专利名称：利用ix蛋白展示狂犬病病毒保护性抗原的犬ii型腺病毒活载体重组疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用犬Ii型腺病毒不同结构蛋白的特性，分别展示狂犬病病毒保护性抗原或抗原表位的重组疫苗，可用于新型动物狂犬病疫苗的研制和应用。
背景技术：
狂犬病是由狂犬病病毒引起的以非化脓性脑脊髓炎为主要特征的一种重要人畜共患传染病，感染人和动物后，一旦发病，死亡率几乎是100%。我国是狂犬病的多发地，每年有上千人死于狂犬病，主要是由带病毒的犬咬伤引起。尽管目前人用商品疫苗安全有效， 但大量带毒动物的存在仍然对人类生命安全构成了直接威胁。特别是近年来，死于狂犬病的人数呈逐年上升的趋势。因此，减少或控制狂犬病病毒在家养动物中的贮集是有效控制人狂犬病发生的重要途径。目前用于动物狂犬病预防的疫苗主要是灭活疫苗和弱毒疫苗，二者对预防狂犬病的发生起到了积极重要的作用。但是灭活疫苗免疫周期短，接种方式单一，不适于动物的田间免疫，而且在我国还没有实现国产化，进口灭活疫苗制备工艺复杂，成本昂贵，比较适用于发达国家。弱毒疫苗在敏感动物体内有毒力返祖的危险，不能从根本上消除狂犬病，因此，难以在我国得到推广。随着对狂犬病病毒分子生物学特性的不断研究，已证明糖蛋白是唯一可以诱导机体产生中和抗体的狂犬病病毒结构蛋白。国际上许多实验室都开展了以糖蛋白为保护性抗原的亚单位疫苗、基因工程亚单位疫苗、DNA疫苗等新型狂犬病疫苗的研究。虽然这些疫苗可以诱导特异性中和抗体的产生，并具有一定的免疫保护力，但由于免疫原性较弱，未得到实际应用。以痘病毒和人5型腺病毒为载体表达狂犬病病毒糖蛋白的活载体重组疫苗研究取得了一定进展，在欧洲和北美洲的免疫试验证明，具有良好的免疫原性。但由于存在再次免疫排斥或安全性问题，而未得到正式批准使用。为提高重组腺病毒疫苗的实际应用价值， 目前，以人5型腺病毒为载体的展示疫苗已有研究，而以犬II型腺病毒为载体的展示疫苗技术在国内外尚未见报道。以犬II型腺病毒为载体的重组疫苗对犬科动物易感，也可在猫、牛和猪等家畜动物体内有效复制，而且遗传特性稳定，安全性好，在新型狂犬病疫苗的研究中具有较大的开发潜力。本实验室构建的表达狂犬病病毒糖蛋白的犬II型腺病毒活载体重组疫苗，已获得国家发明专利，并完成了在生产性试验阶段的生物安全评价，证明具有良好的免疫效果和安全性。在此基础上，为进一步提高犬II型腺病毒重组疫苗的免疫效力和实际应用价值， 本发明提供了一系列以犬II型腺病毒结构蛋白展示表达狂犬病病毒保护性抗原或抗原表位的重组疫苗。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供利用IX蛋白展示狂犬病病毒保护性抗原的犬II型腺病毒活载体重组疫苗。本发明的技术方案是以犬II型腺病毒为载体，在其结构蛋白基因的疏水性位点插入狂犬病病毒保护性抗原基因或表达抗原表位的核苷酸序列，使外源抗原或表位在腺病毒表面与其结构蛋白融合表达。进一步讲，以犬II型腺病毒疫苗株为载体，在其结构蛋白六邻粒、纤突或IX蛋白上，利用这些结构蛋白基因自身的转录原件，融合表达狂犬病病毒保护性抗原或抗原表位， 使其在犬II型腺病毒颗粒表面得以展示，从而达到增强重组疫苗免疫效力的目的。免疫试验证明，该系列重组疫苗均可诱导产生高滴度的针对狂犬病病毒和犬腺病毒的中和抗体， 并能抵抗狂犬病病毒标准强毒株和犬腺病毒强毒株的攻击。首先，在不发生碱基缺失和不影响结构蛋白转录的前提下，对犬II型腺病毒全基因组中六邻粒、纤突或IX蛋白基因进行改造1、过重叠PCR分别在犬II型腺病毒全基因组六邻粒基因超变区的4个位点，按六邻粒的转录阅读框分别插入狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位，使其与六邻粒在腺病毒颗粒外表面融合表达；2、在犬II型腺病毒全基因组^106bp处引入一段人工合成的核酸序列(含Xma I 酶切位点)，在Xma I酶切位点处，按纤突的转录阅读框插入狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位，使其与纤突在腺病毒颗粒外表面融合表达；3、利用犬II型腺病毒IX蛋白基因内的限制性内切酶Ase I位点，在IX蛋白转录终止密码子处插入狂犬病病毒糖蛋白膜外区基因和SV40病毒多聚A转录终止信号，使IX 蛋白与外源抗原表位利用同一转录阅读框在腺病毒颗粒外表面融合表达。其次，狂犬病病毒保护性抗原或抗原表位能随重组犬II型腺病毒结构蛋白一起转录，在病毒颗粒表面产生多个拷贝，其免疫效力好于单一拷贝的重组疫苗；第三，重组疫苗的增殖、扩大培养以及免疫接种的方式均与载体病毒疫苗株犬II型腺病毒一致；第四， 动物接种重组疫苗后，将同时获得针对犬腺病毒感染和狂犬病病毒感染的免疫力，并能抵抗正常致死剂量强毒株的攻击。展示狂犬病病毒保护性抗原的重组犬II型腺病毒的构建过程1、利用实验室前期构建的含犬II型腺病毒全基因组质粒PP0LYII-CAV2中两个单一酶切位点得到含六邻粒基因的大片段，将其克隆入pET-28a载体，获得重组质粒pET-LH。 再利用PET-LH中大片段的两个单一酶切位点得到含六邻粒基因的小片段，将其克隆入 pET-28a载体，获得重组质粒pET-SH。通过重叠PCR将狂犬病病毒中和抗原表位分别插入六邻体超变区内的4个不同位点(分别在犬II型腺病毒全基因组的17378bp、17450bp、 17623bp和18084bp处)，并将PCR产物克隆入pMD18_T载体，进行序列测定。测序正确后， 利用六邻粒中两个单一酶切位点将改造后的六邻粒基因克隆入PET-SH。最后，按照上述路线返向克隆，获得重组犬II型腺病毒全基因组。2、利用pBluescriptll KS (+/-)中的酶切位点&ic I和Kpn I，插入人工合成序列 Linker SK(依次含Sal I,Xma I,Spe I和Pac I多个酶切位点)，获得重组质粒pBS-SKI。 按纤突基因序列，人工合成犬II型腺病毒全基因组序列^050bp ^106bp区段，并插入 Linker SK中Ml I Xma I之间，利用PCR获得犬II型腺病毒全基因组中30182bp 29358bp序列，将两片段插入Linker SK中Spe I Pac I之间，获得重组质粒pBS—SKII。
