专利名称：：用于hiv预防或治疗性免疫的疫苗的制作方法用于HIV预防或治疗性免疫的疫苗本申请是申请日为2001年1月29日，申请号为01807156.2,发明名称为"用于HIV预防或治疗性免疫的疫苗"的发明专利申请的分案申请。本发明涉及HIV蛋白在医药中的新用途以及包含所述HIV蛋白的疫苗组合物。本发明尤其涉及HIVTat和HIVgpl20蛋白的联合应用。此外，本发明涉及HIVNef和fflVgpl20蛋白的联合应用。HIV-1是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的主要原因，获得性免疫缺陷综合征被认为是世界主要健康问题之一。尽管世界范围内进行了深入研究以便获得疫苗，但是这方面的努力迄今仍然没有获得成功。HIV包膜糖蛋白gpl20是用于粘附宿主细胞的病毒蛋白。这种粘附通过与称为CD4的辅助T细胞和巨噬细胞的两种表面分子和两种趋化因子受体CCR-4或CXCR-5之一结合而介导产生。gpl20蛋白首先表达为较大的前体分子(gp160),然后翻译后切割产生gpl20和gp41。gpl20蛋白通过与gp41分子(它插入病毒膜中)连接而保留在病毒体表面。gpl20蛋白是中和抗体的主要靶，但遗憾的是gp120蛋白最具免疫原性的区段(V3环)也是该蛋白变异性最大的部分。因此，认为前体gpl20(或其前体gpl60)用作激发中和抗体的疫苗抗原对于广泛的保护性疫苗仅具有有限的作用。gpl20确实还含有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别性表位。CTL效应细胞能够消除病毒感染细胞，因此构成第二种主要抗病毒免疫机制。与中和抗体的目标区段相反，某些CTL表位似乎在不同fflV病毒片朱中相对保守。为此，认为gpl20和gpl60是疫苗有效抗原性组分，目的在于激发细胞介导的免疫应答(特别是CTL)。已经有关于HIV-1非包膜蛋白的介绍，包括例如内部结构蛋白，例如gag和po/基因产物，以及其它非结构蛋白，例如Rev、Nef、Vif和Tat(Greene等，NewEnglandJ.Med,324,5,308以及下列文献等等(1991);Bryant等(Ed.Pizzo),Pediatr.Infect.Dis.J.,11,5,390以下下列文献等等(1992)。HIVTat和Nef蛋白是早期蛋白，即它们在感染早期及缺乏结构蛋白的情况下表达。在会议论文集中(C.DavidPauza,ImmunizationwithTattoxoidattenuatesSHIV89.6PDinfectioninrhesusmacaques,12thCentGardesmeeting,Marnes-La-Coquette,26.10.1999)，介绍了各种实验，其中单独用Tat类毒素或者联用包膜糖蛋白gpl60疫苗组合(一剂重组痘苗病毒和一剂重组蛋白)免疫恒河猴。然而，所观测到的结果表明，存在包膜糖蛋白并不优于单独用Tat进行的实验。但是，我们发现在保护恒河猴免受嵌合人-猿猴免疫缺陷病毒(SHIV)致病性攻击时，包含Tat-和/或Nef-的免疫原(尤其是Nef-Tat融合蛋白)与gpl20协同作用。迄今，认为恒河猴SfflV感染是人AIDS最相关的动物模型。所以，我们应用该临床前模型评价了单独或者组合包含gpl20抗原和含Nef-及Tat-的抗原的疫苗保护效力。分析两种病毒感染和致病性标记，即恒河猴外周血CD4阳性细胞百分率和血浆游离SfflVRNA基因组浓度，表明所述两种抗原协同作用。单独用gpUO或NefTat+SIVNef免疫与只用佐剂免疫相比，没有任何差异。相反，联合给予gpl20和NefTat+SIVNet抗原导致上述具体实验组所有动物的两种上述参数明显改善。因此，本发明提供HIVTat和/或Nef蛋白和HIVgpl20—起在生产用于人HIV预防或治疗性免疫的疫苗中的新用途。如上所述，相对于只用NefTat+SIVNef或gpl20观测到的结果，一起给予NefTat蛋白、SIVNef蛋白和gpl20蛋白的免疫应答增强。这种增强作用或协同作用作为应用上述组合蛋白免疫的结果可以表现为病毒负荷下降。另一方面，增强作用本身还表现为CD4+维持水平高于没有用mVNefTat、SIVNef和HIVgpl20免疫的维持水平。这种协同作用的原因是gpl20与Tat或者gpU0与Nef、或者gpl20与Nef和Tat二者组合所致。加入其它HIV蛋白还可进一步增强gpl20与Tat和/或Nef之间观测到的协同作用。所述其它蛋白也可以与含gpl20、Tat和/或Nef的疫苗各个组分协同作用，而不需要存在所有原抗原组合。所述其它蛋白可以是HIV调节蛋白，例如Rev、Vif、Vpu和Vpr。它们也可以是得自HlVg"g或/o/基因的结构蛋白。HIVgag基因编码前体蛋白p55,p55能够自动装配成未成熟病毒样颗粒(VLP)。然后，前体蛋白p55蛋白酶解为主要结构蛋白p24(壳体蛋白)和pl8(基质蛋白)，以及若干较小蛋白。可以认为前体蛋白p55和其主要衍生物p24及p18均为合适疫苗抗原，它们可以进一步增强gpl20与Tat和/或Nef之间观测到的协同作用。前体蛋白p55和壳体蛋白p24可用作VLP或单体蛋白。本发明疫苗中HIVTat蛋白可以任选与HIVNef蛋白连接，例如作为融合蛋白。本发明中的HIVTat蛋白、HIVNef蛋白或NefTat融合蛋白可以具有C末端组氨酸尾，优选包含5-10个组氨酸残基。存在的组氨酸(或者"His")尾有助于纯化。在一个优选实施方案中，所述蛋白表达有组氨酸尾，包含5-10个、优选6个组氨酸残基。它们的优点是有助于纯化。已有报道，Nef(MacreadieI.G.等，1993，Yeast9(6)565-573)和Tat(BraddockM等，1989,Cell58(2)269-79)在酵母(酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae))中独立表达。Nef蛋白和Gag蛋白p55和pl8是豆蔻酸化蛋白。以前的W099/16884介绍Nef和Tat在毕赤酵母表达系统(Nef-His和Tat-His构建体)中独立表达，以M达融合构建物Nef-Tat-His。典型的Nef-His(Seq.ID.No.8和9)、Tat-His(Seq.ED.No.10和ll)和Nef-Tat-His融合蛋白(Seq.ID.No.12和13)的DNA和氨基酸序列见图1。本发明HIV蛋白可以以其天然构象使用，或者对于疫苗应用更优选可以被修饰。所述修饰可能因为涉及纯化方法的技术原因需要进行修饰，或者可用于使Tat或Nef蛋白的一种或多种功能特性生物失活。所以，本发明包括HIV蛋白衍生物，HIV蛋白衍生物可以为例如突变蛋白。术语"突变"本文用以指使用广为人知的定点诱变技术或任何其它常规方法缺失、添加或置换了一个或多个氨基酸的分子。举例来说，可以使Tat突变蛋白突变，使其生物失活，同时还保留其免疫原性表位。D.Clements(TulaneUniversity)构建的一种可能突变tat基因(源自BH10分子克隆)在活性位点区(Lys41—Ala)和RGD基元(Arg78—Lys和Asp80—Glu)中存在突变(Virology235:48-64,1997)。图l(Seq.ED.No.22和23)图示突变Tat以及Nef-Tat突变体-His(Seq.ID.No.24和25)。本发明疫苗中HIVTat或Nef蛋白可以在纯化过程中通过化学方法修饰，使得所述蛋白为稳定单体蛋白。一种防止诸如Tat或Nef的蛋白氧化聚集的方法是利用化学修饰所述蛋白巯基。笫一步是用还原剂如DTT、(3-巯基乙醇或谷胱甘肽处理还原二硫键。笫二步是使产生的巯基与烷化剂反应而使其封闭(例如可用碘乙酰胺使所述蛋白羧酰胺化/脲基曱基化)。根据细胞结合测定以及对人外周血单核细胞的淋巴细胞增殖的抑制作用评价，所述化学修饰不会改变Tat或Nef的功能特性。可用以下实施例概述的方法纯化HIVTat蛋白和HIVgpl20蛋白。本发明疫苗包含免疫保护量或者免疫治疗量的Tat和/或Nef或者NefTat及gpl20抗原，而且可用常规技术制备。有关疫苗制剂的全面介绍参见NewTrendsandDevelopmentsinVaccines,Voller等主编,UniversityParkPress,Baltimore,Maryland,U.S.A.1978。例如Fullerton的美国专利4,235,877介绍了脂质体中的包嚢化。例如Likhite的美国专利4,372,945和Armor等的美国专利4,474,757公开了蛋白质与大分子的缀合。疫苗制剂中蛋白量根据在典型接种者体内诱导免疫保护应答而没有显著副作用的剂量进行选择。所述蛋白量随所使用的具体免疫原而不同。一般来说，预期每剂包含1-1000吗各蛋白，优选2-200吗、最优选4-40pg的Tat或Nef或NefTat,而优选1-150]ug、最优选2-25pggpl20。