专利名称：：具有附加在电移植底涂层上的可生物降解释放层的药物洗脱支架的制作方法
技术领域：
：本发明涉及药物洗脱支架。更具体而言，本发明涉及一种施用在金属支架表面上的粘附底物(primer),随后用其本身能够包含药物并以缓释方式释放可生物降解的聚合物涂覆。
背景技术：
：多年来，对于医学设备和药物递送使用涂层已经成为必需的，显著地用于增加医药设备和植入物的能力。药物洗脱医学设备涂层已经形成治疗心血管疾病的主要生物医学设备。在美国和全世界，心脏病和心力衰竭是两种最普遍的影响健康的病症。在冠状动脉病中，心脏血管变窄。当此状况发生时，对心脏肌肉的氧供应减少。冠状动脉病的主要原因是脂肪沉淀阻断了所述动脉("斑块")。治疗冠状动脉病最初使用外科手术和CABG(冠状动脉旁路移植术)，其为心脏外科医生治疗该病的常用和有效的方法。然而，死亡率和发病率很高。在60年代，某些医生开发了利用医学设备的低侵入性治疗。它们通过从股动脉的小切口穿入，就能治疗疾病气囊血管成形术(利用气囊式导管来扩宽已经变窄的动脉，给所述气囊式导管充气可打开动脉PTCA:经皮冠状动脉腔内成形术)被用于患有冠状动脉病患者。气囊血管成形术后，在3至6个月内，由于血栓形成(血块在脉管中发展，其可阻断血管，并终止血液流动)或者异常组织生长，约40至50%的冠状动脉受到再狭窄(在通常通过气囊血管成形术打开血管后，其再次变窄)的影响。因此，再狭窄构成了PTCA有效性的主要限制。在80年代末，引入了裸露的固定人工瓣膜的支架(BareMetalStent)(BMS)，其用于保持冠状动脉扩张，对缓解该问题以及在PTCA方法中气球充气时切开动脉指出了某些途径。所述支架为固定在气囊式导管上的网状管(长的细的柔性管，其可以嵌入身体；在这种情况下，其可穿过心脏)。但是在支架插入后6个月支架竖着嵌入生长中的动脉组织，BMS继续与患者中比率为约25。/。的再狭窄相关。该组织基本上由平滑肌细胞(SMC's)组成，一旦支架放置(apposition),动脉的最初损伤将刺激其增殖。所述放置实际上破坏了内皮细胞层(EC's)，其不得不进一步增殖和迁移，以便再移植(recolonize)到SMC，s上的支架支柱上，从而终止其增殖。生物医学工业通过设计新一代具有能在血管壁中释放选择性药物(西罗莫司、紫杉醇、ABT578、他克莫司、依维莫司....)的涂层支架部分地解决这一破坏率，从而防止了再狭窄。在90年代后期，药物洗脱支架(DES)作为能提供更有效地降低再狭窄至单一形状(singlefigure)的方式逐渐引起了注意。理论上，当活性EC's允许早期再移植时，所述药物可防止SMC's增殖，如后述的细胞能自发地产生一氧化氮(NO)，其为一种起终止SMC's增殖信号作用的小分子。市售的大多数DES为基于聚合释放基质制备的，药物从所述基质中洗脱出。所述聚合物称为生物稳定的所述聚合物永久地保留在支架上，因此，表现出对EC's的炎症应答和再移植两者具有较小的效果。这些DES的主要缺点为它们不能100%释放它们包含的药物。这点的一个重要的后果是保留在涂层中的药物阻止了再移植过程(因为大部分药物与"杀死"SMC's等效或比其更加有效地"杀死"EC's)。该缺点对患者可能具有致命性的及因此对于DES工业的严重的后果。实际上，尽管用BMS可将再狭窄从大约20%降低至用DES的大约5%，工业目前面对由当前DES显示的和未解决的挑战随后血栓形成的现象，艮P，在支架植入后一年或更长时间动脉再凝结。长久已知裸金属支架的植入除了是再狭窄的来源之外，也是血栓形成的来源，但是血栓形成可以很容易地通过联合两种抗血栓形成剂的全身性两种治疗剂处理，所述治疗剂典型地为阿司匹林和氯吡格雷(Plavix⑧)。典型地，规定放置支架的患者服用所述两种治疗剂1至2个月。长期跟踪数据指出该组合对血栓形成具有优良的结果。使用药物洗脱支架，已经报告了许多动脉再凝结病例，其是由于中止服用两种治疗剂后不久凝结(血栓形成)，这使得心脏病专家主张使用所述两种治疗剂3、6、9和12月或更长。报道了某些病例，其中具有完全支架血栓形成的心肌梗死可在中止两种治疗剂18月后仅几星期就出现。晚期血栓形成为一种急性并发症，当其出现时，如果所述患者没有随访中，或即使他在，而同时患者离开cathlab或配备齐全的医疗中心，其可以是致命性的。而且，两种治疗剂为非常不适宜的制约，如某些患者估计时间足够长之后自己决定终止它，或可能忘记服药，或者可能已经经历没有预期到的临床介入，从而，其处于不得不终止所述抗血栓形成治疗的状态。解释晚期血栓形成的准确理由仍然不能完全地理解。病理学家估计晚期血栓形成的问题揭示出由EC's产生的支架再移植不完全，在持续期留下金属或聚合材料与血液接触，在其上易于发生血小板粘附，导致血栓的灾难性沉积。出现了另一种解释，其认为EC's的再移植不完全是药物未完全从释放层释放的结果，其中在所述聚合物+药物层的表面上，其"杀死"在它们努力迁移和增殖中的正迁移中的EC's。因此，晚期血栓形成的危险是现有DES的严重缺点。由于受到非常高的机械约束，在其制造过程(巻曲在气球上)期间、其转移进入动脉(尤其是经过钙化的损害)期间及其膨胀(支架的直径增加至3至5倍)期间，支架面临的不受控制的裂缝和分层是常见现象(rule)。裂缝和分层可产生人造的"粗糙度"，其从几十微米至几毫米，因此，其倾向于严重地妨碍EC's恰当地再移植在支架上。然而，单独的"粗糙度"不能解释为单独地阻碍EC's的再移植。一项评价EC's再移植的研究是在28天中在猪动脉中获得的，其在相同的动脉中使用二个重叠的Cypher或二个Taxus支架，将其与它们相应的裸金属相似物相比，即在相同的动脉中分别使用二个BxVelocity或者二个Express,证实:即使用DES和BMS(因为在两个支架间重叠)，再移植的表面的"粗糙度"相当高，与DES相比，用BMS的再移植总是较好。无论DES、Cypher⑧或Taxus,,即无论正在释放何种药物，用相应的BMS的再移植总是较好。该结果强有力地表明，在展开涂层后，除了涂层的"粗糙度"和支架表面之外，再移植总是比不存在药物时好。这与如下事实相关所有存在的DES具有生物稳定层。药物的释放为通过纯扩散得到的，因此，将永远不会完全:在持续期中，总有某些药物保留在将被再移植的涂层中；在现有DES中使用的所有药物(西罗莫司、紫杉醇)具有阈值中毒浓度，与SMC，s相比，具其有可比较的或甚至更低的抗EC's，即，相比较于SMC，s，它们可以非常相同地或甚至超过地"杀死"EC's:这点指出了现有DES的严重缺点，其在持续期它们局部地保留对EC's有毒性的药物。最后但并非最不重要的，这些药物也许已对动脉的重塑有影响。值得注意的是所谓的"支架malapositkm"显示出某些支架支柱为不完全与动脉壁接触。人们相信，大多数支架malapositions应归于药物的效果，特别是在西罗莫司的情况下，其引起所谓的动脉"正向重塑"(positiveremodelling),即其逐渐的过膨胀(overdilatation):支架最初与动脉壁接触良好，但最后在动脉内"浮动"，在药物的效果下其直径增加。在这种情况下，某些支架支柱保留没有用被EC's再移植(由于它们离动脉壁非常的远)，且可以成为从聚合物物质与血液直接接触堵住的血栓的形成来源。这些血栓形成可以不出现，只要患者处于抗血小板两种治疗剂下，但是在两种治疗剂中止后即立即开始形成(晚期血栓形成)。这又指出现有药物洗脱支架的严重缺点，其是由于药物长时间保留在支架表面上。