4再将狂犬病病毒中和抗原表位按纤突基因的转录阅读框插入PBS-SKII的Linker SK中Xma I和Spe I位点之间，获得改造后的纤突基因。最后，通过Linker SK中两端的酶切位点Ml I和I^ac I，将改造的纤突基因插入pP0LYII-CAV2中，得到重组犬II型腺病毒全基因组。3、利用pP0LYII-CAV2中两个单一酶切位点得到含IX蛋白基因的大片段，将其克隆入pBluescriptll KS (+/-)载体，获得重组质粒pBS_LIX。再利用pBS_LIX中大片段的两个单一酶切位点得到含IX蛋白基因的小片段，将其克隆入PEGFP-Cl载体，获得重组质粒 PEGFP-SIXo然后，在IX蛋白终止密码子处，利用其自身的酶切位点插入狂犬病病毒糖蛋白膜外区基因与SV40多聚A转录终止序列，实现IX蛋白与糖蛋白膜外区融合表达。最后，按照上述路线，返向克隆获得重组犬II型腺病毒全基因组。4、碱裂解法大量制备各种重组犬II型腺病毒基因组质粒，分别经Asc I和Riie I 双酶切游离全基因组后，通过脂质体转染5 μ g基因组DNA于犬肾传代细胞系MDCK，隔天传代1次，直至出现典型的犬腺病毒病变(葡萄串状)。展示狂犬病病毒保护性抗原的犬II型腺病毒活载体重组疫苗免疫原性1、利用MDCK细胞大量制备重组疫苗，并测定疫苗的TCID5tl (均不低于 106-5TCID50/0. 1ml)。取无狂犬病免疫史的家犬为试验动物，分别两侧股内侧肌肉注射和口服接种。2、免疫时每条犬肌肉注射Iml或口服2ml —种重组疫苗，免疫一次，免疫前及免疫后每周采血并分离血清。3、采用荧光抗体狂犬病病毒中和试验(FAVN)法，检测免疫犬血清中和抗体效价， 结果显示，重组疫苗诱导的平均中和抗体水平在免疫后第3周时，均能达到国际最低保护水平(0. 5IU/ml)以上，第4 5周达到最高(4. 62 6. 43IU/ml)。通过血凝抑制试验， 检测试验犬体内腺病毒抗体效价，结果显示，重组疫苗诱导的腺病毒抗体水平在免疫后第4 周时最高，均为1 21(1。展示狂犬病病毒保护性抗原的犬II型腺病毒活载体重组疫苗的免疫保护作用免疫6周后，对各试验组动物进行攻毒，每组分别用IOOLD5tl的狂犬病病毒标准强毒CVS-M和犬腺病毒强毒进行攻毒。攻毒后对试验动物进行封闭隔离饲养，相互之间不接触，每天观察并记录试验动物的采食和发病情况，观察40天。结果显示，口服和肌肉注射任何一种重组疫苗的犬均可抵抗强毒的攻击，存活率在90%以上。
具体实施方案下面结合实施例，对本发明做进一步描述实施例1 以六邻粒展示狂犬病病毒保护性抗原的重组疫苗全基因组的克隆Eco52I和SnaB I双酶切pP0LYII_CAV2，经琼脂糖凝胶电泳回收12516bp片段，克隆入pET-28a载体，获得重组质粒pET-LH。再用Nde I和Mlu I双酶切pET_LH，经琼脂糖凝胶电泳回收4325bp片段，克隆至pET-28a载体，获得重组质粒pET_SH。通过重叠PCR将狂犬病病毒中和抗原表位分别插入六邻体内4个不同位点，并将PCR产物克隆至pMDIS-T 载体，进行序列测定。测序正确后，利用六邻粒Kpn I和Dra I两个自然酶切位点将改造后的六邻粒基因克隆入pET-SH。最后，按照上述路线，返向克隆获得4种重组犬II型腺病毒全基因组质粒 pPolyII-CAV2/HVRl-GAP、pPolyII-CAV2/HVR2-GAP、pPolyII-CAV2/HVR3-GAP和 pPolyII-CAV2/HVR4-GAP。重叠PCR引物序列HV (forward)5’ -ATATCAGGGGTACCCTAGACAGAG-3，；HV(reverse)5， -GGTGTGTATTTAAAGGCATCAGGC-3‘；HVR I-GAP (forward)5’ -CTCGGATCCTGGAGCCCTATTGACATACTAGGTTCAGCTGTCACAAACAATACCTACCA-3’ ；HVRl-GAP(reverse)5' -TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAGCACAGTTATGGCACCTGCAGAGG-3'；HVR2-GAP(forward)5’ -CTCGGATCCTGGAGCCCTATTGACATACTAGGTTCAGAGCTGGGGGATGCGTCTGGCCG-3，；HVR2-GAP(reverse)5’ -TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAGATCGACCCAGCTTTCAGGGCCCA-3’ ；HVR3-GAP(forward)5’ -CTCGGATCCTGGAGCCCTATTGACATACTAGGTTCAGCCATGCTAT ACACTGAAGATGT-3，；HVR3-GAP(reverse)5’ -TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAGGGTGGTCACCTTATAAAATCTGG-3，；HVR4-GAP(forward)5’ -CTCGGATCCTGGAGCCCTATTGACATACTAGGTTCATTTCAGGCAGAAAATACCAATGT-3，；HVR4-GAP(reverse)5’ -TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAGAACCTTCATGGTGGTCATGTTTG-3，。