专利名称：抗淀粉样蛋白免疫原性组合物、方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含AP42的片段和载体(carrier)的免疫原性构
建体、该构建体的产生方法和用途，所述构建体的特征在于，所述片 段位于栽体的活性环位置(展示位置)内。
背景技术：
淀粉样蛋白生成性(Amyloidogenic)病症如阿尔茨海默病(AD) 一直公认为老年人痴呆的主要原因。AD中的认知能力的下降与脑中的 组织病理学变化相关，最相关的是淀粉样蛋白斑(amyloid plaque) 和神经原纤维缠结(neurofibrilary tangle)的形成。
虽然淀粉样蛋白斑包含许多蛋白质，但它们的主要成分为淀粉样 蛋白P (AP)肽。AP肽的形成，和因此AP淀粉样蛋白斑的形成，是 由于淀粉样前体蛋白(APP)的异常加工产生的。
目前，已发展了几种药理学方法减緩或逆转AD的进程。虽然几 种方法关注于抑制AP肽的代谢产生，但其他方法针对于阻止Ap淀粉 样蛋白在受AD影响的患者的脑中积聚。
然而，最有前景的方法针对于通过施用能够产生抗AP的免疫应 答的抗原(主动免疫接种)或针对AP的抗体(被动免疫)增加AP斑的 脑清除。
抗原或免疫原通常是包含不同的抗原位点或"表位"的大分子， 所述抗原位点或"表位"被识别并与免疫系统的不同组分相互作用。 它们通常包括偶联至合适的栽体的小分子或"半抗原"，例如短肽。 载体通常是当在体内施用时能够引起免疫应答的更大分子量的蛋白 质。
在免疫应答中，通过B淋巴细胞与T辅助(TH)细胞协同作用产
生和分泌抗体。在大多数半抗原-载体系统中，B细胞产生对于半抗原 和载体都是特异性的抗体。在这些情况下，T淋巴细胞将具有对载体 的特异性结合结构域，但不识别单独的半抗原。在协同作用的情况下， B和T细胞协同诱导半抗原特异性抗体反应。
因此，在构建有效的抗原中，恰当的载体和恰当的半抗原的选择 对于保证强烈的和选择性免疫原应答是至关重要的。抗原的安全性也 是至关重要的。例如，对AD患者施用由预集合的AP42和免疫佐剂 QS-21组成的有前景的AN-1792疫苗在大约6%的被治疗的受试者中导 致严重的脑膜脑炎(meningoencephalitis )。细胞毒性T细胞的中枢 激活作用(central act ivat ion )和自身免疫反应都被认为是毒性的 潜在机制。抗内源单体AP的免疫应答可以是有害的，因为非聚积的A P类型在神经元活动中具有生理作用。
因此，恰当地选择半抗原和载体以确保抗体的选择性针对有害的 A P类型和预防自身免疫毒性是极其重要的。
WO2005058940提出将包含AP肽或其片段的肽免疫原缀合至蛋白 质/多肽载体。
通过化学方法产生免疫原构建体，所述方法包括衍生载体的氨基 酸残基的官能团，其中通过加帽以阻止它们与其他分子反应来使氨基 酸残基的任何未缀合的、衍生化的官能团失活。这样的方法导致其中A P片段结合至栽体的氨基酸侧链的免疫原。虽然在WO2005058940中提 及几种不同的载体和半抗原，但未显示它们在体内的组织病理学功效。
Kim， H. D.等人在Biochem. Biophys， Res. Commun. 第336巻， 第84-92页提及由A p 1-6的无支撑的ll倍重复组成的抗A P DNA疫苗。
这样的构建体产生无差别识别单体、寡聚体和原纤维的AP 42类 型的抗体。
总之，到目前为止，还未实现抗A0 42的不同装配状态(单体、 寡聚体或原纤维)的免疫原的选择性靶向。
基于上述考虑，仍然存在发展安全和有效的免疫原性构建体的需 要，所述免疫原性构建体可用于预防A P淀粉样蛋白在受AD或其他淀
粉样蛋白生成性疾病例如唐氏综合症影响的患者的脑中聚积的治疗性 疫苗组合物中。
本发明提供了一种重组免疫原性构建体，其特征在于，A0片段 被置于载体的活性环位置(展示位置)内而不是结合至栽体的末端。 通过具有AP 42的片段的B细胞表位在栽体优选硫氧还蛋白(Trx)的活 性环位置(展示位置)内的串联多聚化来获得所述肽。
发现，本发明的免疫原引发识别毒害神经的寡聚体类型的A^淀 粉样蛋白的抗体，最近已表明所述寡聚体类型的AP淀粉样蛋白为淀 粉才羊蛋白生成性疾病的最可能的致病因子(causative agent)。
该能力与展示载体内的AP淀粉样蛋白的特征的免疫原的结构相 关。这样的构型在一定程度上允许免疫原性蛋白的正确折叠和更有效 地将其呈递至免疫系统。当免疫原具有多于一个AP淀粉样蛋白片段 和特别地特定数目的所述片段时，免疫原与A0淀粉样蛋白寡聚体的 相似性据认为进一步提高了其功效和增加了选择性。
载体和片段之间的连接体进一步帮助保持肽表位装配状态。
发明概述
