养基中进行培养；和(e)收集步骤(d)中得到的扩增的活化淋巴细胞。在本发明的方法的一个实施方式中，淋巴细胞活化步骤与第一个扩增步骤在同一个培养容器中同时进行。淋巴细胞能够使用本发明的方法进行培养和扩增的淋巴细胞可来自外周血淋巴细胞。待扩增的淋巴细胞也可以是其他生物学样品中存在的淋巴细胞，例如上皮淋巴细胞、肿瘤内浸润淋巴细胞、癌性腹水或胸水中的浸润淋巴细胞等。由于外周血中的淋巴细胞分离简便、分离后淋巴细胞生存率高等原因，因此优选地使用分离自新鲜外周血的淋巴细胞。淋巴细胞活化术语"淋巴细胞活化"是指应用特异性抗原或非特异性淋巴细胞刺激剂/分子刺激淋巴细胞，导致淋巴细胞合成大分子物质(RNA、蛋白质、DNA)及细胞因子。淋巴细胞活化后进行细胞增殖，并分化为不同功能的子代效应细胞和记忆细胞。术语"淋巴细胞活化剂"是指能够刺激淋巴细胞活化的试剂/分子。例如，可以使用抗CD3抗体作为淋巴细胞活化剂，该试剂刺激T细胞表面的CD3分子，通过T细胞受体有效活化T淋巴细胞。淋巴细胞有丝分裂原是另一类有效的淋巴细胞活化剂。这类分子快速活化淋巴细胞，其作用不通过T淋巴细胞受体。合适的淋巴细胞活化剂的实例是抗CD3抗体。在本发明的淋巴细胞扩增方法的一个具体实施方式中，所述淋巴细胞活化剂是固定化于基质表面的抗CD3抗体。使用固定化的抗CD3抗体是优选的，因为其主要活化具有细胞杀伤功能的CD8+T细胞，这特别有利于提高所扩增的淋巴细胞的抗肿瘤活性。制备含有固定化的抗CD3抗体的培养容器的方法是已知的，且在下文中有详细的描述。细胞因子传统淋巴细胞扩增方法所采用的促进淋巴细胞增殖的细胞因子主要为IL-2、IL-4、IL-la及y干扰素(IFN-Y)。这种细胞因子的配伍形式主要使得CD3+CD56+细胞、CD4+T细胞禾QCD8+T细胞增殖。在本发明中，细胞因子主要使用IL-2。IL-2可以高效率、高专一性地扩增CD8+T细胞，而CD8+T细胞是免疫系统发挥抗肿瘤作用的最重要的细胞成分。传统淋巴细胞扩增方法所采用的细胞因子IL-2的浓度从培养开始至结束，始终使用同一浓度。而与传统方法不同的是，本发明在不同培养阶段使用不同浓度的IL-2。根据本发明，为在短时间内获得大量具有迅速增殖能力的淋巴细胞，在第一个扩增步骤(b)中将步骤(a)中得到的活化淋巴细胞在含有高浓度IL-2的第一培养基中进行培养。优选地，所述第一培养基中IL-2的浓度范围是例如1000U/ml至6000U/ml。细胞在所述第一个扩增步骤中生长至第7-14天。考虑到培养液营养的消耗及IL-2和其它细胞因子活性的降低，每天适量地添加新鲜培养液是非常重要的。在第二个扩增步骤(c)中，将步骤(b)中得到的淋巴细胞在含有低浓度IL-2的第二培养基中继续培养，这样可使得细胞在培养容器中保持增殖速度，并不被过度活化。优选地，所述第二培养基中IL-2的浓度范围是例如1U/ml至500U/ml。细胞在所述第二个扩增步骤中生长3-7天。培养的第10-14天进入第三个扩增步骤(d)，其中将步骤(c)中得到的淋巴细胞在含有中等浓度IL-2的第三培养基中进行培养。优选地，所述第三培养基中IL-2的浓度范围是例如300U/ml至750U/ml。细胞在所述第三个扩增步骤中继续培养3-7天，以便大量扩增细胞，使细胞数目满足临床使用要求。采用本发明的方法，淋巴细胞可达到100倍、甚至IOOO倍以上的扩增。除IL-2以外，本发明的扩增方法中还可进一步加入其他能够促进淋巴细胞增殖的细胞因子。例如，还可在培养基中加入白细胞介素-7(IL-7)和/或白细胞介素-15(IL-15)，以便通过维持记忆细胞的生存能力并减少细胞活化后的死亡，从而达到最好的细胞扩增效果和细胞活性的保持。