抗EpCAM免疫球蛋白的制作方法

专利名称：抗EpCAM免疫球蛋白的制作方法
A.发明领域本发明涉及使用免疫球蛋白分子治疗肿瘤疾病的方法。特别是，本发明涉及包括抗EpCAM免疫球蛋白分子的治疗方法。本发明进一步涉及这种免疫球蛋白在药物生产中的用途。本发明进一步涉及能用来治疗肿瘤疾病的免疫球蛋白分子以及包含这种免疫球蛋白分子的组合物。
B.相关技术在设计包括施用免疫球蛋白分子的治疗方式时，有几个因素是必须考虑的。一方面，治疗性免疫球蛋白必需以足以引发期望的治疗效果的数量施用给患者。这种效果应该在最初的治疗时实现，并且当在两次连续施用之间免疫球蛋白逐渐从患者身体清除时应该继续实现至尽可能大的程度。另一方面，施用的免疫球蛋白的数量不能太大而在患者中引起有害和/或有毒的副作用。
因而产生了难题，当可以耐受而不引起副作用的免疫球蛋白的最大剂量(最大耐受剂量，或“MTD”)将免疫球蛋白的量限制到不足以长时间维持的单剂量水平时，需要免疫球蛋白的最低水平来确保持续的有效性。在这样的情况下，不可能的是维持确保持续的治疗效果所需的“血清波谷水平”直到下一次免疫球蛋白的施用。药物的“血清波谷水平”一般是指药物在患者的血液中在任何时间容许达到的而不丧失治疗效果的最低浓度。因而，它代表了药物的最低量，为了任何要实现的治疗益处，该量必需总是存在于患者的血液中。
现有一些用于维持治疗性免疫球蛋白的期望血清波谷水平的方法。一种方法是增加给患者的免疫球蛋白的初始剂量。然而，这种方法具有的缺点是，可能超过了对于患者是安全的治疗性免疫球蛋白水平，患者可能因而经历有害和/或有毒的副作用。
另一种方法是增加治疗性免疫球蛋白的施用频率。然而，增加的施用频率严重地降低了患者的生活质量，因为需要多次、频繁地造访患者。特别是要治疗的疾病仍处在早期阶段的情况时，患者将不能过上正常的生活。
进一步地，增加的应用频率意味着整个治疗方式所需的更大的治疗性免疫球蛋白总量。因而，与较低频率施用治疗性免疫球蛋白的治疗方式相比，增加的应用频率意味着与给定治疗方式相关的更高的总成本。
在要施用的治疗性免疫球蛋白是特异于在健康和疾病组织中都存在的抗原，而所述抗原在疾病组织中比在健康组织中更普遍的情况下，开发考虑到以上因素的治疗方式变得至关重要。在此，特别大的危险是过高和过频繁的给药将引起治疗性免疫球蛋白和该治疗性免疫球蛋白特异结合的抗原之间不希望的相互作用。这些免疫球蛋白一健康组织的相互作用引起了有害和/或有毒的副作用，其可能使得使用免疫球蛋白的治疗方式复杂化。
在健康和患病的人类组织中都存在的一种这样的抗原是上皮细胞粘附分子(“EpCAM”，也称为17-1A抗原、KSA、EGP40、GA733-2、ks 1-4和esa)。EpCAM是由单层上皮的细胞和由此衍生的肿瘤细胞表达的表面糖蛋白。尽管EpCAM分子在来自健康组织的细胞的表面上呈现，但它在恶性组织中的表达是上调的。EpCAM以定向和高度有序的方式附着于上皮细胞(Litvinov，J Cell Biol.1997，139，1337-1348)。来自在它们的上皮细胞上表达人类EpCAM的转基因小鼠和大鼠实验的数据表明，正常组织上的EpCAM可能不能接近全身施用的抗体(McLaughlin，Cancer Immunol.Immunother.，1999，48，303-311)。在上皮细胞的恶性转化时，迅速生长的肿瘤细胞放弃了上皮细胞的高度细胞秩序。因而，EpCAM的表面分布变得较少地受到限制，该分子更好地暴露在肿瘤细胞上。由于它们的上皮细胞来源，来自大多数癌的肿瘤细胞仍然在它们的表面表达EpCAM。
过去，已经证明了EpCAM是癌症的单克隆免疫球蛋白治疗的有利靶点，特别是在具有可引起以后的实体转移因而恶化患者的预后的散布肿瘤细胞、具有最小的残余疾病的患者中。在具有最小的残余结肠直肠癌症的患者中，当在原发肿瘤的手术后四个月内五次剂量全身施用时，与未治疗的患者相比，特异于EpCAM分子的鼠单克隆免疫球蛋白降低了5年死亡率30％(Riethmüller，Lancet 343(1994)，1177-83)。更近一些，已经报道了在约40％的乳腺癌患者中的强烈的EpCAM过量表达，并与不良的总体和无疾病存活有关(Spizzo et al.，Int.J.Cancer 98(2002)，883-8)。最近，在3,722名患者中分析了EpCAM表达。发现，EpCAM表达在上皮细胞肿瘤中是非常普遍的，已经在超过88％的肿瘤样品中观察到这种表达。具体地，在94.1％的卵巢癌中、94％的结肠癌、92.3％的胃癌、90.1％的前列腺癌和70.9％的肺癌中观察到EpCAM表达。
识别EpCAM的(鼠)单克隆抗体的一个实例是Edrecolomab(Panorex)(Koprowski，Somatic Cell Genet.1979，5，957-971 andHerlyn，Cancer Res.，1980，40，717-721；该全文引入本文作参考)。然而，在结肠癌的辅助免疫治疗期间，第一次施用Panorex引起魏格纳氏肉芽肿病(Wegener′s granulomatosis)的发生和恶化，表明Panorex应当在患有自身免疫性疾病的患者中谨慎应用(Franz，Onkologie 2000，23，472-474；该全文引入本文作参考)。Panorex的局限在于快速形成人类抗小鼠抗体(HAMA)、通过它的鼠IgG2a Fcγ受体与人类免疫效应机制相互作用的能力受到受限和在循环中的短半衰期(Frodin，Cancer Res.，1990，50，4866-4871；该全文引入本文作参考)。此外，在患者中重复注射时，鼠抗体引起速发型变态反应和过敏反应(Riethmüller，Lancet 1994，343，1177-1183，Riethmüller，J Clin Oncol.，1998，16，1788-1794 and Mellstedt，Annals New York Academy of Sciences 2000，910，254-261；它们的全文引入本文作参考)。
ING-1是另一种已知的抗EpCAM免疫球蛋白(Lewis，Curr.Op.Mol.Ther.5，433-6，2003；通过完全引用来合并)。ING-1是小鼠-人类嵌合IgG1免疫球蛋白，当前处于患有进展的上皮细胞瘤的患者的I/II期临床的研究中。虽然在已经预先注射人类肿瘤细胞的小鼠中发现1mg/kg的免疫球蛋白剂量提供了最大的效果，但这个剂量在2名患有腺癌的人类患者中都引起了胰腺炎(腹痛伴有淀粉酶和脂肪酶升高)，使进一步的剂量提高变得不可能。每3周静脉内施用时，发现ING-1的MTD仅为0.3mg/kg体重。考虑到ING-1的半衰期在这个剂量是约31小时，假定平均的成年人体重75kg，有约4.25升血液，21天后(即，16.25个半衰期后)的ING-1血清水平将降低到7×10-5μg/mL血液，比最大细胞溶解效果所需的1μg/mL血清水平还低四个数量级以上。因此ING-1的MTD妨碍了抗EpCAM免疫球蛋白的必需血浆波谷水平的维持。
因此，目前存在着涉及抗EpCAM抗体的癌症治疗方案的需求。相应地，本发明的目的是提供克服了以上所列诸多问题的涉及抗EpCAM免疫球蛋白的治疗方案。
发明概述一种通过向患者施用特异性结合人类EpCAM抗原的人免疫球蛋白在人类患者中治疗肿瘤疾病的方法符合了上述需求，所述免疫球蛋白展现出至少15天的血清半衰期，所述方法包括以不超过每周一次的频率施用所述免疫球蛋白的步骤。