发明内容本发明的目的是提供一种支架，其具有短期类似于DES的性质，以防止再狭窄，且具有长期类似于BMS的历史，以避免血栓形成和使EC，s在重塑前早期增殖和迁移。如之前详细描述的，晚期血栓形成被认为涉及药物未完全释放；较差的涂层完整性，其是由于支架表面上的涂层缺乏粘附性，导致裂缝和分层，其为阻止由EC's的再移植的"粗糙度"的潜在来源；在由于药物引起的支架放置(ISA)不良的情况下，用于EC再移植的涂层的差的促愈合(长期)行为。在根据本发明的DES中，所述药物，如果有，为通过可生物降解的聚合物释放，所述聚合物将在几周后消失，从而释放100%的药物。利用这些可生物降解的聚合物制备涂层必须通过利用粘附下层进行，以便显著地促进用于支架适当放置的良好机械完整性。因此，建议一种药物洗脱支架，包括支架框架；电移植涂层，其涂覆在所述支架框架上，和含有药物的可生物降解的聚合物涂层，其涂覆在所述电移植涂层上。所述DES可进一歩包括一种可生物降解的上涂层。电移植涂层被用作有效的底物涂层，其促进金属支架表面和后来的聚合物涂层之间的粘附。可以将所述电移植涂层施用在所述支架上，干燥，然后施加药物聚合物。后来的聚合物涂层可包含一种或多种治疗化合物，其能向药物洗脱支架提供药物性质。底物电移植涂层起基质和有机聚合物涂层之间桥梁的作用，其对金属和药物聚合物具有良好的粘附性。电移植技术使在所述表面上共价键合，赋予所述层几十纳米至几百纳米，和纳米对照(nanometriccontrol),以及已知的比如p-BuMA的脉管物质的沉积。而且，获得的电移植层均匀，且与所述支架表面共形(conformal)。所述电移植涂层(i)本身消失，即其本身为可生物降解的；或者(ii)对细胞迁移和增殖显示良好的特性，特别是绝对均匀和无裂缝和分层。当所述可生物降解的释放基质消失时，该下层将接触EC's或者SMC，s(正进行再移植)或血液(不完全再移植，ISA等)，或者两者。因此，特别重要地是所述下层本身尽可能地均匀，特别地为其没有裂缝，其将阻止用EC's的完全再移植。图1(A)显示了体外西罗莫司随时间(天)从PLGA双层涂层的累积释放。图1(B)显示了体外西罗莫司随时间(天)从聚(丙交酯)双层涂层的累积释放。图2显示了在体内西罗莫司随时间(天)从PLGA或PLA的分级的释放(fractionalrelease)。具体实施例方式本发明第一个目的为药物洗脱支架(DES)，其包括支架框架；电移植涂层，其涂覆在所述支架框架上，和含有药物的可生物降解的聚合物涂层，其涂覆在所述电移植涂层上。支架框架其中所述支架框架有利地包括金属基质。特别地，所述支架框架包括选自下述的物质不锈钢、镍、钽、钴-铬MP35N或MP20N合金、铂、钛、适宜的生物相容性合金、适宜的生物相容性物质及其组合。电移植涂层电移植层对上面的可生物降解层起粘附底物的作用(在制备、巻曲和支架过程期间)。所述电移植底物涂层为一个均匀层。该层优选地具有的厚度为10nm至1.0微米，特别地，厚度为10nm至0.5微米，更特别地为100nm至300nm。如此厚度，其比在支架表面任一点可达到的曲率的最小半径小，可保证涂层不裂缝。电移植层能够防止可生物降解的聚合物层的裂缝和分层，且显示出与不锈钢BMS相等或比其好的再移植。而且，利用具有厚度为至少约几十或一百纳米的电移植层可保证良好地增强上面的可生物降解层的粘附，这是由于两个聚合层之间的交错结合。在该意义上，所述电移植聚合物的性质的选择是基于释放基体聚合物的性质，其本身为基于想要的药物释放的负载和动力学来选择电移植聚合物和释放基体聚合物必须部分溶混，以组成良好的界面。此为如下情况例如当两种聚合物具有相近的溶解度或Hildebrand参数时，或者当聚合物之一的溶剂对另一个聚合物至少具有良好的溶胀性(swellant)时。除受这些束缚之外，所述电移植聚合物的性质优选来自已知生物相容性的聚合物目录。最后，并非所有的聚合物可通过电移植获得，但是大多数通过增殖链式反应获得的聚合物是合格的，比如乙烯化物(vinylics)、环氧化物、经过开环聚合的环状单体。因此，聚甲基丙烯酸丁酯(p-BuMA)、聚异丁烯酸甲酯(PMMA)或聚EpsilonCaproLactone(p-ECL)为感兴趣的聚合物，通过电移植可获得的，其与疏水性释放基体相互作用。聚甲基丙烯酸羟乙酯(p-HEMA)为一种感兴趣的聚合物，通过电移植可获得的，其与亲水性释放基体相互作用。其它的有机薄膜，用电移植可获得的，但其没有"真的"聚合性质，可以为非常有效的用于释放基体的底物层对于获得的"聚"硝基苯基薄膜来说情况就是如此，应归于在喷雾释放基体之前，在所述支架表面上的苯基重氮盐特别是4氨基苯基重氮四氟硼酸酯的电移植。所述苯基重氮盐为优选地为式Y-ArN2+X-，其中Ar表示芳基，有利地为苯基，X表示阴离子，有利地选自卤素离子、硫酸根离子、磷酸根离子、高氯酸根离子、四氟化硼根离子、六氟磷酸酯根离子和羧酸酯根离子，Y为官能团，有利地选自硝基、羟基、硫醇、氨基、羧基、羰基、酯基、氨基、氰基、烷基或功能化的垸基、苯基或功能化的苯基。所述电移植层，特别地为p-BuMA层，可进一步具钝化行为，且阻断重金属离子(在血液流动中或在动脉壁)从不锈钢表面的释放。所述重金属离子被认为是由金属支架引入血液中引起的炎症的起始的原因，所述血液为电解质介质且因此引起任意金属的部分氧化，直到达到Nemst平衡。特别地，从纵截面观察到研究中电移植层和可生物降解(不含药物)层的动脉壁的厚度总是小于裸金属支架层的厚度，证实肉芽瘤更少，即炎症更少这一结果得到了用28天兔子研究观察到的结果的证实，其中与BMS相比，检测到用支架的炎症更少，所述支架仅用电移植的p-BuMA层涂覆(参见实施例11和12)。在本发明的一个实施方案中，所述电移植层本身为可生物降解的，因此，在所述可生物降解的释放层也已经消失后，其从所述支架的表面消失。所述电移植层具有非血栓形成(或抗血栓)效果和促愈合的效果(pro-healingeffect)(—旦所述可生物降解的释放层已经消失，促进活性EC's的增殖和粘附)。EC's开始在包含药物的可生物降解层增殖，即，在其完全消失前，则所述可生物降解聚合物的水解机制将不再持续，并且EC'S将很快与电移植层接触。如果电移植层本身为可生物降解的，预期所述促愈合的效果为不锈钢表面的。用生物稳定的电移植层会获得更大的促愈合效果，其保证在比较长的时期内用EC'S的适当再移植。使用组合物层进行60天的猪试验，且描述在实施例13中，所述组合物层由电移植p-BuMA(聚甲基丙烯酸丁酉旨)的底层(150μm)，及涂覆其上用PLGA(聚丙交酯共乙交酯)可生物降解释放层(5μm)组成。该研究结果将首先显示出可生物降解的释放层在第一个4周后消失，从而，释放100%的药物。也证实在8周，通过内皮细胞完全地再移植用电移植层和可生物降解层涂覆的支架；因为已知的所述可生物降解层在4周后消失，这意味着良好的再移植为电移植层单独与动脉和血流相互作用的结果。电移植层和可生物降解支架的综合性质为统计学高于BMS，即使在组合物的两层(电移植层+可生物降解的储积)的(困难)位置，其中在可生物降解释放层内部没有药物。根据本发明的DES，在植入支架后不久，由于通过EC，s的较好的再移植，将能终止抗血小板两种治疗。血栓形成为通过表面上的特定蛋白质的粘附引发的现象，抗血栓行为涉及所述表面最小化或者甚至消除蛋白质吸附的倾向。具有该防污效果的几种类型高分子为本领域已知的，比如肝素、CMDBS、PC(磷酰胆碱)基聚合物等，更通常地为载有两性离子基的高分子、聚氧化乙烯(PEO)或聚乙二醇(PEG)，且更通常为具有任意的高疏水表面的。这些聚合物具有的共同特征为，即便有，它们载有非常小的易于促进蛋白质结合在它们的表面的活性功能。简而言之，电移植层可以另外由这些防污物质组成，只要它们也与前述标准相容，其能与释放基体聚合物有良好的连接面(interface),以便具有可接受的抗血栓行为。该条件与所述性质不矛盾，所述电移植层作为底物层，必须符合其将增加厚的可生物降解层粘附到支架的金属表面，如我们上面看到的，因为对所述释放基体聚合物的粘附主要源自与电移植聚合物的交错结合。人们将应当注意由生物相容性Plc研究的PC聚合物为乙烯聚合物，因此可通过电移植获得(p-MPC/BUMA、p-MPC/DMA/TMSPMA，见下文)。在其可作为电移植涂层使用的聚合物中，可提及的可以特别由乙烯基聚合物制成，所述乙烯基聚合物例如丙烯腈、甲基丙烯腈、异丁烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、丙基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸丁酯、羟乙基甲基丙烯酸酯、羟基丙基甲基丙烯酸酯、氰基丙烯酸酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯及其衍生物、N-乙烯基吡硌烷酮、卤乙烯、和聚丙烯酰胺的聚合物；异戊二烯、乙烯、丙烯、氧化乙烯、包含可裂环的分子比如内酯，特别是S己内酯、丙交酯、乙醇酸、乙二醇、聚酰胺、聚氨基甲酸酯、聚(原酸酯)和聚天冬氨酸的聚合物。通过电移植获得的有机薄膜可以为乙烯聚合物或共聚物，特别地是聚BUMA(聚甲基丙烯酸丁酯)、聚HEMA(聚羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚MPC/BUMA(聚2-甲基丙烯酰基氧乙基磷酸胆碱/甲基丙烯酸丁酯)和聚MPC/DMA/TMSPMA(聚甲基丙烯酰基氧乙基磷酸胆碱/月桂基甲基丙烯酸酯/三甲基甲硅烷基丙基甲基丙烯酸酯)。在一个实施方案中，有机薄膜为可生物降解的聚合物，特别是聚己酸内酯、聚丙交酯(PLA)或polyglycolactide(PLGA)。