专利名称：一种表达狂犬病病毒g蛋白的重组假型杆状病毒及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于病毒学和基因工程技术领域，具体涉及一种表达狂犬病病毒主要免疫原性糖蛋白(G蛋白)的重组假型杆状病毒的构建，本发明还涉及以该重组假型杆状病毒制备的疫苗及应用。
背景技术：
狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus, RV)引起的，可以导致人和哺乳动物发生急性脑炎和周围神经炎症的一种人兽共患病。狂犬病的临床特征为恐水、怕风、咽肌痉挛及进行性麻痹等，一旦发病，死亡率几乎达100%。狂犬病的发生最早可以追溯到公元前2300年，迄今仍在世界范围内流行。在亚洲，每年报道人的狂犬病约3.5万例，其中94%是由患病犬或携毒犬咬伤引起的。近年来，我国平均每年因狂犬病而死亡的人数达2000-3000例，且一直呈逐年上升的趋势，尽管我国已广泛使用了高质量的细胞培养灭活疫苗，也在一定程度上取得了令人满意的效果，但狂犬病对我国(尤其是农村和山区)人民正常生活的威胁仍然日趋明显。狂犬病病毒属于弹状病毒科(Rhabdoviridae),同一科的病毒还包括水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus, VSV)、牛流行热病毒(Bovine Ephemeral FeverVirus, BEFV)等。其病毒粒子形态呈子弹状,长180nm,直径75nm,头部为半球形,末端常为平端，病毒颗粒由外壳和核心两部分组成。基因组为单链不分节段的负链RNA，大小约12kb。每个RV粒子由一个分子的基因组RNA和五种蛋白组装而成。这五种蛋白分别为:(I)依赖RNA的RNA聚合酶(L蛋白)；(2)糖蛋白(G蛋白)，为狂犬病病毒的主要免疫原性蛋白；(3)核蛋白(N蛋白)，为磷酸化的蛋白；(4)磷酸蛋白(P蛋白)；(5)基质蛋白或膜蛋白(M蛋白)。其中糖蛋白与病毒的感染和免疫密切相关(殷震.动物病毒学.科学出版社，1997，第二版 329-331)。
糖蛋白是RV粒子的表面膜蛋白，以三聚体的形式定位于病毒的表面，形成病毒的棘状突起(Gaudin Y, Ruigrok Rff, Tuffereau C et al.Rabies virus glycoprotein isa trimer.Virology, 1992,187:627-632) 0它由四个功能区组成，分别是前19个氨基酸的信号肽、20-439位氨基酸的膜外区(抗原区)、440-461位氨基酸的跨膜区、462-504位氨基酸的膜内区(附着区)(Fu S，Deisseroth AB.Use of the cosmid adenoviral vectorsystem for the in vitro construction of recombinant adenoviral vectors.Hum GeneTher, 1997,8:1321-1330) 0 RV G蛋白是有效的保护性抗原，能诱导机体产生中和抗体和细胞免疫反应(Saxena S，Dahiya SS, Sonwane AA et al.A sindbis virus replicon-basedDNA vaccine encoding the rabies virus glycoprotein elicits immune responses andcomplete protection in mice from lethal challenge.Vaccine，2008，26:6592-6601)。以单克隆抗体中和实验技术研究G蛋白上的抗原结合位点，发现G蛋白上至少存在3个中和抗体结合位点。由于G蛋白与狂犬病病毒的毒力及致病性密切相关，而且又是狂犬病病毒的主要保护性抗原，越来越多的研究关注G蛋白在狂犬病防治中的应用。狂犬病疫苗诱导机体产生中和抗体的水平主要取决于G蛋白的量，表达G蛋白基因的重组活病毒载体疫苗在狂犬病的预防中展现了良好的应用前景。研究证实表达RV G蛋白的重组痘苗病毒经消化道免疫狐狸，能诱导机体产生抗狂犬病病毒的中和抗体，可有效地保护狐狸抵抗狂犬病病毒的感染(Lambot M, Blasco E, Barrat J et al.Humoraland cell-mediated immune responses of foxes(Vulpes vulpes)after experimentalprimary and secondary oral vaccination using SAG2 and V-RG vaccines.Vaccine,2001，19:1827-1835)。在欧洲与美国，通过大量投放这种重组狂犬病口服活疫苗，对控制狂犬病病毒在狐狸与浣熊等野生动物中的流行发挥了重要作用。然而，由于痘苗病毒本身具有潜在的致病性，因此，重组痘苗病毒活疫苗不能用来免疫家养动物。为了获得安全、高效、廉价的狂犬病基因工程疫苗，也有研究人员用其它的无致病性的表达系统表达G蛋白来研制亚单位疫苗。