通过使用具有至少15天的血清半衰期的抗EpCAM免疫球蛋白可实现几个有益的效果。最重要的，这种相对长的血清半衰期意味着，作为发明方法的一部分施用的抗EpCAM免疫球蛋白将不会象具有较短半衰期的其它免疫球蛋白，比如以上讨论的IMG-1那样快速地从血液中清除。然后假定，满足用于本发明的方法的免疫球蛋白条件的抗EpCAM免疫球蛋白和不满足这些条件的抗EpCAM免疫球蛋白同时并且以相同的绝对数量施用给人，在给定时间之后，与后一种免疫球蛋白相比，将有更多的前一种免疫球蛋白维持在血清中。在相反的意义上，与较短半衰期的其它抗EpCAM相比，血清中提高的存留容许一次施用较少的在本发明方法中使用的抗EpCAM免疫球蛋白，而仍然维持一定的预定血清波谷水平，即，确保了治疗试剂的总血清浓度从不低于被确定为在两次连续施用之间保持效力所必需的最低水平。这具有有益的效果，在任何给定剂量中需要应用较少的本发明的方法的抗EpCAM免疫球蛋白，从而消除了任何有害和/或有毒的副作用的可能性或至少缓解了任何有害和/或有毒的副作用。
在本发明的方法中使用的抗EpCAM免疫球蛋白的相对长的半衰期还意味着，施用不必过于频繁地进行，从而提高了患者的生活质量并降低了治疗的总成本。
用于本发明的方法的抗EpCAM免疫球蛋白是人免疫球蛋白，这降低了或甚至消除了由患者的免疫系统针对施用的免疫球蛋白产生的非期望免疫反应的可能性。因为当在治疗中使用许多鼠的或甚至鼠-人嵌合免疫球蛋白分子时观察到的与人抗小鼠抗体(“HAMAs”)有关的这种问题，根据本发明的方法不构成问题。
不受理论的限制，发明人相信，在本发明的这个方面中使用的抗EpCAM免疫球蛋白在体内根据两种不同机制中的至少一种引发了治疗效果。一种机制被称为抗体依赖性细胞毒性(“ACDD”)。在ADCC中，包被了免疫球蛋白的细胞(“目标细胞”)被具有Fc受体的细胞(“效应细胞”)杀伤，所述Fc受体识别包被所述目标细胞的免疫球蛋白的Fc部分。在大多数情况下，参与ADCC的效应细胞是天然杀伤(“NK”)细胞，这些细胞在它们的表面带有Fc受体FcγRIII和/或分子CD16。这样，仅包被有免疫球蛋白的细胞被杀伤，因此细胞杀伤的特异性直接与包被这种细胞的免疫球蛋白的结合特异性(在此为EpCAM)有关。
在本发明的这个方面中使用的免疫球蛋白引发治疗效果的另一种机制称为补体依赖性细胞毒性(“CDC”)。在CDC中，在目标细胞的表面上两个相同的免疫球蛋白结合到两个相同的抗原(例如，在此的EpCAM)，从而它们各自的Fc部分变得相互接近。这种情况吸引了补体蛋白，例如它们之中的补体蛋白c1q和c3和c9，后一种在目标细胞上产生孔洞。目标细胞被这种穿孔杀死。同时，目标细胞在称为调理作用(opsonization)的过程中在它/它们表面上的其它位置被装饰。这种装饰吸引了效应细胞，然后效应细胞以类似于在ADCC机制的上下文中所描述的方式杀死目标细胞。
凭借根据本发明的这个方面的方法中使用的免疫球蛋白的长半衰期，与使用具有较短半衰期的抗EpCAM免疫球蛋白相比，可以更长时间和更高水平地利用上述机制的一种或两种的益处。
根据本发明的这个方面，以不超过每周一次的频率向患者施用抗EpCAM免疫球蛋白，优选的不超过每两周一次的频率。在这点上，利用了抗EpCAM免疫球蛋白的长血清半衰期的优点。在每周进行一次施用的情况下，在任何一次施用仅需要少量的免疫球蛋白，因为超过一半的早先施用的免疫球蛋白将仍然存留在患者的血液中。这是因为一周时间小于早先施用的免疫球蛋白的约15天的半衰期。
在每两周进行约一次施用的情况下，根据发明方法的给药频率大约相应于免疫球蛋白的半衰期。因而，在两次连续施用之间的间期中该免疫球蛋白的血清水平从不会减少到超过紧随相应前次施用后数量的约二分之一。这意味着，任何给定施用的剂量不必高于一定的数量，所述数量是在施用之后立即产生下一次施用之时达到的预定血清波谷水平的约两倍所需的量。
一般地，人们可以定义两个施用阶段首先的“加载阶段”，在其中施用一次或多次加载剂量以达到某个稳定的免疫球蛋白血浆水平，和随后的“维持阶段”，在其中施用多次维持剂量以维持期望的免疫球蛋白血浆水平。与后来的维持剂量相比，加载剂量一般以更高的量和/或更频繁地连续施用，因而使得加载阶段的持续时间达到最小。
与本发明方法不同，按照当前的给药方式，执业医生面临两个选择要么以足够高的初始量施用抗EpCAM免疫球蛋白，以在它从身体快速清除之后确保在下一次施用之前维持血清波谷水平(在这种情况下，高的初始剂量可能引起有害和/或有毒的副作用，例如胰腺炎)；要么以足够低的量施用抗EpCAM免疫球蛋白，以避免有害和/或有毒的副作用(在这种情况下，抗EpCAM免疫球蛋白的血清水平在下一次施用之前降至低于血清波谷水平，引起治疗效果的损失)。折中方案是提高低剂量施用的频率，引起患者生活质量的重要的损失。
相反，根据本发明的这个方面的方法在其中取得了平衡，一方面，可以以不引起有害和/或有毒的副作用的量施用各个剂量(individual doses)，另一方面，在血清中的治疗性免疫球蛋白的量不降低到低于在连续的施用之间维持治疗效果所需的血清波谷水平。在两次连续施用之间的至少约一周、优选的在两次连续施用之间的至少约两周的节奏，容许这种平衡，而不过度地损害患者的生活质量。
根据本发明的一个实施方式，在进行下一次施用之前在患者的血液中检查到来自前次施用仍然存在的抗EpCAM抗体血清水平。这样，例如，如果在患者的血液中仍存有来自前次施用的充足的抗EpCAM免疫球蛋白的情况，执业医生可以避免过早地再次施用抗EpCAM免疫球蛋白。对于确切半衰期仍然未知的抗EpCAM抗体，这样可以避免可能引起有害和/或有毒的副作用的偶然的给药过量。同时，根据这种间期测量，执业医生获得了关于所使用的抗EpCAM免疫球蛋白的清除率的宝贵认识，所述间期测量在任何情况下在相应的前次施用之后的至少两周进行。在精密调整进一步的施用计划时这种认识是宝贵的。在连续的施用之间，这种精密调整可以有利地使等待时间明显长于一周，或优选地长于约两周，从而进一步提高了患者的生活质量。
有利地，患者血液中抗EpCAM免疫球蛋白的血清水平的这种间期检查，可以按以下方式进行。首先，执业医生可以确定，在相应的最后一次施用所述免疫球蛋白后的至少一周但先于相应的下一次施用所述免疫球蛋白的一段时间之后，仍存在于所述患者的血液中的所述免疫球蛋白的血清水平，从而获得所述血清蛋白的中间血清水平值。然后将所述免疫球蛋白的这个中间血清水平值与所述免疫球蛋白的预定血清波谷水平(predetermined serum trough level)相比较。如果发现所述免疫球蛋白的中间血清水平值大大高于所述免疫球蛋白的预定血清波谷水平，则执业医生可以有利地选择更久地等待抗EpCAM免疫球蛋白的血清水平进一步降低。在这时，可以重复上述步骤以获得所述免疫球蛋白的新的中间血清水平，然后其将降低到一个接近预定血清波谷水平的值。在任何情况下，人们不应等待太久，以至测定的免疫球蛋白的中间血清水平降至低于该免疫球蛋白的预定血清波谷水平。可能通过等待、测定中间血清水平、并将该中间血清水平与特定抗EpCAM免疫球蛋白的预定血清波谷水平比较的重复循环，当执业医生确定了这个免疫球蛋白的中间血清水平已经降低到所述血清波谷水平的一定百分比之内时，可以进行相应下一次的抗EpCAM免疫球蛋白施用，来使抗EpCAM免疫球蛋白的血清水平回升到合适的水平，用以下一轮的清除。有利地，对于所使用的特定抗EpCAM免疫球蛋白，这种一定百分比可以相当于超过预定血清波谷水平的15％、优选的10％、最优选5％之内的血清水平。
有利地，可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法，例如通过免疫测定来测量中间免疫球蛋白血清水平。例如，为此目的可以使用免疫荧光分析、放射性免疫分析或酶联免疫吸附分析—ELISA分析，后者是优选的。