在本发明的方法中，所述步骤(b)和/或(c)和/或(d)的培养基中IL-7的浓度优选地是l-100ng/ml，而IL-15的浓度优选地是l-200ng/ml。扭养基传统方法所采用的淋巴细胞培养/扩增方案均采用一种固定的细胞培养基，如RPMI-1640或DMEM等。但在本发明的方法中，所述步骤(b)、(c)、和(d)的培养基可以是不同的。优选地，所述第一培养基是RPMI-1640培养基，所述第二培养基是AIM-V培养基，所述第三培养基是DMEM培养基。通过改变不同细胞培养阶段所采用的细胞培养基，可以为细胞提供更为充足的营养成分，提高细胞的增殖能力，进而增加其扩增倍数。此外，在本发明的方法中，所述第一、第二、和第三培养基也可以是混和培养基。此外，所述第一、第二、和第三培养基还可以加入其他有助于淋巴细胞扩增的成分，例如胎牛血清或者人血清。培养基中血清的浓度为1-20%。使用前将血清在37。C解冻后，在56。C加热30分钟使其灭活。术语"混和培养基"在此是指常规培养基，如RPMI-1640，DMEMIMEM，AIM-V等，的一种或多种的混合。培养方式在本发明的方法中，可以使用任何适合用于淋巴细胞活化和扩增的培养容器。例如，本发明的方法可采用细胞培养瓶进行细胞培养，也可采用密闭的细胞培养袋系统进行细胞的扩增培养。培养容器的容积应该满足对细胞进行大量扩增的需要。可用于本发明的培养袋例如可以容纳相当于10-20个T225细胞培养瓶所容纳的细胞数目，这样可大大降低培养细胞的工作量，同时密闭系统大幅度降低了操作中污染的可能性。例如，可以通过瓶式扩增进行所述的第一个扩增步骤，并通过袋式扩增进行所述的第二个扩增步骤和所述的第三个扩增步骤。优选地，在本发明的方法中，淋巴细胞活化步骤与第一个扩增步骤在同一个瓶式扩增容器中同时进行。优选地，所述的第一个扩增步骤进行'7-14天，所述的第二个扩增步骤进行3至7天，且所述的第三个扩增步骤进行3至7天。在本发明的方法中，在进行步骤(e)之前，可以将第三个扩增步骤重复一或多次。使用本发明的扩增活化淋巴细胞的方法，所述生物学样品中的淋巴细胞可被扩增至少10倍、优选地至少100倍、更优选地至少1000倍。优选地，其中扩增后的细胞主要为CD8+T细胞和NK细胞，例如，所扩增的活化淋巴细胞中，008+丁细胞可〉50%。培养/扩增系统制备活化培养容器活化培养容器用于活化生物学样品中的淋巴细胞，其含有淋巴细胞活化剂。在一个具体的实施方式中，本发明的培养/扩增系统使用的活化培养容器含有固定化于不溶性载体例如所述容器表面的抗CD3抗体作为淋巴细胞活化剂。在制备含有固定化于不溶性载体的抗CD3抗体的活化培养容器时，可将抗CD3抗体以灭菌的磷酸氯化钠缓冲液(PBS)稀释成1-50ug/ml的浓度使用。不足lug/ml的浓度时，T细胞的增殖倾向于不充分，超过50ug/ml时，T细胞的增殖虽然充分，但没有固定于不溶性载体的、自由的抗CD3抗体倾向于增多。另外，作为稀释液，只要是灭菌的磷酸氯化钠缓冲液等生理溶液即可，不作特别限定，作为保护剂，可加入白蛋白、琼脂糖等。将稀释的抗CD3抗体无菌地平铺于培养瓶的底面。固定时的反应温度为4-4(TC，更优选为4-25°〇，最优选为4-l(TC。不足4匸时，抗CD3抗体的固定化效率倾向于降低，超过40'C时，抗CD3抗体的活性倾向于降低。固定化时的反应时间为30分钟-24小时，优选1小时至24小时。不足30分钟时，抗CD3抗体的固定化量倾向于降低，超过24小时时，固定时间过长，生产效率倾向于降低。紧接着上述抗CD3抗体的固定化，要除去没被固定的残余的抗CD3抗体稀释液。