本发明提供了包含具有A P 42的免疫显性B细胞表位的片段和载 体的免疫原性构建体(在下文中也表示为免疫原)，所述构建体的特 征在于，所述片段位于载体的活性环位置(展示位置)内。载体优选 是疏氧还蛋白，然而AP片段有利地是少于30个氨基酸残基，优选少 于20个氨基酸残基的N端片段，更优选是Apl-15。
甚至更优选免疫原性构建体具有多于一个片段，优选2至16，最 优选4个片段。
本发明还提供了构建所述免疫原的方法，所述方法包括具有AP 42的片段(优选少于30个氨基酸残基的N端片段)的B细胞表位在 载体的展示位置内的连接体辅助的串联多聚化。
在另一个方面，本发明提供了包含用于抗淀粉样蛋白生成性疾病 的主动免疫接种的所述免疫原的组合物。
在其他方面，本发明提供了所述免疫原用于发展用作抗淀粉样蛋
白生成性疾病的,皮动疫苗(passive vaccine)的抗体(优选单克隆抗 体)的用途。
附图
概述
图la显示根据本发明的Trx(A^ l-15-Gly-Gly-Pro)n构建体。 图lb显示通过金属亲和层析将具有1、 4或8个拷贝的Trx展示
的A P 1-15的构建体纯化至均一。
图lc显示由根据本发明的实施方案的免疫原引发的抗AP抗体
的水平。
图ld显示根据本发明的实施方案的Th2极化反应免疫原。
图2a-b-c显示用来自用根据本发明的实施方案的免疫原免疫的
小鼠的血清处理的人脑切片。
图3显示AFM的图像，该图像显示根据本发明的实施方案的免疫
原的优选结合。
优选实施方案的详述
本发明提供了包含具有至少一个A P 42片段的载体的免疫原性构 建体(或免疫原)。所述片段置于在构象上稳定其的载体的表面暴露 的区域(活性环位置或展示位置)内。
通过凝胶电泳和质语测定法常规地确定构建体的确切大小和化 学均一性。
可通过分析技术确定构建体的结构；然而优选使用核磁共振 (腿)。
栽体优选是硫氧还蛋白(Trx) 。Trx因为其小尺寸(109个氨基酸)、 肽展示能力和用作能够刺激鼠类T细胞增殖的无毒性免疫增强剂的能 力从而是特别合适的载体。然而可使用其他载体。
Ap淀粉样蛋白片段是N端末端，有利地是具有少于30个氨基酸 残基，优选少于20个氨基酸的N端片段和更优选选自下面表l中报导200780006006.8
说明书第5/16页
的AP1-3、 1-4、 1-5、 l-6、 1-7、 l-8、 l-9、 1-10、 1-11、 1-12、 1-13、 1-14、 1-15的N端片段(根据氨基酸的单字母代码)。优选，AP淀 粉样蛋白片段是AP 1 -15。
有利地本发明的免疫原性构建体具有多于一个片段，优选2至16 个，更优选4个片段。
在优选实施方案中，片段通过连接体与载体结合，从而阻止结合 表位(junctional epitope)的形成。所述连接体是短的氨基酸序列， 优选连接体由1至5个氨基酸残基，更优选由甘氨酸-甘氨酸-脯氨酸 (Gly-Gly-Pro)组成。然而也可使用其他连接体，例如甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸(Gly-Pro-Gly-Pro-Gly)或丝氨酸-甘氨酸-丝 氨酸-甘氨酸(Ser-Gly-Ser-Gly)。
优选免疫原构建体由任选地通过合适的连接体连接至4个AP 1-15片段的硫氧还蛋白组成，在下文中表示为Trx(AP 1 - 15)"
构建所述免疫原的方法是克隆方法，所述方法包括在合适的细菌 中扩增载体，将载体插入合适的基因载体(vector)，所述基因载体 包含用于通过pET系统进行蛋白质表达的T7启动子；制备A0片段 DNA插入物；限制性酶切和连接运栽体-基因栽体和A P片段DNA插入 物。
优选A p片段DNA插入物包含氨基酸连接体。 无论何时制备多聚体，使用过量的AP片段DNA插入物。
表1
描述/
A/31-3DAE
Aj81-4DAEF
Aj8l-5DAEFR
AiSl-6DAEFRH
AjSl-7DAEFRHD
Aj81-8DAEFRHDS
A/31-9DAEFRHDSG
A)31-10DAEFRHDSGY
AjSl-llDAEFRHDSGYE
八/31-12DAEFRHDSGYEV
A/31-13DAEFRHDSGYEVH
A/31-14DAEFRHDSGYEVHH
A/31-15DAEFRHDSGYEVHHQ
本发明的优选免疫原性构建体，在已诱导了脑p淀粉样蛋白病状
的转基因小鼠中每月一次的注射进行4个月后，显示减少了海马和大 脑皮层中AP蛋白斑的数目和大小。此外，发现本发明的优选免疫原 性构建体引发识别确定类型的AP 42的抗体。
在海马内注射后，所述抗体能够清除转基因小鼠的海马和皮层中 的A^42阳性斑，所述清除效果对于寡聚性Ap类型是特别明显的。 还发现所述抗体强烈地改善A P相关的星形胶质细胞增生(实施例2)。