在本发明的这个方面的优选的实施方式中，以不超过每两周一次的频率施用人类抗EpCAM免疫球蛋白。在特别的优选的实施方式中，施用以两周的间隔进行，其中每个后续剂量在数量上与施用的第一个剂量相等，即，所有剂量都制成相同的量。这样的施用足以维持免疫球蛋白的血清水平，其从不降低到低于该免疫球蛋白的有益治疗效果所需的预定血清波谷水平，而同时避免了、或基本上避免了有害和/或有毒的副作用。
然而，在另一个实施方式中，还预想了超过、或远远超过两周的施用频率是可能的。在以大于两周的时间间隔施用免疫球蛋白的情况下，在初始剂量之后的任何时候施用的抗体的量应当大于初始剂量，所述初始剂量是指望两周内的随后的施用而设计的。超过两周后施用的后续剂量的数量可以大于两周后施用的剂量，这可根据病例的不同而不同，例如，通过药物动力学模拟(例如，用WinNonlin 4.0.1(Pharsight Corporation，USA；2001)，例如在附随上述说明的实施例中所描述的那些方法来确定。本领域的普通技术人员知道如何构建和/或应用这种模拟。有利地构建这种模拟，从而在相应的施用之后，患者的血清中抗EpCAM免疫球蛋白的水平不被容许降低到低于被确定为治疗效力所必需的血清波谷水平。
人类抗EpCAM免疫球蛋白的长血清半衰期确保了，在施用之间的这个更长的时期，比方说三周甚至四周或2到5周内的任何中间时期，维持了治疗效力所需的预定血清波谷水平。换句话说，人类抗EpCAM免疫球蛋白的长的血清半衰期(即，约15天)确保了自相应的前次施用以来显著数量的这种免疫球蛋白仍存在于血清中。结果，与没有这种长血清半衰期的抗体所必需的相比，只需应用较少的具有约15天半衰期的人类抗EpCAM免疫球蛋白。这降低了有害和/或有毒的副作用的风险。
应当注意到，对具有短半衰期的抗EpCAM免疫球蛋白(例如，对于抗EpCAM免疫球蛋白ING-1，已经测量了它在人类中的血清半衰期为17到31小时)，在仍然维持治疗效果时，这种延长的施用方案和与此相关的多种益处(参见上文)是不可能的。为了确保这种抗EpCAM免疫球蛋白的至少预定血清波谷水平的数量留存在血清中直到之后的施用，施用了太多的抗EpCAM免疫球蛋白以至很可能遭遇有害和/或有毒的副作用。另一方面，通过施用较少的这种短寿命的抗EpCAM免疫球蛋白来避免这种有害和/或有毒的副作用，当在血液中留存的免疫球蛋白的数量降至低于血清波谷水平时，将在两次施用之间的某个时点引起治疗效果的丧失。
当然，如果确定了临床的必需性或益处，具有约15天半衰期的人类抗EpCAM免疫球蛋白可以在进一步的实施方式中以低于两周的时间间隔施用，比方说1周的间隔或从1周到2周的任何中间的时间。虽然这种情况没有完全地利用约15天的长血清半衰期，仍然存在着期望这样的施用的临床状况。为了避免在患者中随着时间的人类抗EpCAM免疫球蛋白的不需要的积累，在此优选的是，相对于以双周节奏施用所需的数量，降低在这种较短间隔中施用的人类抗EpCAM的数量。不足两周后施用的后续剂量的量必须少于两周后施用的剂量，这可以根据不同的病例而确定，例如，通过药物动力学模拟，例如在附随上述说明的实施例中所描述的那些方法来确定。本领域的普通技术人员知道如何构建和/或应用这种模拟。有利地构建这种模拟，从而在相应的施用之后，患者的血清中抗EpCAM免疫球蛋白的水平不被容许降低到低于确定为治疗效力所必需的血清波谷水平。
根据一个实施方式，施用可以是静脉内的、腹膜内的、皮下的、肌肉内的、表面的(topical)或皮内的。做为选择，可以合适的使用这些施用方法的组合。进一步设想的是与其它化合物的联合应用方案，其它化合物例如，通过T细胞起作用的双特异性抗体构建体、靶向的毒素或其它化合物，或通过其它机制起作用的其它化合物，例如抗肿瘤试剂。联合施用抗EpCAM免疫球蛋白的临床方式可以包括同时的、在其它成分之前或之后的联合施用。
有利地，所述肿瘤疾病选自乳腺癌、上皮癌、肝细胞癌、胆管细胞癌症、胃癌(stomach cancer)、结肠癌、前列腺癌、头和颈部癌症、皮肤癌(黑素瘤)、泌尿生殖道的癌症、例如，卵巢癌癌、子宫内膜癌、宫颈癌和肾癌；肺癌、胃癌(gastric cancer)、小肠的癌症、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌症、食道癌、催涎腺的癌症或甲状腺的癌症。
在另一个实施方式中，所述疾病也可以是最小的残余疾病，优选早期实体肿瘤、进展的实体肿瘤或转移性的实体肿瘤，其特征在于由单个细胞的存活引起的肿瘤的局部或非局部的复发。
在本发明的这个方面的特别优选的实施方式中，所述肿瘤疾病是前列腺癌或乳腺癌。在此，特别优选的是，施用的人类抗EpCAM免疫球蛋白是包含具有SEQ ID NO1所列氨基酸序列的免疫球蛋白重链和具有SEQ IDNO2所列氨基酸序列的免疫球蛋白轻链的抗EpCAM免疫球蛋白。当施用这种人类抗EpCAM免疫球蛋白时，优选的是它以1-7mg/kg体重的相应剂量数量、更优选2-6mg/kg体重每两周约一次地施用。
本发明的进一步的方面提供了与人类EpCAM抗原特异性结合的人免疫球蛋白的用途，所述免疫球蛋白展现出至少15天的血清半衰期，该免疫球蛋白用于制备治疗肿瘤疾病的药物。做为选择，包含这种免疫球蛋白的组合物也可以用于制备上述的药物。然后可以根据上文阐述的给药计划有利地施用所述药物用于肿瘤疾病的治疗方法。
根据本发明的这个方面的一个实施方式，制备的药物适合于通过静脉内的、腹膜内的、皮下的、肌肉内的、表面的或皮内的途径施用。做为选择，可以通过视情况组合超过一种的这些途径来进行施用。进一步设想的是与其它化合物的联合施用方案，其它化合物例如，通过T细胞起作用的双特异性抗体构建体、靶向的毒素或其它化合物，或通过其它机制起作用的其它化合物，例如抗肿瘤试剂。联合施用抗EpCAM免疫球蛋白的临床方式可以包括同时的、在其它成分之前或之后的联合施用。
有利地，所述肿瘤疾病是乳腺癌、上皮癌、肝细胞癌、胆管细胞癌症、胃癌、结肠癌、前列腺癌、头和颈部癌症、皮肤癌(黑素瘤)、泌尿生殖道的癌症，例如，卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、和肾癌；肺癌、胃癌、小肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌症、食道癌、催涎腺的癌症、或甲状腺癌症。
在另一个实施方式中，所述疾病也可以是最小的残余疾病，优选早期实体肿瘤，进展的实体肿瘤或转移性的实体肿瘤，其特征在于由单个细胞的存活引起的肿瘤的局部或非局部的复发。
在进一步的方面，本发明涉及与人类EpCAM抗原特异性结合的人免疫球蛋白，特征是在向人类患者施用之后所述免疫球蛋白展现出至少15天的血清半衰期。在治疗肿瘤疾病的方法中这种抗体的用途的描述中，在上文已经详细说明了与这种长的血清半衰期有关的益处。优选的是所述免疫球蛋白展现出20天、19天、18天、17天、16天或15天的血清半衰期。特别优选的是约15天的血清半衰期。
根据本发明的优选的实施方式，所述人免疫球蛋白的半衰期是15天，并且所述人免疫球蛋白包含具有SEQ ID NO1中所列氨基酸序列的免疫球蛋白重链和具有SEQ ID NO2中所列氨基酸序列的免疫球蛋白轻链。