Fu等证实，浣熊口服杆状病毒表达的狂犬病病毒G蛋白疫苗，可诱导机体产生抗狂犬病病毒的中和抗体，并能保护浣熊抵抗狂犬病病毒高致病性毒株的攻击(Fu ZF,Ruppreeht CE, Dietzschold B et al.0ral vaccination of raccoons(Procyon lotor)with baculovirus-expressed rabies virus glycoprotein CJ7.Vaccine,1993,11:925-928)。但由于G蛋白不易纯化，研制狂犬病病毒G蛋白亚单位疫苗的进展缓慢，因此，许多研究转向利用G蛋白基因构建DNA核酸疫苗。DNA疫苗不但能诱导体液免疫和细胞免疫，而且具有生产简便、成本低廉、稳定性好等优点。用表达狂犬病病毒G蛋白的质粒经肌肉免疫小鼠，能诱导高水平的体液免疫与细胞免疫，并能保护80 %以上的小鼠抵抗狂犬病病毒的攻击。最新的研究还发现，用表达狂犬病病毒G蛋白的DNA疫苗经皮内免疫犬I次，机体不但能产生高滴度的中和抗体，维持时间长，而且能保护免疫犬在免疫I年后仍能抵抗致死剂量狂犬病病毒的攻击(Lodmell DL, Ewah LC, Parnell MJ et al.0ne-timeintradermal DNA vaccination in ear pinnae one year prior to infection protectsdogs against rabies virus.Vaccine，2006，24:412-416)。G蛋白不仅能诱导很强的中和抗体，还能刺激机体产生细胞免疫反应。研究发现，RV激活的天然免疫反应，尤其是IFN-α/β的上调表达，与RV G蛋白的表达水平密切相关。在中枢性神经系统和初级神经元细胞上，减毒RV表达G蛋白的量是高致病性RV表达量的3倍以上，且两者诱导 的炎症反应和G蛋白的表达量呈反相关。通过基因芯片分析和real-time PCR验证表明，在减毒RV感染的小鼠体内能检测到大量炎症因子的上调表达，而高致病RV感染引起的炎症反应很弱甚至没有。而且，减毒RV能诱导许多与天然免疫和抗病毒效应相关的基因上调表达，尤其是与IFN-α/β以及炎症趋化因子信号通路有关的分子。其中，上调表达的IFN信号基因有STAT1、STAT2、STAT3和JAK-2等，IFN调节基因有IRF-1、IRF-2、IRF-7, IFN 效应基因有 0AS、Mx、PKR 等，以及趋化因子 MCP-1、IP-10、RANTES等(Wang Zff, Sarmento L, Wang Y et al.Attenuated rabies virus activates, whilepathogenic rabies virus evades,the host innate immune responses in the centralnervous system.J Virol, 2005, 79:12554-12565) Faber 等还发现 RV 在接种小鼠以后，致病性RV在脑组织中的病毒滴度是减毒RV的1000倍，进一步的研究还表明致病性RV是通过限制自身G蛋白的表达来逃避机体的天然免疫屏障，使其具有更强的致病性和更强的增殖倉泛力(Faber M, Pulmanausahakul R, Hodawadekar SS et al.0verexpression of therabies virus glycoprotein results in enhancement of apoptosis and antiviralimmune response.J Virol,2002, 76:3374-3381 ；Faber M，Pulmanausahakul R，Nagao Ket al.1dentification of viral genomic elements responsible for rabies virusneuroinvasiveness.Proc Natl Acad Sci USA, 2004,101:16328—16332) 由于 G 蛋白的限制性表达有利于RV逃避机体的天然免疫屏障，在设计狂犬疫苗时，利用高效表达载体在体内大量表达G蛋白，诱导机体产生强的特异性体液免疫和细胞免疫，更有利于机体在接种疫苗后抵抗RV的感染。
RV G蛋白作为RV最主要的保护性抗原，不仅可诱导特异性中和抗体的产生，而且可剌激机体产生细胞免疫，在抵抗RV的感染中起到了决定性的作用，因此，研制针对RV G蛋白的基因工程疫苗已成为狂犬病疫苗的研究热点。杆状病毒载体是目前应用十分广泛的病毒表达载体之一，它被广泛的应用于蛋白表达、基因治疗、疫苗开发等领域。杆状病毒表达系统作为一种真核表达系统，在外源基因表达方面具有糖基化、磷酸化和蛋白切割加工等修饰过程，表达产物的生物学特性与天然产物相似，而且表达效率高(Luckow VA, Summers MD.High level expression of nonfusedforeign genes with Autographa californica nuclear polyhedrosis virus expressionvectors.Virology, 1989,170:31-39)。传统的杆状病毒由于其宿主特异性，这种高效表达载体仅限用于介导外源基因在其受纳昆虫细胞内表达。