番茄提取物的治疗用途的制作方法

专利名称：番茄提取物的治疗用途的制作方法
番茄提取物的治疗用途 本发明涉及用于预防静脉血栓形成的组合物。
背景技术：
静脉血栓形成，即在静脉中形成血块，每年造成大量的死亡，并且代
表着世界范围内的重要的健康问题(Lopez, J. A., Kearon, C.， Lee, A. Y.Y. (2004). Deep Venous Thrombosis (深静脉血栓形成).//emato/ogy (血液学) 2004: 439-456)。
涉及静脉血栓形成的主要的临床疾病包括深静脉血栓形成(DVT)和肺 栓塞。DVT是这样的疾病，其中在深静脉中形成血块，例如在腿或胳膊中 深静脉或在下腹部的深静脉中形成血块。估计每年在英国每1000人中有 约1-3人发展了 DVT。在DVT的大多数情形中，所述血块很小并且不会 引发任何症状。身体能够分解这些血块，因此不会存在长期问题。但是， 在许多情形中，血块较大并且因此可以部分或完全的阻断静脉中的血流， 导致围绕静脉的肌肉(例如腓肠肌)的肿胀和肌肉的疼痛。在一些情形中， 血块的块可以分解，并且随血流到肺中，在那里其形成肺栓塞阻断肺中的 血流，这可能会导致胸痛，呼吸短促或甚至在严重的情形中引起死亡。
己经充分意识到一些危险因子，其使DVT更可能在个体中发生并且 这些包括年老，持续很长时间的不运动，肥胖症，最近的外科手术，伤害 如骨折，使用口服避孕药物，激素替代疗法，怀孕，产褥期，癌症和治疗 癌症，抗磷脂综合征，各种遗传危险因子，和血浆(plasmatic)危险因子。 遗传危险因子，主要涉及止血系统，包括在编码抗凝血酶，蛋白质C和蛋 白质S的基因中的突变，和因子VLeiden和因子IIG20210A突变。血浆 (plasmatic)危险指示物包括hyperhomocysteinemia和升高浓度的因子II, VIII， IX， XI和血纤蛋白原。
血栓形成是由于止血系统的机能障碍或成分的不适合的激活导致的。 止血系统由两个单独的但是关联的系统组成血小板和凝蛋白。其主要的功能是协调分子信号的网络以确保血液的流动性，同时预防血液损失。如 果发生了血管损伤，血管系统的完整性由血液保持，其在由血小板启动并 由凝蛋白增强的过程中，在损伤的位点被转化为不可溶的凝胶。
静脉和动脉血栓形成发生的机制以及在两种类型的血栓中形成的血 块的结构明显不同，并且为此原因，通常将静脉和动脉血栓形成视为不同 的临床实体。
在动脉血栓形成疾病如动脉粥样硬化或事件如中风或心肌梗塞中，血 小板涉及血栓形成的事件的起始。然而，在涉及静脉血栓形成的疾病中， 疾病的发作通过起始凝固级联所导致，并且血小板聚集所发挥的作用要少 得多。确实，发现血小板聚集抑制剂如阿司匹林在预防静脉血栓形成中具 有极少的作用。
组织因子(TF)是跨膜糖蛋白，其是凝固级联的主要起始物。在血管损 伤的过程中，发生血液暴露于内皮下的TF。暴露的TF分别充当用于因子 Vila (FVIIa)催化激活的因子IX (FIX)和因子X (FX)， tenase和凝血酶原酶复 合物的关键成分的辅因子。这导致FXa和凝血酶的快速形成。接着，凝血 酶接着将血纤蛋白原裂解成血纤蛋白，其随后聚合形成血纤蛋白块。
FVIIa/TF复合物涉及许多血栓形成疾病的病理机制，并且TF的循环水 平是血栓形成的危险因子。血液不适合的暴露于TF导致循环炎性细胞因子 的慢性上调，这又升高了急性阶段炎性标志物如C反应性蛋白的循环水平。 所述炎性系统的这种方式的破坏可以导致在循环的单核细胞上的TF表达， 有助于凝固级联中的持续的不平衡，并且溢出进入激活更广泛的止血系 统。