本发明的进一步的方面提供了包含如上所述的人类抗EpCAM免疫球蛋白的组合物。可以有利地将这种组合物施用给人类患者作为治疗疾病的治疗方案的一部分。考虑到在肿瘤疾病中EpCAM分子的表达的普遍性(prevalence)，特别优选的是可以施用这种组合物作为目的在于治疗这样的肿瘤疾病的治疗方案的一部分。可以通过施用根据本发明的这个方面的这种组合物来有利地治疗的肿瘤疾病包括乳腺癌、上皮癌、肝细胞癌、胆管细胞癌症、胃癌、结肠癌、前列腺癌、头和颈部癌症、皮肤癌(黑素瘤)、泌尿生殖道的癌症，例如，卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、和肾癌；肺癌、胃癌、小肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌症、食道癌、催涎腺的癌症、或甲状腺的癌症。
在另一个实施方式中，所述疾病也可以是最小的残余疾病(minimalresidual disease)，优选早期实体肿瘤，进展的实体肿瘤或转移性的实体肿瘤，其特征在于由单个细胞的存活引起的肿瘤的局部或非局部的复发。
包括在本发明这个方面之内的是，本发明的治疗方案可以治疗单一的肿瘤疾病或肿瘤疾病的组合，例如可以治疗由于原发肿瘤疾病的转移性传播引起的一种或多种继发的肿瘤疾病。
如在此使用的，术语“抗体”、“抗体分子”、“免疫球蛋白”和“免疫球蛋白分子”理解为是等同的。在合适的地方，任何复数的使用都隐含了单数，任何单数的使用都暗含了复数的含义。
附图的简要说明以下附图形成了本说明书的一部分，被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考一个或多个这些附图并结合在此提供的特定实施方式的详细说明，可以更好地理解本发明。
附

图1I期各群组(或称为组，cohort)的给药计划附图2每个群组中与时间相对应的抗EpCAM免疫球蛋白的血浆浓度附图3在抗EpCAM免疫球蛋白的单次给药之后患者群组的药物动力学参数附图4在抗EpCAM免疫球蛋白的多次给药之后患者群组的药物动力学参数附图5三分区模型(three-compartment model)的示意图附图6具有30μg/mL的目标波谷水平的抗EpCAM免疫球蛋白的波峰和波谷血浆水平附图7具有10μg/mL的目标波谷水平的抗EpCAM免疫球蛋白的波峰和波谷血浆水平附图8A-F表达EpCAM的组织的免疫组织学染色附图9在患有各种肝脏疾病的患者中EpCAM半定量组织学分值的中值发明的详细说明以下实施例被包括在本发明内以说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解，实施例在以下描述了本发明人公开的技术，在实施例中公开的技术能够很好地实施本发明，因此可以认为实施例构成了用于实践本发明的优选方式。然而，本领域的技术人员根据当前公开的内容应当理解，可以在公开的特定的方案中进行许多变化，在不离开本发明的精神和范围的情况下仍获得同样的或相似的结果。
实施例1在I期研究中测量的药物动力学的结果群组。在具有激素难治的前列腺癌的患者中，在14天的时间间隔两次单一静脉内输注之后，研究了特征为SEQ ID NO1和2的抗EpCAM免疫球蛋白(下文称“抗-EpCAM”)的药物动力学。施用的剂量是10、20、40、64、102、164和262mg/m2体表面积。在第1天和第15天在每个剂量水平处理两名或三名患者。在从第1天到第70天(第二次施用后56天)的29-31个采样时点采取血液样品。通过特异性ELISA方法测量抗EpCAM的血清浓度。ELISA被构建为典型的三明治样夹心ELISA，在其中大鼠抗-抗EpCAM抗体用作俘获抗体，鸡抗-抗EpCAM抗体用作检测抗体(如Sambrook，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press中所描述的)。用于I期患者群组的给药方案在附图1中示出。在附图1的第3栏中符号“～”表示计算的剂量值，单位是mg/kg，是平均剂量(采用各个群组中的患者数目)除以平均体重(也采用各个群组中的患者数目)的结果。因而，各个剂量值代表两个平均值的商。
血清浓度。在抗EpCAM的两次单独的静脉内的输注之后在单个患者中测量抗EpCAM的血清水平(来自2-3次测定的平均值±SD)。单个群组中的个体分布型的对比在附图2中示出。在以14天的时间间隔两次单独的静脉内输注之后从患有激素难治的前列腺癌的患者的所有剂量组获得的平均浓度/时间分布型(算术平均值)在附图2中示出。
简化的剂量方案。患者接受个人化的剂量，其按照mg抗EpCAM/m2体表面积计算。由于一个剂量组中不同患者观察到的血清分布型的一致性，分析了剂量方案的简化是否是可行的。为了这个目的，将群组5、6和7的分布型标准化为相等的500mg总剂量，根据血清水平的变异性比较结果。
对于9名患者，剂量正常化到500mg总剂量引起血清水平改变了26.6％的平均系数(％CV)。变异系数从14.8到67.3％，在较低的血清水平观察到了最高的变异。根据这些结果，将剂量方案简单化到总剂量认为是可行的。
药物动力学非分区评估(Non-Compartmental Evalation)。在第一次静脉内输(单次剂量)注抗EpCAM之后，为患有激素难治的前列腺癌的所有七个群组的患者计算的主要药物动力学参数(算术平均数)的总结在附图3中示出。在第14天第二次静脉内施用(多次剂量)之后抗EpCAM的主要药物动力学参数(算术平均数)在附图4中示出。
附图3和4中使用的术语的定义如下。Cmax是指最大(测量的)浓度。AUCτ是指从第14到28天(多次剂量)用梯形规则(trapezoidal rule)计算的一个剂量间隔中(τ＝14天)观察到的浓度/时间曲线下的面积(AUC)。AUCINF是指使用梯形规则根据公式AUC∞＝AUCz+Cz/ke计算的从0小时到无穷大的AUC。t是指平均表观末端半衰期(mean apparent terminalhalf-life)(ln2/λz)，其中术语“平均”是指多个测定的血清半衰期值的平均数；术语“表观”是指将曲线拟合外推至选定的药物动力学值到无穷大的时点，从而在患者血清中的免疫球蛋白的数量在无穷大的时间衰减到接近零；术语“末端”是指这个无穷大的时点。参数τ是用作恒定的倍增系数(constantmultiplication factor)的标准药物动力学参数，参数z表示任何时点z。Clss是指总体的身体清除，根据公式剂量/AUC来计算。Vss是指分配的表观容积(apparent volume of distribution)。Vz是指分配的平均容积。CL是指清除的平均容积。
在单次剂量之后平均表观末端半衰期(t)测定为6.72±0.88天(从7-14天计算)，在多次剂量施用后为14.74±4.23天(从最后三个采样点计算，即，28-42天或35-70天)。不同的半衰期值是由于第二剂量之后的明显更长的观察期，由于曲线拟合良好度的提高，测量的值越久，测出的半衰期值变得越精确。因而，14.74±4.23天的t值代表了更精确的t值，因为它是在很长的时间段上测量的。
在第一次施用之后，测出了10.4L的Vz和1.1L/天的清除平均容积。这些数据正与对第二剂量计算的结果相符合，为11.5L的平均Vz和1.0L/天的清除平均容积(CL)。此外，在所有剂量组中这些数据是很好地可比较的(变异系数从8.2％到14.8％)。结果，对于参数Vz和参数CL都没有观察到剂量依赖性。
剂量线性。确定了关于参数Cmax、AUClast(0-14)/AUCτ(14-28)和AUCinf的相互关系。对于所有参数(Cmax、AUClast(0-14)/AUCτ(14-28)和AUCinf)，人们可以推定在研究的剂量范围内的剂量线性增加。
药物动力学分区评估。
分区分析基于需要药物恒定输注的两种不同的模型。对于最佳分区的模型的评定，选择了从群组6获得的关于平均浓度对比时间的数据。对于两种评估，因为施用之后更长的观察期，采用了第二剂量之后的分布型。
