专利名称：抗微生物感染的免疫球蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗微生物感染的免疫球旦白制剂的制备方法及其应用，尤其涉及一种采用疫苗免疫接种乳牛，诱发其高敏感状态，用其牛奶制备抗微生物感染的免疫球旦白制剂的方法及其应用。
发明技术背景正常人体胃肠道及呼吸道粘膜上均有含量丰富的免疫球旦白A，抵御侵犯人体的多种致病性微生物，当人体免疫功能减弱或缺乏时，人体腔道粘膜免疫球旦白A含量会显著降低，从而使致病微生物侵犯人体，导致各类感染性疾病的发生和发展。
婴幼儿身体内免疫功能尚未发育完成，主要靠母乳的免疫球旦白来杀灭微生物，所以非母乳喂养的婴儿容易发生各类感染。
人体免疫功能低下或免疫功能缺乏也会引起严重的感染，尤其后天性免疫缺乏症患者(爱滋病人)会因为免疫功能缺陷而极易患各种感染性疾病。
众所周知，牛初乳中含有大量免疫球旦白，能对抗各种微生物感染，但牛初乳来源较少，不易收集，不容易形成大批量的生产规模。
多项实验研究已经证实，通过免疫接种乳牛，能诱发乳牛产生特异性抗体以抵抗各类微生物，美国专利(4,324,784)公布的技术，用变异链球菌接种乳牛产生的特异性抗体能防治龋齿。
进一步研究发现，采用复合抗原致敏乳牛，诱发乳牛进入高敏感免疫状态，其分泌的牛奶中产生的抗体能有效对抗多种微生物。
本发明所要解决的技术问题是，选择适当的抗原接种乳牛，诱发乳牛高敏感免疫状态，并从其分泌的牛奶中制备抗微生物感染的免疫球旦白，用来预防和治疗各类微生物感染。
发明内容
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案，其特征是，选择合适的抗原或抗原组合，制备单价或多价复合抗原疫苗，免疫接种经选择的健康乳牛，监测接种乳牛血清以确定其已进入高敏感免疫状态，重复追加接种足够剂量的疫苗以维持其高敏感免疫状态，测试牛奶中免疫球旦白的生物活性，从收集的牛奶中，通过采用超微滤膜分离提纯的方法，制备高纯度抗微生物感染的免疫球旦白。
本发明的技术特征是，单独的抗原或者复合抗原都可以被用作制备接种乳牛的疫苗，抗原类型可以是细菌、病毒、孢子体、螺旋体等微生物或其他物质，只要该抗原可以引发接种的乳牛进入高敏感免疫状态。最适宜的抗原类型是细菌，最好是采用多价抗原形式的灭活细菌疫苗。
本发明的技术特征是，选择的免疫接种对象可以是乳牛或乳羊，最好是健康乳牛，接种方式可以是皮下注射、皮内注射、静脉注射、腹膜内注射、乳房内注射、口服、灌肠、肌肉注射等，只要该接种形式能使接种动物致敏，最好的接种方式是肌肉注射，如果肌肉注射不能引发高敏感免疫状态，可以同时采用静脉注射或乳房内注射的方法联合接种，以诱发接种动物进入高敏感免疫状态。接种的剂量要足够，剂量范围从1，times，10，sup.6cells到1.times.10.sup.8cells。
本发明的技术特征是，应该监测接种乳牛是否对抗原敏感，以及是否已进入高敏感免疫状态。有很多已知的方法可以检测这种敏感性，其中包括皮肤敏感性试验、测定血清中特异性抗体滴度，最好的方法是分别测试乳牛接种前后血清对多价抗原复合疫苗产生的抗体凝集反应，如果在接种后出现特异性抗体凝集反应，则证实已经进入高敏感免疫状态。
本发明的技术特征是，在首次免疫接种诱发乳牛高敏感免疫状态后，应该重复追加接种注射，以维持这种已诱发的高敏感免疫状态，重复注射应维持足够的剂量，至少应等于首次接种剂量，必要时可加大剂量，但不超过初始剂量的150％，重复接种的时间和次数取决于抗原的选择及组合，通常是每两周重复注射一次，一般可重复注射4～6次，但在这期间至少每两周监测一次血清抗体凝集反应，如果接种乳牛出现免疫耐受现象，则应停止使用该乳牛的牛奶作为原料制备免疫球旦白。
本发明的技术特征是，制备高纯度免疫球旦白的方法是，对收集的牛奶采用离心方式脱脂，用酸剂调整牛奶PH至4.5～4.9，最好是PH4.7～4.8，加热30℃～50℃，最好40℃，加热时间20分钟～40分钟，最好30分钟，可降温至4℃后静置过夜，用滤布过滤器，最好是尼龙滤布过滤器滤除凝集的酪旦白后直接喷雾干燥，或加碱剂，调整PH至6.8～7.0后喷雾干燥成干粉，或者在加热后直接用离心机离心沉淀酪旦白，离心时间15分钟～45分钟，最好30分钟，离心速度3000～6000转/分，最好5000转/分，离心沉淀去除酪旦白后，上清液用分子量为100,000～120,000D的超微滤膜分离过滤、浓缩物浓缩至原体积10～30％时，冷冻干燥或喷雾干燥制备干粉，喷雾干燥时温度不能超过140°F。