具体疫苗的最佳量可通过包括观测患者体内的抗体滴度和其它反应的标准研究而确定。一个疫苗剂量具体实例包含20貼NefTat和5或20jiggpl20。初次免疫接种后，患者可于约4周内接受一次加强免疫，以及可以接受后续的第二次加强免疫。在本发明疫苗制剂中本发明蛋白优选佐剂化。关于佐剂的全面介绍见VaccineDesign_theSubunitandAdjuvantApproach,Powell和Newman主编,PlenumPress,NewYork,1995。合适的佐剂包括铝盐，诸如氢氧化铝凝胶(alum)或磷酸铝，但也可以是钙盐、铁盐或锌盐，或者可以是酰化酪氨酸或酰化糖的不溶性悬浮液，阳离子或阴离子衍化的多糖或聚磷腈。本发明疫苗制剂中，优选所述佐剂组合物优先诱导Thl型应答。然后，应当知道，不排除其它应答，包括其它体液免疫应答。通过所迷抗原与免疫系统细胞相互作用，从而对所迷抗原产生免疫应答。产生的免疫应答可主要分为两大类体液免疫应答或细胞机制)。这两类免疫应答称为Thl型反应(细胞介导的应答)以及Th2型免疫应答(体液免疫应答:)。非常典型的Thl型免疫应答的特征可能在于产生抗原特异性单倍型限制性细胞毒性T淋巴细胞以及天然杀伤细胞反应。在小鼠中，通常TM型应答的特征在于产生IgG2a亚型抗体，而在人类中这些抗体相当于IgGl型抗体。Th2型免疫应答的特征在于产生各种各样的免疫球蛋白同种型，在小鼠包括IgGl、IgA和IgM。可以认为产生这两种类型免疫应答的驱动力是细胞因子，细胞因子是为数众多的已鉴定的蛋白信使，其作用是辅助免疫系统细胞，控制最终免疫应答为Thl或Th2型应答。因此，高水平Thl型细胞因子往往促进诱导对给定抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平Th2型细胞因子往往促进诱导对抗原的体液免疫应答。重要的是记住，Thl型免疫应答和Th2型免疫应答的区别并不是绝对的。实际上，有个别人支持将免疫应答描述为主要是Thl型或主要是Th2型的免疫应答。然而，按照Mosmann和Coffman描述小鼠CD4+veT细胞克隆时采用的细胞因子家族分类来考虑细胞因子家族常常是便利的(MO柳"朋，n^O#7Wa",i丄(7卯"7T27;^7722不^淋S^f为、必谬谬导放不^7^教橫遂.X""""/仏vzewo//wmwo/ogy,7，#7"-773^)。传统上，Thl型反应与T淋巴细胞产生INF-y和IL-2细胞因子有关。其它常常与诱导Thl型免疫应答直接相类的细胞因子如IL-12并不是T细胞产生的。相反，Th2型反应与IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和肿瘤坏死因子(3(TNF-(3)分泌有关。已知某些疫苗佐剂特别适于刺激Thl型或Th2型细胞因子反应。传统上，在免疫接种或感染后免疫应答的Thl:Th2平衡的最佳指标包括用抗原再刺激后直接测量体外T淋巴细胞产生的Thl或Th2细胞因子，和/或测量抗原特异性抗体反应的IgGl:IgG2a比例。因此，Thl型佐剂是在体外用抗原再刺激时刺激分离的T细胞产生高水平Thl型细胞因子而且诱导产生与Thl型同种型有关的抗原特异性免疫球蛋白反应的佐剂。适用于本发明、可配制产生佐剂的优选Thl-型免疫刺激剂包括但不限于下列佐剂。单磷酰脂质A、尤其是3-de-0-酰化单磷酰脂质AOD-MPL)是优选用于本发明的TM-型免疫刺激剂。3D-MPL是RibiImmunochem，Montana生产的众所周知的佐剂。化学上它常常以具有4、5或6个酰化链的3-de-0-酰化单磷酰脂质A的混合物提供。S-de-0-酰化单磷酰脂质A的混合物可用GB2122204B中介绍的方法纯化制得，所述专利文献还公开了二磷酰脂质A及其3-0-脱酰化变异体的制备。其它纯化的合成脂多糖已有介绍(US6,005,099和EP0729473Bl;Hilgers等，1986，/"f.Jrc/.乂〃wgy./wmwio/.,79(4):392-6;Hilgers等，1987,Immunology,60(1):141-6;以及EP0549074Bl)。优选型3D-MPL为0.2以下直径的颗粒型制剂，其生产方法公开于EP0689454。皂苷也是本发明的优选Thl免疫刺激剂。皂苷是周知的佐剂，参见Lacaille-Dubois,M和WagnerH.(1996,急苷生物及药理活性综述，Phytomedicine第2巻，第363-386页)。例如QuilA(从南美洲的树Sa/70""r/aMo/Z"a获得)及其各部分介绍见US5,057,540和"皂苷用作疫苗佐剂"，Kensil,C.R.,O"ievi>wgCfi^r/erS;y对,1996，12(1-2):1-55;以及EP0362279Bl。已有介绍溶血性泉苷QS21和QS17(QuilA的HPLC纯化部分)为有效的系统佐剂，其生产方法公开于美国专利号又0^,S40和EP0362279Bl。此外，上述参考文献还介绍QS7(Quil-A的非溶血性部分)用作系统疫苗的有效佐剂。QS21的应用详见Kensil等(腦,J.Immunology第146巻，431-437)。QS21和聚山梨醇酯或环糊精联合应用也是已知的(WO99/10008)。包含QuilA部分如QS21和QS7的颗粒性佐剂系统见WO96/33739和WO96/11711。另一种优选免疫刺激剂为包含未曱基化CpG二核菩酸("CpG")的免疫刺激性寡核苷酸。CpG是存在于DNA中的胞嗜咬-鸟苦二核苷酸基元的缩写。CpG为通过系统和粘膜途径给予的佐剂，这是本领域已知的(WO96/02555，EP468520，Davis等，J./附附朋o/,1998,160(2):870-876;McCluskie和Davis，丄/mmw"o/.，1998，161(9):4463-6)。曽经观测到BCG的DNA部分可以发挥抗肺瘤效应。进一步研究表明，根据BCG基因序列获得的合成寡核苷酸能够诱导免疫刺激作用(体外及体内均具有这种作用)。上述研究的作者得出结论，某些回文序列，包括中央CG基元，具有所述免疫刺激作用。CG基元在免疫刺激中的关键作用后来由Krieg，Nature374,笫546页，1995公开阐明。详细分析表明，CG基元必定存在于某一序列环境，而且所述序列在细菌DNA中是普遍性的，而在脊推动物DNA中是罕见性的。免疫刺激性序列常常是嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中CG基元是非曱基化的，但是已知其它未曱基化CpG序列也是免疫刺激性的而且可用于本发明。在某些6个核苷酸组合中存在回文序列。数个所述基元无论是重复的一个基元还是不同基元的组合，均可存在于同一寡核苷酸中。存在一种或多种包含所述免疫刺激性序列的寡核苷酸可以激活各种免疫细胞亚群，包括天然杀伤细胞(产生y干扰素而且具有细胞溶解活性)和巨噬细胞(Wooldrige等，笫89巻(笫8期)，1977)。目前，还证实其它不具有所述共有序列的含未曱基化CpG的序列具有免疫调节性。配制成疫苗时，CpG的一般给予形式为与游离抗原一起的游离溶液(WO96/02555;McCluskie及Davis,同上)，或者与抗原共价结合(WO98/16247)，或者用诸如氢氧化铝的载体配制((肝炎表面抗原)Davis等，同上；Brazolot誦Millan等，iVoc.A^/.爿cadUSA,1998，95(26),15553-8)。如上所述的免疫刺激剂可以与载体配制在一起，例如脂质体、水包油乳剂，和或金属盐，包括铝盐(例如氢氧化铝)。例如3D-MPL可以用氢氧化铝(EP06894S4)或水包油乳剂(WO95/17210)配制；QS21可优选用含胆固醇的脂质体(WO96/33739)、水包油乳剂(WO95/17210)或alum(WO98/15287)配制；CpG可用alum(Davis等，同上；Brazolot-Millan,同上)或者用其它阳离子载体配制。此外，优选免疫刺激剂组合应用，尤其是单磷酰脂质A和皂苷衍生物组合(WO94/00153;WO95/17210;WO96/33739;WO98/56414;WO99/12565;WO99/11241)，更优选WO94/00153公开的QS21和3D-MPL组合。另一方面，CpG+皂苷如QS21组合也构成可用于本发明的有效佐剂。因此，合适的佐剂系统包括例如单磷酰脂质A、优选3D-MPL与铝盐组合。增强系统包括单磷酰脂质A和皂苷衍生物组合，特别是在WO94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合，或者在WO96/33739中公开的QS21在含胆固醇的脂质体(DQ)中猝灭的反应原性较小的组合物。WO95/17210介绍了特别有效的佐剂制剂，它包括QS21、3D-MPL和维生素E的水包油乳剂，是可用于本发明的另一种优选制剂。