为了研究最佳拟合，采用了以下的分区模型●2-分区评估●3-分区评估对于两种模型，评估是可能的，然而，用3-分区分析获得了明显更好的拟合。在3-分区分析之后，在观察的Y和预测的Y之间的相合性(congruence)显著更好。为此，所有进一步的评估都根据这种3-分区模型来进行。
在患者中静脉内短期输注10、20、40、102、164和262mg/m2体表面积之后，研究了抗EpCAM的药物动力学。每个群组处理两名或三名患者。在42或70天的时间段采取血液样品。通过ELISA方法测量抗EpCAM的血清浓度。可以对所有患者获得和评估直至第42或70天的完整血清分布型。
清除容积和分配容积没有显示剂量依赖性，在第一和第二剂量之后没有显示主要的差异。根据来自7个群组的数据，在研究的剂量范围中可以假定参数Cmax、AUCτ1和AUClast的剂量线性。
分区分析显示了0.565天(ta)、3.78(tβ)和13.3天(tλz)半衰期的抗EpCAM血清浓度的三级下降。
如根据末端半衰期(约两周)所预料的，各自剂量方式的模拟产生了双周设计的最佳结果。每周剂量的模拟引起了积累，而每4周的施用引起了抗EpCAM血清水平的降低。考虑到尽可能快地达到目标波谷水平，建议了与维持剂量相比双倍剂量的加载剂量。
实施例2根据在I期研究中获得的测量数据来模式化抗EpCAM给药策略为这项研究选择的给药方案和治疗持续时间基于在患有前列腺癌的患者中抗EpCAM的I/II期临床研究的结果的药物动力学的模式化。模拟的目标是发现抗EpCAM的给药方案以分别达到10和30μg/mL的血清波谷水平。
根据临床前的实验，10μg/mL的血清波谷水平预计是对抗EpCAM的抗肿瘤活性有效的。然而，不能排除更高的剂量可能更有效。因此，将在临床试验中评估计算达到30μg/mL的血清波谷水平的第二剂量。这个血清波谷浓度预计没有另外的毒性，因为Cmax和AUC值没有超过I期临床研究中观察到的值。
由于更好的拟合，所有模拟都基于来自群组5到7的3-分区评估数据。
模拟的目标是考虑频率(每周、双周、每4周)、不同的波谷水平(10μg/mL、30μg/mL抗EpCAM)来评定最佳的施用方案和所需的剂量，并评估抗EpCAM的加载剂量的益处。
如对大约两周的末端半衰期值所预计的，双周的给药方案产生了最好的结果。采用7天和28天的施用频率，模拟分别产生了血清水平的积累或轻微的降低。加载剂量(LD)的应用引起了即时达到所需的波谷水平。对静脉内施用抗EpCAM，模拟了以下的剂量和相应的最小和最大血清水平。
每14天施用。如对抗EpCAM的末端半衰期所预计的，双周施用产生了具有恒定的Cmin和Cmax值的模拟的分布型，因而可认为是推荐的给药方案。因此，选择双周模型来计算产生10和30μg/mL目标波谷水平的抗EpCAM所需的剂量。
通过分区评估获得用于计算的初始参数。
●研究数据在前列腺癌I/II期研究中获得的药物动力学测量值●软件WinNonlin 4.0.1(Pharsight Corporation，USA；2001)●模型PK模型19(3区室IV输注，宏观常量(macro-constant)，无延迟时间，第一顺序消除(1st order elimination)，均匀加权)。
附图5是三分区模型的示意图，其中“1”代表中央分区，“2”和“3”代表两个不同的外围分区。中央分区处于与血浆的即时平衡中。在施用药物之后，外围分区需要一定时间来达到与中央分区的平衡。K13、K31、K12、K21、K10是各自的速度常数，其中数字13、31等等的排序表示抗EpCAM的通过方向。
虽然原始的研究数据限于70天的时间，将模拟延至120天的时间。模拟基于加载阶段(即，在第1、8和15天施用药物)和维持阶段(即，在第29天和此后每14天施用药物)●组A(低剂量)2mg抗EpCAM/kg体重每周的加载阶段(第1、8、15天)，之后是每到第二周2mg抗EpCAM/kg体重的23次维持剂量●组B(大剂量)6mg抗EpCAM/kg体重每周的加载阶段(第1、8、15天)，之后是每到第二周6mg抗EpCAM/kg体重的23次维持剂量。
这些研究中预定的剂量产生了药物动力学参数(即，Cmax和AUC)，它们没有超过I期研究中施用给患者最高剂量所测量到的那些。已经使用药物动力学模型计算了加载阶段和维持阶段，以在短期内达到目标血清波谷浓度并避免超过I期研究中所评定的值的最大血浆浓度。
附图6显示了包括加载阶段、目标血清波谷水平30μg/mL的、对于抗EpCAM的如上所述双周施用的模拟。附图7显示了包括加载阶段、目标血清波谷水平10μg/mL的、对于抗EpCAM的如上所述双周施用的模拟。
附图6和7显示了在120天的时间标度上各自的药物施用。可以看到波峰和波谷血清浓度，波峰水平由曲线的上部所呈现，波谷水平由曲线的下部所呈现。图表描述了分别达到10和30μg/ml的上述不同波谷水平的模拟。从附图中可看出，在两个模拟中，波峰和波谷血清浓度是不同的。
实施例3抗EpCAM毒性数据，与ING-1比较，外推法以下内容描述了各个患者群组观察到的有害事件(adverse event)(AE)。为了以下的目的，将AE定义为发生在施用药物的人体上、与这种治疗不一定具有因果关系的，在患者或临床研究中的任何不期望的医学现象。因此它可以是与使用研究的产品暂时相关的任何不利的和非期望的体征(包括异常的实验所见)、症状或疾病，不管是否认为与研究的产品有关。
有害的药物反应(adverse drug reaction)(即，研究者认为至少有可能与研究药物有关的AE)由研究者根据NCI通用毒性标准((NCT Common ToxicityCriteria)CTC，版本2.0)来分级。对于没有在NCI CTC表格中列出的有害药物反应，将遵循用于有害事件的严重度分级的一般性定义。因此，“轻微的”AE描述为患者很少可注意到的症状。它不影响患者的通常的活动或行为，和/或它没有临床的后果。“中度的”AE影响受试者的正常活动，足以使受试者不舒服。它具有某些临床后果；可能需要对症状进行治疗。“重度的”AE是引起重度的不适和可能是应当中止研究性治疗的这种严重度的事件。受试者通常不能工作或进行正常活动，和/或AE具有明确的临床后果。可能需要对症状的治疗。“严重有害事件”(SAE)定义为在任何剂量的任何不期望的医学现象导致死亡、危急生命、需要住院病人进行住院治疗或延长现有的住院治疗，引起持久性或重大的无力(disability)/无能力(incapacity)，或是先天异常/出生缺陷。
在治疗和在最后输注后28天的安全跟踪期期间，19名患者(95％)报告了与研究药物无关的总共120件有害事件(AE)。与较低剂量群组(群组1∶7；群组2∶9；群组3∶12；群组4∶7；群组5∶12)相比，群组6(38个事件))和群组7(35个事件)中报告了更多的有害事件。所述群组在附图1中列出，在以上的实施例1中已说明。
不考虑研究者对与研究药物关系的评定，最常见的治疗紧急性临床AE是体温增高(在所有患者的30％中报告)、恶心(30％)、发热(20％)、腹泻(15％)、疲劳(15％)、发冷(15％)和呕吐(15％)。不考虑研究者对与研究药物关系的评定，最常见的报告为有害事件的治疗紧急性实验室改变是升高的碱性磷酸酶(在所有患者的30％中报告)、淋巴细胞减少(30％)、升高的LDH(25％)、PTT降低(20％)、血红蛋白降低(20％)、WBC失调(15％)、糖尿(15％)和升高的转氨酶(15％)。