在电移植涂层和可生物降解层(包含药物层或上涂层)之间的粘附上面的可生物降解层可粘附电移植层上，通过；与电移植聚合物形成化学键(参见，例如专利申请WO04/005410，本文引入作为参考)；*将所述可生物降解层的前体插入电移植聚合物化学品中，以便引起其在电移植聚合物薄膜内部形成，然后，该电移植聚合物薄膜将起作为所述可生物降解层的固定层的作用(参见例如专利申请WO04/074537和WO04/075248,本文将其引入作为参考)；通过交错结合使在电移植层内形成前(pre-formed)的可生物降解的聚合物相互渗透。交错结合涉及在所述电移植层内所述可生物降解聚合物的聚合链可以"蠕变"或"reptate"，且在所述电移植层内形成至少一个"环形"。对于聚合物，当随机构型时，一个"环形(loop)"为链的典型尺寸；其可以通过所谓的聚合物的回转半径来评价。即使其与具体的聚合物、其分子结构等有某些关系，聚合物的回转半径大多数时间小于100nm，表明对于能改善粘附而言，电移植层必须比能含有至少一个组成上层的聚合物环形的阈值厚。交错结合是一种获得优良的可生物降解层在所述电移植层上粘附的方法，只要满足后续的条件(providedthelatter):比约100nm厚；具有与上面的可生物降解的聚合物相同的可湿性(即疏水性/亲水性)，以能够在所述两者之间"混合"；具有小于上面的可生物降解聚合物的玻璃转化温度，以便在保持所述药物稳定性的足够低温度下获得热交错结合；或为至少由能溶解所述上面的可生物降解聚合物的溶剂或包含所述上面的可生物降解聚合物或其组分的分散体的溶剂溶胀，因此交错结合可以在室温下，有效地通过仅由这些液体在电移植层表面上液滴的附加形成所述液体，其溶胀电移植层，引起所述溶液或分散体的组分插入电移植层中，然后，蒸发，形成交错的复合材料。该后续的条件足够在可生物降解释放层和电移植层之间形成良好的和稳定的连接面。与化学键合或分层相比，交错结合为一种在释放基质和电移植层之间建立连接面的本发明优选的方案因为在本文中选择的所述释放基质为可生物降解的，其所剩余的为已知的结构(电移植)的聚合物，即没有未反应的化学基团或可水解键，所述化学基团或可水解键能促进剩余的电移植薄膜反应，易于引起炎症和/或血栓形成的反应。交错结合需要人们可以在电移植层涂覆的支架上涂敷包含可生物降解聚合物层和任选的药物的溶液，适宜地可选择性具有想要的可湿性。例如，PLGA在二氯乙垸、二氯甲垸或氯仿中易溶，可用于大多数疏水性药物，比如西罗莫司、紫杉醇或ABT-578。在这种情况下，电移植的p-BuMA为具有想要的交错连接面的适当选择，因为其容易被氯仿或二氯甲垸溶胀(且甚至可溶于其中)。根据制备的观点，该涂敷可通过浸渍或者通过喷雾完成。较少使用浸渍，因为每次发射(shot)，它不能使人们获得比约2至3μm厚的层对于更大的厚度，人们必须在再浸渍之前完全地干燥第一层，以避免已经涂覆的所述层再溶解。这一束缚使得对于超过2μm的层来说，浸渍非常不方便。在这一方面，喷雾容易实施(参见实施例14)。喷雾上述溶液的喷嘴面向所述支架，将其旋转以便存在于喷雾的所有外表面。为了在上述条件下获得适当的交错连接面，人们应当有利地引进所谓的"湿法喷雾"或"低压"条件要喷雾的溶液具有低粘度(典型地<]cP，纯氯仿的粘度为0.58cP)，喷嘴距旋转支架为短距离，在所述喷嘴中惰性载体气体(氮、氩气、压縮空气)的压力典型地为小于1bar。这些条件导致液体喷雾成细小的液滴，其在所述喷雾室的大气中移动，使其击中所述电移植支架因为电移植聚合物层和喷雾溶液具有相同的可湿性，液滴显示非常低的接触角(=良好润湿)，因此，液滴在表面上汇集并因此在早期形成膜(filmogenic)。除了在可生物降解层和电移植层之间制备良好的连接面之外，"低气压"喷雾装置能制备在所述支柱之间具有非常小的网形的涂层支架。喷嘴与支架的相对运动能在单次击中中沉淀出均匀的和相对薄的(〈lum)层，其中仍然充满溶剂。转动和空气更新能蒸发所述溶剂，由于所述层薄而更容易，在表面上留下聚合物层(+药物)。然后，将第二层喷雾在第一层上，诸如此类，以便达到想要的厚度(从而负载)。由于为了达到想要的厚度其施加了几次喷雾，可以分批地使用所述"低气压"喷雾装置，其中将旋转的几个支架与用于每个支架上的一个喷雾嘴平行，从而，能够使当另一个支架正在喷雾时，其它的支架可蒸发干燥。这可保持系统的生产量足够高，即使低压喷雾法本身是高度连续的。这些低压喷雾系统为在实施例14中列出的，其可以每批次处理20个旋转的支架，由X-Y扫描系统处理控制单个喷嘴在支架上移动。该系统的一个特性为当所述X-Y系统在箱子之外时，旋转支架为在箱子中(能提取溶剂，且对操作者安全)喷嘴的运动通过磁铁引导穿过箱顶，保持所述箱子的"闭合壳层"结构以使得戴手套将所述试样架通过可移动的样品-载体从侧门塞入其中，并当门从内打开时将其插入和连接到箱子中的转轴。包含药物的可生物降解层所述可生物降解的释放层将有利地具有的厚度为1至200um，更有利地厚度为大约1至10um(取决于负载)，以便获得在规定时期内释放药物。药物聚合物涂层可包括一种或多种药物。每种药物可包括一种生物活性剂。所述生物活性剂可以是药理学活性药物或生物活性化合物。所述药物聚合物涂层可以在药物聚合物洗脱支架的制备、包装、灭菌或储存期间进行降解。在灭菌期间，例如，可存在药物或聚合物的氧化，导致水解损害、聚合键裂解、聚合物和/或药物破坏、或药物聚合物涂层实际裂缝或剥落。在制备或制备的支架中的温度偏差可引起药物聚合物涂层的所有部分或一部分分层。本发明通过在聚合物-药物涂层和金属支架之间使用电移植底物涂层解决了该问题，从而减少或防止了药物-聚合物分层。在施用于底物涂层支架之前，可利用微珠、微粒或纳米包囊技术，使用白蛋白、脂质体、铁蛋白或其它可生物降解的蛋白质和磷脂将所述药物包囊在药物聚合物涂层中。其中所述生物活性剂可包括抗肿瘤剂比如三乙烯硫代磷酰胺、抗增殖剂、反义药剂、抗血小板剂、抗血栓形成剂、抗凝剂、抗生素、抗炎药、基因治疗剂、有机药物、药物化合物、重组体DNA产物、重组体RNA产物、胶原、胶原衍生物、蛋白质、蛋白质类似物、糖类、糖类衍生物或其组合。所述生物活性剂可以是能提供用于预防和治疗疾病或障碍的治疗特性的任意治疗性物质。抗肿瘤剂可预防、杀死或阻断支架附近的癌细胞的生长和扩散。抗增殖剂可预防或终止细胞生长。反义药剂可在遗传水平中用以中断产生引发疾病的蛋白质的过程。抗血小板剂可作用于血小板，抑制其血液凝结功能。抗血栓形成药剂可主动地延迟血块形成。抗凝剂可延迟或预防血液凝固，抗凝疗法可使用化合物比如肝素和香豆素。抗生素可杀死或抑制微生物生长，并可用于抗击疾病和感染。抗炎药可用于抵抗或减少支架附近的炎症。基因治疗剂可以改变人类基因的表达以治疗、治愈或最终预防疾病。有机药物可以是任意小分子治疗物质。药物化合物可以是任意能提供治疗效果的化合物。重组DNA产物或重组体RNA产物可包括修饰的DNA或RNA遗传物质。药学有用的生物活性剂也可包括胶原及其它蛋白质、糖类及其衍生物。例如，可选择所述生物活性剂用于抑制脉管再狭窄，其为一种相当于给其中放置支架的体腔的直径变窄或收縮的病症。所述生物活性剂通常可控制细胞增殖。控制细胞增殖可包括增加或抑制靶细胞或细胞类型的生长。所述生物活性剂可以是抗一种或多种如下病症的药剂包括冠状再狭窄、心血管再狭窄、血管造影再狭窄、动脉硬化、增生及其它疾病和病症。例如，可选择所述生物活性剂用于抑制或预防脉管再狭窄，其为一种相当于给其中放置支架的体腔的直径变窄或收縮的病症。所述生物活性剂通常可控制细胞增殖。控制细胞增殖可包括增加或抑制靶细胞或细胞类型的生长。所述生物活性剂可包括鬼臼霉素、依托泊苷、喜树碱、喜树碱类似物、米托蒽醌、西罗莫司及其衍生物或类似物。鬼臼霉素为一种有机的高毒性的药物，其具有抗癌性，且可抑制DNA合成。依托泊苷为一种可来源于鬼臼霉素的半合成形式的抗肿瘤药，可用于治疗单囊肿的白血病、淋巴瘤、小细胞肺癌和阴囊癌。喜树碱为一种抗癌药物，其可以起拓扑异构酶抑制剂的作用。与喜树碱结构相关的喜树碱类似物比如氨基喜树碱可用作抗癌药物。米托蒽醌也为一种重要的抗癌药物，常用于治疗白血病、淋巴瘤和乳腺癌。西罗莫司为一种可干涉正常细胞生长周期的药物，且可用于减少再狭窄。所述生物活性剂也可包括这些药剂的类似物和衍生物。由于抗氧剂具有antirestonetic性质和治疗效果，其本身可以有益的。药物聚合物涂层可从支架软化、溶解或侵蚀来洗脱至少一种生物活性剂。该洗脱机制可被称为表面侵蚀，其中所述药物聚合物涂层的外表面溶解、降解或被身体吸收；或者骨架侵蚀(bulkerosion),其中大部分的药物聚合物涂层生物递降释放所述生物活性剂。药物聚合物涂层的侵蚀部分可以被身体吸收、代谢或相反地清除。