其中，在犬II型腺病毒全基因组17378bp处插入外源基因时，用引物HV和 HVRl-GAP,最终得到重组犬II型腺病毒全基因组质粒pPolyII-CAV2/HVRl-GAP ；在 17450bp处插入时，用引物HV和HVR2-GAP，最终得到重组犬II型腺病毒全基因组质粒 pPolyII-CAV2/HVR2-GAP ；在17623bp处插入时，用引物HV和HVR3-GAP，最终得到重组犬 II型腺病毒全基因组质粒pPolyII-CAV2/HVR3-GAP ；在18084bp处插入时，用引物HV和 HVR4-GAP，最终得到重组犬II型腺病毒全基因组质粒pPolyII-CAV2/HVR4-GAP。狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位DNA序列 5’ -TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAG-3’。PCR反应条件以在犬II型腺病毒全基因组17378bp处插入外源基因为例，质粒pET_SH为模板， HVR(reverse)和 HVR1-GAP (forward)为引物，在 TaKaRa Ex Taq DNA 聚合酶作用下，95°C 预变性5min，94°C变性45s，59°C退火45s，72°C延伸lmin，共30个循环，得到突变位点左侧片段(2L)。以 pET-SH 为模板，HVRl-GAP(reverse)和 HV(forward)为引物，在 TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶作用下，95°C预变性5min，94°C变性45s，56°C退火45s，72°C延伸lmin, 共30个循环，72°C延伸IOmin扩增突变位点右侧片段QR)。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化。然后，进行第二步PCR，分别取25-50ng 2L和2R片段充分混勻作为模板， 以HV (forward)和HV (reverse)为引物，在TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶作用下，95°C预变性5min, 94°C变性45s，56°C退火45s，72°C延伸lmin，共30个循环，扩增得到HVRl-GAP突变片段。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化，连接到PMD18-T Vector，进行测序。在其他位置插入时以相同方法，利用各自引物进行重叠PCR扩增。实施例2 以纤突展示狂犬病病毒保护性抗原的重组疫苗全基因组的克隆利用pBluescriptll KS(+/-)中的酶切位点&ic I和Kpn I，插入人工合成序列 Linker SK(依次含Sal I,Xma I,Spe I和Pac I多个酶切位点)，获得重组质粒pBS-SKI。 按纤突基因序列，人工合成犬II型腺病毒全基因组序列^050bp ^106bp区段，并插入 Linker SK中Ml I Xma I之间，利用PCR获得犬II型腺病毒全基因组中30182bp 29358bp序列，将两片段插入Linker SK中Spe I Pac I之间，获得重组质粒pBS-SKII。 再将狂犬病病毒中和抗原表位按纤突基因的转录阅读框插入PBS-SKII的Linker SK中Xma I和Spe I位点之间，获得改造后的纤突基因。最后，通过Linker SK中两端的酶切位点Ml I和he I，将改造的纤突基因插入pP0LYII-CAV2中，得到重组犬II型腺病毒全基因组质粒 pP0LYII-CAV2/Fiber-GAP。Linker SK 序歹ljSense sequence 5’ -CGTCGACAGTCCCGGGAGTGGCGCCAGTGGGCCCAGTACTAGTGCCTTAATTAAGGTAC-3，；Antisense sequence 5’ -CTTAATTAAGGCACTAGTACTGGGCCCACTGGCGCCACTCCCGGGACTGTCGACGAGCT-3，。人工合成犬II型腺病毒全基因组^050bp ^106bp区段序列Sense sequence 5’ -TCGACGGTGCCCCCAGCAGAAGTATCGACTGCATGCTAATTATTAACAAACCAAAAC-3，；Antisense sequence 5’ -CCGGGTTTTGGTTTGTTAATAATTAGCATGCAGTCGATACTTCTGCTGGGGGCACCG-3，。PCR引物序列Forward 5' -TGATCACCGCAACGGTGAATG-3’Reverse :5’ -TGAGTATGATGATGCTCTTGCAC-3，PCR反应条件在TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶作用下，95°C预变性5min，94°C变性45s，55°C退火 45s，72°C延伸lmin，共30个循环，72°C延伸lOmin。