另一种优选制剂仅含有CpG寡核苷酸或者含有CpG寡核苷酸和铝盐。在本发明另一方面中，所述疫苗可包含编码Tat、Nef和gpl20多肽中的一种或多种多肽的DNA,使得原位产生所述多肽。所述DNA可以存在于本领域技术人员已知的众多传递系统中的任何一种传递系统中，包括核酸表达系统(如质粒DNA)、细菌和病毒表达系统。众多基因传递技术是本领域周知的，例如Rolland,Crit.Rev.Therap.DrugCarrierSystems15:143-198,1998和其中引用的参考文献描迷的传递技术。合适的核酸表达系统包含在患者体内表达所必需的DNA序列(例如合适的启动子和终止信号)。当表达系统为重组的活;徵生物时，例如病毒或细菌，目的基因可以插入活的重组病毒或细菌基因导免疫应答。用于该目的的病毒和细菌例:^:疸病毒(如痘苗病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒、修饰的痘病毒如ModifiedVirusAnkara(MVA))、曱病毒属(新培斯病毒、塞姆利基森林病毒、委内瑞拉马脑炎病毒)、黄病毒(黄热病病毒、登革病毒、日本脑炎病毒)、腺病毒、腺伴随病毒、小核糖核酸病毒(脊髓灰质炎病毒、鼻病毒)、疱渗病毒(水痘-带状疱渗病毒等)、李斯特氏菌属(Listeria)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、BCG。这些病毒和细菌可以是有毒力的，或者以各种方式减毒以获得活疫苗。这样的活疫苗也构成本发明的一部分。因此，本发明优选疫苗的Nef、Tat和gpl20组分可以以编码所需蛋白的多核苷酸形式提供。而且，可用组合的蛋白及DNA型制剂按照本发明进行免疫接种。认为初免-加强免疫诱导宽范围免疫应答是有效的。佐剂化蛋白疫苗主要诱导抗体和T辅助性免疫应答，而质粒或活载体传递的DNA诱导强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。因此，蛋白和DNA免疫结合可产生各种各样的免疫应答。这在HIV情况下特别有关，因为认为中和抗体和CTL对免疫防御fflV均是重要的。按照本发明，gpl20、Nef和Tat单独或组合免疫方案可以包括序贯("初免-加强")或同时给予蛋白抗原和编码上述蛋白的DNA。所述DNA可以以质粒DNA或重组活载体形式传递，例如痘病毒载体或者任何其它合适活载体，例如本文上述活载体。蛋白抗原可以注射一次或多次，然后给予一次或多次DNA,或者首先给予DNA一次或多次，然后进行一次或多次蛋白免疫。本发明初免-加强免疫的具体实例包括用重组活载体形式(例如修饰痘病毒载体，如ModifiedVirusAnkara(MVA)，或者曱病毒，如委内瑞拉马脑炎病毒)的DNA初免，然后用蛋白、优选佐剂化蛋白加强免疫。所以，本发明进一步提供包含以下组分的药盒a)包含部120、Nef和Tat蛋白中的一种或多种蛋白和药学上可接受的赋形剂的组合物；和b)包含gpl20、Nef和Tat编码多核苷酸中的一种或多种多核香酸和药学上可接受的赋形剂的组合物；前提是(a)或(b)中的至少一种包含gpl20和Nef和/或Tat和/或Nef-Tat。组合物a)和b)可以单独以任何顺序给予或者一起给予。优选a)包含全部三种gpl20、Nef和Tat蛋白。优选b)包含全部三种gpl20、Nef和TatDNA。最优选Nef和Tat为NefTat融合蛋白形式。本发明再一方面提供生产本文上述疫苗制剂的方法，其中所述方法包括混合本发明组合蛋白。所述蛋白组合物可以与合适佐剂、任选载体混合。可用于本发明制剂的特别优选的佐剂和/或载体组合如下i)3D-MPL+DQ中的QS21ii)Alum+3D-MPLiii)Alum+DQ中的QS21+3D-MPLiv)Alum+CpGv)3D-MPL+DQ中的QS21+水包油乳剂vi)CpG下面的实施例和附图阐明本发明。实施例总体介绍从Bm/Lai分离抹(Ce1140:9-17,1985)选择Nef基因用于以下实验的构建物，因为该基因属于与共有Nef最密切相关的基因。用于Bru/LaiNef基因的原料是在哺乳动物表达载体pcDNA3(pcDNA3/Nef)上克隆的1170bpDNA片段。Tat基因源自BH10分子克隆。该基因作为被称作pCVl的HTLVIIIcDNA克隆为人们所接受，在Science,229，笫69-73页，1985中对其进行了描述。可在毕赤酵母或者任何其它宿主中表达Nef和Tat基因。实施例1.在巴斯德毕赤酵母中表达HIV-l/^/和tof序列在曱基营养酵母巴斯德毕赤酵母中，在诱导型醇氧化酶(AOXl)启动子的控制下，表达Nef蛋白、Tat蛋白和Nef-Tat融合蛋白。为了表达这些HIV-l基因，使用修饰型整合载体PHIL-D2(INVITROGEN)。该载体以这样一种方式修饰异源蛋白的表达紧接在A0X1基因的天然ATG密码子之后，并产生具有一个甘氨酸和六个组氨酸残基尾的重组蛋白。通过在PfflL-D2载体的相邻AsuII和EcoRI位点之间克隆寡核苷酸接头，构建此PfflL-D2-MOD载体(参见图2)。除了His尾之外，此接头还携带NcoI、SpeI和XbaI限制位点，在所述限制位点之间插入恥/、tof和融合物。1.1构建整合型载体pRIT14597(编码Nef-His蛋白)、pRIT14598(编码Tat-His蛋白)和pRIT14599(编码融合物Nef-Tat-His)。用引物01和02经PCR由pcDNA3/Nef质粒扩增"e/基因。Ncol引物01(SeqIDNO1):5,ATCGTCCATG*GGT.GGC.AAG.TGG.T3,Spel引物02(SeqIDNO2):5，CGGCTACTAGTGCAGTTCTTGAA3，获得的PCR片段和PHIL-D2-MOD整合型载体都用Ncol和Spel限制，在琼脂糖凝胶上纯化，连接产生整合型质粒pRIT14597(见图2)。利用PCR，用引物05和04由pCVl质粒衍生物扩增to基因Spel引物04(SeqIDNO4):5，CGGCTAeiAQITTCCTTCGGGCCT3，Ncol引物05(SeqIDNO5):5'ATCGTCCATGGAGCCAGTAGATC3，在所述PCR片段的5'末端引入一个Ncol限制位点，而在3，末端用引物04引入一个Spel位点。获得的PCR片段和PHIL-D2-MOD载体都用NcoI和SpeI限制，在琼脂糖凝胶上纯化，连接产生整合型质粒pRIT14598。为构建pRIT14599,在PHIL-D2-MOD载体的EcoRI平端(T4聚合酶)和Ncol位点之间连接相当于"e/-toHis编码序列的910bpDNA片段。通过Xbal平端(T4聚合酶)和Ncol消化pRIT14596获得"e/-tof-His编码片^R。1.2巴斯德毕赤酵母菌林GS115(his4)的转化。为获得表达Nef-His、Tat-His和融合蛋白Nef-Tat-His的巴斯德毕赤酵母菌抹，用携带相应表达盒加上HIS4基因的线性Notl片段转化菌抹GS115,以互补宿主基因组中的his4。用Notl-线性片段转化GS115有利于在AOXI基因座重组。通过定量斑点印迹分析选择多拷贝整合克隆，并确定整合、插入(Mut+表型)或置换(Muf表型)的类型。从每次转化中选择显示高水平产生重组蛋白的一种转化体产生重组Nef-His蛋白(一种豆蔻酸化的215个氨基酸的蛋白)的菌株Y1738(Mut+表型)，所述重组Nef-His蛋白组成如下。豆蔻酸。蛋氨酸，利用PHIL-D2-MOD载体的Ncol克隆位点产生。205个氨基酸的Nef蛋白(从氨基酸2开始，延伸至氨基酸206)。通过克隆步骤产生的一个苏氨酸和一个丝氨酸(在PHIL-D2-MOD载体的Spel位点克隆)。。一个甘氨酸和六个组氨酸。产生Tat-His蛋白(一种95个氨基酸的蛋白)的菌株Y1739(Mut+表型)，所述Tat-His蛋白组成如下。蛋氨酸，利用NcoI克隆位点产生。85个氨基酸的Tat蛋白(从氨基酸2开始，延伸至氨基酸86)。通过克隆步骤引入的一个苏氨酸和一个丝氨酸。一个甘氨酸和六个组氨酸产生重组Nef-Tat-His融合蛋白(一种豆蔻酸化的302个氨基酸的蛋白)的菌抹Y1737(Muf表型)，所述Nef-Tat-His融合蛋白组成如下。豆蔻酸。蛋氨酸，利用NcoI克隆位点产生。205个氨基酸的Nef蛋白(从氨基酸2开始，延伸至氨基酸206)。通过克隆步骤产生的一个苏氨酸和一个丝氨酸。85个氨基酸的Tat蛋白(从氨基酸2开始，延伸至氨基酸86)。通过克隆步骤引入的一个苏氨酸和一个丝氨酸。一个甘氨酸和六个组氨酸实施例2.在巴斯德毕赤酵母中表达HIV-1Tat-突变体还表达了突变重组Tat蛋白。突变Tat蛋白在保持其免疫原性表位的同时，必须是生物学上无活性的。选择由D.Clements(Tulane大学)构建的双突变似f基因用于这些构成物。