近年来的研究发现，携带哺乳动物启动子的重组杆状病毒能介导外源基因在各种哺乳动物细胞和动物体内使外源蛋白得到高效稳定的表达，且其自身基因组并不复制和表达(Volkman LE，Goldsmith PA.1n VitroSurvey of Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus Interaction withNontarget Vertebrate Host Cells.Appl Environ Microbiol，1983，45:1085-1093)。进一步的研究发现，表面展示有水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatatis Virus，VSV)糖蛋白(VSV/G)的假型杆状病毒，能转导更多种类的细胞，且介导基因表达的效率更高(Barsoum J，Brown R，McKee M et al.Efficient transduction of mammalian cells bya recombinant baculovirus having the vesicular stomatitis virus G glycoprotein.Hum Gene Ther，1997，8:2011-2018 ;Pieroni L，Maione D，La Monica N.1n vivo genetransfer in mouse skeletal muscle mediated by baculovirus vectors.Hum GeneTher, 2001,12:871-881)。许多研究结果证实，通过直接注射介导免疫原性蛋白表达的杆状病毒疫苗就能诱导机体产生高水平的体液免疫和细胞免疫反应(Wu Q，Fang L，Wu Xet al.A pseudotype baculovirus-mediated vaccine confers protective immunityagainst lethal challenge with H5N1 avian influenza virus in mice and chickens.Mol Immunol，2009，46:2210-2217 ；Bai B,Lu XiMeng J et al.Vaccination of mice withrecombinant baculovirus expressing spike or nucleocapsid protein of SARS-1ikecoronavirus generates humoral and cellular immune responses.Mol Immunol，2008，45:868-875)。RV和VSV同属弹状病毒科成员，其糖蛋白具有类似的特性，如介导膜融合的活性。早在1992年，Tuchiva利用杆状病毒在昆虫细胞中表达RV G蛋白时就发现，RV G蛋白能介导细胞间的融合，且这种融合能被RV G蛋白的抗血清所抑制(Tuchiya K,MatsuuraY，Kawai A et al.Characterization of rabies virus glycoprotein expressed byrecombinant baculovirus.Virus Res, 1992, 25:11-13)。此外，Tani 在研究重组杆状病毒体外和体内基因转导效率时发现，表面展示有RV G蛋白的杆状病毒转导神经元细胞的效率是未经修饰杆状病毒的 500 倍(Tani H, Limn CK, Yap CC et al.1n vitro and in vivogene delivery by recombinant baculoviruses.J Virol, 2003, 77:9799-97808)。基于上述原因，申请人以狂犬病病毒G蛋白对杆状病毒载体进行修饰，使其展示在杆状病毒囊膜表面，并以修饰后的假型杆状病毒为载体构建能在哺乳动物细胞中表达狂犬病病毒G蛋白的重组假型杆状病毒疫苗。以此获得的重组杆状病毒疫苗既具有亚单位疫苗的特性，又具有活病毒载体疫苗的特性，并在小鼠模型上探讨该疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫效力。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，其第一个目在于以狂犬病病毒G蛋白对杆状病毒进行修饰，使其展示在杆状病毒囊膜表面，并以此假型杆状病毒为载体构建能高效转导哺乳动物细胞并表达狂犬病病毒G蛋白的重组假型杆状病毒。本发明的第二个目的是利用上述重组病毒制备防治狂犬病的疫苗，该疫苗具有亚单位疫苗和活病毒载体疫苗的双重特性。本发明的第三个目的还包括将上述获得的疫苗用于狂犬病的防制。本发明通过以下技术方案实施:以狂犬病病毒G蛋白对杆状病毒进行修饰，使其展示在杆状病毒囊膜表面，构建狂犬病病毒G蛋白修饰的假型杆状病毒载体。然后，在此假型杆状病毒载体中插入含狂犬病病毒G蛋白基因的哺乳动物细胞表达盒。