药物聚合物涂层也可包括聚合物基质。例如，所述聚合物基质可包括己内酯基聚合物或共聚物，或各种环状聚合物。所述聚合物基质可包括各种合成的和非合成的或天然存在的高分子及其衍生物。所述聚合物有利地选自多种组合的一种或多种可生物降解的聚合物，比如聚合物、共聚物和嵌段聚合物。这些可生物降解的(也称为生物可吸收的(bio-resorbable或bioabsorbable)聚合4勿包舌polyglycolides、聚交酉旨、聚己酸内酯、聚甘油癸二酸酯、聚碳酸酯例如酪氨酸衍生的、生物聚酯比如聚(P-hydroxyalcanoate)(PHAs)和衍生的化合物、聚氧化乙烯、聚丁烯对苯二酸酯(polybutyleneterepthalate)、聚二氧六环酮、杂合物、组合物、具有生长调节剂的胶原基质、蛋白多糖、葡糖胺聚糖(glycosaminoglycans)、真空形成SIS(小肠粘膜下层)、纤维、壳多糖和葡聚糖。这些可生物降解的聚合物中任一种可单独使用或与这些或其它的可生物降解的聚合物以可变的组合使用。所述聚合物基质优选地包括可生物降解的聚合物比如聚交酯(PLA)、聚乙醇酸(PGA)聚合物、聚(e己内酯)(PCL)、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或其它的共聚物。所述药物可以分散在整个聚合物基质中。所述药物或生物活性剂可从聚合物基质中扩散出，以洗脱生物活性剂。所述药物可从聚合物基质中扩散出，并且进入支架周围的生物材料中。所述生物活性剂可从药物聚合物中分离出，并从聚合物基质中扩散出，进入周围的生物材料中。在一个进一步的实施方案中，所述药物涂层组合物可以使用药物42-Epi-(四唑基)-西罗莫司制备，在授予AbbottLaboratories,AbbottPark,111的美国专利No.6,329,386中有阐述，且来自由用BiocompatiblesInternationalP丄.C.的磷酸胆碱涂层而分散在制备的(fashioned)涂层内，在美国专利No.5,648,442中有阐述。可以选择所述聚合物基质以提供想要的生物活性剂的洗脱速率。可以合成所述药物，以便特定的生物活性剂也具有两种不同的洗脱速率。例如，具有两种不同的洗脱速率的生物活性剂将使得在外科手术的二十四小时内快速递送药理学活性药物，而在其后的例如两个月至六个月内缓慢地、稳定地递送药物。可选择电移植底物涂层以稳定地将聚合物基质固定在所述支架框架上，所述聚合物基质包含快速释放(deployed)的生物活性剂和缓慢洗脱的药物。外涂层可生物降解层所述DES可进一步包括外涂层(topcoatlayer),其由与可生物降解的涂层释放层相同的组合物制备。特别地，所述外涂层可生物降解层可包括可生物降解的聚合物比如聚交酯(PLA)、聚乙醇酸(PGA)聚合物、聚(e己内酯)(PCL)、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或其它的共聚物。制备方法聚合物的电移植为一种基于在原位表面上形成聚合物层的技术，即从前体水浴而不是预制备的聚合物形成聚合物层的技术。涂层的表面是电子极化的，且起聚合引发剂的作用，其通过繁殖链式反应引起表面聚合(参见FR2821575;本文引入作为参考)。本发明使用其中可能容易地从前体溶液开始进行实际聚合物电移植的操作模式，所述前体溶液易于制备和控制，特别地为(i)一种施加电极电势的试验设计，其推动移植反应；(ii)使用电解介质，其至少为形成的聚合物的良好溶胀剂，或者为所述聚合物的良好溶剂。一种生物相容性粘性薄膜(例如聚丁基甲基丙烯酸酯(p-BuMA))可在如下条件下在伏安法(voltammetric)扫描支架上(不锈钢，铬钴合金)获得在包含重氮盐(尤其为芳基重氮盐，比如4-硝基重氮苯四氟硼酸(nitrobenzenediazoniumtetrafluoroborate))和单亍本(p-BuMA，3.5mo1/1)的溶液(溶剂-DMF)中，重氮盐的浓度为5.10—4至10-1摩尔/l(尤其为10-2摩尔/1)，可能的范围为-0.2V/ECS至3.0V/ECS，扫描速率为100mV/s。所述电解溶液可以包括主要由实施者(即不介入电聚合反应)想要溶液化所述链可聚合单体的溶剂。然而，单体可以是起溶剂的作用，使得这些液体的存在不一定是必需的。当使用它们时，这些溶剂优选地选自二甲基甲酰胺、二甲亚砜、乙酸乙酯、乙腈、四氢呋喃、丙烯碳酸酯及通常在电化学中使用的其它溶剂、二氯乙烷及常见的氯化溶剂类。溶剂也可以选自水和醇。使溶解之前进行蒸馏以便于除去它们包含的水，和使其严格的控制反应介质上大气的含水率都没有必要。因此，所述方法可易于大规模实施。所述电解液也可以包含至少一种支持电解质，以便于确保和/或改善电解液中通过的电流。当使用它们时，支持电解质为优选地选自季铵盐比如高氯酸盐、甲苯磺酸盐、四氟硼酸、六氟磷酸盐、卤化季铵、硝酸钠和氯化钠。所述电解液可以进一步包含用于改善所述薄膜均匀性的试剂(表面活性剂)，比如甘油。如果存在，该薄膜具有很少的交联，且其在表面上的粘附是与下层金属形成键的结果。由于这个原因，我们应当利用术语聚合物的电移植，此后，即使它现在指通过电还原溶液获得的移植，所述溶液包含可以进行繁殖链式反应的单体和重氮盐，后者优选地为低浓度。这样的方法能在所有的导电基质上进行电移植，所述基质比如有机薄膜支架，特别是聚合的、具有几十纳米至几百纳米厚度的薄膜。涂覆在支架框架上的电移植溶液为干燥的。在干燥所述薄膜前，可吹掉过量的液体。干燥可在室温或高温下在干燥的氮气或其它适宜的环境下进行，其是为了消除或除去任意挥发性组分的聚合溶液，所述环境包括真空环境。涂层的支架可在中等高温下于60分钟，在40℃和真空下(10mbar)烘干，以除去底物涂层内部俘获的任何溶剂。电移植底物涂层的厚度可以为10nm至l.O微米的范围，以便于足够地涂层所述支架框架，和提供能随后施加药物聚合物的令人满意的下层。可包括其它的施用和干燥步骤以达到想要的底物涂层的厚度。对于所述的电移植底物涂层，可通过喷雾或通过浸渍实施湿法。所述药物聚合物可以混入适宜的溶剂中，并利用施加方法比如浸渍、喷雾、涂抹或刷涂施加在底物上。在涂层操作期间，药物聚合物与电移植底物涂层粘附良好。所述药物聚合物涂层可在施加电移植底物涂层之后立即施加。另外，最后可将药物-聚合物涂层施加到具有电移植底物涂层的支架上。药物聚合物可以与适宜的溶剂混合形成聚合溶液。所述药物聚合物可包括聚合物基质和一种或多种治疗化合物。为了形成药物聚合物涂层，可将单体比如醋酸乙烯酯衍生物与其它的单体在溶剂比如异丙醇中混合形成聚合溶液。所述混合物可反应形成聚合物，且一种或多种生物活性剂可以与聚合的混合物混合形成具有预定洗脱比率的药物聚合物。包含生物活性剂的适宜的生物活性剂或溶液可以与聚合溶液混合。另外，可将聚合物比如共聚多酯或嵌段共聚物溶于适宜的溶剂中，且可将一种或多种生物活性剂加入所述混合物中。可以在聚合溶液中将所述混合物与一种粘合促进剂混合。选择一种或多种粘合促进剂，并且将其加入到所述混合物中。可将聚合溶液应用到具有电移植底物涂层的支架框架上。可使用用于施加聚合物溶液的任意适宜的方法将聚合溶液应用到所述支架上。可以吹掉过量的液体，并干燥聚合溶液。千燥可以在室温或高温(400℃)下和在干燥的氮气或适宜的环境下进行，以除去任意挥发性组分的聚合溶液。可使用另一种浸渍和干燥歩骤来增厚涂层。药物聚合物涂层的厚度可在1.0微米至200微米之间或更大，以便于提供具有生物活性药剂的充分的和满意的药理学利益。药物聚合物涂层的处理可包括风干或在空气、氮气或其它受控环境中低温加热。所述药物聚合物涂层可通过加热所述药物聚合物涂层至预定温度来处理。更具体而言，本发明的阐述性实例为在本文中提供的。下述实施例阐述了(1)电移植溶液制剂(2)在不锈钢支架上的电移植方法(3)在钴铬支架上的电移植方法(4)电移植的p-BuMA的侵蚀屏障效果(5)电移植p-BuMA和PLA的浸涂层的试样(dipcoatedcoupons)的侵蚀屏障性质(6)用于沉淀储积层的喷涂法(7)用电移植层增强粘附(8)体外药物释放动力学的实例(9)电移植涂层的细胞毒性研究(10)电移植涂层的溶血研究(11)局部植入后电移植支架的局部耐受性研究(12)在兔子模型中，在14和28天，与BMS相比，电移植BuMA涂层的支架的再移植性质(13)在猪中完全涂层的支架后的局部耐受性(14)用于制备DES的低压喷雾系统，其具有与电移植层的良好连接面实施例1:电移植溶液制剂本发明的一个实施方案为溶解在DMF溶剂中的基于乙烯单体正丁基甲基丙烯酸(BuMA)的电移植溶液制剂。