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化， 连接到PMD18-T Vector，进行测序。实施例3 以IX蛋白展示狂犬病病毒保护性抗原的重组疫苗全基因组的克隆EcoR I和Cla I双酶切pP0LYII_CAV2，琼脂糖凝胶电泳回收3610bp片段，克隆入 pBluescriptll KS (+/-)，获得重组质粒 pBS-LIX。Mlu I 与 EcoR I 双酶切 pBS-LIX，琼脂糖凝胶电泳回收340bp片段，克隆入pEGFP-Cl，获得重组质粒pEGFP-SIX。在IX蛋白终止密码子处，利用单一酶切位点Ase I插入狂犬病病毒糖蛋白膜外区基因(G’)与SV40多聚 A转录终止信号序列，实现IX蛋白与糖蛋白膜外区融合表达。最后，按照上述路线，返向克隆获得重组犬II型腺病毒全基因组质粒PP0LYII-CAV2/IX-G’。实施例4 重组疫苗的包装与鉴定1、重组疫苗的包装
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取改造的犬二型腺病毒质粒pPolyII-CAV2/HVRl_GAP、pPolyII-CAV2/HVR2_GAP、 pPolyII-CAV2/HVR3-GAP、 pPolylI-CAV2/HVR4-GAP, pPOLYII-CAV2/Fiber-GAP 禾口 PP0LYII-CAV2/IX-G’各5 μ g，分别以Asc I和Riie I双酶切释放重组的全基因组，利用 Lipofectamine 2000转染至MDCK细胞系，直到细胞出现病变。酶切条件限制性内切酶Asc I和Pme I各10U，IOXBuffer 5 μ 1，质粒5 μ g，加水补至 50μ 1。37°C水浴反应Ih后，氯仿异戊醇04 1)抽提1次，2倍体积无水乙醇沉淀，灭菌四馏水溶解沉淀，-20°C保存备用。2、重组疫苗的鉴定重组疫苗基因组鉴定取50ml培养瓶内已呈葡萄串状病变的单层MDCK细胞，倾弃培养基，以PBS洗涤2 次，加入800 μ 1新鲜配制的细胞裂解液(0.6% SDS, IOmM EDTA，100 μ g/ml蛋白酶K)，37°C 温育lh，加入200 μ 1 5Μ NaCl，轻轻混勻后，冰水浴lh。将全部混合物移入离心管，于4°C， 12000rpm离心40min，上清移入加一离心管，以等体积酚氯仿抽提2次，加入终浓度0. 25M 醋酸钠和2倍体积无水乙醇，12000rpm离心lOmin，DNA沉淀以70%乙醇洗涤1次，无菌风干后，溶于50 μ 1去离子水。以基因组为模板，PCR扩增外源基因，测序鉴定。鉴定用PCR引物序列①CAV2/HVR 1-GAP、CAV2/HVR2-GAP、CAV2/HVR3-GAP 和 CAV2/HVR4-GAP 鉴定用弓丨物序列Forward 5' -GGTGTGTATTTAAAGGCATCAGGC-3，；Reverse :5’ -ATATCAGGGGTACCCTAGACAGAG-3，。②CAV2/Fiber_GAP鉴定用引物序列Forward 5' -AGCAGAAGTATCGACTGCAT-3，；Reverse :5’ -TGAGTATGATGATGCTCTTGCAC-3，。③CAV2/IX-G’鉴定用引物序列Forward 5' -AGCTGAAGATCCAGGTGGCT-3，；Reverse :5’ -ACGCTGGACACGGTATTATC-3，。PCR反应条件同上。TCID50 的测定将IX IO7MDCK细胞传入96孔细胞培养板，每孔内细胞约1X106，补加培养基至 100μ1ο次日，接入待测病毒样品。在1 11孔内，进行KT1 10_"稀释，A H列为同浓度重复。7天后，以Karber法计算待测重组疫苗的TCID5(1。免疫原性鉴定(Westernblotting)取含狂犬病病毒SRV9株的细胞裂解液50 μ 1，加等量2 X SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴lOmin，冷却至室温，短暂离心后进行SDS-PAGE电泳。电泳完毕，将胶上蛋白样品电转移到硝酸纤维素膜上，分别与犬抗重组疫苗的多抗及阳性和阴性对照多抗、HR标记兔抗犬二抗反应，最后以DAB/H2A显色，根据显色带出现与否及其位置判定重组疫苗是否表达狂犬病病毒抗原。
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毒力鉴定取4 5月龄犬腺病毒和狂犬病病毒抗体阴性犬60条，按接种重组疫苗不同分为 6组，每组10条，分别用含IO8TCID5tl和IO7TCID5tl的重组疫苗细胞培养液各肌肉注射5条犬。注射后，观察注射犬的饮食、精神状态等表现，测量体温、计数白细胞数量和其它临床表现等，并在4周后解剖注射犬，观察犬体病理变化，并进行肝等主要脏器的组织切片观察。稳定性鉴定1 X IO6MDCK细胞传入25cm2细胞培养瓶内，细胞长成单层后，按培养瓶内培养基体积的0. 5%接入重组疫苗，接种后3 4天收毒，对各种重组疫苗分别连续传代40次，标记并保存每次的培养液，同时每隔5代，提取感染细胞中的腺病毒基因组，通过PCR和DNA测序鉴定外源基因的大小、方向和位置。结果1.各重组疫苗基因组内均正确插入了狂犬病病毒保护性抗原，转录方向与病毒基因组转录方向一致；2. 0. Iml各重组疫苗的TCID50无明显差别，为IO6.5 IO7 ；3.