通过使用磷酸氯化钠缓冲液(PBS)等适当的清洗液清洗没有被固定的抗CD3抗体，使其干燥。干燥方法可以在去除清洗液以后利用4-l(TC冷库中的自然干燥、10-4(TC的加温干燥、冻千等方法。考虑到抗CD3抗体的活性和稳定性，优选冻干，最优选4-l(TC冷库中的自然干燥。如上所述，在不溶性载体的表面抗CD3抗体被固定化，得到该抗CD3抗体的固定化表面被干燥的T细胞培养用载体，无菌密封后获得活化培养容器。制备第一扩增容器第一扩增容器用于对活化淋巴细胞进行第一个扩增步骤，其含有第一培养基，所述第一培养基含有高浓度的IL-2。优选地，所述第一培养基中的IL-2的浓度是1000U/ml至6000U/ml。用基础培养基RPMI-1640培养基稀释IL-2浓度为100G-6000U/ml。为提高细胞的存活率和生存时间，可加入IL-7和/或IL-15。浓度分别为l-100ng/ml和l-200ng/ml。随后，将培养基配成体积比为含有1-20%的胎牛血清或人血清(将血清在37。C解冻后，在56。C加热30分钟使其灭活)的细胞培养基，但为了促进淋巴细胞增殖，一般优选2-10(V/V)%。培养基优选地使用灭菌的RPMI-1640培养基，但并不仅限于此，其他适合于淋巴细胞的培养基或混合培养基均可使用。如此制备得到用于第一扩增容器的第一培养基。当活化步骤与第一扩增步骤同时进行时，，可直接将如上所述配制的培养基加入到上述活化培养容器中。制备第二扩增容器第二扩增容器用于对活化淋巴细胞进行第二个扩增步骤，其含有第二培养基，所述第二培养基含有低浓度的IL-2。优选地，所述第二培养基中的IL-2的浓度是1U/ml至500U/ml。优选地，第二扩增容器可以使用袋式培养容器。用AIM-V培养基稀释IL-2浓度为1-500U/ml。为提高细胞的存活率和生存时间，可加入IL-7和/或IL-15。浓度分别为l-100ng/ml和1-200ng/ml。随后，将培养基配成体积比为含有1-20%的胎牛血清(将血清在37。C解冻后，在56'C加热30分钟使其灭活)的细胞培养基。如此制备得到用于第二扩增容器的第二培养基。第二培养培养基采用AIM-V培养基效果最好，但并不仅限于此，其它适合于淋巴细胞的培养基或混合培养基亦可。制备第三扩增容器第三扩增容器用于对活化淋巴细胞进行第三个扩增步骤，其含有第三培养基，所述第三培养基含有中等浓度的IL-2。优选地，所述第三培养基中的IL-2的浓度是300U/ml至750U/ml。优选地，第三扩增容器可以使用袋式培养容器。用DMEM培养基稀释IL-2浓度为300-750U/ml。为提高细胞的存活率和生存时间，可加入IL-7和/或IL-15，浓度分别为l-100ng/ml禾口1-200ng/ml。随后，将培养基配成体积比为含有1-20%的胎牛血清(将血清在37。C解冻后，在56。C加热30分钟使其灭活)的细胞培养基。如此制备得到用于第三扩增容器的第三培养基。第三培养基采用DMEM培养基效果最好，但并不仅限于此，其它适合于淋巴细胞的培养基或混合培养基亦可。免疫治疗方法
技术领域：
：本发明还提供了一种免疫治疗方法，包括给个体施用通过上述本发明的扩增活化淋巴细胞的方法而获得的扩增的活化淋巴细胞(EAL)。在本发明的免疫治疗方法的一个实施方式中，通过上述扩增方法所获得的淋巴细胞是扩增的活化自体淋巴细胞(ExpandedActivatedAutologousLymphocytes,艮卩EAAL)，且所述免疫治疗方法包括以下步骤(i)从个体获得含有淋巴细胞的生物学样品；(ii)采用上述本发明的扩增活化淋巴细胞的方法扩增所述淋巴细胞，由此获得扩增的活化自体淋巴细胞；和(iii)将所述扩增的活化自体淋巴细胞回输给所述个体。