NaN03被用作一种电解质载<table><row><column></column><column>乙烯单体的浓</column><column>重氮N02四氟硼酸的浓度</column><column>NaN03浓度</column><column>甘油</column><column>%DMF</column></row><row><column></column><column>30%</column><column>(10)-3M</column><column>2,5.(10)-2</column><column>5%</column><column>65%</column></row><table>表l:电移植溶液制剂实施例2:在不锈钢支架上的电移植方法利用在实施例i中描述的化学溶液，用具有下述参数的电移植p-BuMA涂层18毫米不锈钢冠状支架(ClearStreamTechnologies),漂洗，且在10mbar真空下在40℃下干燥60分钟。利用该方法获得的涂层厚度为约150nm。电移植参数方法循环伏安法，断路电势为-3.2V/CE，通入氩气(2Lmin)-1。扫描次数扫描50次扫描速率50mV/s。实施例3:在钴铬支架上的电移植方法利用在实施例1中描述的化学溶液，用具有下述参数的电移植p-BuMA涂层18毫米钴-铬冠状支架(Natec-medical)，漂洗，且在10mbar真空下在40℃下干燥60分钟。在电移植之前，用NH4F40%溶液处理支架表面1分钟。利用该方法获得的涂层厚度为约150nm。电移植参数方法循环伏安法，断路电势为-3.5V/CE，通入氩气(2Lmin—1)。扫描次数扫描50次扫描速率50mV/s。实施例4:电移植p-BuMA的侵蚀屏障性质在根据在实施例2中描述的试验设计合成的涂层不锈钢试样上评价电移植p-BuMA的防蚀能力。为了该目的，将电移植p-BuMA涂层试样(试验)和非涂层试样(对照)以按照lcm2/ml的表面积/体积比的9g/l浸入NaCI溶液中。将样品保存在37。C，轻微搅拌，通过按常规取样释放介质来评价钴、镍和钼离子析出的时程。利用感应耦合等离子体-质谱仪(ICP-MS)定量所述离子。<table>complextableseeoriginalpage22</column></row><table>表2:离子释放从金属表面释放的离子被电移植p-BuMA涂层强烈降低，例如，释放的镍(到目前为止，其为最有毒的元素)从不锈钢试样上的28ng/cm2降低至电移植p-BuMA片上的3ng/cm2。实施例5:电移植p-BuMA和PLA浸涂片的侵蚀屏障性质将不锈钢电移植p-BuMA片浸涂在聚交酯(p-PLA)溶液中(在氯仿中5%w/v)，所述溶液包含或不包含20%(w/w)的模型药物己酮可可碱。在浸渍后，将涂层在室温下稳定24小时，在40。C的烘箱中千燥48小时。根据在实施例3中描述的试验设计进行离子释放。在下述表3中给出了在150天内，在NaCl(9g/l)的溶液中从316不锈钢试样、电移植p-BuMA+p-PLA浸涂试样和包含己酮可可碱的电移植p-BuMA+p-PLA浸涂试样中Cr(A)、Ni(B)和Mo(C)离子释放的比较<table>complextableseeoriginalpage22</column></row><table><row><column><table>Inox+PLA+PTX</column><column>4</column><column>7</column><column>1</column></row><table>表3在用双层涂层涂布的不锈钢试样上观察到同样减少的离子释放，Ni离子的含量显著地从30ng/cm2降低至约8ng/cm2，并且，分别对于电移植p-BuMA/p-PLA涂层和电移植p-BuMA/PLA/己酮可可碱涂层，Cr离子含量从18ng/cm2减少至6ng/cm2和4ng/cm2。实施例6:喷雾涂层方法用于将储积聚合物涂层涂覆在电移植金属支架的喷雾涂层方法显示了本发明的另一个实施方案。干燥后，用包含西罗莫司的可生物降解的聚酉旨(聚交酉旨-共-乙交酯50/50,PLGA)喷雾涂层18毫米的电移植支架。将共聚物(0.25%w/v)溶在氯仿中。然后，将西罗莫司溶在氯仿/聚合物混合物中，得到西罗莫司/聚合物的最终比例为30。/。(w/w)。通过用具有下述参数的细孔喷嘴喷雾，将所述混合物施用在电移植p-BuMA支架上，固定在旋转轴柄上<table><row><column>喷雾流速(uL/s)</column><column>24</column></row><row><column>喷雾体积(uL)</column><column>192</column></row><row><column>压力(bar)</column><column>0.3</column></row><row><column>支架转速(rpm)</column><column>2000</column></row><row><column>喷嘴/支架距离(mm)</column><column>6.5</column></row><row><column>喷雾运行数</column><column>50</column></row><table>表4:喷雾参数将两层的涂层施用在所述不锈钢支架的内腔和外腔(abluminal)面上，所述支架具有与内腔表面相比更厚的(并且更好的)外腔表面。在真空烘箱中于40°C进行干燥。利用上述参数，在支架上的所述涂层称重为800+/-80ug，所述涂层厚度为约5至7um。所述药物负载为164+/-16ug。实施例7:电移植p-BuMA下层对储积聚合物粘附的增强；一个功能试验。进行粘着试验以突出储积聚合物层在预电移植支架上的粘附强度。在不锈钢支架(18mm，ClearstreamTechnologies)上的双层涂层是根据实进行该试验以模拟涂层在植入期间可经受的磨蚀。为了该目的，使所述涂层的支架穿过模拟冠状动脉的硅管几次，之后，展开所述支架。在所述试验后，对所述支架进行光学和扫描电子显微镜检查。对于底物电移植支架没有观察到涂层分层所有IO个电移植涂层支架穿过所述模拟的损害磨蚀试验，而没有电移植p-BuMA底物的喷雾涂层支架显示出严重的分层。实施例8:体外药物释放研究在这些实施方案中，从双层涂层支架释放西罗莫司的时程为根据下述试验设计获得的根据在实施例1中用于电移植p-BuMA给出的试验设计和在实施例5中用于可生物降解的聚合物喷雾涂层涂布18mm不锈钢支架。将每个涂层支架浸入在包含lml释放溶液(99。/。磷酸盐缓冲液，0.01M，pH=7.4/1%吐温20)的小瓶中，保存在37'C下，轻微搅拌(gentlesitting)。定期除去释放介质，用新的一种代替。利用分光光度计Hitachi3在A=278nm的波长测定所述释放介质的吸光率(任意单位)。利用校正曲线确定西罗莫司的浓度，一式三份。图l(A)和l(B)分别图解了在体外西罗莫司从双层涂层的快速释放(A)和缓慢释放(B)(累积释放(。/。)对时间(天))。对于快速释放，所述储积层为丙交酯和乙交酯，PLGA(120000g/mol)的共聚物(50/50)，而对于缓慢释放，所述可生物降解的聚合物为聚(丙交酯)(30000g/mo1)。在药物释放动力学中的差异与所述可生物降解的储积层的降解速率直接相关。因为50/50PLGA聚合物比PLA的降解更快。体内的相应特征显示在图2中(释放比率对时间(天)，其从在移植的支架上剩余药物的测定结果获得，所述支架来自在髂股模型中的NZ兔子+特征为PLGA的特征X特征为PLA的特征在所述两种情况下，释放的药物(西罗莫司)和负载的药物为相同的。该图显示出对于快速释放(PLGA)而言，药物完全地释放，且释放聚合物在28天完全消失，而对于PLA，在28天所述药物仅释放60%,认为其在两个月内消失。实施例9:电移植涂层的细胞毒性研究根据标准ISO10993-5进行电移植涂层的潜在细胞毒性研究。该研究旨在定性和定量地评价电移植p-BuMA的细胞毒性，如在将其施加于接种在96孔微板中的细胞后试验提取物。在37℃下，于96小时内，在无菌、密闭的、化学惰性容器中，用包含胎牛血清的培养基(DMEM)进行提取，一式三份。电移植p-BuMA的表面面积和提取载体的体积之比等于3cm2/ml。将提取物及其稀释液(50%和10%)置于细胞上，保持接触至少24小时。用活体染料中性红测定细胞毒性。保持的测定方式为常见的细胞形态学(定性评价)，且细胞生活力百分比(定量评价)与活细胞的数量成正比(定量分析)，所述百分比基于通过在540nm阅读获得的吸光率。