该加基因(源自BH10分子克隆)在活性位点区(Lys41—Ala)和在RGD基元(Arg78—Lys和Asp80—Glu)中具有突变(Virology235:48-64,1997)。所述突变加基因被认为是在CMV表达质粒(pCMVLys41/KGE)中于EcoRI和HindIII位点之间亚克隆的cDNA片段。2.1构建整合型载体pRIT14912(编码Tat突变体-His蛋白)和pRIT14913(编码融合物Nef-Tat突变体-His)。用引物05和04经PCR(参见1.1部分pRIT14598的构建)由pCMVLys41/KGE质粒扩增tof突变基因。在所述PCR片段的5'末端引入一个Ncol限制位点，而在3，末端用引物04引入一个Spel位点。获得的PCR片段和PHIL-D2-MOD载体都用Ncol和Spel限制，在琼脂糖凝胶上纯化，连接产生整合型质粒pRIT14912。为了构建pRIT14913,用引物03和04经PCR由pCMVLys41/KGE质粒扩增tof突变基因。Spel引物03(SeqIDNO3):5，ATCGTA￡I^LGAG.CCA,GTA.GAT.C3，Spel引物04(SeqIDNO4):5，CGGCT^SCAeiTTCCTTCGGGCCT3,获得的PCR片段和质粒pRIT14597(表达Nef-His蛋白)都用Spel限制酶消化，在琼脂糖凝胶上纯化，连接产生整合型质粒pRIT14913。2.2巴斯德毕赤酵母菌林GS115的转化。通过使用先前在1.2部分中描述的整合和重组菌抹选择策略，获得表达Tat突变体-His蛋白和融合物Nef-Tat突变体-His的巴斯德毕赤酵母菌4朱。选择出两种产生Tat突变体-His蛋白(一种95个氨基酸的蛋白)的重组菌冲朱Y1775(Mut+表型)和Y1776(Muf表型)。选捧出一种表达Nef-Tat突变体-His融合蛋白(一种302个M酸的蛋白)的重组菌株Y1774(Muf表型)。实施例3:发酵产生重组蛋白TAT-HIS的巴斯德毕赤酵母典型过程见下表。发酵包括产生高细胞密度培养物的生长期(根据适当曲线添加甘油型培养基)以及诱导期(添加曱醇和盐/孩么量元素溶液)。发酵中，生长期跟踪取样检测其620nm的吸光度。诱导期中通过泵加入曱醇，通过气相色谱(对培养物样品)和用质谱仪在线气体分析监测曱醇浓度。发酵后，于2-8。C以5020g离心30，回收细胞，细胞浆状物保藏于-20。C。为了进行后续工作，解冻细胞浆状物，以150OD(620nm)重悬浮于缓冲液(Na2HP04pH750mM、PMSF5%、异丙醇4mM)，通过DynoMill(空间0.6L,3000rpm,6L/H,珠粒直径0.40-0.70謹)石皮碎细"包4次。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>发酵用培养基:固体预培养rYNB+葡萄糖+琼脂)葡萄糖lOg/1Na2Mo04,2H20:0細2g/1Acidsfolique:0.000064g/1KH2P04:lg/1MnS04.H20:0細4g/1肌醇0.064g/1MgS04.7H200.5g/1H3B03:0.0005g/1维生素B6:O細g/1CaC12.2H20:0.1g/1KI:0扁1g/1碟胺素0.008g/1NaCl:0.1g/1CoC12.6H20:0細09g/1烟酸0.000032g/1FeC13.6H20:0.0002g/1核黄素0.000016g/1Panthot6nateCa:O細g/1CuS04.5H20:0細04g/1生物素0.000064g/1对氨基苯甲睃0.000016g/1ZnS04.7H20:0.0004g/1(NH4)2S04:5g/l琼脂18g/l液体预培养(YNB+甘油)甘油2%(v/v)Na2Mo04.2H20:0.0002gAAcidefolique:0細064g/1KH2P04:lg/1MnS04.H20:0.0004g/1肌醇0.064g/1MgS04.7H200.5g/1H3B03:0細5g/1维生素B6:O還g/1CaC12.2H20:0.1g/1KI:O扁lg/1O駕g/1NaCl:0.1g/1CoC12.6H20:0.00009g/1烟酸0細032g/1FeC13.6H20:0.0002g/1核黄素0扁016g/1Panthot6nateCa:O駕g/1CuS04.5H20:0細04g/1生物素0細064g/1对氨基苯曱酸0細016g/1ZnS04.7H20:0.0004g/i(NH4)2S04:5g/1初始发酵罐装料fFSC006AA)(NH4)2S04:6.4g/1KH2P04:9g/1Na2Mo04,2H20:2.04mg/1MgS04.7H204.7g/1MnS04.H20:4.08mg/1CaC12.2H20:0.94g/1H3B03:5.1mg/1FeC13.6H20:10mg/1KI:1.022mg/1HC1:1.67mg/1CoC12.6H20:0.91mg/1CuS04.5H20:0.408mg/1NaCl:0.06g/1ZnS04.7H20:4.08mg/1生物素0.534mg/1生长期用加料液OTB005AA)甘油38.7%v/vNa2Mo04.2H20:5.7mg/lMgS04.7H2013g/1CuS04.5H20:1.13mg/lCaC12.2H20:2.6g/1CoC12.6H20:2.5mg/1FeC13.6H20:27.8mg/1H3B03:14.2mg/1ZnS04.7H20:11.3mg/l生物素1.5mg/1MnS04.H20:11.3mg/1KI:2.84mg/1KH2P04:24.93g/1NaCl:0.167g/1诱导期用盐和徵量元素加料液(TSE021AB):KH2P04:45g/lNa2Mo04.2H20:10.2mg/1MgS04.7H2023.5g/1MnS04.H20:20.4mg/1CaC12.2H20:4.70g/1H3B03:25.5mg/1NaCl:0.3g/1KI:5.11mg/lHC1:8.3ml/1CoC12.6H20:4.55mg/1CuS04.5H20:2.04mg/1FeC13.6H20:50.0mg/1ZnS04.7H20:20.4mg/1生物素2.70mg/1实施例4:纯化Nef-Tat-His融合蛋白(巴斯德毕赤酵母)由146克重组巴斯德毕赤酵母细胞(湿重)或2LDyno-mill匀浆OD55进行纯化流程。在室温下进行层析步骤。在步骤之间，Nef-Tat阳性流分在冷室(+4。C)中保存过夜；更长时间时，将样品于-2(TC冷冻保存。146克巴斯德毕赤酵母细胞勻浆緩沖液:2L50mMPO4pH7.0最终OD:50Dyno-mill破碎(4次)丄离心JA10转子/9500rpm/30min/室温Dyno-mill沉淀丄洗涤(l小时-4'C)离心丄沉淀丄溶解(0/N-4。C)i还原(4小时-室温-暗处)脲基甲基化(半小时-室温-暗处)在N广-NTA-琼脂糖(Qiagen-30ml树脂)上固定化金属离子亲和层析丄稀释丄緩冲液:+2L10mMPO4pH7.5-150mM-NaCl0.50/oempigenJA10转子/9500rpm/30min/室温緩冲液:十660ml10mMPO4pH7.5-150mMNaCl-4.0MGuHCl+0.2M2-巯基乙磺酸钠盐(加入粉末)/在温育前调节pH至7.5(用0.5MNaOH溶液)+0.25M硤乙酰胺(加入粉末)/在温育前调节pH至7.5(用0.5MNaOH溶液)平衡纟爰冲液:10mMPO4pH7.5-150mMNaCl-4.0MGuHCl洗涤緩冲液1)平t^缓冲液2)10mMP04pH7.5誦150mMNaCl-6M尿素3)10mMP04pH7.5-150mMNaCl-6M尿素-25mM咪唑洗脱緩冲液:10mMPO4pH7.5-150rnMNaCl-6M尿素-0.5M咪哇离子强度降至18mS/cm2稀释緩冲液:10mMPO4pH7.〗尿素6MSPSepharoseFF(Pharmacia_SOml树脂)阳离子交换层析浓缩Superdex200XK16/60凝胶过滤层析(Pharmacia-120ml树脂)山透析(0/N-4。C)丄过滤除菌平衡緩冲液:10mMP04pH7.5-150rnMNaCl-6.0M尿素洗涤緩沖液1)平衡緩沖液2)10mMP04pH7.5-250mMNaCl-6M尿素洗脱緩冲液:lOmM硼酸盐pH9.0-2MNaCl-6M尿素至5mg/mllOkDaOmega膜(Filtron)洗脱緩冲液:10mMP04pH7.5-150mMNaCl-6M尿素5ml样品/注射—注射5次緩冲液:10mMPO4pH6.8-150mMNaCl-0.5M精氨酸^MillexGV0.22拜*比率0.5M精氨酸1600ng/ml蛋白浓度。纯度图3通过Daiichi^!艮染色和图4通过考马斯蓝G250显示由SDS-PAGE估计的纯度7JC平。