因此，本发明的免疫原性构建体可形成用作抗淀粉样蛋白生成性 疾病的主动疫苗和纟皮动疫苗的组合物。
对于主动免疫接种，有利地将包含本发明的免疫原性构建体的药 物组合物与佐剂一起施用。
佐剂和/或栽体的选择取决于包含佐剂的疫苗的稳定性、施用途 径、给药方案、用于被接种的物种的佐剂的功效，在人中，药学上可 接受的佐剂是由相关控制单位(pertinent regulatory body)已批准 的或可批准用于人施用的佐剂。例如，完全佛氏左剂不适合于人施用。 合适的佐剂包括3 De-O-酰基化的单磷酰脂质A (MPL)、胞壁酰-二-肽和皂苷例如QS21和Quil A。
优选类型的佐剂是铝盐(明矾)，例如氩氧化铝、磷酸铝、硫酸铝。
其他佐剂包括细胞因子例如白细胞介素(IL-1、 IL-2、和IL-12)、巨 噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)。
可将佐剂和免疫原一起作为单一组合物一起施用，或可在施用免 疫原之前、同时或之后施用佐剂。任意地，可同时使用2种或更多种 不同的佐剂。
可以在同一小瓶中包装和提供免疫原和佐剂或在分开的小瓶包 装和提供免疫原和佐剂且在使用前混合。
包含本发明的免疫原性构建体的药物组合物还可包括含多种其 他药学上可接受的组分。参见Remington'sPha簡ceutical Science (第15版，Mack Publishing Company, Easton， Pennsylvania, 1980)。
优选药物形式取决于希望的施用和治疗应用的模式。取决于希望 的制剂，组合物还可包含药学上可接受的、无毒性的栽体或稀释剂， 所述载体或稀释剂被定义为常用于配制用于动物或人施用的药物组合 物的媒介物。
选择稀释剂以不影响组合物的生物学活性。此类稀释剂的实例是 蒸馏水、生理磷酸緩沖盐溶液、林格氏溶液、葡萄糖溶液和Hank's 溶液。
对于胃肠外施用，可以以可注射剂量的具有药学载体的生理可接 受的稀释剂中的物质的溶液或悬浮液的形式施用本发明的免疫原性构 建体，所述稀释剂可以是无菌液体例如水化油(water oils)、盐水、 甘油或乙醇。
此外，辅助物质例如湿润剂、乳化剂、表面活性剂、pH緩冲物质 等可以存在于组合物中。
本发明的组合物可制备为可注射的液体溶液或悬浮液；还可制备 适合于在注射之前用于液体媒介物中的溶液或悬浮液的固体形式。
还可以以积、存注射(depot injection)或植入制剂(implant preparation)的形式施用本发明的免疫原性构建体，可以以这样的方 式如允许活性成分的持续释放的形式配制所述制剂。
适合于其他施用方式的另外的制剂包括口服、鼻内和肺制剂、栓
剂和透皮制剂。
对于被动免疫接种，将组合物注射入哺乳动物例如豚鼠或其他动 物物种，然后纯化所得的抗体，随后将其注射入人。
优选抗体是单克隆抗体，通过用Trx(ABl-15)4免疫原性构建体 免疫哺乳动物来产生所述抗体。所述抗体用于预防和治疗淀粉样蛋白 生成性疾病，特别是阿尔茨海默病。
实施例1
不同TrxA0免疫原性构建体的制备和不同的抗TrxA&抗体的效 应的离体评估
使用克隆策略进行Trx(A0 l-15)n的构建(图la)，所述克隆策略 依赖于与具有在噬菌体T7启动子的控制之下的Trx编码序列的经改造 的接受体基因栽体相比，过量的AP1-15 DNA插入物的使用。分离具 有l、 4或8个拷贝的Trx展示的AP1-15的构建体，并且将其用于表 达相应的肽，然后通过金属亲和层析将所述肽纯化至均一 (图lb)。
有助于产生正确装配的A P 1-15多聚体的是存在于Trx序列内的 唯一的。( /位点(核苷酸位置99-105，相应于氨基酸残基34-35，鉴 定为... CG/GT (A) CCG... 30的定向和按读框融合的能力以及编码 间插Gly-Gly-Pro连接体的末端序列并入至A P 1-15 DM内的整合， 从而也防止连接表位的形成。
以相似的方式制备具有单拷贝的全长A0 42肽的第四构建体 (TrxAp42)。虽然不顾A P 1-15的多倍性，所有Trx (A P 1-15) n多肽 都是可溶性的，但大多数TrxA0 42蛋白是以不溶性形式包含在内含 体内的(未显示)。因此，即使当融合至异源细菌细胞背景中的Trx， AP 42仍表现出很弱的可溶性。
用10 nmol的上述Trx(Aei5)n多肽或用当量的预集合的合成的 42或TrxA0 42 (全都补充以明矾，经批准用于人用途的佐剂)处 理5组10只雄性BALB/c小鼠(图lc)。
用单独的緩冲液(PBS)或用不含明矾的A0 42注射的另外两组