各重组疫苗均表达了狂犬病病毒糖蛋白中和表位，抗体可以与狂犬病病毒糖蛋白特异性结合；4.毒力检测结果显示，注射犬未出现饮食和精神表现等异常，体温在正常范围内 (37.5 38.5°C)。体内白细胞计数显示，白细胞总数(7.5 16.0X109/L)分类计数均在正常范围内，注射犬未出现蓝眼或厌食等临床表现。解剖未见主要组织器官出现异常变化， 重组疫苗注射犬肺、肝和肾等组织切片与健康犬的组织切片无明显区别。5.稳定性鉴定结果表明，各重组疫苗经过40代传代，其基因组(包括外源基因的大小、方向和位置)均保持不变，外源基因序列均未发生改变。实施例5 以六邻粒展示狂犬病病毒保护性抗原的犬II型腺病毒活载体重组疫苗的免疫效果实验动物狂犬病病毒和腺病毒抗体阴性的4 5月龄犬80条，随机分为8组，每组10条。动物免疫分别以TCID5tl 为 106·5 的重组疫苗 CAV2/HVR1-GAP、CAV2/HVR2-GAP、CAV2/HVR3-GAP 和CAV2/HVR4-GAP对8组犬进行免疫。每种重组疫苗各免疫20条犬，其中肌肉注射10条， Iml/条；口服 10 条，2ml/条。免疫检测免疫前及免疫后每周分别采集少量静脉血，分离血清，以FAVN检测受试犬狂犬病病毒中和抗体水平。攻毒试验免疫6周后，每组随机抽取5条犬，以IOOLD5tl狂犬病标准强毒株CVS-M接种；其余犬以IOOLD5tl犬I型和II型腺病毒强毒混合物接种。隔离观察各犬至接种后40天，详细记录各组犬的发病及死亡情况。结果1.所有受试犬的免疫前血清内检不出抗犬腺病毒及狂犬病病毒的特异性抗体；
2.所有犬免疫后2 3周，其血清中均可检出抗腺病毒抗体，至6周时，抗体仍维持在较高水平；3.所有受试犬免疫后3 4周时，其血清中均可检出狂犬病中和抗体，抗体消长规律与腺病毒抗体一致；4.受试犬能抵抗犬I型与II型腺病毒强毒的攻击，存活率为95% ；5.受试犬能抵抗狂犬病强毒的攻击，存活率为90% ；结论4株不同重组疫苗均可诱导机体产生针对犬腺病毒和狂犬病病毒的特异性中和抗体，对犬腺病毒和狂犬病病毒感染具有保护作用。实施例6 以纤突展示狂犬病病毒保护性抗原的犬II型腺病毒活载体重组疫苗的免疫效果实验动物狂犬病病毒和腺病毒抗体阴性的4 5月龄犬20条，随机分为2组，每组10条。动物免疫分别以TCID5tl为IO6 5的重组疫苗CAV2/Fiber_GAP对2组犬进行免疫。其中肌肉注射10条，Iml/条；口服10条，2ml/条。免疫检测免疫前及免疫后每周分别采集少量静脉血，分离血清，以FAVN检测受试犬狂犬病病毒中和抗体水平。攻毒试验免疫6周后，每组随机抽取5条犬，以IOOLD5tl狂犬病标准强毒株CVS44接种；其余犬以IOOLD5tl犬I型和II型腺病毒强毒混合物接种。隔离观察各犬至接种后40天，详细记录各组犬的发病及死亡情况。结果1.所有受试犬的免疫前血清内检不出抗犬腺病毒及狂犬病病毒的特异性抗体；2.所有犬免疫后2 3周，其血清中均可检出抗腺病毒抗体，至6周时，抗体仍维持在较高水平；3.所有受试犬免疫后3 4周时，其血清中均可检出狂犬病中和抗体，抗体消长规律与腺病毒抗体一致；4.受试犬能抵抗犬I型与II型腺病毒强毒的攻击，存活率为95% ；5.受试犬能抵抗狂犬病强毒的攻击，存活率为90% ；结论重组疫苗CAV2/Fiber_GAP可诱导机体产生针对犬腺病毒和狂犬病病毒的特异性中和抗体，对犬腺病毒和狂犬病病毒感染有保护作用。实施例7 以IX蛋白展示狂犬病病毒保护性抗原的犬II型腺病毒活载体重组疫苗的免疫效果实验动物狂犬病病毒和腺病毒抗体阴性的4 5月龄犬20条，随机分为2组，每组10条。动物免疫
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分别以TCID5tl为IO6 5的重组疫苗CAV2/IX-G’对2组犬进行免疫。其中肌肉注射 10 条，Iml/ 条；口服 10 条，2ml/ 条。免疫检测免疫前及免疫后每周分别采集少量静脉血，分离血清，以FAVN检测受试犬狂犬病病毒中和抗体水平。攻毒试验免疫6周后，每组随机抽取5条犬，以IOOLD5tl狂犬病标准强毒株CVS44接种；其余犬以IOOLD5tl犬I型和II型腺病毒强毒混合物接种。隔离观察各犬至接种后40天，详细记录各组犬的发病及死亡情况。结果1.所有受试犬的免疫前血清内检不出抗犬腺病毒及狂犬病病毒的特异性抗体；2.所有犬免疫后2 3周，其血清中均可检出抗腺病毒抗体，至6周时，抗体仍维持在较高水平；3.所有受试犬免疫后3 4周时，其血清中均可检出狂犬病中和抗体，抗体消长规律与腺病毒抗体一致；4.受试犬能抵抗犬I型与II型腺病毒强毒的攻击，存活率为95% ；5.受试犬能抵抗狂犬病强毒的攻击，存活率为90% ；结论重组疫苗CAV2/IX-G’可诱导机体产生针对犬腺病毒和狂犬病病毒的特异性中和抗体，对犬腺病毒和狂犬病病毒感染有保护作用。附改造后犬II型腺病毒结构蛋白基因序列1.改造后犬II型腺病毒结构蛋白六邻粒基因序列重组疫苗CAV2/HVR1-GAP中六邻粒基因序列ATGGCAACCCCGTCGATGCTGCCACAATGGTCTTACATGCACATTGCTGGCCAGGACGCCGCCGAATA CTTGTCTCCCGCCCTGGTTCAGTTTGCCCAAGCAACCAGTTCTTACTTTAAGTTGGACAACAAGTTCAGAAACCCC ACTGTGGCCCCCACCCACGATGTGACCACTGAGAGGTCGCAGCGCTTGCAGCTGCGCTTTGTGCCAGTCATGCAA GAGGATGGCCAGTACACTTACAAAACCCGCTTCCAGCTTGCGGTGGGAGACAACAGGGTGCTGGACATGGCCAGT ACTTACTTCGATATCAGGGGTACCCTAGACAGAGGCCCCTCCTTCAAGCCTTACAGCGGCACCGCCTACAATGCC CTCGCCCCCAAGGCCGGGGCTAACAACTGTCTTTTTAATGGACAGGGTGCCAATATTAACACTTTAGCCCAGGTG