申请人:所在的华 中农业大学农业微生物学国家点实验室动物传染病室通过分子生物学技术获得一株重组假型杆状病毒BV-RVG/RVG，该重组病毒于2010年10月22日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO:V201022，该重组毒株的特征在于:具有表达狂犬病病毒G蛋白的双表达盒，既含有Pph启动子驱动狂犬病病毒G蛋白表达并使其展示在病毒粒子囊膜表面的昆虫细胞表达盒PPH-RVG-poly (A)，又含有CMV启动子驱动狂犬病病毒G蛋白在哺乳动物细胞中高效表达的哺乳动物细胞表达盒CMV-RVG-poly(A)，其中所述的狂犬病病毒G蛋白核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。本发明的优点在于:1.本疫苗的第一个优势是将狂犬病病毒主要免疫原性糖蛋白(RVG)展示在杆状病毒粒子的囊膜表面，其作用有两个:①囊膜表面展示有RVG蛋白的重组杆状病毒，即为假型杆状病毒，所展示的RVG蛋白能介导细胞间的融合，促进假型杆状病毒在体外和体内的转导效率，进一步提高外源基因的表达效率；②纯化的假型杆状病毒粒子表面展示有大量的RVG蛋白，以此假型杆状病毒免疫动物能刺激机体产生针对RVG的特异性免疫反应。2.本疫苗的第二个优势是以囊膜表面展示有RVG蛋白的重组假型杆状病毒为载体构建表达RVG蛋白的活病毒载体疫苗，该疫苗在体外和体内都能高效转导哺乳动物细胞并高效表达RVG蛋白。3.本疫苗突破以往单纯亚单位疫苗和活病毒载体疫苗的局限，同时兼具亚单位疫苗和活病毒载体疫苗的双重特性。
序列表SEQ ID NO:1是本发明中人工合成的RVG基因编码序列。其完整编码区序列全长为1575bp，编码524个氨基酸。图1:是本发明的总体技术流程图。图2:是本发明中转移质粒pFastBac-RVG-poly(A)-CMV_EGFP的构建路线图。图3:是本发明中转移质粒pFastBac-RVG-poly(A)-CMV_RVG的构建路线图。图4:显示了本发明中转移质粒pFastBac-RVG-poly⑷-CMV-EGFP的酶切鉴定图。图中Marker为DNA分子量大小标准；I为Bgl 11/Xho I双酶切转移质粒pFastBac-RVG-poly (A) -CMV-EGFP 的鉴定结果。图5:显示了本发明中转移质粒pFastBac-RVG-poly (A)-CMV-RVG的酶切鉴定图。图中Marker为DNA分子量大小标准；I为Xho I单酶切转移质粒pFastBac-RVG-poly (A) -CMV-RVG 的鉴定结果。图6:是重组假型杆状病毒BV-RVG/EGFP和BV-RVG/RVG的结构示意图。图7:是重组假型杆状病毒BV-RVG/EGFP和BV-RVG/RVG在Sf9细胞上的病变图，图左是BV-RVG/EGFP在Sf9细胞上的病变图；图右是BV-RVG/RVG在Sf9细胞上的病变图。图8:是表达报告蛋白(EGFP)的重组假型杆状病毒BV-RVG/EGFP和野生型杆状病毒(Wide type BV)转导Hela细胞后的荧光图片，图左是BV-RVG/EGFP ;图右是野生型杆状病毒(Wide type BV)。 图9:是重组假型杆状病毒BV-RVG/EGFP和BV-RVG/RVG在小鼠模型中诱导的RV特异性ELISA抗体水平。图10:是重组假型杆状病毒BV-RVG/EGFP和BV-RVG/RVG在小鼠模型中诱导的RV特异性中和抗体水平。图11:是重组假型杆状病毒BV-RVG/EGFP和BV-RVG/RVG免疫BALB/c小鼠后，用ELISA方法检测小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-Y的水平。
具体实施例方式实施例1:本发明中转移质粒 pFastBac-RVG-poly (A)-CMV-EGFP 和pFastBac-RVG-poly (A) -CMV-RVG 的构建本发明中转移质粒pFastBac-RVG-poly (A)-CMV-EGFP 和pFastBac-RVG-poly (A)-CMV-RVG的构建路线图见图1和图2所示。l.poly(A)序列和EGFP基因的引物设计、PCR扩增以及基因克隆根据载体pC1-neo (Cat.N0.E1S41,购买自Promega公司)中poly(A)的核苷酸序列，设计上游引物 poly (A) -Forward:TTTAGATCTCGACATGATAAGATACA (下划线部分为 Bgl