在本发明的免疫治疗方法中，当所使用的扩增的淋巴细胞是自体淋巴细胞时，我们称其为扩增活化自体淋巴细胞疗法(即ExpandedActivatedAutologousLymphocytes(EAAL)Therapy)。在治疗中使用的淋巴细胞来源于病人自身的少量外周血。这些淋巴细胞在约2至4周的短时间内，可以活化扩增达100-1000倍，再回输于病人体内。本发明的免疫治疗方法可用于治疗患有例如肿瘤、感染性疾病、先天性或后天性免疫缺陷症、以及器官移植后感染性疾病及感染诱发的肿瘤的个体。与传统CIK细胞不同，用此方法获得的活化细胞大部分是CD8+T淋巴细胞(>50%)。CD8+T淋巴细胞在杀伤病毒感染的细胞和癌症细胞中发挥重要的功能。人体内T淋巴细胞包括许多针对不同抗原的特异性细胞。这些细胞经过培养后，理论上它们会针对不同的肿瘤抗原/病毒抗原具有广泛的识别和杀伤效果。治疗的目的，是将这样的淋巴细胞在体外活化增殖，提高其功能，在治疗中使用，以杀伤肿瘤细胞。可使用本发明的免疫治疗方法进行治疗的肿瘤例如为肺癌、贲门癌、结肠癌、乳腺癌、髓母细胞瘤、胃癌、肾癌、和恶性黑色素瘤，且患有肿瘤的个体可以是正在接受放疗和/或化疗的个体。对一部分慢性病毒感染的病人，如乙型和丙型肝炎病人，该方法还可有效清除感染的病毒。因此也可使用本发明的免疫治疗方法治疗感染性疾病，例如病毒感染，特别是乙型肝炎病毒感染和丙型肝炎病毒感染。本发明的主要优势在于培养系统可为标准化的试剂盒系统；仅需采集20-50ml供者或者自身外周血用于分离淋巴细胞;对供者或病人淋巴系统损伤小；节约费用；提高病人对放化疗的耐受，可与放化疗联合治疗；可高频率治疗；扩增效率高，可达100—1000倍细胞扩增；自体不同时间、不同个体之间、不同实验室间均具有稳定的可重复性；细胞稳定，在扩增后24小时内保持细胞活性，可在12小时内细胞回输；可长途运输。实施例以下实施例用于例证本发明，其无意于以任何方式对本发明进行限制。l.细胞活化首先制备以固定化的抗CD3抗体包被的培养瓶。将抗CD3抗体(Ortho)以灭菌的磷酸氯化钠缓冲液(PBS)稀释至10"g/ml。将稀释的抗CD3抗体无菌地平铺于培养瓶(Costa)的底面。4"C过夜。用磷酸氯化钠缓冲液(PBS)清洗没有被固定的抗CD3抗体后在4-l(TC冷库中自然干燥，得到该抗CD3抗体的固定化表面被干燥的T细胞培养用载体，无菌密封后获得活化培养容器。用肝素盐水处理的注射器采集人静脉血全血20ml，加入20mi生理盐水，进行2倍稀释，将每10ml稀释后的血液加在3ml的密度梯度离心剂Ficoll-Paque(Sigma國AldrichCorp.,St.Louis,MO,U.S.A.)上层，在1600rpm、25分钟、20。C条件下进行离心(Beckman,Fullerton,CA,U.S.A.,S4750A)，回收淋巴细胞。将分离的淋巴细胞用RPMI-1640培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA，U.S.A.)洗3次，最后制成细胞密度约2X106/ml的细胞悬液。将此细胞悬浊液5ml(1乂107个)加入上述活化培养容器(包被了固定化的抗CD3抗体的培养瓶)中，在50ml含6000U/ml的IL-2的如上所述的第一扩增试剂中开始培养。2.细胞扩增培养的第2天起，显微镜(中国重庆光学仪器厂，CKX-41)下观察细胞，如细胞增殖良好，共加入180ml如上所述的第一扩增试剂，细胞在此条件下生长至第7天。考虑到培养液营养的消耗及IL-2(美国诺华制药厂，中国北京四环制药厂)和其它细胞因子活性的降低，每天适量地添加新鲜培养液是非常重要的。