Superdex200步骤后〉95%透析和过滤除菌步骤后>95%回收由146克重组巴斯德毕赤酵母细胞—2LDyno-mill匀浆OD55)纯化得到51mgNef-Tat-his蛋白。实施例5:纯化巴斯德毕赤酵母中的氧化型Nef-Tat-His融合蛋白由73克重组巴斯德毕赤酵母细胞(湿重)或lLDyno-mill匀浆OD50进行纯化流程。在室温下进行层析步骤。在步骤之间，Nef-Tat阳性流分在冷室(+4。C)中保存过夜；更长时间时，将样品于-2(TC冷冻保存。73克巴斯德毕赤酵母细胞匀浆緩冲液:lL50mMPO4pH7.0-Pefabloc5mM最终OD:50Dyno-mill破碎(4次)离心Dyno-mill沉淀洗涤(2小时-4'C)JA10转子/9500rpm/30min/室温离心沉淀溶解(0/N-4'C);在N广-NTA-琼脂糖(Qiagen-15ml树脂)上固定化金属离子亲和层析緩冲液:+1L10mMPO4pH7.5mM-NaCl0.5%EmpigenJA10转子/9500rpm/30min/室温150緩沖液:十330ml10mMPO4pH7.5-150函NaCl-4.0MGuHCl平衡緩冲液:10mMPO4pH7.5-150mMNaCl-4週GuHCl洗涤緩沖液1)平衡緩沖液2)10mMP04pH7.5-150mMNaCl-6M尿素稀释SPSepharoseFF(Pharmacia-7ml树脂)阳离子交换层析浓缩透析(0/N-4。C)过滤除茵3)10mMP04pH7.5-150函NaCl-6M尿素-25mM咪唑洗脱緩冲液:lOmMP04pH7.5-150mMNaCl-6M尿素-0.5M咪唑离子强度降至18mS/cm2稀释援沖液:10mMPO4pH7.5-6M尿素平,冲液:10mMPO4pH7.5-150mMNaCl-6.0M尿素洗涤緩冲液1)平衡緩冲液2)10mMP04pH7.5-250mMNaCl-6M尿素洗脱緩冲液:10mM硼酸盐pH9.0-2MNaCl-6M尿素至0.8mg/mllOkDaOmega膜(Filtron)緩冲液:10mMPO4pH6.8-150mMNaCl-0.5M精氨酸MillexGV0.22,—图6显示由SDS-PAGE估计的纯度水平(Daiichi银染色、者马斯蓝G25Q、蛋白质印迹法)透析和过滤除菌步骤后〉95%—回收(蛋白质比色测定评价DOCTCABCA)由73克重组巴斯德毕赤酵母细胞(湿重)或lLDyno-mill匀浆OD50纯化得到2.8mg氧化型Nef-Tat-his蛋白实施例6:纯化还原型TAT-HIS蛋白(巴斯德毕赤酵母)由160克重组巴斯德毕赤酵母细胞(湿重)或2LDyno-mill匀浆OD66进行纯化流程。在室温下进行层析步骤。在步骤之间，Tat阳性流分在冷室(+4'C)中保存过夜；更长时间时，将样品于-20。C冷冻保存。160克巴斯德毕赤酵母细胞匀浆Dyno-mill破碎(4次)丄离心丄Dyno-mill沉淀丄洗涤(l小时-4'C)离心丄沉淀溶解(0/N-4'C)离心丄还原(4小时-室温-暗处)緩沖液:+2L50mMP04pH7.0-4mMPMSF最终OD:66JA10转子/9500rpm/30min/室温緩冲液:+2L10mMPO4pH7.5-150mMNaCl-1%EmpigenJA10转子/9500rpm/30min/室温緩冲液:十660ml10mMP04pH7.5-150mMNaCl-4.0MGuHClJA10转子/9500rpm/30min/室温+0.2M2-巯基乙磺酸钠盐(加入粉末)/在温育前调节pH至7.5(用1MNaOH溶脲基曱基化(半小时-室温-暗处)在N广-NTA-琼脂糖(Qiagen-60ml树脂)上固定化金属离子亲和层析稀释SPSepharoseFF(Pharmacia-30ml树脂)阳离子交换层析浓缩透析(0/N-4。C)过滤除菌液)+0.25M碘乙酖胺(加入粉末)/在温育前调节pH至7.5(用1MNaOH溶液)平IP爰冲液:10mMPO4pH7.5-150mMNaCl-4週GuHCl洗涤緩冲液1)平衡緩冲液2)10mMP04pH7.5-150mMNaCl-6M尿素3)10mMP04pH7.5-150mMNaCl-6M尿素-35mM咪唑洗脱緩冲液:10mMP04pH7.5-150mMNaCl-6M尿素-0.5M咪哇离子强度降至12mS/cm稀释緩冲液:20mM硼酸盐pH8.尿素6M平衡緩冲液:20mM硼酸盐pH8.5-150mMNaCl—6.0M尿素洗涤緩冲液:平衡緩冲液洗脱緩冲液:20mM硼酸盐pH8.5-400mMNaCl—6.0M尿素至1.5mg/mllOkDaOmega膜(Filtron)緩冲液:10mMPO4pH6.8-150mMNaCl-0.5M精氨酸MillexGV0.22,—图7显示由SDS-PAGE估计的纯度水平(Daiichi银染色、者马斯蓝G25Q、蛋白质印迹法)—回收(蛋白质比色测定评价DOCTCABCA)由160克重组巴斯德毕赤酵母细胞(湿重)或2LDyno-mi11匀浆OD66纯化得到48mg还原型Tat-his蛋白。实施例7:纯化氧化型Tat-his蛋白(巴斯德毕赤酵母)由74克重组巴斯德毕赤酵母细胞(湿重)或lLDyno-mill匀浆OD60进行纯化流程。在室温下进行层析步骤。在步骤之间，Tat阳性流分在冷室(+4。C)中保存过夜；更长时间时，将样品于-2(TC冷冻保存。74克巴斯德毕赤酵母细胞透析和过滤除菌步骤后:〉95%緩冲液:+1L50mMP04pH7.0-5mMPefabloc最终OD:60Dyno-mill破碎(4次)离心JA10转子/9500rpm/30min/室温Dyno-mill沉淀洗涤(l小时-4'C)緩冲液:+1L10mMPO4pH7.5-150mM-NaCl—1%Empigen离心JA10转子/9500rpm/30min/室温沉淀溶解(0/N-4。C)离心丄在N广-NTA-琼脂糖(Qiagen-30ml树脂)上固定化金属离子亲和层析丄稀释SPSepharoseFF(Pharmacia-1Sml树脂)阳离子交换层析浓縮透析(0/N-4'C)緩冲液:+330mllOmMPC^pHT.S-lSOmMNaCl-4.0MGuHClJA10转子/9500rpm/30min/室温平衡緩冲液:10mMPO4pH7.5-150mMNaCl-4.0MGuHCi洗涤緩冲液:1)平衡緩沖液2)10mMP04pH7.5-150mMNaCl-6M尿素3)10mMPO4pH7.5-150mMNaCl-6M尿素-35mM咪唑洗脱緩冲液:10mMPO4pH7.5-150mMNaCl-6M尿素0.5M咪哇离子强度降至12mS/cm稀释緩冲液:20mM硼酸盐pH8.5-6M尿素平衡緩冲液:20mM硼酸盐pH8.5-150mMNaC1-6.0M尿素洗涤緩冲液1)平衡緩沖液2)20mM硼酸盐pH8.5-400mMNaCl-6.0M尿素洗脱纟A沖液:20函口底漆pH11.0-2MNaCl-6M尿素至1.5mg/mlIOkDaOmega膜(Filtron)緩沖液:10mMPO4pH6.8-150mMNaCU0.5M精氨酸丄过滤除菌MillexGV0.22|am—图8显示由SDS-PAGE估计的纯度水平(Daiichi银染色、者马斯蓝G25Q、蛋白质印迹法)—回收(蛋白质比色测定评价DOCTCABCA)由74克重组巴斯德毕赤酵母细胞(湿重)或ILDyno-mill匀浆OD60纯化得到19mg氧化型Tat-his蛋白。实施例8:纯化SIV还原型NEF-HIS蛋白(巴斯德毕赤酵母)由340克重组巴期-德毕赤酵母细胞(湿重)或4LDyno-mill匀浆OD100进行纯化流程。在室温下进行层析步艰《。在步骤之间，Nef阳性流分在冷室(+4。C)中保存过夜；更长时间时，将样品于-2(TC冷冻絲。340克巴斯德毕赤酵母细胞透析和过滤除菌步骤后:〉95%緩冲液:4L50函P04pH7.0-PMSF4mM最终OD:100Dyno-mill破碎(4次)离心JA10转子/9500rpm/60min/室温Dyno-mill沉淀丄溶解(0/N-4'C)緩冲液:+2.6L10mMPO4pH7.5-150mMNaCl-4.0MGuHCl离心还原(4小时-室温-暗处)脲基甲基化(半小时-室温-暗处)丄在N广-NTA-琼脂糖(Qiagen-40ml树脂)上固定化金属离子亲和层析浓缩Superdex200凝胶过滤层析(Pharmacia-120ml树脂)浓缩透析(0/N-4'C)过滤除菌JA10转子/9500rpm/30min/室温+0.2M2-巯基乙磺酸钠盐(加入粉末)/在温育前调节pH至7.5(用1MNaOH溶液)+0.25M碘乙酰胺(加入粉末)/在温育前调节pH至7.5(用1MNaOH溶液)平衡IC冲液:10mMPO4pH7.5-150mMNaCl-4.0MGuHCl洗涤緩冲液1)平沖液2)10mMP04pH7.5-150mMNaCl-6M尿素-25mM咪唑洗脱緩冲液:10mMPO4pH7.5-150mMNaCl-6M尿素-0.5M咪唑至3mg/ml10kDaOmega膜(Filtron)洗脱緩冲液:10mMPO4pH7.5-150mMNaCl-6M尿素至1.5迈g/ml10kDaOmega膜(Filtron)緩冲液:10mMPO4pH6.8-150mMNaCl-Empigen0.3%MillexGV0.22—图9显示由SDS-PAGE估计的纯度水平(Daiichi银染色、者马斯蓝G250、蛋白盾印迹法)—回收(蛋白质比色测定评价:DOCTCABCA)由340克重组巴斯德毕赤酵母细胞(湿重)或4LDyno-mill匀浆OD100纯化得到20mgSIV还原型Nef-his蛋白。