用作阴性对照。在第四次注射后2周收集血清，随机成对地混合，使 用集合的A042作为耙抗原，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析血 清。如图lc中所示，由Trx(Api-15)4和Trx(Api-15)s但非由TrxA P 1-15引发的平均抗AP抗体的水平显著比模拟物处理的对照的水平 更高(P〈0. 05;)，与42处理组的水平相似，其中TrxAP42的表现 与游离的AP 42 —样。
P是与关于对数转化的对照和实验数据的t检验相关的p值，使 用贝叶斯或规贝'H匕才示准差(regularized standard deviation) ; P 表示在统计检验中获得的结果归因于偶然性而非真正的测量之间的相 关性的概率。
通过同种型特征镨(图ld)显示明矾佐剂的常见的强抗炎性Th2 极化反应。虽然对于所有抗原观察到类型G和亚类1 (IgGl)的免疫球 蛋白占主体，但可再现地，对于多聚化的Trx(AP l-15h和TrxAP 42 免疫缀合物，IgGl/IgG2 (类型G和亚类2的免疫球蛋白)的比率比对 于未缀合的A 0 42的所述比率更高(代O. 05)。
然后研究响应Trx(A0 l-15)n而产生的抗血清结合淀粉样蛋白斑 的能力。该性质(目前被认为是体内抗AP抗体的功效的最佳预后指 标)不是与所有之前描述的抗Ap抗血清(例如，m266和靶向A042 的C端部分的其他抗体)共有的性质。
如图2a-b所示，来自用Trx(APl-15)。的四聚体或八聚体形式免 疫的小鼠的血清与淀粉样蛋白斑结合，直至1/1000的稀释度。
用抗多聚化Trx(AP l-15)n抗体标记大神经斑以及成熟的和未成 熟的斑。使用在兔子中产生(使用AP40作为抗原)的阳性对照抗Pan &淀粉样蛋白抗血清观察到更广泛的免疫染色，特别是在老年斑核心 内的免疫染色(未显示)。通过比较，使用来自模拟物处理的动物(未 显示)的血清或使用来自用单体TrxApl-15 (图2c)免疫的小鼠的血 清未检测到斑。
最后，使用免疫印迹法评估不同的抗Trx(AP l-15)n抗体抗在之 前确定的条件下体外产生的和通过原子力显微镜(AFM)验证的AP 42
的不同装配状态(单体、寡聚体和原纤维)的能力。该分析的结果示于
图3中，该图显示抗Trx(AP 1-15)8抗体结合所有3种A042类型， 然而Trx(A0 1-15)4抗体优选结合可溶性寡聚体和原纤维，但不结合A p42单体。强烈相反地，用单体TrxAP 1-15抗原产生的抗体显示不 结合Ap42原纤维以及不识别A0 42原纤维。后一观察与这些抗体在 ELISA中不能识别高级AP42集合体以及不能识别AD斑中的Ap原纤 维一致(参见图lc和2c)。然而，有趣地，抗单体TrxAP 1-15抗体结 合A0 42单体和寡聚体(图3)。因此即使使用中等强度的佐剂例如明 矾、A1(0H)3配制时，Trx(Ap 1-15)4仍是可溶性的、具有良好免疫原 活性的缺乏T细胞表位的淀粉样蛋白P衍生物。Trx(Api-15)4产生 结合突触毒性的(synaptotoxic) A 0 42寡聚体和原纤维但不结合假 定的生理单体A p类型的抗体的能力也是显著的。
与其他肽免疫策略相比，Trx-dPI的主要有利方面是其时间和成 本效果、细胞毒性的缺乏和化学上均一的免疫缀合物的产生、易于验 证的批与批之间的一致性。此外， 一旦鉴定了 "前导抗原(lead antigen)",其可容易地进行进一步修饰，包括另外的肽表位的整合 和用于DNA接种目的的基因载体替换。
TrxAP构建体。使用经设计提供限制性位点y^e/ e化/z^/的引 物1和2 (表2)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码大肠杆菌硫氧 还蛋白的序列。用A^e/eAs/z7)7/限制性内切酶对扩增的片段进行双酶 切，然后将其连接至用相同的两种酶消化的pET28b (Novagen);所得 的基因栽体(称为pT7Kan-Trx)具有细菌疏氧还蛋白的N端和C末端 His6标记形式和卡那霉素抗性标记。
将Trx编码序列内的唯一的C/ o/位点(核苷酸位点99-105，相应 于氨基酸残基34-35，鉴定为5'.,.CG/GT(A)CCG... 3')用作克隆位 点。
唯一的CpoI位点的定向和按读框整合的能力有助于多聚体的产生。
pT7Kan-TrxA P 1-15。已通过使磷酸化的寡核苷酸退火获得编码A
0 1-15肽、淀粉样蛋白^肽AP42的N端片段的序列，所述寡核苷酸 是
5'-
GTCCGATGGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTT CATCATCAAGGCG-3'(正向) 3'-