将细胞及培养基一起，在培养的第7天后转入如上所述的第二扩增试剂中，在细胞培养袋中继续生长3天。培养的第10天，将如上所述的第二扩增试剂中的细胞与如上所述的第三扩增试剂混合均匀后，在两个细胞培养袋中继续培养4天。如需更多数目的细胞，可以继续将两个细胞培养袋中的细胞再与一个如上所述的第三扩增试剂中的试剂混合均匀后，在三个培养袋中继续培养。3.细胞收获将培养袋中的细胞转入离心管中，1600rpm，离心10分钟。细胞用1%白蛋白(中国北京天坛生物制品公司)溶液洗两次后，重悬于5%的白蛋白-生理盐水中，进行以下检测。4.自体淋巴细胞扩增的倍数使用本发明培养后的人淋巴细胞起始数量为20mi外周静脉血。培养前单个核细胞起始数量约为0.5-5X107。培养后，细胞数目在两周内平均可增加323倍(图1)，三周至四周培养后细胞可扩增1000倍以上。5.扩增后自体淋巴细胞的表型淋巴细胞的表型检测方法如下进行标记的细胞每管106个细胞，根据所检测的细胞表型需要，标记以下不同组合的抗体。细胞标记采用FITC-标记的抗-CD25，PE-CY5-标记的抗-CD4，FITC-标记的抗-CD16，PE-标记的抗-CD56,PE-CY5-标记的抗-CD8(Becton-Dickinson,MountainView,CA,U.S.A.),PE-标记抗-CD8(ebioscience,SanDiego,CA，U.S.A.)和ECD-标记的抗-CD3(BeckmanCoulter,Fullerton,CA，U.S.A.)。相应的同型抗体用于背景校正。表型分析使用库尔特流式细胞仪(COULTEREPICSXL)，软件为COULTEREXP032ADC(BeckmanCoulter,Fullerton,CA,U.S.A.)。本发明所采用的起始细胞为外周血单个核细胞，其中T淋巴细胞约为40-70%，NK细胞约为1-5%。经过培养后，细胞的主要成分为T淋巴细胞和NK细胞(>95%)。其中CD8+T细胞的比例约为50-95%(图2)。而CD8+的T淋巴细胞和NK细胞是机体发挥抗肿瘤，抗病毒作用的最主要淋巴细胞成分。同时，本发明方法培养后的细胞CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例明显下降，有利于淋巴细胞抗肿瘤作用的发挥。6.用于肿瘤患者的效果将按照本发明的方法制备的淋巴细胞回输给病人，细胞的给药量可根据临床需要而定，优选为每次细胞量为5x109。1)提高肿瘤患者体内抗肿瘤细胞因子Y干扰素(IFN-Y)的水平。细胞内细胞因子Y干扰素(IFN-Y)水平的检测方法如下自接受EAAL回输的患者釆集淋巴细胞。将2x106/孔细胞铺于24孔板，使用PMA(10ng/ml;Sigma-AldrichCorp.,St.Louis,MO,U.S.A.)禾口Ionomycin(1ug/ml;Sigma-AldrichCorp"St.Louis,MO,U.S.A.),在monensin(10PM;Sigma-AWrichCorp.,St,Louis,MO,U.S.A.)存在的条件下在刺激6小时。收获细胞，用抗表面分子的单克隆抗体如ECD-CD3禾卩PE-CY5-CD8室温染色15分钟。用PBS洗后，用Cyt叩erm(Becton-Dickinson,MountainView,CA,U.S.A.)禾n含0,1%saponin(Sigma-AldrichCorp.,St.Louis,MO,U.S.A.)的渗透液处理20分钟后，加入PE-结合的抗-IFN-Y抗体(ebioscience,SanDiego,CA，U.S.A.)