实施例9:纯化HIV还原型NEF-HIS蛋白(巴斯德毕赤酵母)由160克重组巴斯德毕赤酵母细胞(湿重)或3LDyno-mill匀浆OD50进行纯化流程。在室温下进行层析步骤。在步骤之间，Nef阳性流分在冷室(+4。C)中保存过夜；更长时间时，将样品于-2(TC冷冻保存。160克巴斯德毕赤酵母细胞透析和过滤除菌步骤后:〉95%緩沖液:3L50mMP04pH7.0-Pefabloc5mM最终OD:504Dyno-mill破碎(4次)冷冻/解冻离心JA10转子/9500rpm/60min/室温Dyno-mill沉淀溶解(0/N-4。C)緩冲液:+1L10mMPO4pH7.5國150函NaCl-4.0MGuHCl离心JA10转子/9500rpm/60min/室温还原(3小时-室温-暗处)脲基曱基化(半小时-室温-暗处)在N广-NTA-琼脂糖(Qiagen-1Oml树脂)上固定化金属离子亲和层析山浓缩Superdex200凝胶过滤层析(Pharmacia-120ml树月旨)透析(0/N-4。C)丄过滤除菌+0.1M2-巯基乙磺酸钠盐(加入粉末)/在温育前调节pH至7.5(用1MNaOH溶液)+0.15M碘乙酰胺(加入粉末)/在温育前调节pH至7.5(用1MNaOH溶液)平衡緩冲液:10mMPO4pH7.5-150mMNaCl-4遍GuHCl洗涤緩冲液1)平m冲液2)lOmMP04pH7.5-150mMNaCl-6M尿素3)10mMP04pH7.5-150mMNaCl-6M尿素-25mM咪唑洗脱緩冲液:10慮柠檬酸盐卩116.0-150rnMNaCl-6M尿素-0.5M咪哇至3mg/ml10kDaOmega膜(Filtron)洗脱lj冲液:10mMPO4pH7.5-150mMNaCl-6M尿素緩沖液:10mMPO4pH6.8-150mMNaCl-0.5M精氨酸MillexGV0.22(am—图10显示由SDS-PAGE估计的纯度水平(Daiichi4艮染色、者马斯蓝G250、蛋白质印迹法)透牙斤和过滤除菌步骤后>95%—回收(蛋白质比色测定评价:DOCTCABCA)由160克重组巴斯德毕赤酵母细胞(湿重)或3LDyno-mill匀浆OD50纯化得到20mgHIV还原型Nef-his蛋白。实施例10:在巴斯德毕赤酵母中表达SIVwe/序列为了评价在致病性SfflV攻击模型中的Nef和Tat抗原，我们表达了猕猴中的猿猴免疫缺陷病毒(SIV)Nef蛋白SlVmac239(AidsResearchandHumanRetroviruses,6:1221-1231,1990)。在Nef编码区中，SlVmac239在92aa之后具有一个符合读框的终止密码子，预期为仅IOkD的截短产物。Nef读框的其余部分为可读框，预计它编码其完全可读形式的263aa蛋白(30kD)。我们使用的SlVmac239"e/基因起始材料为相当于克隆在LX5N质粒上的完整编码序列的DNA片段(得自DrR.C.Desrosiers,So幽orough,MA,USA)。使这种SIV"e/基因在成熟前终止密码子处突变(9353位核苷酸G取代原T核苷酸)，以便表达全长SlVmac239Nef蛋白。为了在巴斯德毕赤酵母中表达所述SIV"e/基因，使用PHIL-D2-MOD载体(前面用于表达fflV-l"e/和加序列)。在诱导型醇氧化酶(AOXl)启动子控制下表达所述重组蛋白，该蛋白的C末端延长为有助于纯化的组氨酸亲和尾。10.1构建整合型载体pRIT14卯8为了构建pRIT14908,用引物SNEF1和SNEF2经PCR由pLX5N/SIV-NEF质粒扩增SIVwe/基因。引物SNEF1:5'ATCGTCCATG.GGTGGAGCTATTTT3'Ncol引物SNEF2:5'CGGCTA￡I^IGCGAGTTTCCTT3'Spel扩增的SIV"e/DNA区段从核苷酸9077开始，于核苷酸9865终止(AidsResearchandHumanRetroviruses,6:1221-1231，1990)。在所述PCR片段的5'末端导入一个Ncol限制位点(带有m/基因的ATG密码子)，而在3'末端导入一个Spel位点。获得的PCR片段和整合型载体PHIL-D2-MOD都用Ncol和Spel限制。因为一个Ncol限制位点位于SlV"e/扩增序列上(位置9286),所以获得分别约200bp和约600bp的两个片段，在琼脂糖凝胶上纯化，与PHIL-D2-MOD载体连接。自动测序证实"e/扩增区段后，收集获得的重组质粒，命名为pRIT14908。10.2巴斯德毕赤酵母菌林GS115(his4)的转化。为获得表达SIV"e/-His的巴斯德毕赤酵母菌株,用仅携带表达盒和HIS4基因的线性Notl片段转化菌抹GS115(图11)。因为两个末端与巴斯德毕赤酵母具有的AOX1基因同源，所以所述线性NotlDNA片段有利于在AOXI基因座重组。通过定量斑点印迹分析选择多拷贝整合克隆。选捧出一个显示重组蛋白产量最高的转化体，称为Y1772。菌抹Y1772产生重组SIVNef-His蛋白(一种272个氨基酸的蛋白)，所述重组SIVNef-His蛋白组成如下。豆蔻酸。蛋氨酸，利用PHIL-D2-MOD载体的Ncol克隆位点产生。262个氨基酸的Nef蛋白(从氨基酸2开始，延伸至氨基酸263，见图12)。通过克隆步骤产生的一个苏氨酸和一个丝氨酸(在PHIL-D2-MOD载体的Spel位点克隆(图11》。一个甘氨酸和六个组氨酸核酸和蛋白序列见图12。10.3Y1772菌株表达产物的表征表达水平在含有1%曱醇作为碳源的培养基中诱导16小时后，估测重组Nef-His蛋白丰度为10%总蛋白(图13，3-4泳道)。溶解度离心产生Nef-His蛋白的重组菌抹Y1772的诱导培养物。细胞沉淀重悬浮于^皮碎緩冲液中，用0.5mm玻璃珠破碎细胞，离心细胞提取物。在考马斯蓝染色的SDS-PAGE10。/。上比较不溶性沉淀包含的蛋白(P)和溶解上清液包含的蛋白(S)。如图13所示，菌抹Y1772主要重组蛋白(泳道3-4)在不溶性部分。具有满意重组蛋白表达水平的菌抹Y1772用于产生及纯化SIVNef-His蛋白。实施例11:在CHO中表达GP120建立了产生gP120糖蛋白的稳定CH0-K1细胞系。重组gP120糖蛋白为HIV-1分离抹W61D的重组截短型gP120包膜蛋白。gP120糖蛋白分泌入细胞培养基中，然后可从培养基中纯化所述蛋白。构建gpl20转染质粒pRIT13968荻得的HIV-1分离抹W61D的包膜DNA编码序歹"包括tat和rev的5'外显子)(Dr.Tersmette,CCB，Amsterdam)为含基因组gpl60包膜编码序列的质粒W61D(Nco-XhoI)。该质粒称为pRIT13965。为了构建gpl20表达盒，必须利用引物寡核苷酸序列(DIR131)和PCR技术使一个终止密码子插入pRIT13965中的gpl60编码序列的氨基酸glu515密码子。引物DIR131含有3个终止密码子(在所有可读框中)和一个Sail限制位点。然后，用得自pRIT13965的gpl60质粒亚克隆pW61denv(pRIT13966)的N-末端BamHl-DraI片段(170bp)和通过PCR由pRIT13965产生的Dml-Sall片段(510bp)重新构建完整的gpl20包膜序列。将两种片段凝胶纯化，一起连接入大肠杆菌质粒pUC18中，首先用Sail(klenow处理)切割，然后用BamHl切割。获得质粒pRIT13967。对含有gpl20编码盒的Xmal-Sall片段(1580bp)的基因序列进行测序，发现与预测序列相同。首先用Bcll(klenow处理)切割，然后用Xmal切割，使质粒RIT13967连接入CHOGS表达载体pEE14(CelltechLtd.,UK)。获得的质粒称为pRIT13968。制备主细胞库应用经典磷酸钙沉淀/甘油冲击法使gpl20构建物(pRIT13968)转染入CHO细胞中。2天后，CH0K1细胞用选择性生长培养基(GMEM+磺基亚胺蛋氨酸(MSX)25fjM+谷氨酸盐+天冬酰胺+10%胎牛血清)培养。进一步在1751112培养瓶中扩增3个选定的转染克隆，很少细胞的培养瓶保藏于-80。C。选择C-env23，9进一步扩大培养。制备小型细胞预备库，冷冻20个安瓿。