II酶切位点);下游引物 Poly(A)-Reverse:TTTGGATCCTACCACATTTGTAGAGG(下划线部分为BamH I酶切位点)。以载体pCI_neo为模板,进行poly (A)序列的扩增,poly (A)序列的扩增条件为:95°C 3min变性后进入循环，循环参数为:95°C lmin，56°C 30sec，72°C lmin，35个循环后72°C延伸lOmin。在1.6%的琼脂糖凝胶上电泳回收约220bp的扩增产物并将其克隆至PMD18-T载体上，获得重组质粒pMD18T-poly (A)，进行序列测定，证实无碱基误配。根据载体pBSmut4EGFP(由美国Stanford大学Okada Ami博士惠赠；文献来源:OkadaA, Lansford R, Weimann JM, et al.1maging Cells in the Developing NervousSystem with Retrovirus Expressing Modified Green Fluorescent Protein.ExpNeurol，1999，156:394-406)中绿色荧光蛋白(EGFP)的完整编码区核苷酸序列设计上游弓丨物 EGFP-Forward:TTTAGATCTACCATGGTGAGCAAGGGC(下划线部分为 Bgl II 酶切位点)，下游引物 EGFP-Reverse:TTTGGATCC GCTTTACTTGCACAGCTCG (下划线部分为 BamH I 酶切位点)。以载体pBSmut4EGFP为模板，进行EGFP的扩增，其扩增条件为:95°C变性3min后进入循环，循环参数为:95°C lmin,55°C lmin, 72°C 1.5min ;35 个循环后 72°C延伸 lOmin。在I %的琼脂糖凝胶上电泳回收约750bp的扩增产物并将其克隆至pMD18-T载体，获得重组质粒PMD18T-EGFP，进行序列测定，证实无碱基误配。进一步用BamH I和Bgl II双酶切 pMD18T-EGFP，回收约 750bp 的 EGFP 基因片段，插入 pcDNA3.1 (Cat.N0.V790-20,购买自Invitrogen公司)的BamH I位点，获得重组质粒pcDNA3.1-EGFP。2.本发明中pFastBac-RVG骨架质粒的构建根据GenBank中公布的狂犬病病毒CVS_B2c株的G蛋白完整编码区核苷酸序列(GenBank:AF042824.1)，在其核苷酸序列的5’端引入Bgl II位点，在3’端引入BamH I位点，并在保持氨基酸序列不变的条件下将第1335位的核苷酸G人工突变为A，以消除基因内部的Bgl II酶切位点。RV G基因的人工 合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。合成序列如下: 5，AGATCTACCATGGTTCCTCAGGTTCTTTTGTTTGTACTCCTTCTGGGTTTTTCGTTGTGTTTCGGGAAGTTCCCCATTTACACGATACCAGACAAACTTGGTCCCTGGAGCCCTATTGACATACACCATCTCCGCTGTCCAAATAACCTGGTTGTGGAGGATGAAGGATGTATCAACCTGTCCGGGTTCTCCTACATGGAACTCAAAGTGGGATACATCTCAGCCATCAAAGTGAACGGGTTCACTTGCACAGGTGTTGTGACAGAGGCAGAGACCTACACCAACTTTGTTGGTTATGTCACAACCACATTCAAGAGAAAGCATTTCCGCCCCACCCCAGACGCATGTAGAGCCGCGTATAACTGGAAGATGGCCGGTGACCCCAGATATGAAGAGTCCCTACAAAATCCATACCCCGACTACCACTGGCTTCGAACTGTAAGAACCACCAAAGAGTCCCTCATTATCATATCCCCAAGTGTGACAGATTTGGACCCATATGACAAATCCCTTCACTCAAGGGTCTTCCCTGGCGGAAAGTGCTCAGGAATAACGGTGTCCTCTACCTACTGCTCAACTAACCATGATTACACCATTTGGATGCCCGAGAATCCGAGACCAGGGACACCTTGTGACATTTTTACCAATAGCAGAGGGAAGAGAGCATCCAACGGGAACAAGACTTGCGGCTTTGTGGATGAAAGAGGCCTGTATAAGTCTCTAAAAGGAGCATGCAGGCTCAAGTTATGTGGAGTTCTTGGACTTAGACTTATGGATGGAACATGGGTCGCGATGCAAACATCAGATGAGACCAAATGGTGCTCTCCAGATCAGTTGGTGAATTTGCACGACTTTCGCTCAGACGAGATTGAGCATCTCGTTGTGGAGGAGTTAGTCAAGAAAAGAGAGGAATGTCTGGATACATTAGAGTCCATCATGACCACCAAGTCAGTAAGTTTCAGACGTCTCAGTCACCTGAGAAAACTTGTCCCAGGGTTTGGAAAAGCATATACCATATTCAACAAAACCTTGATGGAGGCTGATGCTCACTACAAGTCAGTCCGGACCTGGAATGAGATCATCCCCTCAAAAGGGTGTTTGAAAGTTGGAGGAAGGTGCCATCCTCATGTGAACGGGGTGTTTTTCAATGGTATAATATTAGGGCCTGACGACCGTGTCCTAATCCCAGAGATGCAATCATCCCTCCTCCGGCAACATATGGAGTTGTTGGAATCTTCAGTTATCCCCCTGATGCACCCCCTGGCTGACCCTTCTACAGTTTTCAAAGAAGGTGATGAGGCTGAGGATTTTGTTGAAGTTCACCTCCCCGATGTGTACAAACAAATCTCAGGGGTTGACCTGGGTCTCCCGAACTGGGGAAAGTATGTATTGATGACTGCAGGGGCCATGATTGGCCTGGTGTTGATATTTTCCCTAATGACATGGTGCAGAAGAGCCAATCGACCAGAATCGAAACAACGCAGTTTTGGAGGGACAGGGGGGAATGTGTCAGTCACTTCCCAAAGCGGAAAAGTCATACCTTCATGGGAATCATATAAGAGTGGAGGTGAGATCAGACTGTGAGGATCC3，(5 ’ 端下划线部分为Bgl II酶切位点，3’端下划线部分为BamHI酶切位点)将人工合成的RV G基因连接至pMD18-T载体获得获得重组质粒pMD18T-RVG。以Bgl 11/BamH I双酶切pMD18T_RVG后，回收1.5kb的G基因，插入到杆状病毒转移载体 pFastBacl (Cat.N0.10360-014,购自 Invitrogen 公司)的 BamH I 位点，获得重组质粒pFastBac-RVG,在重组质粒中RVG基因上游的Bgl II酶切位点消失，下游的BamH I继续存在，进一步对其进行酶切鉴定和测序鉴定，证实无碱基误配。3.转移质粒 pFastBac-RVG-poly (A)-CMV-EGFP 的构建将pMD18T_poly (A)以Bgl 11/BamH I双酶切后，回收poly (A)片段，插入真核表达质粒 pcDNA3.1-EGFP 的 Bgl II 位点，获得重组质粒 pcDNA3.1-poly (A) -CMV-EGFP,并经酶切鉴定证实构建正确；以Bgl II/EcoRI双酶切pcDNA3.1-poly (A) -CMV-EGFP,回收基因片段poly(A)-CMV-EGFP，插入pFastBac-RVG的BamH I/EcoR I位点，获得重组质粒pFastBac-RVG-poly (A)-CMV-EGFP，经酶切验证，酶切片段大小与预期大小一致(图3)。4.转移质粒 pFa stBac-RVG-poly (A)-CMV-RVG 的构建将pMD18T-poly(A)以Bgl 11/BamH I双酶切后，回收基因片段poly (A)，插入真核表达载体pcDNA3.1的Bgl II位点，获得重组质粒pcDNA3.1-poly (A);以Bgl Π /EcoR
I双酶切 pcDNA3.1-poly (A)，回收基因片段 poly (A)-CMV，将其插入 pFastBac-RVG 的 BamHI/EcoR I 位点，获得重组质粒 pFastBac-RVG-poly (A)-CMV。再以 Bgl Π /Sal I 双酶切PMD18T-RVG,将切下的 RVG 片段回收并插入 pFastBac-RVG-poly (A) -CMV 的 BamH I/Sal I位点，获得重组质粒pFastBac-RVG-poly (A) -CMV-RVG,经酶切验证，酶切片段大小与预期大小一致(图4)。实施例2:重组假型杆状病毒疫苗的获得以实施例1所构建的转移质粒pFastBac-RVG-poly (A)-CMV-EGFP和pFastBac-RVG-poly (A) -CMV-RVG包装本发明中的重组假型杆状病毒，详细步骤如下:1.转移质粒的转座(I)取转移质粒 pFastBac-RVG-po Iy (A) -CMV-EGFP 和pFastBac-RVG-poly (A)-CMV-RVG 各 lng，分别加入两管 DHlOBac 感受态(Cat.N0.12331-013,购自Invitrogen公司)中，轻轻混勻，冰浴30min。(2) 42°C水浴热击 45sec，再冰浴 2_5min。(3)加入900μ1的LB培养基(1 %胰蛋白胨，0.5 %酵母浸出物，1 % NaCl，pH
7.0),37 °C 225r/min 摇床复苏 4h。(4)将上述复苏菌液用LB培养基稀释至10' 10_2、10_3，在每块LB培养平皿(LB液体培养基中加入1.5%琼脂粉，并含卡那霉素50 μ g/ml、庆大霉素7 μ g/ml、四环素10 μ g/ml、X-gal 100 μ g/ml和异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 40 μ g/ml)中加入上述稀释液各100μ 1，涂布均匀；37°C培养48h，挑取白色克隆，在LB平皿上划线纯化，37°C培养过夜。2.重组Bacmid DNA的分离提取(I)挑取白色克隆于2ml LB培养基(含50 μ g/ml卡那霉素，7 μ g/ml庆大霉素，10 μ g/ml 四环素)，37°C摇床 250-300r/min 培养 24h 以上。(2)取1.5ml培养物于1.5ml EP管中，12000r/min离心lmin。弃上清液，然后加入 0.3ml 的溶液 I(15mM Tris-HCl, IOmM EDTA, 100 μ g/ml RNase)，轻轻吹打重悬细胞。(3)加入 0.3ml 溶液 II (0.2MNa0H, I % SDS)，轻轻混匀，室温放置 5min。(4)缓缓加入0.3ml溶液III (3M KAc)，轻轻混匀，冰上放置5-lOmin。