或同型对照，4。C孵育30分钟后，用PBS洗后，同上流式细胞仪分析结果。在使用EAAL方法治疗的肿瘤患者体内，回输后，其分泌抗肿瘤细胞因子IFN-Y的淋巴细胞数目明显增多(图3，左)。同时，分泌IFN-Y的量明显上升(图3，右)。IFN-Y除本身具有抑制和杀伤肿瘤的作用外，对机体免疫系统还具有重要的调节作用。它可使免疫系统的功能趋向于Thl方面平衡，即发挥杀伤性功能。而肿瘤病人体内由于肿瘤分泌的免疫抑制因子的作用，机体免疫环境多为免疫杀伤抑制性环境，阻碍了杀伤性淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤。因此，EAAL在抗肿瘤治疗的作用机制除直接杀伤或抑制肿瘤生长外，可能还包括改善患者体内的免疫抑制性环境，优化肿瘤杀伤的免疫环境(见下文(2))。2)调节肿瘤患者免疫系统，明显提高具有抗肿瘤作用的淋巴细胞在免疫系统中的比例。细胞表型的分析方法同前。EAAL回输后，病人外周血淋巴细胞中CD8+T细胞的比例明显上升(图4)，CD4+T细胞与CD8+T细胞的比例明显下降(图5)。说明病人的免疫系统趋向于向免疫杀伤功能的淋巴细胞平衡。3)在部分肿瘤患者中显示出消除肿瘤的作用。经过EAAL回输治疗，部分患者显示出肿瘤部分消退，肿瘤稳定，和生活质量的明显改善的治疗效果(见病例报告及表1)。病例报告1非小细胞肺癌脑转移患者该患者在接受EAAL治疗期间和前三个月没有接受其它任何治疗，治疗前后脑CT显示，转移灶缩小。病例报告2复发的乳腺癌，治疗后(5次回输)肿瘤标志物CA15.3水平下降(图6)。病例报告3小脑躬l部髓母细胞瘤术后第二次脑脊髓广泛种植复发，血象一直较低，无法正常整套的化疗疗程。其主管医生采用EAAL疗法配合化疗，即每次化疗后7天，回输EAAL，每周一次，连续多次。最后一次回输后2周开始，做下一次化疗。该患者在5个月时间内，经历了2个化疗疗程后，6次EAAL治疗后，核磁共振结果显示转移灶大部分消失。患者在化疗间期的自觉生活质量较第一次复发治疗时明显改善，治疗期间不需像第一次复发化疗那样做无菌隔离，患者在化疗间期一直坚持爬山锻炼，没有出现过因贫血导致的心慌、气短等症状，无食欲下降、体重减轻、睡眠不良等化疗副反应症状。病例报告4结肠癌双肺转移患者，女，65岁，化疗+EAAL回输治疗病人食睡正常，精神体力良好，咳嗽消失，复查显示肺部病灶有所縮小，多个淋巴结转移有所好转。表l.部分患者经EAAL回输治疗后的临床效果。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>权利要求1、一种扩增活化淋巴细胞的方法，包括(a)淋巴细胞活化步骤，其中将含有淋巴细胞的生物学样品与淋巴细胞活化剂相接触；(b)第一个扩增步骤，其中将步骤(a)中得到的活化淋巴细胞在含有浓度为1000U/ml至6000U/ml的IL-2的第一培养基中进行培养；(c)第二个扩增步骤，其中将步骤(b)中得到的淋巴细胞在含有浓度为1U/ml至750U/ml的IL-2的第二培养基中进行培养；(d)第三个扩增步骤，其中将步骤(c)中得到的淋巴细胞在含有浓度为300U/ml至1000U/ml的IL-2的第三培养基中进行培养；和(e)收集步骤(d)中得到的扩增的活化淋巴细胞。2、权利要求1的方法，其中所述淋巴细胞活化步骤(a)与第一个扩增步骤(b)同时进行。3、权利要求1或2的方法，其中所述淋巴细胞活化剂是固定化的抗CD3抗体。4、权利要求1或2的方法，其中步骤(b)和域(c)和/或(d)的培养基中还含有其他细胞因子。5、权利要求4的方法，其中所述其他细胞因子是IL-7和/或IL-15。