本发明的技术特征是，为了保持免疫球旦白的生物活性，所有的工艺均需严格控制温度，牛奶原料进行巴氏消毒时，温度不能超过140°F，时间不能超过15秒，在整个制备过程中，都要注意控制温度，在喷雾干燥时，温度也不能超过140°F。
本发明的技术特征是，本发明制备的免疫球旦白干粉中，免疫球旦白含量约为8％，其中免疫球旦白(IgG)是主要成份，具有生物活性，可以采用多种已知的方法进行测定，抗体凝集试验是一种简单有效的方法。
本发明的技术特征是，本发明制备的免疫球旦白可以制备成多种形式制剂使用，可以直接应用干粉制剂，或加溶液配制成口服液应用，或者与其他药物辅料混合制备成片剂、胶囊剂、散剂、冲剂、颗粒剂、油剂、乳剂等服用，还可以作为食品添加剂制备成食品使用，如牛奶、奶粉、速溶咖啡、速溶茶、饼干、糕点、冰琪淋等，还可以制备成口香糖、含片形式，以对抗口腔中微生物，或制备成气雾剂以对抗咽喉或呼吸道微生物，还可以制备成水溶性溶液与超声雾化装置共同应用以对抗上呼吸道微生物。
本发明的技术特征是，本发明制备的免疫球旦白制剂，适用于婴幼儿，尤其适用于未采用母乳喂养的婴儿预防和治疗胃肠道微生物感染；适用于体质虚弱、抵抗力低下、免疫功能低下的人群用来预防和治疗胃肠道微生物感染、呼吸道微生物感染、口腔、咽喉部微生物感染；适用于免疫功能低下或免疫功能缺乏的患者用来预防和治疗各类微生物感染，尤其是爱滋病病人的胃肠道感染；还适用于长期服用肾上腺皮质激素类药物的病人所发生的各类空腔器官感染。
本发明的技术特征是，本发明方法制备的免疫球旦白制剂用于预防和治疗各类微生物感染的剂量是0.1～20g/天，较好的范围是1～10g/天，最好是2～5g/天，取决于感染类型和患者状态，长期服用无毒付作用，可以与任何其他药物或营养成分共同使用。
本发明的有益效果是，制备的高纯度免疫球旦白能有效对抗各类致病微生物，长期服用无毒付作用，原料来源丰富，制备过程简单，容易推广普及。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明实施例1免疫接种及抗体滴度检测选用大肠杆菌(Escherichia Coli，American Type Culture StrainNo.13076)，用标准细菌培养基在37℃温度下培养48小时，60℃二小时灭活细菌，离心收集细菌，用双蒸馏水冲洗五次，用生理盐水稀释成最终浓度为4.times.10.sup.8cells，选择健康乳牛，在臀部肌肉注射5ml，然后每周注射一次，连续注射四周，共注射5次，在第五周未，收集接种乳牛牛奶，采用微粘集程序测定抗大肠杆菌抗体，以未免疫注射前的乳牛的牛奶作为对照，表1监视其结果。
表1免疫接种前后牛奶抗大肠杆菌滴度对比免疫接种前 免疫接种后05,000
对照表1结果显示，在免疫接种后抗大肠杆菌抗体滴度显著升高，证明免疫接种诱发了高免疫敏感状态。
实例2制备复合细菌疫苗从美国菌种培养中心(American Type Culture Collection)获得下列菌种金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus，ATCC#.11631)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis.155)、酿脓葡萄球菌1型(streptococcus pyogenes.Typel.8671)、3型(Type3.10389)、5型(type 5.12347)、8型(Type 8.12349)、12型(type 12.11434)、14型(type 14.12972)、18型(type 18.12357)、22型(type 22.10403)、产气杆菌(Aerobacteraerogenes.884)、大肠杆菌(Escherichia Coli.11126)、肠炎(沙门)杆菌(Salmonellaenteritidis 13076)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa 7700)、肺炎杆菌(KlebsiellaPneumoniae.9590)、鼠伤寒(沙门)杆菌(Salmonella typhimurium.13311)、出血杆菌(Haemophilus typhimurium.9333)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris 13315)、志贺痢疾杆菌(Shigella dysenteriae.13313)、肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae.6303)、变异链球菌(Strep.sanguinis 10556)、小链球菌(Strep.Mitis.6249)、出血链球菌(Strep.Sanguinis.10556)、唾液链球菌(Strep.Salivarius.13419)、缺乳链球菌(Strep.Agalactiae.13813)。