(5) 12000r/min室温离心IOmin,期间另取一 2ml离心管，加入800 μ I异丙醇。(6)轻轻把上清液转入含异丙醇的离心管，避免把白色沉淀带入。轻轻倒转离心管数次，冰上放置5min,室温12000r/min离心15min。(7)弃上清，倒置离心管于吸水纸上吸干，然后加入70%乙醇洗涤沉淀，12000r/min室温离心5min,弃上清。(8)使沉淀在空气中自然干燥5-10min，加40 μ I TE溶液(ImM EDTA, IOmMTris-Cl,pH 8.0)溶解沉淀。3.重组假型杆状病毒的获得 (I)将形态良好、生长旺盛的Sf9细胞(购买自湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，CCTCC)接入6孔细胞培养板，2ml/孔，8 X IO5细胞/孔，室温放置Ih使细胞贴壁。(2)配制昆虫细胞转染液:①取 8μ I 脂质体 Cellfectin II (Cat.N0.10362-100，Invitrogen)加入 100 μ I 无血清 Grace，s (Cat.N0.10902-096, Invitrogen)液，润旋混勻；②取I U g Bacmid DNA加入100 μ I无血清Grace’ s液,轻轻混勻；5min后，再将脂质体Cellfectin II稀释液和Bacmid DNA稀释液轻轻混匀，室温孵育25min。(3)将转染混合液均匀滴入6孔板的细胞上，置27°C温箱，5h。(4)弃掉6孔板中的转染液，换为2ml的含10%胎牛血清(Cat.N0.10099-141，Invitrogen)的Grace’s生长液,继续培养72h,待出现细胞病变后,收集细胞培养上清即可获得第一代(Pl代)重组假型杆状病毒，分别命名为BV-RVG/RVG和BV-RVG/EGFP，重组假型杆状病毒结构示意图见图6，该重组假型杆状病毒在昆虫细胞中引起的细胞病变图见图7。4.重组假型杆状病毒疫苗的生产工艺重组假型杆状病毒疫苗的生产工艺包括重组病毒的扩大、浓缩以及滴度测定。(I)重组假型杆状病毒的扩增Pl代重组杆状病毒的滴度较低，其滴度范围一般为IX IO6-1X 107PFU/ml。继续以0.1个感染复数(MOI)接种昆虫细胞，3天后收获病毒上清，能获得滴度较高的P2代重组杆状病毒，其滴度能达到I X IO7-1 X 108PFU/ml ;以P2代重组杆状病毒为毒种，将每种重组杆状病毒以0.1个MOI各接种8个T175细胞瓶的Sf9细胞，3天后收获细胞上清(病毒液)。(2)重组假型杆状病毒的浓缩将收获的病毒液在4°C条件下，5000g离心15min，以除去细胞碎片；再将去除细胞碎片的病毒液转移至加有3ml 25%鹿糖垫层的38ml超速离心管,24000r/min (Beckman,JS-24.38rotor)离心2h。病毒沉淀用PBS在4°C冰箱溶解过夜后，混匀并分装冻存于_80°C冰箱。(3)重组假型杆状病毒的滴度测定。用杆状病毒专用滴度测定试剂盒测定重组假型杆状病毒的滴度，详细方法见试剂盒说明书(BacPAK Baculovirus Rapid Titer Kit User Manual, Cat.N0.631406,Clontech)。实施例3:重组假型杆状病毒BV-RVG/EGFP转导Hela细胞1.在6孔板中接种Hela细胞(购买自湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，CCTCC)，9X105细胞/孔，37°C培养lh，使细胞贴壁。2.用憐酸盐缓冲液(PBS, 140mmol NaCl, 2.7mmo1 KCI , 10mmoI Na2HPO4,1.8mmoIKH2PO4, pH 7.4)洗细胞3次，以MOI = 50的剂量将重组假型杆状病毒BV-RVG/EGFP以及野生型杆状病毒(Wild type BV,购自Invitrogen公司)接入细胞中，27°C感作4h后弃掉上清，加入含5% FBS的DMEM培养基。3.将细胞置于37°C 5% CO2培养箱中培养48h后，在荧光显微镜下观察EGFP的表达，说明RVG蛋白修饰的假型杆状病毒能高效转导哺乳动物细胞，其荧光图片见图8。实施例4:本发明中重组假型杆状病毒疫苗对小鼠免疫效力的生物学实验1.BALB/c小鼠的免疫程序BALB/c小鼠分为4组，分别为BV-RVG/RVG免疫组、BV-RVG/EGFP免疫组、BV-VSVG-CMV-EGFP (BV-VSVG/EGFP,见文献:Wu Q，Fang L, Wu X et al.A pseudotypebaculovirus-mediated vaccine confers protective immunity against lethalchallenge with H5N1 avian influenza virus in mice and chickens.Mol Immunol,2009,46:2210-2217)对照组和PBS对照组，每组10只，采用后腿肌肉注射，每只小鼠IOOy I (含IX IO8PFU的上述重组病毒)，共免疫2次，间隔3周。