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12tggggcccattcaaaagattggttttggaaatgttgaggccatggaaatcaacctcaatgccaacctcttcaaaagc ttcctttactccaatgtggccttatacttgcctgatgcctttaaatacacacctgaaaacattgtggcccctgccaa tgtgaatacctatgcttacat gaatgttagattacccgccgccaaccttatagatacctttgtaaatattggcgcc agatggtcaccagatgtaatggacactgttaatcctttcaaccaccacagaaatgcaggactccgctaccgttcaca actgcttggcaatggccgctattgctcgttccatattcaggtccctcaaaaattttttgcaatcaaaaatctcctcc tactgcctggaacgtacacgtacgagtggtctttcagaaaggatgtaaacatgatccttcaaagcagcttgggcaat gacctccgagtggatggggccaccatcaacattcagagcatcaacctatatgcaagctttttcccaatggcacacaa cactgcctccactctggaagccatgctgcgcaacgatgtaaatgaccagtcctttgcagactacctgtcttctgcca acatgctttatcccatccctgccaacactactaacctgccaatctccattcccgccagaaactgggcgggatttaga gggtggagctttaccagaattaagcaacgagaaactcctgccctgggctcgccttatgatccctacttcacttattc gggcagtattccatatctggatgcaactttttacctcagccacacctttagaagagtttccatcatgtttgactctt ccgtgtcttggcctggcaatgacaggctgcttacccccaatgagtttgagattaaaaggtatgtagacggtgaaggt tacaatgtggcccagtccaacatgacaaaagactggttcatggttcaaatgctagcccactacaacatcggctacca aggctaccacctgccagaaagctacaaggacagaatgtactccttcctaagaaactttgagcccatgtgcagacagt tggtggacgtggccaactatgctgcctaccagccggttaccgtgggccaccagcataacaattctggttatgctagc gccctttcggcctttaacccgcgtgaggggcacccatacccagcaaactggccttacccactcattggagccaatgc agtacccactgtcacccagaaaaagttcctctgcgacaggtccctgtggcgcatcccattctcctccaactttatgt ctatgggaaccctcactgacctgggccaaaacctgctgtactctaactccgcccacgcccttgacatgacttttgag gttgatgccatgaatgagcccactctgttgtacgttttgtttgaagtgttcgacgtggcacgcgtccatcagcccca ccggggggtgattgaggtagtgtacctcagaactcccttctccgccggcaacgccaccacctaa_■序列为狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位基因序列重组疫苗cav2/hvr3-gap中六邻粒基因序列atggcaaccccgtcgatgctgccacaatggtcttacatgcacattgctggccaggacgccgccgaata cttgtctcccgccctggttcagtttgcccaagcaaccagttcttactttaagttggacaacaagttcagaaacccc actgtggcccccacccacgatgtgaccactgagaggtcgcagcgcttgcagctgcgctttgtgccagtcatgcaa gaggatggccagtacacttacaaaacccgcttccagcttgcggtgggagacaacagggtgctggacatggccagt acttacttc gatatcaggggtaccctagacagaggcccctccttcaagccttacagcggcaccgcctacaatgccc tcgcccccaaggccggggctaacaactgtctttttaatggacagggtgccaatattaacactttagcccaggtgccc tctgcaggtactgtggctgtcacaaacaatacctaccagccagagccccagctgggccctgaaagctgggtcgatg gcagcctagcagagctgggggatgcgtctggccgtgcccttaaggcttcaaccccgcgcatgccttgctatggttc