GCTACCTACGTCTTAAGGCTGTACTGAGTCCTATACTTCAAGTAG TAGTTCCGCCAG-5'(反向)
具有末端。0/识别序列。已以1 /10的基因栽体/插入物摩尔比将5 7 bp (5' 突出。oi)的DNA插入物与C/70/-消化的pT7Kan-Trx连接。
N-n4-6xHi s-nlO-TRX(1-33)GPMDAEFRHDSGYEVHHQGGPTRX (36-109) -nl5-6xHis-C
完整序列是
mgssbbhhhbssglvprgshMGDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDF WAEWCGPMDAEFRHDSGYEV冊QGGPC認IAPILDEIADEYQGKL TVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQL KEFLDANLRdpnsssvdklaaalehhhhhb
TrxA 3 1-15构建体的主要特征在于，在A P 1-15肽的N端上存 在Met残基(M) 、 A P 1-15肽的C端上存在Gly-Gly-Pro连接体以及存 在编码细菌石克氧还蛋白的N端和C端His6标记的形式的序列。
pT7Kan-Trx (AP 1-15)4 e pT7Kan-Trx (A卩卜15) 8。已以相似的方 式，但以1/100的基因载体/插入物摩尔比获得具有更多拷贝的AP 1-15肽的构建体。通过限制性内切酶消化/凝胶电泳筛选重组克隆， 将它们中的具有4或8个拷贝的A P 1-15序列的两个克隆用于表达和 纯化相应的重组蛋白Trx (A P 1-15) 4和Trx (A P 1-15) 8。
两个His6标签的存在有助于纯化步骤且可增^免疫原性，如在 赖氨酸残基的串联重复的情况下。
表2
N° 引物名称 序列 L
1 Nde-Trx-PLUS Cgcatatgggcgataaaattattcacc 602 Bam—Trx-MINUS Cgggatcccgccaggttagcgtcgag 60
Trx A0多肽的表达和纯化。通过向用上述各构建体转化的大肠 杆菌BL21Star (DE3)细胞(Invi trogen)中加入1 mM异丙基- P -D-硫代 半乳糖苷(IPTG)，并让其在37C下进行2小时，以诱导表达。将不同 的大肠杆菌林系(Origami-DE3; Novagen)和改良的表达条件 (pT7-Amp-Trx基因载体；在30C进行5小时)用于Trx A P 42 (其在 别的条件下是完全不溶的)的表达。在细胞裂解后，将His6标记的 Trx 多肽与金属亲和树脂(Talon; Clontech)结合，按照厂商说明 书进行纯化，然后用磷酸盐緩冲液(PBS)进行充分透析。使用考马斯 染色法(Bio-Rad)和通过UV吸收确定蛋白质的浓度。通过在11%的聚 丙烯酰胺SDS凝胶上的凝胶电泳和MALDI-TOF分析(MassLynx 4.0， Waters)来评估个体多肽的组成和纯度。
免疫方案。对重组Trx A0多肽(2 mg/ml于PBS中)进行过滤灭 菌，在即将使用前，将各等分(10nmol)与1 mg明矾(Sigma-Aldrich) 混合在400 ju 1的终体积中。将A0 42 (Sigma-Aldrich)溶解在PBS (2 mg/ml)中，在免疫前在37t:集合过夜。如图lc中所说明的，在第1、 15、 30和60天，用上述抗原皮下注射5组随机组合的1月龄的雄性 BALB/c小鼠(Charles River Laboratories;每纟且10只动物)。对照使用PBS和集合的Ap42 (两者都不含明矾)注射的两个阴性对照组使 用相同的处理。在最后一次增强后2周收集血清，将血清成对随机混 合。
抗Ap42抗体的检测。以固定的1/200的稀释度，使用集合的A (0.5 jug/孔)作为靼抗原23，通过ELISA检测总的抗A042抗 体。在温育、洗涤以及加入辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗小鼠免疫球 蛋白(1/5000; Sigma-Aldrich)和显色底物邻苯二胺(Sigma-Aldrich) 后，在450 nm处通过分光光度测量读板。以固定的1/200的稀释度， 使用大鼠抗小鼠Ig亚类特异性的、HRP缀合的二抗(TechniPharm)进 行免疫球蛋白同种型的确定。以一式三份对5对来自各组的血清进行
ELISA;只将来自组1、 3、 4、 6和7 (图lc)中的3个最高的应答者 的血清亚群用于同种型确定。使用Analyze-it软件，通过单因素方差 分析进行组间的比较。