在首免后第3周和第5周经尾静脉负压采血，分离血清，检测RV特异性中和抗体和ELISA抗体。于二免后2周，断颈处死实验小鼠，无菌取出脾脏，利用淋巴细胞分离液(购自深圳达科为生物技术有限公司)分离脾淋巴细胞，进行细 胞免疫(IFN-Y)检测。2.RV特异性ELISA抗体米用Saxena 等报道(Saxena S, Dahiya SS, Sonwane AA et al.A sindbis virusreplicon—based DNA vaccine encoding the rabies virus glycoprotein elicitsimmune responses and complete protection in mice from lethal challenge.Vaccine,2008,26:6592-6601)的RV特异性ELISA抗体检测方法，检测血清中特异性针对RV的ELISA抗体水平，结果表明，无论是在首次免疫后还是加强免疫后，BV-RVG/RVG疫苗组的ELISA抗体水平均最高，并且在加强免疫后迅速上升，达到较高水平，而表面仅展示有RV G蛋白的重组假型杆状病毒BV-RVG/EGFP免疫组的ELISA抗体水平较低，加强免疫后上升缓慢，与BV-RVG/RVG疫苗组相比，差异显著(P < 0.05，t-test)，BV-VSVG/EGFP对照组和PBS对照组未检测到特异性ELISA抗体，实验结果见图9。3.RV特异性中和抗体米用Yuan 等报道(Yuan Z, Zhang S, Liu Y et al.A recombinant pseudorabiesvirus expressing rabies virus glycoprotein:safety and immunogenicity in dogs.Vaccine, 2008, 26:1314-1321)的RV特异性中和抗体检测方法，检测血清中特异性抗RV的中和抗体水平，结果表明，无论是在首次免疫后还是加强免疫后，BV-RVG/RVG疫苗组的中和抗体水平均较高，并且在加强免疫后上升迅速，达到较高水平，而表面仅展示有RV G蛋白的重组假型杆状病毒BV-RVG/EGFP免疫组的中和抗体水平较低，在加强免疫后上升较慢，与BV-RVG/RVG疫苗组相比，差异显著(P < 0.05，t-test)，BV-VSVG/EGFP对照组和PBS对照组未检测到特异性中和抗体，实验结果见图10。4.ELSIA夹心法检测脾淋巴细胞分泌的IFN- Y水平采用ELISA方法(龙振洲.医学免疫学(第2版).人民卫生出版社，2000年版)检测小鼠脾淋巴细胞被特异抗原刺激后分泌IFN-Y的能力。结果表明本发明经修饰改造后的重组假型杆状病毒疫苗BV-RVG/RVG免疫组分泌IFN- Y水平要显著高于重组杆状病毒BV-RVG/EGFP 免疫组(P < 0.01, t-test)。此外，BV-VSVG/EGFP 对照组诱导的 IFN- Y 水平显著高于PBS对照组(P <0.01，t-test)，说明杆状病毒作为疫苗载体具有诱导非特异性细胞免疫的佐剂效应，实验结 果见图11。
权利要求
1.株重组假型杆状病毒BV-RVG/RVG，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO:V201022，其特征在于，该重组病毒具有表达狂犬病病毒G蛋白的双表达盒，既含有Pph启动子驱动狂犬病病毒G蛋白表达并使其展示在病毒粒子囊膜表面的昆虫细胞表达盒PPH-RVG-poly (A)，又含有CMV启动子驱动狂犬病病毒G蛋白在哺乳动物细胞中高效表达的哺乳动物细胞表达盒CMV-RVG-poly(A)，其中所述的狂犬病病毒G蛋白核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所不。
2.权利要求1所述的重组假型杆状病毒BV-RVG/RVG制备的疫苗。
3.权利要求1所 述的重组假型杆状病毒BV-RVG/RVG在制备狂犬疫苗中的应用。
4.权利要求2所述疫苗在预防狂犬病中的应用。
全文摘要
本发明属于病毒学和基因工程技术领域，具体涉及一种表达狂犬病病毒主要免疫原性糖蛋白(RVG)的重组假型杆状病毒的构建、疫苗制备及应用。本发明得到的重组假型杆状病毒含有双表达盒，既含PPH启动子驱动RVG表达并使其展示在病毒粒子囊膜表面的昆虫细胞表达盒，又含CMV启动子驱动RVG在哺乳动物细胞中高效表达的哺乳动物细胞表达盒。用该重组杆状病毒制备的狂犬病疫苗具有亚单位疫苗和活病毒载体疫苗的双重特性。免疫小鼠后，能刺激机体产生高水平的狂犬病病毒特异性ELISA抗体、中和抗体以及IFN-γ，具有潜在的疫苗应用价值。该重组杆状病毒BV-RVG/RVG保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NOV201022。本发明还包含了该重组杆状病毒疫苗的制备及应用。
文档编号A61P31/14GK103088063SQ201110349009
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者方六荣, 吴群峰, 肖少波, 于福来, 傅振芳, 陈焕春 申请人:华中农业大学