阳性对照对于每次试验，在试验条件下用提供可重现的细胞毒性效果的产品进行试验，所述试验条件为在培养基(DMEM)中，3.2g/l的苯酚溶液。如果死亡率百分比为约100%，则该试验符合要求。阴性对照在该试验条件下，用没有产生细胞毒性效果的物质(高密度聚乙烯)进行对照。如果细胞存活率百分比为100%，则该试验符合要求。<table><row><column>样品</column><column>定性评价</column><column>在540nm的吸光率</column><column>生存率％</column><column>死亡率%</column></row><row><column></column><column>DMEM对照品</column><column>所有细胞都使用中性红染色的</column><column>0.495±0.016</column><column>100%</column><column>0%</column></row><row><column></column><column>提取溶剂</column><column>所有细胞都为使用中性红染色的</column><column>0.521±0.028</column><column>100%</column><column>0%</column></row><table>25<table>complextableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表5:电移植pBuMA底物毒性的定性和定量评价在电移植底物涂层提取物上进行的该试验没有显示出在二十四小时后出现细胞毒性的迹象。实施例10;溶血研究；直接接触试验。在该实施例中，溶血指在用电移植涂层直接接触中红细胞的破坏。所述溶血研究为在lcm2的符合ISO10993-4和ASTMF756-93的电移植p-BuMA和灭菌的不锈钢试样上进行的。人类血液基质的修复柠檬酸盐抗凝的人类血液为在来自三个供体的无菌条件中获得。在1小时内使用血液。血液基质的稀释评价每种血液的血红蛋白浓度，其为97.95±8.32-111.86±3.90-91.05±0.94mg/ml。游离血浆血红蛋白必须低于lmg/ml(0.30-0.32-0.28mg/ml)。通过适宜量的生理盐水(25.66士0.05mg/ml-26.19士lmg/ml-25.37士0.69mg/ml)稀释来调节每个血样的总血红蛋白含量为25.01±2.5mg/ml。血红蛋白检测血液的血红蛋白将20μ1的血液与5ml的Drabkin's试剂(Sigma-525-2)混合(15分钟)。利用分光光度计在入=540nm测定吸光率(任意单位)。使用利用参考标准(血红蛋白标准，Sigma-525-18)制备的从0.036至0.72mg/ml的校正曲线测定血红蛋白浓度。血浆血红蛋白在溶血管中，将100lU的血浆与5ml的Drabkin's试剂混合(15分钟)。利用分光光度计(Kontron)在入=540nm波长测定相对于Drabkin's试剂的吸光率(任意单位)。使用利用参考标准(血红蛋白标准，Sigma-525-18)制备的从0.036至0.720mg/ml的校正曲线测定血红蛋白浓度，一式三份。静电试验.-在无菌条件下，将5ml的每种血液基质递送到包含试验物质的螺丝管帽试管中。试验物质样品的表面面积和血液基质的体积之比为3cm2/ml。阳性对照由200u1的血液基质加10ml的水组成。阴性对照由单独的血液基质组成。给试管盖上帽，且固定保存在37"C的适宜的试管架中4小时。在规定的培养时间结束时，离心所有的试管(100xG，15分钟)。将每种不含细胞的血浆的上清液部分转移到15ml试管(聚丙乙烯，无菌)中，离心(700xG，5分钟)。小心的除去上清液，用于随后的血红蛋白分析。血红蛋白测定将lml的上清液与3ml的Drabkin's试剂混合。在入二540nm测定吸光率。利用参考标准(血红蛋白标准，Sigma-525-18)制备从0.03至0.72mg/ml的校正曲线。利用校正曲线测定每个上清液中的血浆血红蛋白浓度。根据下述公式计算溶血指数(HI):<formula>seeoriginaldocumentpage27</formula>表6显示出在上清液中的血红蛋白水平，表7给出了相应的溶血指数(HI)。利用3份血液，一式三份评价，获得阴性对照的平均HI为0.35±0.04%。利用3份血液，一式三份评价，在存在p-BuMA底物下的平均HI为0.29±0.03%。<table><row><column>血红蛋白(mg/ml)</column></row><row><column>Sl(基质)</column><column>阳性对照</column><column>阴性对照</column><column>电移植的p-BuMA样品</column></row><row><column>25.66±0.05</column><column>26.60士O.ll</column><column>0.09±0.01</column><column>0.06±0.01</column></row><row><column>S2(基质)</column><column>阳性对照</column><column>阴性对照</column><column>电移植的p-BuMA样品</column></row><row><column>26.19±1.00</column><column>26.72±0.18</column><column>0.08士O.Ol</column><column>0.08±0.00</column></row><row><column>S3(基质)</column><column>阳性对照</column><column>阴性对照</column><column>电移植的p-BuMA样品</column></row><table>25.37±0.6925.79±0.330.10±0.010.08±0,01表6:在上清液中的血红蛋白水平<table><row><column>溶血指数(HI)</column></row><row><column>Sl(基质)</column><column>阳性对照</column><column>阴性对照</column><column>电移植的p-BuMA样品</column><column>103.68±0.43</column><column>0.35±0.04</column><column>0.25±0.04</column></row><row><column>S2(基质)</column><column>阳性对照</column><column>阴性对照</column><column>电移植的p-BuMA样品</column><column>102.01±0.67</column><column>0.31±0.05</column><column>0.31±0.00</column></row><row><column>S3(基质)</column><column>阳性对照</column><column>阴性对照</column><column>电移植的p-BuMA样品</column></row><table>101.67±1.300.39±0.030.31±0.03表7:溶血指数结果显示出电移植涂层的样品在直接接触时没有溶血性质。实施例11:电移植支架植入兔子中后的局部耐受性这项研究的一个目的是用于评价电移植p-BuMA支架与裸金属支架相比的局部耐受性。根据在实施例2中给出的试验设计涂层电移植涂层的支架(不锈钢，18mm长度)，利用批准的标准试验设计(43t:，50%的相对湿度)，用氧化乙烯灭菌。试验步骤1－植入位点将涂层的或未涂层的支架植入每只动物的右和/或左骼动脉部位4周。2-动物的制备和麻醉,用阿托品(atropinumsulfuricum，AGUETTANT，法国)麻醉前给药兔子，根据内标准方法中的肌内途径，用替来他明-唑拉西泮(Zoleti1⑧100,VIRBAC,法国)25mg/kg和甲苯噻嗪(Rompun⑧2%BAYERAG，德国)5mg/kg麻醉。剪去外科手术部位的毛皮，用杀菌肥皂(Vetedine⑧savon,VETOQUINOL,法国)洗涤，用聚维酮碘(Vetedine溶液，VETOQUINOL，法国)消毒。在植入每个支架前，通过导引器将下述药物给药至股动脉Aspegic(SYNTHELABO,法国)，50mg。HeparineChoay(SYNTHELABO,法国)，50IU。