ctatgctccccccaccaacgaaaatggaggt |ctcggatcctggagccctattgacatac |taggttc^1 actggtccagtggaatccagattttataaggtgaccaccaacaataacaatgaagcagatgcc
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icccgggI1 TGGAGCCCGATCGATATAGGCGCCTCTCTAAAAGGCGCATGCAAACTCAAGTTATGTGGAGTTCTTG GACTTAGACTTATGGACGGAACATGGGGGCCCAGTAATGAGACCAAATGGTGTCCTCCCGATCAGTTGGTTAATCTG CACGACTTTCGCTCAGACGAAATTGAGCATCTTGTTGTAGAGGAGGCTAGTGGCGTTGCCACTTACACCCTTACCTT TAGGTTTTTAAACTTTAACAGACTAAGCGGAGGTACCCTGTTTAAAACTGATGTCTTAACCTTTACCTATGTAGGCG AAAATCAATAAAACCAGAAAAAAATAAGTTTAAAAGCTTTATTTTTCATACACGCGAGCGGTAAGGCTGCCGCCTTC AGGAAAAGTTACTCTGTAAACAGTTCTTTCACAACAGCACAAAACATAGGTATTAGTTAACAGTTCATTTGGGCTAT AATAATATACATTTTCTTGGGTGGCAAAGCAAGGGTCGGTAATCTCAACAAAACCATCAACTGGAATGCAAGAATAG TCCAGCACGGTGGGTTCAATCTAAAAATGAAGAAACGCGTTGAGGTTCACTAAGCACAGGTTTTGAATCTGTCGGCA GCGTCCATGCATCATAGCTTGTCTCAAAGCAGATTGTCTTCTTTCCTCTGCCTTGGAAGTGGTTTGGTGAAGCACTA CAGGTGTCTTTTCAACCTCTTTCAGCACCCGCACTATTACAGATCTCACCCACACAGCACAGTTTTTAAGAGAACAA TAGTTTTGAAGGCTACAAGATTTACACTTAAGCACCAGCCAGTAATTATAAGTGCTTTTAAGAACTACCCCTAGCTC AGGGTTAATGCACCTTTTAATGGCCTCCATGCAGGCTTTATGGACAGTTCTAAAAAAAGACAGTCTAAAATAAATGT AGTGAGTGTTTCTAAATATAATACTCCCCACATAGTTAATTTCATCAGGCCTGCTAGAATTTACAAACTCTCGGTAC CACATATACTTTTTATTCATAGCCCCACCCTTAATAAAGTCCTCAATCACTTTCTGAACCACATGCTTGCTAGCCAT GCATTGTAAAGACAAGCTGTTAGAGCAGTGACAGTGTACTCGCCACGTTTGAGCCTCTGCCAGGCAGCAGTGCTTAG
15TTACTATCAACTCAATACCCGCATTGCATGTAAACCCCCCAAAGAGCAGTTTTTCATGCCTGTGTAGCACATCATCC CACAAAATAGGAATTTCATAGCATAAAGCAAAGCAATTACAATATTTAGGAACTCTCACCACAGCAGTCACGTGACA TGTTGTCTCAGCAGTGCAGTTGCCTTCCATCCTACAATTATGAACAAAAACTAAACACTTCTAACAAAGATACAGTG
ACAATCTCCCTTCCTCTAAAAGCATTGTTTACATTAGGGTGATTATTAACAACGTCAGAAATTTCTT ΙΤΑΑΤΤΑ,
AAGTGCCTTTAAAATGTGCAAGAGCATCATCATACTCAI加框I序列分别为Ml I、Xma I和I^ac I位点，下划线部分是狂犬病病毒中和抗原表位序列。3.重组疫苗CAV2/IX-G’中IX蛋白序列
atggaccctcaacagaaggggcttgtgaacacgtgttttgtgactacgcg
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gttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcat cacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttg
tccaaactcatcaatgtatcttaacgcg|taat|分是犬II型腺病毒IX蛋白序列，下划线部分是狂犬病病毒糖蛋白膜外区
16序列，阴影部分是SV40poly(A)序列。
权利要求
1.一种利用IX蛋白展示狂犬病病毒保护性抗原的犬II型腺病毒活载体重组疫苗，其特征在于以犬II型腺病毒为载体，在其结构蛋白基因的疏水性位点插入狂犬病病毒保护性抗原基因或表达抗原表位的核苷酸序列，使外源抗原或表位在腺病毒表面与其结构蛋白融合表达，所述的疏水性位点位于犬II型腺病毒结构蛋白IX蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组疫苗，其特征在于利用犬II型腺病毒IX蛋白基因内的限制性内切酶Ase I位点，在IX蛋白转录终止密码子处插入狂犬病病毒糖蛋白膜外区基因和SV40病毒多聚A转录终止信号，使IX蛋白与外源抗原利用同一转录阅读框在腺病毒颗粒外表面融合表达。