免疫组织化学。根据它们与来自68岁的具有严重的阿尔茨海默 病的常见神经病理学和临床症状的患者的人脑切片中的A P斑结合的 能力，筛选来自用3种TrxApi-15多肽的每一个多肽免疫的小鼠的血 清。分析不同稀释度(1/100-1/1000)的来自组5、 6和7中的3个最高 应答者的混合血清；使用1/500的稀释度获得最佳结果。向福尔马林 固定的、用曱酸(80%， 15分钟)预处理的颞(temporal)皮层组织的 连续的8jum脑切片加入血清。来自模拟物处理的(PBS)动物的血清和 商业抗A P 40多克隆抗体制剂(Anti-Pan P-Amyloid, Biosource)分 别用作阴性和阳性对照。按照厂商说明书，使用En Vision Plus/辣 根过氧化物酶系统(Dako),使用3-3'-二氨基联苯作为显色底物显示 免疫标记。
用数码相机以50至400X的放大率获取图像。
点印迹测定法和AFM成像。按照本领域内已知的之前的方案(参 见例如Stine，W. B.等人在J. Biol. Chem.第278巻，第11612-11622 页)制备用于点印变分析的A042类型。简而言之，将溶解在2MDMS0 (lmM的终浓度)的A0 42用作单体形式的来源；以100 )iM的终浓度 将DMSO原液稀释入冷Ham's F12 K介质(不含酚红；Biosource)，然 后在4。C温育24小时，将所述稀释液用于制备可溶性寡聚体；将以100 iaM的终浓度稀释入10mMHCl且在37"€下温育24小时的相同原液用 于产生AP原纤维。通过AFM验证不同AP类型的鉴定以及验证可溶性 寡聚体溶液中不存在原纤维。在这一点上，将上述AP42溶液在20 n 1沉积緩沖液(deposition buffer) (4 mM HEPES pH 7. 4， lOmMNaCl, 7 mMMgCl2)中稀释l()倍至10 yM的终浓度，并将其在室温下立即沉 积在新切开的红云母(ruby mica)上。5分钟后，用milli-Q级水漂 洗云母片，然后在氮流下逐渐干燥。使用以敲击模式操作的、使用商 业跳板(diving board)珪悬臂梁(MikroMasch)的Nanoscope III显
微镜(Digital Instruments)收集图像。使用真空操作的点印器(dot blotter apparatus ) (96孑U Bio—Rad)，将相应于0. 1 pmol或1 pmol 的A p 42肽的固定体积的各A P类型点在用20 mM Tris-HCl， pH 7. 5， 0.8% NaCl (TBS)预湿润的硝酸纤维素膜(GE Healthcare Life Sciences)上。以每次8张膜的批量制备点印迹，干燥所述点印迹，且 在使用前在4'C下贮存不超过2周。按照厂商说明书，在蛋白A小纯 化柱(Diatheva)上亲和纯化用于点印迹分析的抗血清。在使用考马斯 染色法确定总的免疫球蛋白浓度后，以0.75 ng/ml的终浓度将纯化 的免疫球蛋白用于点印迹分析。在室温下，在用5%的补充0. 05%Tween 20的TBS(TBST)中的脱脂奶粉封闭后，将印迹与脱脂奶粉-TBST中的3 种Trx AP 1-15—抗中的每一种一起温育1.5个小时，用TBST洗涤3 次，每次IO分钟，然后按照厂商的说明，使用SuperSignal West Femto 试剂盒(Pierce)进行小鼠免疫球蛋白的检测。使用来自各组中的最高 响应混合物的抗血清进行3次独立的技术重复。
实施例2
抗Trx (A 0 1-15) 4抗体在体内对成年Tg2576转基因小鼠中的脑0 淀粉样蛋白病状的作用的评估
方法
从波士顿大学(Boston University)的阿滋海默病中心的小鼠 群体(Alzheimer's Disease Center's mouse colony)获得表达人 APP (1)的瑞典突变的雌性转基因AD(Tg2576)小鼠。由Dr. Karen Hsiao-Ashe (Department of Neurology, University of Minnesota Medical School)提供该群体的建立者。APP Tg2576小鼠早在8个月 的时候发生行为异常并展示脑AP沉积物(如蛋白斑)连同相关的星 形胶质细胞增生的组织学证据。使用尾部DNA通过标准PCR测定法来 对小鼠进行基因分型，在随意接触食物和水的情况下，在标准的条件 下关养小鼠，每笼4只小鼠。将置于12小时光照方案中的6只14月 龄的APP小鼠(每只32-34 g)用于进行手术。通过盐酸氯氨酮/甲苯蓉