每种细菌接种按照规定，采用合适的培养液，在37℃恒温下培养48小时，观察培养是否正常，如果细菌在培养基中生长良好，用离心机分离培养液，细菌用无菌生理盐水冲洗五次，用60℃温度灭活2小时，杀死所有细菌，从已灭活的细菌中采集样本继续在培养基中培养(37℃下培养2小时)，确认无细菌存活，收集的细菌冷冻干燥成为细菌粉，上述每种粉称取1g，用500ml生理盐水混悬，并反复稀释，直至配制成浓度为2.times.10.sup.8 bacterial cells/ml的溶液，(在660nm上显示1.0光密度单位)。
实施例3用复合疫苗免疫接种乳牛选择健康乳牛，用实施例1配制的复合细菌疫苗免疫接种乳牛，采用肌肉注射形式，在臀部肌肉注射5ml疫苗，每隔二周相同剂量追加注射一次，共重复追加五次，在第一次注射后5天，采集接种乳牛的牛奶，采用放射免疫法测定复合抗原的抗体滴度，并与未免疫接种前采集的牛奶进行对比，发现免疫接种后复合抗原的抗体滴度增加百倍，证明接种乳牛处于高敏感免疫状态。
实施例4制备免疫球旦白收集免疫接种乳牛的牛奶30升，离心方式脱脂，加1N HCL调PH至4.7，加温至40℃，持续30分钟，用尼龙布过滤去除酪旦白，收集制备奶酪的付产品乳浆20升，直接用真空泵输入装有分子量为10,000D超微滤膜的交错切面流体超滤装置(TFF)，输入压为3Bar，输出压为2Bar，弃去上清液，收集的浓缩液直接输送至装有分子量为100,000D超微滤膜的上述同样设备，收集浓缩物直接进行冷冻干燥成粉，得到高纯度免疫球旦白干粉。
实施例5制备免疫球旦白收集免疫乳牛的牛奶，脱脂、调酸、加热，滤除酪旦白，收集乳浆，进行巴氏消毒(温度为140°F时间持续15秒)，乳浆直接被泵入交错切面流体超滤装置(TFF)(美国Pall公司产品)，选择超微滤膜的分子量为120,000，浓缩至原容积20％，收集浓缩物直接以140°F的温度喷雾干燥，得到高纯度的免疫球旦白干粉。
实施例6测定免疫球旦白的生物活性用大肠杆菌制备抗原，用该抗原与实施例4中制备的免疫球旦白进行粘集反应，测试反应中，免疫球旦白与抗原特异性结合，滴度达3400，证明免疫球旦白具有生物活性。
实施例7临床验证免疫球旦白疗效随机选择免疫力低下的腹泻病人8名，服用实施例4制备的免疫球旦白，每人每天服用剂量5g，第二天起7名病人腹泻次数明显减少，第四天起腹泻停止，无其他任何付反应。
权利要求
1.本发明涉及一种抗微生物感染的免疫球旦白制剂的制备方法及其应用，尤其涉及一种采用疫苗免疫接种乳牛，诱发其高敏感状态，用其牛奶制备抗微生物感染的免疫球旦白制剂的方法及其应用，其特征是，选择合适的抗原或抗原组合，制备单价或多价复合抗原疫苗，免疫接种经选择的健康乳牛，监测接种乳牛血清以确定其已进入高敏感免疫状态，重复追加接种足够剂量的疫苗以维持其高敏感免疫状态，测试牛奶中免疫球旦白的生物活性，从收集的牛奶中，通过采用超微滤膜分离提纯的方法，制备高纯度抗微生物感染的免疫球旦白。
2.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，单独的抗原或者复合抗原都可以被用作制备接种乳牛的疫苗，抗原类型可以是细菌、病毒、孢子体、螺旋体等微生物或其他物质，只要该抗原可以引发接种的乳牛进入高敏感免疫状态，最适宜的抗原类型是细菌，最好是采用多价抗原形式的灭活细菌疫苗。
3.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，选择的免疫接种对象可以是乳牛或乳羊，最好是健康乳牛，接种方式可以是皮下注射、皮内注射、静脉注射、腹膜内注射、乳房内注射、口服、灌肠、肌肉注射等，只要该接种形式能使接种动物致敏，最好的接种方式是肌肉注射，如果肌肉注射不能引发高敏感免疫状态，可以同时采用静脉注射或乳房内注射的方法联合接种，以诱发接种动物进入高敏感免疫状态，接种的剂量要足够，剂量范围从1，times，10，sup.6 cells到1.times.10.sup.8cells。