3.根据权利要求2所述的重组疫苗，其特征在于利用PP0LYII-CAV2中两个单一酶切位点得到含IX蛋白基因的大片段，将其克隆入pBluescriptn KS(+/_)载体，获得重组质粒pBS-LIX，再利用pBS-LIX中大片段的两个单一酶切位点得到含IX蛋白基因的小片段，将其克隆入PEGFP-Cl载体，获得重组质粒pEGFP-SIX，然后，在IX蛋白终止密码子处，利用其自身的酶切位点插入狂犬病病毒糖蛋白膜外区基因与SV40多聚A转录终止序列，实现IX 蛋白与糖蛋白膜外区融合表达，最后，按照上述路线，返向克隆获得重组犬II型腺病毒全基因组。
4.根据权利要求1所述的重组疫苗，其特征在于所述的狂犬病病毒保护性抗原基因为狂犬病病毒糖蛋白膜外区序列为GGCCCAAATTCCCTATTTACACGATACCAGACACACTTGGTCCCTGGAGACCGATCGATATACATCATCTCA GTTGCCCAAACAATTTGGTTGTGGAGGATGAAGGATGCACCAACCTGTCAGGGTTCTCCTACATGGAACTTAAAGTT GGACACATCTCAGCCATAAAGGTGAACGGGTTCACTTGCACAGGCGTTGTGACAGAGGCAGAAACGTACACTAACTT TGTTGGTTATGTCACCACCACGTTCAAAAGAAAGCATTTCCGCCCAACACCAGATGCATGTAGAGCCGCGTACAACT GGAAGATGGCCGGTGACCCCAGATATGAAGAGTCTCTACACAGTCCGTACCCTGACTACCATTGGCTTCGAACCGTA AAAACCACAAAGGAGTCTATCGTTATCATATCTCCAAGTGTGGCAAATTTGGACCCATATGATAACTCCCTTCACTT GAGGGTCTTCCCTAGCGGAAAGTGCTCAGGAATAACGGTGCCTTCTGTCTACTGCTCAACTAACCACGATTACACCG TTTGGATGCCTGAAATCCTGAGACTAGGGACATCTTGTGATATTTTTACTAATAGTAGAGGGAAGAGAGCATCCAAG GGGAGCAAGACCTGTGGCTTTGTAGATGAAAGGGGCCTATATAAGTCTCTAAAAGGCGCATGCAAACTCAAGTTATG TGGAGTTCCTGGACTTAGACTTATGGACGGAACATGGGTCTCGATGCAGACATCAAATGAGACCAAATGGTGTCCTC CCGGTCAGTTGGTTAATCTGCACGACCTTCACTCAGACGAAATTGAGCATCTTGTTGTAGAGGAGTTGGTCAAGAAA AGAGAGGAGTGTCTGGATGCACTAGAGTCCATCATAACCACCAAGTCAGTGAGTTTCAGACGTCTCAGTCATTTAAG AAAACTTGTCCCCGGGTTCGGAAAGGCATATACCATATTCAACAAGACCTTGATGGAGGCTGAAGCTCACTACAAGT CAGTCAGGACTTGGAATGAGATCATCCCCTCAAAAGGGTGTTTGAGAGTTGGAGGGCATGTTTTAATCCCAGAGATG CAATCATCCCTCCTCCAGCAACATATAGAGTTATTGGAATCCTCAGTTATTCCCCTGATGCACCCCCTTGCAGACCC GTTCACAGTTTTCAAGGACGGCGATGAGATTGAGGATTTTGTGGAAGTTCACCTTCCCGATGTGCACGAACAGGTCT CAGGGGTTGACCTGGGTCTCCCGAACTGGGGGAAG。
5.根据权利要求1所述的重组疫苗，其特征在于所述的表达抗原表位的核苷酸序列为TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAG 或 CCCGGGTGGAGCCCGATCGATATAGGCGCCTCTCTAAAAGGCGCATGCAAACTCAAGTTATGTGGAGTTCTTGGACTTAGACTTATGGACGGAACATGGGGGCCCAGTAAT GAGACCAAATGGTGTCCTCCCGATCAGTTGGTTAATCTGCACGACTTTCGCTCAGACGAAATTGAGCATCTTGTTGT AGAGGAGGCTAGC。
全文摘要
一种利用IX蛋白展示狂犬病病毒保护性抗原的犬II型腺病毒活载体重组疫苗，涉及利用犬II型腺病毒不同结构蛋白的特性，分别展示狂犬病病毒保护性抗原或抗原表位的重组疫苗，在其结构蛋白基因的疏水性位点利用IX蛋白插入狂犬病病毒保护性抗原基因或表达抗原表位的核苷酸序列，使外源抗原或表位在腺病毒表面与其结构蛋白融合表达。本发明重组疫苗攻毒后对试验动物进行封闭隔离饲养，观察并记录试验动物的采食和发病情况，结果显示，口服和肌肉注射任何一种重组疫苗的犬均可抵抗强毒的攻击，存活率在90％以上。
文档编号C12N15/66GK102335424SQ20111027391
公开日2012年2月1日 申请日期2007年8月22日 优先权日2007年8月22日
发明者刘晔, 张守峰, 扈荣良, 李忠 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所