而且，在每次血管造影前，将下述血管扩张药物给药至股动脉Corvasal(linsidomine,0.06mg,AVENTIS,法国)。3-前程序性血管造影(Pre-proceduralangiography)暴露一个颈动脉，引入5或6Fr导引器套管。使5个或6个引导导管和导线(GW)前进穿过套管到达末端主动脉。通过用PhilipsBV212设备注射对比物质(Hexabrix320，LaboratoiresGUERBET,法国)来实施骼脉管树的血管造影绘图。报道每个动脉的直径。在支架植入后目标过度牵张近似地为1.2。4-支架的放置根据下述方法将支架植入骼动脉(l或2个支架/每个动物)将引导导管(GC)和GW插入目标位点。GW的完全縮回。将支架展开系统插入目标位点。在定义的气球压力(=8个大气压)下支架的展开。支架在髂总动脉中的植入。从GC中撤出递送系统。5-后程序性血管造影用血管造影进行开放的植入动脉的即吋评价。报道每个动脉的直径，计算获得的过度牵张。6-箭龄細舰劍每日观察动物的任何临床异常。在植入歩骤的前一天开始抗凝剂处理，每个每天给药共30天Aspegic(阿司匹林100mg/ml,SYNTHELABO,法国)，肌内，50mg/天。7-处死和采样通过致死性注射巴比妥酸盐(DolethalND，LaboratoiresVETOQUINOL，法国)处死动物。进行植入的动脉外表面的肉眼检查观察任何局部不耐受性的标准(炎症、坏死、出血或任意其它损害)，并报道。进行宏观摄影。鉴定样品，并固定在10%缓冲的甲醛溶液中用于组织病理学。8-组织病理学样品的制备将植入位点在递增浓度的酒精溶液中脱水，包埋在PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)中。通过Donath改进的显微硬度划痕和磨削技术(DonathK.,BrunnerG.:Amethodforthestudyofimdecalcifiedboneandteethwithattachedsofttissues,—种用于研究粘附有软组织的未脱钙的骨和牙齿的方法，J.Oral.Pathol.ll;318-326,1982)获得一个远侧部分。用改进的Paragon染色法来染色该部分用于定性和定量分析。9-解释在光学显微术(NIKONEclipseE600,装有x4、x10、x20和x40透镜，装备有数字照相机DN100NIKON)下检查组织学切片。根据ISO10993-6标准进行半定量的组织学评价。应特别注意存在的纤维组织、血纤蛋白、变性现象、坏死、平滑肌细胞、弹性薄片膨胀、炎症细胞和物质老化及血栓出现。进行组织学显微照相。根据下述评定尺度评定每个参数。0:不存在1:有限的2:中度3:显著的4:重度这些参数能准确地评价任意的炎症、异物反应和免疫反应。定量地评价内膜(Neointimal)形成。结果1-组织病理学分析半定量分析报道在表2中2-常规观察结果所述支架支柱显示了具有圆角的正方形形状。在样品中没有观察到微观支架的实质性改变。3--非涂层的支架(对照产品)完全地展开所有的支架，使其良好地结合在血管壁中。将支架框架并入包含中等数量的平滑肌细胞、纤维细胞和有限巨噬细胞渗透物的中等厚度的内膜组织中。一个样品(动物，n°3，右侧)显示出有限的弹性薄片破裂，而没有内侧突出。猜想在一个样品(动物，n°11，左侧)的内膜组织内存在有限量的蛋白多糖物质。没有观察到血栓。4-涂层的支架(试验产品)覆盖支架框架的纤维肌性内膜层的厚度与参照组的相当或比其略薄。这些发现是在对照动物内获得的。由于样品数和可评价的观察结果的限制，没有得出有关生物学显著性发现的结论。巨噬(macrophagic)反应具有类似于参照组的轻微放大(slightmagnitude)。没有观察到血栓。用涂层的(试验产品)和/或未涂层的支架(对照产品)成功地植入总共14只动物中的10只。在该研究中，支架植入后的动脉过度牵张达到起始动脉直径的约1.1至1.4倍。植入1个月后，在从8只存活的动物(n=6，没有涂层的支架；n=7涂层的支架)中获得的样品中没有发现肉眼可见的损伤(坏死、炎症、出血)。在处死的动物中没有观察到堵塞的任何征兆。<table>complextableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表8:半定量的组织病理学分析R=右；L-左；M-平均值在植入1月后取回支架的兔子组织学部分的结果对于所有的试验或对照组，没有局部非耐受反应的任何征兆，在狭窄方面存在轻度纤维肌性内膜增殖而有相当的结果。结论主要的组织病理学发现如下-所有的试验和对照支架都是完全展开的，良好地结合血管壁，而没有血栓。-植入一个月后，对于所有的试验或对照支架组，没有观察到局部不耐受的任何征兆。-试验和对照支架组在狭窄方面显示出相当的结果，存在轻度的纤维肌性内膜增殖。而且，在兔子模型(ISO10993)中，电移植层能够防止可生物降解的聚合物层的裂缝和分层，并且显示出与不锈钢裸金属支架相比，即使没有比其更好，而也具有相等的再移植。实施例12:与BMS相比，在p-BuMA电移植支架的兔子中于14和28天的再移植按照实施例3的试验设计，用大约200nm的电移植p-BuMA层涂层钴铬支架。在全身麻醉下，将20个支架(18mm,裸金属，n=10，以及用电移植p-BuMA层涂层，11=10)放置在十只新西兰白兔的髂股动脉中。在第14天处死第一组的5只动物，接着，在第28天处死第二组的。根据在Finn等的Circulation,112,270(2005)中描述的试验设计提取髂股动脉，制备出以进行纵截面。用SEM检查横截面，从SEM图(如上)估计内皮覆盖度。结果归纳在下表9和IO中<table><row><column>14天</column><column>28天</column></row><row><column>BMS</column><column>98%</column><column>93%</column></row><row><column>在BMS上的p-BUMA</column><column>88%</column><column>100%</column></row><table>表9:来自支柱上SEM纵截面的内皮覆盖度(％)<table><row><column>14天</column><column>28天</column></row><row><column>BMS</column><column>98%</column><column>93%</column></row><row><column>在BMS上的p-BUMA</column><column>89%</column><column>100%</column></row><table>表10:来自支柱之间的SEM纵截面的内皮覆盖度(。/。)这些结果表明与裸金属支架相比，在用电移植p-BuMA层涂层的支架上，在支柱上和在支柱之间的内皮覆盖度(如从纵截面的SEM分析计算)较高或与其相当。人们应当特别地注意到早在植入电移植支架14天后，再移植就为有效的，其表明根据该技术的最适宜的直接将受益于该结果，并将药物释放的期间降低至最少，以便促进愈合效果(pro-healingeffect)。实施例13:在猪中完全涂层支架后的局部耐受性用由电移植p-BuMA下层(150nm)制备的组合层进行60天的猪试验，所述下层上为用PLGA(聚丙交酯-共-乙交酯)可生物降解的释放层(5um)涂层。简而言之，十六只驯养的雄性猪(25至30kg)经历在全身麻醉下将32个支架(18mm长，裸金属，n=16，和双层涂层的支架，r^l6)放置在左侧前降支动脉(IVA)或冠状动脉左旋支(Cx)。通过利用具有支架与动脉比为约1.2的定量冠状的血管造影来选择具有平均冠状直径为2.5mm的段。接着，经标准的导线使用支架固定的气囊式导管前进到预选择的用于展开的冠状部分。在IO秒内一次给气囊式导管充气10个大气压，然后，缓慢地退出，将所述支架留在适当位置(没有预先或之后扩张)。冠状的IVUS为了评价体内的内膜形成程度，在支架植入后8周进行IVUS。动脉样品在支架植入后8周切除心脏。除去IVA、Cx和CD，在磷酸缓冲盐水(PBS)中洗涤，然后，根据用于组织形态测定术、免疫化学分析或扫描电子显微术而制备。组织形态测定术,将样品固定在4℃下的福尔马林(3%)中12小时，在梯度乙醇系列(70°至100℃，4℃下)和丙酮中脱水24小时，然后埋入glycomethylmetacrylate(GMA)中。对于每种样品，切下50um厚的切片(Isomet,Buehler法国)，且用Verhoeff-vanGieson染色用于分析。