为了制备预备库和MCB，在GMEM培养基中培养细胞，培养基中加入7.5%胎牛血清并含有50)LiMMSX。测试上述细胞培养物的无菌和支原体情况，证实为阴性。利用从预备主细胞库获得的细胞制备主细胞库CH0K1env23.9(12代)。简而言之，将2个安瓿的预备主种子细胞接种在添加7.5%渗析胎牛血清的培养基中。将细胞分入4个培养瓶中，于"。C培养。细胞贴壁后，培养基改为添加50pMMSX的新鲜培养基。细胞汇合时，用胰酶消化收集细胞，以1/8分瓶比例在T-培养瓶-滚瓶-细胞工厂装置中传代培养。通过胰酶消化和离心从细胞工厂装置收集细胞。细胞沉淀重悬浮于添加DMSO作为冷冻保藏剂的培养基中。预先标记安瓿，高压灭菌，加热密封(250个瓶)。检查小瓶有无渗漏，于-70。C保藏过夜，然后保藏于液氮中。细胞培养和制备粗品收获物快速解冻2瓶主细胞库。合并细胞，接种入2个装有添加7.5%渗析胎牛血清(FBS)的合适培养基的T-培养瓶(37土1。C)。当细胞达到汇合时(13代)，胰酶消化收集细胞，合并细胞，在10个上述T-培养瓶中扩大培养。胰酶消化汇合细胞(14代)，连续在2个细胞工厂装置(每个装置6000cm2;15代)、然后在10个细胞工厂装置(16代)中扩大培养。所述生长培养基中添加7.5。/。渗析胎牛血清(FBS)和1%MSX。当细胞达到汇合时，弃去生长培养基，代之以仅含有1%渗析胎牛血清而无MSX的"生产培养基"。每2天(间隔48小时)收集上清液，直至32天。立即通过1.2-0.22Mm过滤装置澄清收获的培养液，纯化前保藏于-20。C。实施例12:从细胞培养液纯化HIVGP120(W61DCHO)所有纯化步骤在2-8。C的冷室中进行。在此温度下调节緩冲液pH,通过0.2滤膜过滤。测试其致热原含量(LAL测定)。连续监测柱洗出液的280nm光密度、pH和电导率。(i)澄清培养液收获的澄清细胞培养液(CCF)过滤除菌，加入Tris緩冲液pH8.0至30mM终浓度。纯化前CCF冷冻保藏于-20。C。疏水作用层析解冻后，在澄清培养液中加入硫酸铵至1M。使溶液通过以30mMTris緩冲液-pH8.0-1M硫酸铵平衡的TSK/TOYOPEARL-BUTYL650M(TOSOHAAS)柱过夜。在上述条件下，抗原与凝胶基质结合。用梯度逐步降低的硫酸铵洗涤柱。抗原于30mMTris緩冲液-pH8.0-0.25M硫酸铵时洗出。阴离子交换层析在降低溶液电导率5-6mS/cm后，将合并的gP120流分加样至以Tris盐》爰沖液-pH8.0平衡的Q-sepharoseFastFlow(Pharmacia)柱。以阴性模式即gP120不结合凝胶操作柱，同时滞留绝大部分杂质。fiv)浓缩及超滤性渗滤为了提高蛋白浓度，将gP120合并液加至截留50kDa的FILTRON膜"OmegaScreenChannel"。浓缩完成后，用包含氯化钩0.3mM的5mM磷酸緩冲液pH7.0通过渗滤交换所述緩冲液。如果不立即进行进一步处理，将gP120合并液冷冻保藏于-2(TC。解冻后，使所述溶液通过0.2juM膜以便去除不溶性物质。(v)羟基磷灰石层析将gP120UP合并液加样至以5mM磷酸緩冲液+氯化钙0.3mM,pH7.0平衡的macro-PrepCeramicHydroxyapatiteII型(Biorad)柱。用相同緩冲液洗涤柱。抗原通过柱，而杂质与柱结合。(vi)阳离子交换层析将gP120合并液加样至以醋酸緩冲液20mM,pH5.0平衡的CM/TOYOPEARL-650S(TOSOHAAS)柱。用相同緩冲液、然后用醋酸盐20mM,pH5.0和NaCl10mM洗涤柱。之后用含80mMNaCl的相同緩冲液洗脱抗原。(vii)超滤为了增强纯化过程的病毒清除能力，再进行一个超滤步骤。使gP120合并液通过截留150kDa的FILTRON膜"OmegaScreenChannel"超滤。该孔径膜不会阻留抗原。上述过程后，在截留50kDa的相同类型膜(Filtron)上浓缩稀释抗原。(Viii)大小排阻凝胶层析将gP120合并液加样至SUPERDEX200(PHARMACIA)柱，以便交换所述緩冲液以及消除残余杂质。用磷酸緩冲盐溶液(PBS)洗脱柱。(ix)过滤除菌和保藏使流分通过0.2jiMPVDF膜(Millipore)过滤除菌。过滤除菌后，纯化物冷冻保藏于-20。C,直至进行配制。以下流程表概述纯化流程。^SDS-PAGE分析估测纯化物的纯度水平(银染色/考马斯蓝/蛋白质印迹法)295%。-产率约2.5mg/LCCF(根据Lowry测定)-总纯化产率约25%(根据Elisa测定)。=>纯化物质于37。C稳定1周(根据WB分析)。从培养液纯化gpl20标记Z表示去除病毒的关键步骤。澄清培养液丄疏水作用层析(BUTYL-TOYOPEARL650M)阴离子交换层析(阴性模式)(Q-SEPHAROSE)丄50KD超滤(浓度及緩冲液交换)(保藏于-加。C)羟基磷灰石层析<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>实施例13:疫苗制备按照本发明制备的疫苗包括一种或多种编码抗原的DNA重组体的表达产物。此外，所述制剂包含在油/水乳剂中的3脱氧酰化单磷酰脂质A3D-MPL和QS21的混合物、或者含未曱基化CpG二核苷酸基元的寡核苷酸以及氢氧化铝载体。3D-MPL:是革兰氏阴性菌明尼苏达沙门氏菌(Salmonellami皿esota)的化学解毒形式脂多糖(LPS)。在SmithKlineBeechamBiologicals进4亍的实马全表明，与各种载体组合的3D-MPL强有力地增强体液免疫和Thl型细胞免疫。QS21:是一种由QuillajaSaponariaMolina树的树皮粗提物纯化的皂苷，它具有很强的佐剂活性它诱导对若干抗原的抗原特异性淋巴细胞增殖和CTL。在SmithKlineBeechamBiologicals进4亍的实-睑证明，3D-MPL和QS21组合在诱导体液免疫应答和Thl型细胞免疫应答中存在明显的协同作用。油/水乳剂包含2种油(维生素E和鲨烯)和含乳化剂吐温80的PBS。所述乳剂包含5%鲨烯、5%维生素E、2%吐温80,平均颗粒大小为180nm(参见WO95/17210)。在SmithKlineBeechamBiologicals进4亍的实验4正实，〇/W乳剂与3D-MPL/QS21联合使用进一步增强其免疫刺激特性。制备油/水乳剂(2倍浓缩物)将吐温80溶于磷酸緩冲盐溶液(PBS)中，得到在PBS中的2%溶液。为获得100ml两倍浓缩的乳剂，涡旋混合5克DLa-生育酚和5ml鲨歸，以充分混合。加入90ml的PBS/吐温溶液并充分混合。然后将得到的乳剂通过注射器，最后将其用M110S微流设备微流化。得到的油滴大小约为180nm。制备水包油制剂以IO倍浓缩的PBSpH6.8和水稀释抗原(单独或组合的100吗gpl20、20jigNefTat和20吗SIVNef),然后以5分钟间隔连续加入水包油乳剂、3D-MPL(50吗)、QS21(50吗)和1|ug/ml硫柳汞(作为防腐剂)。乳剂体积等于总体积的50%(对于500^1剂量为250|ia)。所有的温育都在室温搅拌下进行。CpG寡核苷酸(CpG)是含有一个或多个CpG序列基元的合成未曱基化寡核苷酸。与主要诱导混合型TH1/TH2应答的水包油制剂相比，CpG是非常有效的TH1型免疫诱导剂。CpG比水包油制剂诱导更低水平的抗体，但是诱导良好水平的细胞介导的免疫应答。预计CpG诱导较低的局部反应原性。制备CpG寡核苷酸溶液:使CpG干粉溶解于7jc获得5mg/mlCpG溶液。制备CpG制剂使所述3种抗原对氯化钠150mM透析，消除抑制即120吸附在氢氧化铝上的磷酸根离子。在吸附在氬氧化铝上之前，将用水稀释的抗原(100貼gp120、20吗NefTat和20SIVNef)与CpG溶液(500jugCpG)温育30分钟，有利于NefTat和Nef抗原的His尾与寡核苷酸之间的潜在相互作用(与游离CpG相比，当与所述抗原结合时所述CpG的免疫刺激作用更强)。然后，间隔5分钟连续加入氢氧化铝(500pg)、10倍浓缩氯化钠和1i!g/ml硫柳汞(作为防腐剂)。所有温育在室温搅拌下进行。实施例14:对恒河猴进行的免疫接种以及SHIV攻击实验第一项研究用下列疫苗组合物在第0、1和3个月肌肉内免疫各组(4只/组)恒河猴第1组佐剂2+gpl20第2组佐剂2+gpl20+NefTat+SIVNef第3组佐剂2+NefTat*+SIVNef第4组佐剂6+gpl20+NefTat+SIVNef笫5组佐剂2+NefTat+SIVNef第6组佐剂2佐剂2包含鲨烯/维生素E/吐温80/3D-MPL/QS21佐剂6包含alum和CpG。TaP表示突变Tat,其中Lys41—Ala,在RGD基元中Arg78—Lys,Asp80—Glu(Virology235:48-64，1997)。最后一次免疫后1个月，用致病性SfflV(病毒抹89.6p)攻击所有动物。