大多数有害事件是轻微的(70％)或中度的(25％)。在四名患者中报告了六起重度有害事件(级别3)如下在治疗前由中度(级别2)值的患者中升高的碱性磷酸酶；在患有已知糖尿病的患者中的糖尿；一名患者伴有降低的血红蛋白和RBC和体重降低；一名患者伴有椎间盘疝形成。调查员评定这些事件都不与研究药物相关。没有报告级别4事件。
在研究期间在4名患者中报告了四起严重有害事件(SAE)。有一起调查员认为可能与研究的药物有关在来自群组3(40mg/m2体表面积)的患者中由于第二次抗EpCAM输注之后级别1的发烧而延长住院治疗。
小鼠-人类嵌合的、高亲合性(KD2×10-9)抗EpCAM抗体ING-1的临床研究在1mg/kg的剂量引起胰腺炎。在清楚的MTD下这些有害事件是剂量依赖性的。可能的是，免疫球蛋白ING-1针对EpCAM抗原的亲合性与抗EpCAM相比高两个数量级，与ING-1观察到的毒性分布型有关。由于ING-1的MTD(1mg/kg)和在抗EpCAM方案中预定的最高剂量(6mg/kg)相似，可预料的是，以上研究的免疫球蛋白抗EpCAM具有显著更高的安全范围，可能是由于其低得多的亲合性。
实施例4疾病中的EpCAM表达为了评定在此描述的治疗方法的适用性范围，在许多不同疾病中研究了人类EpCAM抗原的表达。预料的是，本发明的方法可以有效地应用于任何疾病，在所述疾病中相对于给定组织的健康状态，在疾病状态下EpCAM表达升高。特别是，对于肝脏组织中的EpCAM抗原合成加以了特别的关注。
患者和组织。总共254个不同的肝脏组织样本通过EpCAM的免疫组织学和以下所列的相关形态学的参数进行表征。分析了不同的肿瘤样品，包括63例HCC、5例肝脏的胆管细胞癌和30例发育不良的节结(前恶性肝细胞的前兆损害)，以及5例正常的肝脏样本。33例活组织检查采自患有丙型慢性肝炎的患者，27例来自患有慢性乙型肝炎的患者，28例来自患有慢性酒精肝疾病(ALD)的患者；9名患者患有自体免疫性肝炎(AIH)。通过使用Menghini针进行活检来获得肝脏组织，对于HCC通过切除术或肝脏移出来获得。立即将组织固定在4％中性缓冲的甲醛中，根据标准方案进行处理。
形态学评估。根据用H&E染色的切片进行形态学评估(癌和慢性肝炎的分级)。HCC的分级如Nzeako et al.，Cancer 76，1995，579-88中所列的进行。如下对非肿瘤性肝脏疾病进行形态学评估通过使用如Ishak，Mod.Pathol.7，1994，690-713中描述的经修改的肝脏活动指数(hepatic activity index)来分析慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎的坏死性炎症的活动。
免疫组织学评估。使用所谓的ABC法和二氨基联苯胺作为发色团，如早先描述的(Prange et al.，J.Pathol.201，2003，250-9)进行免疫组织学。小鼠单克隆抗人类EpCAM抗体(克隆VU-1D9；Novocastra，Newcastle，UK)稀释1/50，并在30min的胰蛋白酶预处理(0.1％，pH 7.8)后应用。相应地进行cyclinD1(DCS-6；1∶100；DAKO，Hamburg，Germany)、p53(FL-393；1∶50；Santa Cruz，Santa Cruz，USA)和遍在蛋白(70458；1∶200；DAKO)的免疫组织学。进行阴性对照，包括省略原始抗体。
对于在HCC中EpCAM染色的评估，仅半定量地对强度进行了分级(0＝阴性，+(1)＝弱阳性，++(2)＝中度阳性，+++(3)＝强阳性(至少与胆管染色的强度相等))。如下对非肿瘤活检标本中EpCAM的肝细胞表达进行分级0＝无肝细胞染色；(+)(0.5)＝少数散布的阳性肝细胞，+(1)＝沿几个或大多数间隔或门静脉管道(septa or portal tract)的小群干细胞，++(2)＝环绕几个或大多数门静脉管道或间隔并发展到midacinar区域的大群阳性肝细胞，+++(3)＝广泛的肝细胞阳性，一般覆盖至少50％的肝小叶(acinus)。通过使用描述性统计学(平均值、中值、最大值、频率)和Spearman的相关系数来进行统计学评价。P＜0.05的水平被认为是显著的。
在HCC中EpCAM的新近表达(neo-expression)。正常的肝脏组织显示了所有胆管上皮细胞的强烈染色，而肝细胞是完全阴性的(数据未显示)。在63例分析的HCC中的9例(14.3％；附图8A-F)和在所有分析的肝脏的胆管细胞癌(n＝5)中，EpCAM的免疫组织学显示了特异性的膜染色(membranousstaining)。在HCC中，表达从弱到强烈，似乎在中度和不良分化的HCC中更常见，而仅一个良好分化的HCC是阳性的。在30例代表前恶性损害(pre-malignant lesion)的发育不良的节结中，仅3例显示了轻微的EpCAM表达。对相同组织分析了许多其它的肿瘤相关抗原，综合表达数据进行相关性分析。在HCC中EpCAM表达与p53和遍在蛋白的核积累之间存在着中度但是显著的正相关(p＜0.05)，但与被怀疑的上游调节物cyclin D1之间没有。
在慢性坏死炎症性肝脏疾病中EpCAM的肝细胞新近表达。在高百分比的被分析的非肿瘤肝脏组织中检测到肝细胞的特异性膜阳性(附图8C-E)。在患有慢性肝炎的情况中发现了显著的阳性(marked positivity)，在患有ALD的那些情况中发现的程度较低。此外，注意到所有小导管增殖的阳性，以及分散在门静脉周围的实质的单个小细胞的阳性(潜在的前体细胞)。肝细胞的阳性显示了强烈的门静脉周围的/间隔周围的(periseptal)优势度，在某些情况下达到了胆管染色的强度。在任何情况下在非实质肝细胞中存在EpCAM的非特异性反应性。
当分析半定量免疫组织分值的平均值和中值时(参见方法)，在有HBV感染(平均分值0.93；中值分值0.5；最大分值3；阳性EpCAM染色的频率(+/++/+++)55.6％；)、ALD(平均分值0.88；中值分值0.75；最大分值2.5；阳性EpCAM染色频率(+/++/+++)78.6％；)，和HCV-感染(平均分值0.86；中值分值0.5；最大分值3；阳性EpCAM染色的频率(+/++/+++)63.6％)的组织中EpCAM表达是最高的。患有AIH的患者具有中间的EpCAM染色(平均分值0.72；中值分值0.5；最大分值3；阳性EpCAM染色频率(+/++/+++)55.6％；)。在患有慢性的胆疾病PBC(平均分值0.13；中值分值0；最大分值0.5；阳性EpCAM染色的频率(+/++/+++)25.0％；)和PSC(平均分值0.04；中值分值0；最大分值0.5；阳性EpCAM染色的频率(+/++/+++)7.7％；)的患者中几乎没有肝细胞的EpCAM表达(附图9；在图右侧的标绘中显示了统计变量的说明)。
结论。针对肝纤维化的阶段以及坏死性炎症活动的组织学生化参数与EpCAM表达的相关性，对来自患有慢性肝病像慢性肝炎C病毒(HCV)和肝炎B病毒(HBV)感染、慢性自体免疫肝炎(AIH)、慢性酒精肝疾病(ALD)和肝细胞癌(HCC)的患者的组织样品进行半定量分析。在正常的成年人肝脏中是EpCAM阴性的肝细胞，在来自患有慢性肝病的患者的肝脏组织中显示了重新(de novo)EpCAM表达。在患有坏死性炎症性疾病(HCV和HBV肝炎、AIH、ALD)的患者中肝细胞的EpCAM表达是最高的。肝细胞的EpCAM表达与炎症性活动的组织学和生化参数和纤维化的程度显著地相关，在有HBV感染的患者中这是特别惊人的。此外，14.3％的HCC显示了肿瘤细胞上的EpCAM表达。