观察组织切片(NikonE-600,Nikon,法国)，数字化，并进行形态测定(Metamorph,法国)。通过在每个动脉段的5个切片进行形态测定分析来定量增厚的内膜。领IJ定内膜面积如从体内弹性薄片(IEL)至内腔边缘的面积，介质面积为IEL和外弹性膜之间的面积。增厚的内膜表示为比例[(内膜面积/内膜面积+介质面积)]。免疫化学分析在干燥过程结束时，除去支架，将动脉埋入石蜡块中，将其切成4μm厚的切片，接着，浸入3％。过氧化氢水溶液中(Sigma,法国)，以抑制内源性过氧化物酶活性。通过在5%牛白蛋白PBS中培养10分钟来阻断非特定性染色。在PBS中洗涤两次后，在各种抗体(抗MIB1、a-肌动蛋白、因子VIII、巨噬细胞(AM-3K))中培养切片。两个独立的观察者计算在内膜和介质区域的着色细胞。扫描电子显微术为了该目的，在4℃，用4%戊二醛、O.IM磷酸盐缓冲液，PH7.2固定样品l小时，且在PBS中洗涤1小时。接着，通过使用梯度乙醇和纯的丙酮使它们脱水，从C02(CPD010BAL-TECAG,Liechtenstein)临界点中干燥。用Au/Pd(EmscopeAshfordUK)喷射涂层样品，用于采用次级电子的扫描电子显微术(JSM6300JeolTokyoJapan)观察。2.8统计分析所有的试验都进行三次，结果表示为平均值土SD。用如下这些值(p<进行ANOVA试验。在导管插入前天开始用抗血小板治疗剂(Plavix300Mg和aspirin75Mg)处理，在整个研究持续期间(随后的6小时、1个月和2个月)继续处理至通常数量(Plavix75mg和阿司匹林75mg每天)。在射线透视(Seldinger)下，通过股骨方式给猪插入导管。将探针"EBU"(Medtronic)置于左侧冠状躯干口，使冠状网状结构选择性浑浊化。在注射50UI/kg肝素后，进行起始冠状动脉内回波描记术(echographic)控帝U(IVUS)(AtlantisPlus40mhz,Boston)。最初的IVUS使有可能估计冠状动脉直径和指导支架植入至获得支架/动脉比为120%。接着，将支架放置在脉管的中段(12个大气压，干燥度为10)。在用于保护好所述支架放置的新的冠状造影(coronarogmphic)控制和IVUS后，取出所述物质，施加手法压迫在股穿刺的位点，直到获得hesmostasis。在两个月的寿命期后，如上所述进行新的导管插入用于冠状造影控制。通过新的IVUS进行支架内狭窄的评价和内膜增殖。该研究结果将首先显示出可生物降解的释放层在第一个4周后消失，从而，释放100%的药物。实际上，通过SEM，人们仅仅可以看到"粗糙的"电移植p-BuMA层的特征在于其"月(limar)"方面(可重现的"火山口"表面不规则；尽管其为均相的，且随处都含有聚合物，即使在"月形孔中")。在植入后30天通过SEM观察支架表面，人们看到电移植p-BuMA的所述"月形火山口"特征，证实可生物降解层完全消失，因此，药物全部被释放。可生物降解层的消失进一歩得到了通过ToF-SIMS分析上述表面和动脉内部的证实，其显示出不存在可生物降解聚合物药物。鉴于第8周观察到的再移植，电移植p-BuMA倾向于通过内皮细胞的适当再移植。IVUS结果证实双层涂层支架的非常好的耐受性，因为在植入8周后，观察到非常少量的内膜增殖和非常少量的平滑肌细胞增殖，所述非常少量的内膜增殖可通过免疫组织学研究来证实，其证实所述涂层是非常安全的而没有炎症，如通过HES染色所示，所述HES染色为一禾中完全的endothelizationvon-(willebrand染色)。实施例14:用于制备与电移植层具有良好连接面的DES的"低压"喷雾装置该设备由具有一个透明壁的手套箱构成。将X-Y扫描系统置于所述箱外面的顶部，通过在外面的磁铁移动，其进一步通过在箱内部顶板上的另一个磁铁来操作做X-Y移动。后一个内部的磁铁可进一步连接到喷嘴。箱的远处壁具有阳性附属物，其连接到外部的电发动机，能通过从设备的前面板调节所述发动机的电压来使所述附属物以可控速度转动。将支架放置在探针上，其进一步用试样架上的尖端物塞住。这些尖端物可相对于试样架全周转动:它们连接到试样架的常见的旋转杆内部，其末端-在试样架的后面-具有阴性附属物，其可以用所述箱的远端壁(farwall)中的阳性附属物塞住。因此，当所有的支架都置于探针上时，其中它们自己可塞住尖端，且当样品座插在箱子的远端壁上时，所有的支架同时且以同样的可调速度旋转。所述X-Y系统为通过外部计算机控制，且推动喷嘴的移动顺序和喷雾，所述喷嘴位于每个支架的顶部，当整个长度的支架单向和单向的反面向前移动吋，一个接着一个开始喷雾，在喷雾终止前，会移动到另一个支架，又开始喷雾。样品座可以保存每批20个，因此，喷嘴从支架#20背部转移至支架#1用于第二次喷雾在整个长度的样品座中，在如下期间基本上不能"看到"每个支架的喷雾，所述期间相当于从一个支架喷雾的Ts时间的19倍时间+清除所述喷嘴的时间TQ的1倍时间。因此，可见所有的支架具有完全相同的实验设计，且证实涂布装置是高度可再生的。质量检测误差结果(涂层在一系列53个DBS的质量，其已经使用如上所述的设备喷雾)显示出相对于目标质量(和因此的目标药物剂量)具有15%的接收标准，仅3个DES因为不符合规格而被拒绝，得到的总产率为94.2%。即使施加更严格的10%耐受性，所述系统给出的收率为86.5%，其实质上高于大多数存在于工业系统中(因为其对药物剂量的通常的规格为大约20%)的。我们将这一特性归于非常高的湿/低压系统的重现性，其由于适当电子移植层提供润湿性而理想地促进。我们也感受到对于低压、气体驱动、喷嘴而言，在喷雾溶液和最后一个聚合物层中的药物浓度之间的关系是高度线性的和高度可重现的，即使其没有严格的一一相对性。权利要求1.一种药物洗脱支架，其包括支架框架；电移植涂层，其涂覆在所述支架框架上，和含有药物的可生物降解的聚合物涂层，其涂覆在所述电移植涂层上。2.权利要求1的药物洗脱支架，其中所述支架框包含金属基质。3.权利要求1或2的药物洗脱支架，其中所述支架框架包括选自下述的物质不锈钢、镍、钽、钴-铬MP35N或MP20N合金、钼、钛、适宜的生物相容性合金、适宜的生物相容性物质及其组合。4.前述权利要求中任一项的药物洗脱支架，其中所述电移植涂层具有10nm至l.O微米的厚度。5.前述权利要求中任一项的药物洗脱支架，其中所述电移植涂层由选自下述的单体制备乙烯化物、环氧化物和经过开环聚合的环状单体和芳基重氮盐。6.权利要求5的药物洗脱支架，其中所述单体选自甲基丙烯酸丁酯、异丁烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟乙酯、s己内酯和4-氨基苯基重氮四氟硼酸酯。7.前述权利要求中任一项的药物洗脱支架，其中涂覆在所述电移植涂层上的所述聚合物涂层含有生物活性剂。8.权利要求7的药物洗脱支架，其中所述生物活性剂选自反义药剂、抗肿瘤剂、抗增殖剂、抗血栓形成剂、抗凝剂、抗血小板剂、抗生素、抗炎药、基因治疗剂、治疗性物质、有机药物、药物化合物、重组体DNA产物、重组体RNA产物、胶原、胶原衍生物、蛋白质、蛋白质类似物、糖类及糖类衍生物。9.前述权利要求中任一项的药物洗脱支架，其中所述药物聚合物涂层选自一种或多种可生物降解的聚合物、共聚物和嵌段聚合物。10.权利要求8的药物洗脱支架，其中所述可生物降解的聚合物选自聚乙醇酸交酯、聚交酯、聚己酸内酯、聚甘油癸二酸酯、聚碳酸酯例如酪氨酸衍生的、生物聚酯比如聚(13-hydroxyalcanoate)(PHAs)和衍生化合物、聚氧化乙烯、聚丁烯对苯二酸酯、聚二氧六环酮、杂合物、组合物、具有生长调节剂的胶原基质、蛋白多糖、葡糖胺聚糖、真空形成的小肠粘膜下层、纤维、壳多糖、葡聚糖及其混合物。11.前述权利要求中任一项的药物洗脱支架，其中所述含有药物的聚合物涂层具有的厚度为1至200微米。12.前述权利要求中任一项的药物洗脱支架，进一步包括可生物降解的上涂层。13.根据权利要求12药物洗脱支架，其中所述上涂层为使用与可生物降解的涂层释放层相同的组合物制备的。全文摘要本发明提供一种药物洗脱支架和制备所述可生物降解的药物洗脱支架的方法，所述支架包括一个金属支架框架、涂覆在所述支架框架上的电移植底物涂层(electro-graftedprimercoating)；和含有药物的可生物降解的聚合物涂层，其涂覆在所述电移植底物涂层上。文档编号A61F2/82GK101346156SQ200780000988公开日2009年1月14日申请日期2007年6月13日优先权日2006年6月13日发明者C·比罗,E·埃诺,F·哈龙申请人:阿卡摩公司