从用病毒攻击周(16周)开始，在指定时间点周期性l血样，通过FACS分析测定外周血单核细胞中的CD4阳性细胞百分率(图14)以及通过bDNA检测测定血浆RNA病毒基因组浓度(图15)。结果所有动物用SfflVs9.6p攻击后均成为感染动物。在第1、3、5、6组所有动物中(只有第1、6组(对照组)各有1只动物例外)，病毒抹攻击后CD4阳性细胞均下降。第2组所有动物CD4阳性细胞略孩t下降，随着时间回复至基线水平。在第4组动物中观测到相似趋势(图14)。病毒负荷数据几乎与CD4数据相反。3/4的第2组动物(以及在1只保持CD4阳性细胞的对照动物)中，病毒负荷下降到^r测水平以下，第4只动物仅显示临界水平的病毒负荷量。大多数其它动物保持高水平或中间水平病毒负荷量(图15)。令人惊奇的是，在整个研究中，通过ELISA检测的抗Tat和抗Nef抗体滴度第3组(突变Tat)比笫5组(非突变Tat的等同组)高2-3倍。68周时(攻击后56周)，接受完全抗原组合的两组(笫2、4组)所有动物仍存活，而其它组大多数动物均因为AIDS样症状不得不进行安乐死。各组存活动物为第1组2/4笫2组4/4第3组0/4第4组4/4第5组0/4笫6组1/4结论gpl20和NefTat(在存在SIVNef的情况下)组合防止CD4阳性细胞丧失，降低致病性SHIV89.6p感染动物体内的病毒负荷量，延迟或者防止出现AIDS样疾病症状，而单独的印120或NefTat/SIVNef不对SfflV攻击的病理结果产生保护作用。佐剂2为包含鲨烯、维生素E和吐温80以及3D-MPL和QS21的水包油乳剂，它似乎对最终研究结果的作用比alum/CpG佐剂更强。第二项研究进行笫二个恒河猴SfflV攻击研究的目的是确证候选疫苗gpl20/NefTat+佐剂的效果以及比较不同Tat型抗原。该研究由一个不同的实验室进行。研究设计如下。在笫0、4、12周肌肉内注射免疫各组(6只/组)恒河猴，在第16周用标准剂量的致病性SHIV89.6p攻击。第1组是重复第一项研究的笫2组。笫1组佐剂2+gpl20+NefTat+SIVNef第2组佐剂2+gpl20+Tat(氧化型)第3组佐剂2+gpl20+Tat(还原型)第4组佐剂2随访/最终指标仍为CD4阳性细胞百分率、RT-PCR检测的病毒负荷量、发病率和死亡率。结果除了第2组的1只动物外，所有动物均在用SHIVs^p攻击后变成感染动物。第4对照组和笫3组所有动物以及第2组(l只动物例外)所有动物攻击后的CD4阳性细胞显著降低。第1组只有1只动物显示CD4阳性细胞显著降低。与第一项研究的动物不同，笫二项实验的恒河猴在病毒攻击后1个月，不同水平的CD4阳性细胞稳定(图16)。稳定性一般低于初始的CD4阳性细胞百分率，但是决不使CD4阳性细胞完全丧失。可以说明这一点是用于第二项研究的恒河猴种群对SfflV诱导疾病的易感性降低。尽管如此，gpl20/NefTat/SIVNef疫苗和两种gpl20/Tat疫苗的有益作用得到证实。在免疫接种动物中，CD4阳性细胞百分率20以上的动物数为5，没有1只佐剂组对照动物保持高于所述水平。分析血浆RNA病毒负荷量证实了研究动物的易感性相对较低(图17)。6只对照动物中只有2只保持高病毒负荷量，而其它动物中病毒从血浆中消失。因此，用病毒负荷量参数难以证实疫苗的作用。结论分析CD4阳性细胞表明，疫苗gpl20/NefTat+佐剂(存在SIVNef)防止大多数免疫接种动物CD4阳性细胞下降。这进一步证实了笫一个SHIV研究获得的结果。由于研究动物缺乏易感性，所以不能用病毒负荷量参数证实疫苗作用。总而言之，根据SHIV模型证据，gpl20和Tat及NefHIV抗原组合可以对HIV感染的病理结果产生保护作用。单独的Tat抗原与gpl20组合也可以对CD4阳性细胞下降提供一定保护作用。其作用不如gpl20/NefTat/SIVNef抗原组合明显，但是证实gpl20和Tat能够介导抗SfflV诱导性疾病表现的一定保护作用。用与第一个研究动物来源完全无关的不同来源的恒河猴进行第二个SfflV攻击研究。CD4阳性细胞百分率和血浆病毒负荷量两个参数均提示，笫二个研究的动物对SfflV诱导性疾病的易感性更低，而且动物之间的变异性明显更大。尽管如此，用包含gpl20/NefTat和SIVNef的实-险疫苗仍然可见gpl20/NefTat/SIVNef疫苗对保持CD4阳性细胞的有益作用。说明所述疫苗作用不仅在独立研究中获得重现，而且在不相关猴群中得到证实。序列表<110〉S边ithKlineBeechamBiologicalsS.A.<120>用于HIV预防或治疗性免疫的疫苗<130>B45209<160〉31<170〉FastSEQforWindowsVersion3.0<210〉1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220〉<223〉引物〈220〉〈221>misc—feature<222>11,15,19，23，27<223〉n=A,T，C或G<400>1atcgtccatgnggtnggcnaagntggnt28<210〉2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2cggctactagtgcagttcttgaa23<210〉3<211〉29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<220〉<221>misc—feature<222>12,16，20，24,28<223>n=A,T，C或G<400>3atcgtactagtngagnccangtangatric29<210>4<211>24<212>靈<213>人工序列<220><223>引物<400>4cggctactagtttccttcgggcct24<210〉5〈211〉23<212>薩<213>人工序列<220><223>引物<400>5atcgtccatggagccagtagatc23<210〉6<211>24<212>DNA〈213〉人工序列<220〉<223>引物<400>6atcgtccatgggtggagctatttt24〈210〉7〈211〉23〈212〉DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉引物〈400〉7cggctactagtgcgagtttcctt23<210〉8〈211〉648〈212〉DNA〈213〉人<400〉8atgggtggcaagacgagctgggagcaatcacaagaggaggtacaaggcagattcactcccttccctgatttggtgctacaaacaccagctttagagtggagagtacttcaagtggtcaaaagccagcagcca^gt3gca^aggaggtgggctgtagatctggcagaactaagctagtacctgttacacccggtttgacagagaactgcacaagtagtgtgagatggggtgtacagcagctttttccagtctagccactttagatatccttcacaccagggagttgagccatgtgagcctgccgcctagcatagtggccacgttggatggcggagcagcataccaatgctgacacctcaggttaaaagaaaLgatctgtggaccaggggtcagataaggtagcatggaatggtttcatcacgcatcaccatcctactgtaagctcgagacctcttgtgcctgtacctttaagaggggggacttctaccacacgatatccactaagaggccaaatgaccctgatggcccgagaaccattaaggaaagaatgggaaaaacatgctagaagcaaccaatgactgg肌gggctaacaaggctacgacctttggataaaggagaggagagaagtggctgcatccg60120180240300360420480540600648<210>9<211〉215<212>PRT<213>人<400>9MetGlyGlyLysTrpSerLysSerSerValValGlyTrpProThrVal151015ArgGluArgMetArgArgAlaGluProAlaAlaAspGlyValGlyAla202530AlaSerArgAspLeuGluLysHisGlyAlalieThrSerSerAsnThr354045AlaAlaThrAsnAlaAlaCysAlaTrpLeuGluAlaGinGluGluGlu505560GluValGlyPheProValThrProGinValProLeuArgProMetThr657075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