嗪腹膜内注射(100mg/kg氯氨酮和10mg/kg甲苯噻嗪；100 ju 1/10 g体重)麻醉小鼠，使用小鼠头适配器将小鼠置于立体定向仪(Koph)。 使用热垫使体温调节保持在37X:，在整个过程中进行呼吸监测。在正 中线上切割头皮以暴露矢状缝，确定两个半球中的立体定位坐标
(stereotaxic coordinate) (2)。 前自用作参照点(2. 0 mm)， 在左 和右冲黄线坐标(lateral coordinate)的接合处(1. 75 mm)在颅盖上 钻孔。使用钝尖的lOjal注射器(Hamilton)将亲和纯化的抗Trx(A0 l-15)4抗体和来自PBS处理的小鼠的模拟球蛋白(各2 jul)分别立 体定向地注射入左海马和右海马(2. 0 mm的腹侧(ventral))。在放 置好注射器后，进行2分钟的停留时间，然后进行4分钟的注射时间， 在撤出注射器之前停留另外2分钟。当使用9mm的小手术夹封闭切口 时使用局部抗菌药。将小鼠保持在温暖的垫子上直至完全恢复。按照 国立卫生研究院关于实验动物的管理和使用的指南(National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animal)以及得到Veterans Administration和波士动物管理委员会
(Animal Care Committees )的允许进行所有动物实验。注射后7天， 深度麻醉小鼠，使用2%的緩冲的多聚甲醛(100 ml)经颈动脉对小鼠 进行灌流。将脑固定后(post-fix) 2小时，在分级的系列甘油中进 行冷冻防护，然后进行冷冻切片(50 pm)。针对尼氏物质(Nissl substance)对连续切片的小鼠组织切片进行染色，用抗A042 (目录 号344; Biosource International)、抗Ap寡聚体(All ; Biosource International)和胶质细胞原纤维抗原蛋白(glial fibrillary antigen protein) (GFAP; Dako)抗体进行免疫染色，和使用用于鉴 定成熟的AP斑的Ca即bell-Switzer方法进行银染色。定量分析始于 耳间1.68 mm/前自-2.12 mm至耳间2.16 mm/前自-1.64 mm 的海马内的连续切割的Ap42免疫染色冠状組织切片。使用BioVision (3)和Neurolucida软件程序(MicroBrightField， Williston， VT)从 抗Trx(A0 1-15)4处理的半球内和对侧PBS处理的半球内的相同脑区 域的高清晰图象定量A0 42阳性斑。BioVision将斑块与背景神经毡
区分开并且对斑块进行计数，Neurolucida从BioVision图像提取数 据，并将其输出至Excel (Microsoft, Redmond, WA)以进行统计分析。
结果
然后通过将该抗体立体定向地注射入14月龄的APP转基因AD (Tg2576)小鼠来评估抗Trx(AP 1-15)4的免疫治疗潜能。注射入对侧 半球的来自只用PBS处理的小鼠的模拟免疫球蛋白用作该实验的内对 照。注射后7天，组织病理学检查显示，与模拟物注射的半球相反， 接受抗Trx(AP 1-15)4抗体的小鼠的海马和重叠新皮层(overriding neocortex)中的A^染色显著减少。A 0阳性斑不仅不存在于注射位 置，而且在注射半影(注射位置的前/后2 mm)内明显减少。
这暗示着抗Trx(AP l-15)4抗体在体内不仅乾向原纤维和小寡聚 体，而且靶向更高级的寡聚体。为了验证这些发现不是抗Trx(A0 1-15)4和抗AP—抗之间的竟争的结果，我们通过使用胶质细胞原纤 维抗原蛋白(glial fibrillary antigen protein) (GFAP)免疫染色 和Campbell-Switzer 4艮染检测星形股质细胞增生(astrogliosis ) 和AP斑来进行可选择的组织病理学分析。与对侧模拟物注射半球相 比，抗Trx(AP 1-15)4抗体注射半影内的星形胶质细胞增生和胶质相 关斑显著减少。此外，如Campbell-Switzer 4艮染所显示的，与才莫拟物 注射的半球相比，抗Trx(Ap 1-15)4注射的半球中存在少得多的斑。 两个观察都与使用抗AP抗体的检测获得的免疫染色数据一致。从定 量的观点，与PBS处理的半球相比，在抗Trx(AP 1-15)4处理的半球 中，AP42阳性斑的数量显著减少(PBS处理的半球3. 34xl03 ± 0.58; 抗Trx( 1-15)4处理的半球0.97xl03 ± 0.27， P < 0.01)。
权利要求
1. 包含载体的免疫原性构建体，所述载体在其活性环位置中具有至少一个Aβ42的片段。
2. 权利要求1的免疫原性构建体，其中载体是硫氧还蛋白。