4.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，应该监测接种乳牛是否对抗原敏感，以及是否已进入高敏感免疫状态，有很多已知的方法可以检测这种敏感性，其中包括皮肤敏感性试验、测定血清中特异性抗体滴度，最好的方法是分别测试乳牛接种前后血清对多价抗原复合疫苗产生的抗体凝集反应，如果在接种后出现特异性抗体凝集反应，则证实已经进入高敏感免疫状态。
5.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，在首次免疫接种诱发乳牛高敏感免疫状态后，应该重复追加接种注射，以维持这种已诱发的高敏感免疫状态，重复注射应维持足够的剂量，至少应等于首次接种剂量，必要时可加大剂量，但不超过初始剂量的150％，重复接种的时间和次数取决于抗原的选择及组合，通常是每两周重复注射一次，一般可重复注射4～6次，但在这期间至少每两周监测一次血清抗体凝集反应，如果接种乳牛出现免疫耐受现象，则应停止使用该乳牛的牛奶作为原料制备免疫球旦白。
6.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，制备高纯度免疫球旦白的方法是，对收集的牛奶采用离心方式脱脂，用酸剂调整牛奶PH至4.5～4.9，最好是PH4.7～4.8，加热30℃～50℃，最好40℃，加热时间20分钟～40分钟，最好30分钟，可降温至4℃后静置过夜，用滤布过滤器，最好是尼龙滤布过滤器滤除凝集的酪旦白后直接喷雾干燥，或加碱剂，调整PH至6.8～7.0后喷雾干燥成干粉，或者在加热后直接用离心机离心沉淀酪旦白，离心时间15分钟～45分钟，最好30分钟，离心速度3000～6000转/分，最好5000转/分，离心沉淀去除酪旦白后，上清液用分子量为100,000～120,000D的超微滤膜分离过滤、浓缩物浓缩至原体积10～30％时，冷冻干燥或喷雾干燥制备干粉，喷雾干燥时温度不能超过140°F。
7.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，为了保持免疫球旦白的生物活性，所有的工艺均需严格控制温度，牛奶原料进行巴氏消毒时，温度不能超过140°F，时间不能超过15秒，在整个制备过程中，都要注意控制温度，在喷雾干燥时，温度也不能超过140°F。
8.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，本发明制备的免疫球旦白可以制备成多种形式制剂使用，可以直接应用干粉制剂，或加溶液配制成口服液应用，或者与其他药物辅料混合制备成片剂、胶囊剂、散剂、冲剂、颗粒剂、油剂、乳剂等服用，还可以作为食品添加剂制备成食品使用，如牛奶、奶粉、速溶咖啡、速溶茶、饼干、糕点、冰琪淋等，还可以制备成口香糖、含片形式，以对抗口腔中微生物，或制备成气雾剂以对抗咽喉或呼吸道微生物，还可以制备成水溶性溶液与超声雾化装置共同应用以对抗上呼吸道微生物。
9.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，本发明制备的免疫球旦白制剂，适用于婴幼儿，尤其适用于未采用母乳喂养的婴儿预防和治疗胃肠道微生物感染；适用于体质虚弱、抵抗力低下、免疫功能低下的人群用来预防和治疗胃肠道微生物感染、呼吸道微生物感染、口腔、咽喉部微生物感染；适用于免疫功能低下或免疫功能缺乏的患者用来预防和治疗各类微生物感染，尤其是爱滋病病人的胃肠道感染；还适用于长期服用肾上腺皮质激素类药物的病人所发生的各类空腔器官感染。
10.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，本发明方法制备的免疫球旦白制剂用于预防和治疗各类微生物感染的剂量是0.1～20g/天，较好的范围是1～10g/天，最好是2～5g/天，取决于感染类型和患者状态，长期服用无毒付作用，可以与任何其他药物或营养成分共同使用。
全文摘要
本发明涉及一种抗微生物感染的免疫球蛋白制剂的制备方法及其应用，尤其涉及一种采用疫苗免疫接种乳牛，诱发其高敏感状态，用其牛奶制备抗微生物感染的免疫球蛋白制剂的方法及其应用，其特征是，选择合适的抗原或抗原组合，制备单价或多价复合抗原疫苗，免疫接种经选择的健康乳牛，监测接种乳牛血清以确定其已进入高敏感免疫状态，重复追加接种足够剂量的疫苗以维持其高敏感免疫状态，测试牛奶中免疫球蛋白的生物活性，从收集的牛奶中，通过采用超微滤膜分离提纯的方法，制备高纯度抗微生物感染的免疫球蛋白。
文档编号A61K35/20GK1557490SQ20041001584
公开日2004年12月29日 申请日期2004年1月15日 优先权日2004年1月15日
发明者高春平 申请人:高春平