6、权利要求5的方法，其中IL-7的浓度为l-100ng/ml和/或IL-15的浓度为l-200ng/ml。7、权利要求1或2的方法，其中所述第一培养基是RPMI-1640i肯养基。8、权利要求1或2的方法，其中所述第二培养基是AIM-V培养基。9、权利要求1或2的方法，其中所述第三培养基是DMEM培养基。10、权利要求1或2的方法，其中所述第一、第二、和第三培养基是相同的培养基或混和培养基。11、权利要求1或2的方法，其中步骤(b)中所述的第一个扩增步骤进行7-14天，步骤(c)中所述的第二个扩增步骤进行3至7天，且步骤(d)中所述的第三个扩增步骤进行3至7天。12、权利要求11的方法，其中在进行步骤(e)之前，任选地将步骤(d)重复一或多次。13、权利要求1至12中任一项的方法，其中淋巴细胞被扩增100至1000倍。14、权利要求13的方法，其中扩增后的细胞主要为CD8+T细胞(〉50。/。)和NK细胞。15、一种用于扩增活化淋巴细胞的培养系统，其包括(a)用于活化生物学样品中的淋巴细胞的活化培养容器，其含有淋巴细胞活化剂；(b)用于对活化淋巴细胞进行第一个扩增步骤的第一扩增容器，其含有第一培养基，所述第一培养基含有浓度为1000U/ml至6000U/ml的IL-2;(c)用于对活化淋巴细胞进行第二个扩增步骤的第二扩增容器，其含有第二培养基，所述第二培养基含有浓度为1U/ml至750U/ml的IL-2;和(d)用于对活化淋巴细胞进行第三个扩增歩骤的第三扩增容器，其含有第三培养基，所述第三培养基含有浓度为300U/ml至1000U/ml的IL-2。16、一种用于扩增活化淋巴细胞的培养系统，其包括(a)用于活化生物学样品中的淋巴细胞并同时进行第一个扩增步骤的第一扩增容器，其含有淋巴细胞活化剂和第一培养基，所述第一培养基含有浓度为1000U/ml至6000U/ml的IL-2;(b)用于对活化淋巴细胞进行第二个扩增步骤的第二扩增容器，其含有第二培养基，所述第二培养基含有浓度为1U/ml至750U/ml的IL-2;和(c)用于对活化淋巴细胞进行第三个扩增步骤的第三扩增容器，其含有第三培养基，所述第三培养基含有浓度为300U/ml至1000U/ml的IL-2。17、权利要求15或16的培养系统，其中所述淋巴细胞活化剂是固定化于所述容器表面的抗CD3抗体。18、权利要求15或16的培养系统，其中所述第一和/或第二和/或第三培养基中还含有其他细胞因子。19、权利要求18的培养系统，其中所述其他细胞因子是IL-7禾口/或IL-15。20、权利要求19的培养系统，其中IL-7的浓度为l-100ng/ml禾口/或IL-15的浓度为l-200ng/ml。21、权利要求15或16的培养系统，其中所述第一培养基是RPMI-1640培养基。22、权利要求15或16的培养系统，其中所述第二培养基是AIM-V培养基。23、权利要求15或16的培养系统，其中所述第三培养基是DMEM培养基。24、权利要求15或16的培养系统，其中所述第一、第二、和第三培养基是相同的培养基或混和培养基。全文摘要本发明涉及扩增活化淋巴细胞的方法，其包括将含有淋巴细胞的生物学样品与固定化的抗CD3抗体相接触，然后以含有不同浓度IL-2的培养基培养活化的淋巴细胞，以扩增活化的淋巴细胞。本发明还涉及用于扩增活化淋巴细胞的培养系统。所扩增的活化淋巴细胞可用于对肿瘤、感染性疾病、先天性或后天性免疫缺陷症进行免疫治疗。文档编号A61K35/26GK101302491SQ20071010285公开日2008年11月12日申请日期2007年5月9日优先权日2007年5月9日发明者歈王申请人:歈王