3. 权利要求1的免疫原性构建体，其中Ap42片段通过氨基酸 连接体与载体结合。
4. 权利要求2的免疫原性构建体，其中至少一个A042片段是 少于30个氨基酸残基的N端片段，优选选自Api-3、 1-4、 1-5、 l-6、 1-7、 l一8、 l一9、 1-10、 1-11 、 1-12、 1一13、 1-14、 l-15的N端片段。
5. 权利要求4的免疫原性构建体，其中至少一个Ap42片段是A P 1-15。
6. 权利要求5的免疫原性构建体，其中A p 1-15片段通过氨基 酸连接体与硫氧还蛋白结合。
7. 权利要求6的免疫原性构建体，其中氨基酸连接体是 Gly-Gly-Pro。
8. 权利要求5的免疫原性构建体，其中硫氧还蛋白具有多于一 个Apl-15片段。
9. 权利要求8的免疫原性构建体，其中硫氧还蛋白具有4至16 个AP1-15片段。
10. 权利要求9的免疫原性构建体，其中硫氧还蛋白具有4个A P 1-15片段(Trx(AM-15)4)。
11. 权利要求8至10任一项的免疫原性构建体，其中各A P 1-15 片段通过氨基酸连接体与硫氧还蛋白结合。
12. 权利要求11的免疫原性构建体，其中氨基酸连接体是 Gly-Gly-Pro。
13. 用作抗淀粉样蛋白生成性疾病的治疗性疫苗的药物组合物， 其包含含有栽体的免疫原性构建体，所述载体在其活性环位置内具有 至少一个A卩42的片段。
14. 权利要求13的组合物，其中载体是硫氧还蛋白。
15. 权利要求14的组合物，其中AP42片段通过氨基酸连接体 与栽体结合。
16. 权利要求14的组合物，其中至少一个A0 42片段是少于30 个氨基酸残基的N端片段，优选选自Api-3、 1-4、 1-5、 1-6、 l-7、 1-8、 1-9、 1-10、 1-11 、 1-12、 1-13、 1-14、 l-15的N端片段。
17. 权利要求16的组合物，其中至少一个A P 42片段是A P 1-15。
18. 权利要求17的组合物，其中AP 1-15片段通过氨基酸连接 体与硫氧还蛋白连接。
19. 权利要求18的组合物，其中氨基酸连接体是Gly-Gly-Pro。
20. 权利要求17的组合物，其中硫氧还蛋白具有多于一个AP 1-15片段。
21. 权利要求20的组合物，其中硫氧还蛋白具有4至16个AP 1-15片段。
22. 权利要求21的组合物，其中硫氧还蛋白具有4个AP 1-15片段。
23. 权利要求22的组合物，其中各Ap 1-15片段通过氨基酸连 接体与硫氧还蛋白结合。
24. 权利要求23的組合物，其中氨基酸连接体是Gly-Gly-Pro。
25. 权利要求13的组合物，其还包含佐剂。
26. 权利要求25的组合物，其中佐剂选自3De-0-酰基化单磷酰 脂质A (MPL)、皂苷QS21、胞壁酰-二-肽或铝盐。
27. 权利要求26的组合物，其中铝盐选自氢氧化铝、磷酸铝和 硫酸铝。
28. 识别权利要求1至12的免疫原性构建体的单克隆抗体。
29. 权利要求28的抗体，其中免疫原性构建体是Trx(AP 1-15)4。
30. 用于预防或治疗淀粉样蛋白生成性疾病的治疗剂，其包含根 据权利要求28或29的单克隆抗体作为活性成分。
31. 权利要求30的治疗剂，其中淀粉样蛋白生成性疾病是阿尔 茨海默氏病。
32. 用于制备包含载体的免疫原性构建体的方法，所述载体在其 活性环位置内包含至少一个A0 42的片段，所述方法包括i) 在合适的细菌中扩增载体，ii) 将载体插入合适的基因载体，所述基因载体包含用于在整个 pET系统中进行蛋白质表达的T7启动子；iii) 制备Ap片段DNA插入物；iv) 限制性酶切和连接载体-基因载体和A P片段DNA插入物。
33. 权利要求32的方法，其中载体是硫氧还蛋白。
34. 权利要求32的方法，其中细菌是大肠杆菌。
35. 权利要求32的方法，其中基因载体是pT7Kan-Trx。
36. 通过权利要求32的方法获得的免疫原性构建体。
全文摘要
本发明提供了通过具有Aβ42片段的B细胞表位在载体(优选细菌硫氧还蛋白(Trx))的活性环位置(active loop site)(展示位置)内的串联多聚化获得的重组免疫原。构建具有多于一个拷贝的Aβ42片段、优选具有间插氨基酸连接体的多肽，并且将所述多肽与佐剂一起注射入小鼠。发现引发的抗体选择性结合神经炎性AD斑内的纤维状和/或寡聚体Aβ。
文档编号A61K39/00GK101384279SQ200780006006
公开日2009年3月11日 申请日期2007年2月13日 优先权日2006年2月24日
发明者B·P·爱姆比姆博, G·威尔莱蒂, N·默尔图, S·奥图纳罗 申请人:奇斯药制品公司