该结果表明，EpCAM的重新表达仅在一小部分肝细胞癌(HCC)中发生，但在慢性的坏死性炎症性肝脏疾病中的肝细胞上经常地发生。这种表达与疾病活性和纤维化正相关。具体地，已经证明了在慢性坏死炎症性肝脏疾病中的肝细胞EpCAM新近表达(neo-expression)与纤维化和坏死性炎症性活动的相关性。这些发现暗示了即将出现的治疗选择，例如靶向恶性肿瘤中的目标EpCAM的单克隆抗体，并且也可以适用于某些HCC。作为特定的结果，一部分HCC代表针对EpCAM的抗体治疗的有效目标。
实施例5使用“抗EpCAM”的II期研究中获得的患者数据证实药物动力学预测期望的是，使用从随后II期研究中获得的真实患者数据来证实根据药物动力学模型的预测的精确性(它们本身基于抗EpCAM的I期研究获得的药物动力学数据，参见上文的实施例1和2)，在所述II期研究中根据本发明施用抗EpCAM。这项II期研究是国际的、开放标记的(open-label)、多中心(multicenter)、随机化、具有两个平行处理组的II期研究。将参与抗EpCAMII期研究的患者随机分成两个组，第一组接受如以下说明施用的低剂量的抗EpCAM(2mg/kg体重)，第二组接受如以下说明的高剂量的抗EpCAM(6mg/kg体重)。在抗EpCAM II期研究的过程中，每名患者最初在加载阶段间隔一周接受抗EpCAM的三次加载剂量(各为2mg/kg体重或6mg/kg体重，取决于患者组)，继之以直至23次随后的抗EpCAM维持剂量(再次地，2mg/kg体重或6mg/kg体重，取决于患者组)，其中每两周施用单个维持剂量。
根据基于抗EpCAM I期研究数据的药物动力学预测，接受低剂量抗EpCAM的第一患者组的血清波谷水平预计将接近10μg/ml(与附图7所示的波谷水平相关)，而接受高剂量抗EpCAM的第二患者组的血清波谷水平预计将接近30μg/ml(与附图6所示的波谷水平相关)。
分析如下进行。用HD4A4(针对抗EpCAM的抗独特型抗体；5μg/ml体积100ml)包被96孔板，继之以阻断和洗涤步骤。添加刻度标准、质量控制样品和抗EpCAM的样品(100ml，以合适的稀释度)，继之以洗涤步骤。用生物素化的抗人IgG检测HD4A4结合的抗EpCAM，再次继之以洗涤步骤。添加链霉抗生物素蛋白(0.5mg/ml，体积100μl)，再次洗涤96孔板，在最后的步骤添加180μl的pNPP。用50μl 3M NaOH停止分析，在405和490nm在ELISA读取器上测量。以1∶100的关系进行低剂量样品的稀释。以1∶300的关系进行高剂量样品的稀释。结果在附图10中示出。
附图10用点描述了对来自低剂量组的一名患者测量的个体波谷水平(患者编号401001；数据点用正方形标明)和对来自高剂量组的另一名患者测量的个体波谷水平(患者编号101002；数据点用菱形标明)。连接各个患者的数据点的水平线的平均垂直水平代表了该患者观察到的血清波谷水平。因此，可以看出，高剂量患者101002的水平线(钻石形点)表明了抗EpCAM的波谷水平浓度与这个剂量的30μg/ml的预计值的良好一致性(比较附图6中的图表的连接预测的波谷的水平线)。同样地，低剂量患者401001的水平线(方形点)表明了抗EpCAM的波谷水平浓度与这个剂量的10μg/ml的预计值的良好一致性(比较附图7中的图表的连接预测的波谷的水平线)。
这些数据用抗EpCAM II期研究期间获得的真实患者数据证实了根据抗EpCAM I期研究期间获得的数据通过药物动力学模型预测波谷水平的精确性。因而，可以断定，药物动力学模型的假定和结果是正确的，根据本发明的治疗方式具有上文中详细说明的效果和益处。
**************在此公开和在此要求权利的所有组合物和方法可以根据当前的公开来制造和执行而不需过度的实验。虽然已经就优选的实施方式描述了本发明的组合物和方法，对本领域的技术人员显而易见的是，可以将各种变化应用于组合物和方法以及在此描述的步骤和步骤的顺序中，而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体地，显而易见的是，可以用化学上和生理学上都相关的某些试剂替换在此描述的试剂，而达到相同的或相似的结果。对于本领域的技术人员显而易见的所有这种相似的替换和修改都认为处在由附随的权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念之内。
序列表<110>米克罗麦特股份公司(Micromet AG)<120>抗EpCAM免疫球蛋白<130>MIC-022 PCT<140>未知<141>2005-02-09<150>US 10/778,915<151>2004-02-13<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>457<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗EpCAM重链<400>1Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Asp Met Gly Trp Gly Ser Gly Trp Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr100 105 110Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala115 120 125Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser130 135 140Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe145 150 155 160Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly165 170 175
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu180 185 190Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr195 200 205Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys210 215 220Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro225 230 235 240Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys245 250 255Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val260 265 270Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr275 280 285Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu290 295 300Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His305 310 315 320Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys325 330 335Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln340 345 350Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu355 360 365Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro370 375 380Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn385 390 395 400Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu405 410 415Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val420 425 430Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln435 440 445Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys450 455<210>2<211>214<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>抗EpCAM轻链<400>2Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asp Ile Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105 110Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala130 135 140Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln145 150 155 160Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165 170 175Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr180 185 190Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser195 200 205Phe Asn Arg Gly Glu Cys210
权利要求
1.一种通过向患者施用与人类EpCAM抗原特异性结合的人免疫球蛋白在人类患者中治疗肿瘤疾病的方法，所述免疫球蛋白展现出至少15天的血清半衰期，所述方法包括以不超过每周一次的频率施用所述免疫球蛋白的步骤。
2.权利要求1的方法，进一步包括(a)在相应的最后一次施用所述免疫球蛋白、但先于相应的下一次施用所述免疫球蛋白的至少一周的时间之后，测定仍存在于所述患者的血液中的所述免疫球蛋白的血清水平，从而获得所述血清蛋白的中间血清水平值；(b)将所述免疫球蛋白的所述中间血清水平值与预定的所述免疫球蛋白的血清波谷水平相比较；(c)任选地重复步骤(a)和(b)；(d)如果所述免疫球蛋白的中间血清水平值不高于超过所述血清波谷水平值以上15％、优选10％、最优选5％，进行相应的下一次施用。
3.权利要求1或2的方法，其中设置所施用的所述人免疫球蛋白的剂量的大小，从而，在两次相应施用之间的间隔时间结束时，维持在血清中的所述人免疫球蛋白的量从不降至低于预定的血清波谷水平。
4.权利要求1到3的任一项的方法，其中所述施用每两周进行一次，或其中所述施用频率低于每两周进行一次。
5.权利要求4的方法，其中所述施用每两周进行一次，并且所述人免疫球蛋白的施用剂量从一次施用到下一次保持不变。
6.权利要求4的方法，其中所述施用频率低于每两周进行一次，并且所述人免疫球蛋白的施用剂量和施用频率从一次施用到下一次保持不变。
7.权利要求5或6的方法，其中所述起始的和所有随后的剂量的大小通过药物动力学模拟来确定。
8.以上的权利要求的任一项的方法，其中所述施用是静脉内的、腹膜内的、皮下的、肌肉内的、表面的或皮内的。
9.以上的权利要求的任一项的方法，其中所述肿瘤疾病是乳腺癌、上皮癌、肝细胞癌、胆管细胞癌症、胃癌、结肠癌、前列腺癌、头和颈部癌症、皮肤癌(黑素瘤)、泌尿生殖道的癌症，例如，卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、和肾癌；肺癌、胃癌、小肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌症、食道癌、催涎腺的癌症、或甲状腺的癌症。
10.权利要求9的方法，其中所述肿瘤疾病是前列腺癌或乳腺癌，所述人免疫球蛋白以1到7mg每kg体重的剂量每两周一次地施用。
11.权利要求10的方法，其中所述人免疫球蛋白以2到6mg每kg体重的剂量每两周一次地施用。
12.以上的权利要求的任一项的方法，其中所述人免疫球蛋白包含具有SEQ ID NO1中所列氨基酸序列的免疫球蛋白重链和具有SEQ ID NO2中所列氨基酸序列的免疫球蛋白轻链。
13.与人类EpCAM抗原特异性结合的人免疫球蛋白，特征是在向人类患者施用之后所述人免疫球蛋白展现出至少15天的血清半衰期。
14.权利要求13的人免疫球蛋白，其中所述血清半衰期是20、19天、18天、17天、16天或15天。
15.权利要求13或14的人免疫球蛋白，其中所述半衰期是15天，并且所述人免疫球蛋白包括具有SEQ ID NO1中所列氨基酸序列的免疫球蛋白重链和具有SEQ ID NO2中所列氨基酸序列的免疫球蛋白轻链。
16.包含权利要求13-15任一项的人免疫球蛋白的药物组合物。
17.与人类EpCAM抗原特异性结合的人免疫球蛋白用于制备治疗肿瘤疾病的药物的用途，所述人免疫球蛋白展现出至少15天的血清半衰期，所述药物被配制为用于以不超过每周一次的频率施用。
18.权利要求17的用途，其中所述药物被配制为以不超过每两周一次的频率施用。
19.权利要求17或18的用途，其中所述药物被配制为每两周施用，并且所述人免疫球蛋白的施用剂量从一次施用到下一次保持不变。
20.权利要求17-19任一项的用途，其中所述药物被配置为以不超过每两周一次的频率施用，设置所施用的所述人免疫球蛋白施用剂量，从而，在两次相应施用之间的间隔时间结束时，维持在血清中的所述人免疫球蛋白的量从不降至低于被确定为治疗效力所必需的血清波谷水平。
21.权利要求17-20任一项的用途，其中所述药物被配制为用于静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、表面或皮内施用的药物。
22.权利要求17-21任一项的用途，其中所述肿瘤疾病是乳腺癌、上皮癌、肝细胞癌、胆管细胞癌症、胃癌、结肠癌、前列腺癌、头和颈部癌症、皮肤癌(黑素瘤)、泌尿生殖道的癌症，例如，卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、和肾癌；肺癌、胃癌、小肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌症、食道癌、催涎腺的癌症、或甲状腺的癌症。
全文摘要
本发明特别涉及通过向患者施用特异性结合人类EpCAM抗原的人免疫球蛋白来治疗人类患者中肿瘤疾病的方法，所述免疫球蛋白呈现至少15天的血清半衰期，所述方法包括以不超过每周一次、优选以不超过每两周一次的频率施用所述免疫球蛋白的步骤。
文档编号A61P35/00GK1976951SQ200580009976
公开日2007年6月6日 申请日期2005年2月9日 优先权日2004年2月13日
发明者马尔特·彼得斯, 马赛厄斯·洛彻, 纳德贾·普朗, 科尼利亚·奎特 申请人:米克罗麦特股份公司