尽管TF是通过血管损伤被释放到血流中的，但是经常在静脉壁没有任 何损伤的情况下发生DVT。在最近数年，越来越多的证据显示TF在正常的 血浆中循环[见(l) Giesen等.Blood-bome tissue factor:another view of thrombosis.(血液产生的组织因子血栓形成的另一种观点).Proc. Natl. Acad. Sci. USA.(美国国家科学院院报)1999; 96:2311-2315 (2) Koyama等, Determination of plasma tissue factor antigen and its clinical significance(确定 血浆组织因子抗原及其临床意义).Br丄Haematol.(英国血液学杂志)1994; 87:343-347;和(3) Albrecht等.Dete乙力,ow o/ czVcw/油'wg" "m認pctor朋c//actor F// fl "w7wa/ popM/a"ow(;在正常群体中检测循环组织因子和因子 VII). T77rom6. HaemoW. 1996;75:772-777],两者都与细胞衍生的膜微泡相 关，并且作为可溶的，可变剪接形式，发现具有内源TF的微泡在体内提睾 肌微循环中有助于实验血栓形成(Falati等.M J f实'麥度学染/蟲J . 2003;197:1585-1598)， 并且己经显示在血友病小鼠中提高止血 (Hrachovinova等.」Va/1. Afe/. 2003;9:1020-1025)。在前面的文献中所述的实 验系统中，具有TF的微泡似乎通过在损伤的位点与血小板或激活的内皮细 胞结合而参与血栓形成，该过程取决于在微泡上的P-选择蛋白糖蛋白配体 -l(PSGL-l)和在激活的血小板上的P-选择蛋白之间的相互作用。
国际专利申请WO 99/55350公开了将番茄的水溶性提取物用作血小 板聚集的抑制剂的应用。番茄提取物(通过商标名Cardioflow⑧或 Fmitflow 已知)的血小板聚集抑制性质已经受到了广泛的媒体公开并且 在公众出版物中提出所述提取物和来自其他来源的番茄提取物可以减少 DVT的危险-见例如，a)Vibrant Life, 1 January 2006(2006年1月1日)，ISSN: 0749-3509; Volume 22 (22巻);Issue 1 (第1期)；(b) Main Report - Health and Wealth Letter, Drinking Tomato Juice Protects The Heart(主要的矛艮道—〈建 康和财富通讯，饮用番茄汁保护心脏)，3 October 2005(2005年10月3日)；(c) Citywire, 18 February 2005 (2005年2月18日)；(d) Vema Noel Jones, Chicago Tribune(芝加哥论坛)，RESOURCES. Q, 16 January 2005 (2005年1 月16日)；(e) Lindsay Mcintosh, Aberdeen Press & Journal, 23 September 2004(2004年9月23日)；(f) The Express, 23 September 2004(2004年9月23 日)，City And Business (城市与商业)编辑Stephen Kahn; (g) Citywire， 22 September 2004 (2004年9月22日);(h) The Sunday Mail(星期日邮箱)，5 September 2004 (2004年9月5日)；(i) ANSA - English Media Service, HEALTH: TOMATOES CAN PREVENT HEART DISEASES(ANSA —英语 媒体服务，健康番茄可以预防心脏病)，28 August 2004(2004年8月28 曰)；和类似文献。
在每一个讨论了提取物性质的潜在基础的前述文献中，关于提取物在 减少DVT的危险中的潜在应用的推测不可避免地基于提取物的已知的血 小板聚集抑制活性。然而，如上述讨论，血小板聚集不引起开始的静脉血栓形成，并且发现血小板聚集抑制剂如阿司匹林在预防DVT中作用极少。 在公众出版物中关于番茄提取物可以通过它们的血小板聚集抑制性质预 防DVT的报道被同时期的在医药杂志GP(Haymarket出版物，伦敦，英国) 中的文章，2004年4月5日，题为"GP Clinical-Behind The Headlines-Can tomato drink halt blood clots (GP临床-在标题之后-番茄饮料可以防止血液 凝块吗？)"所深入剖析。在所述文章中，作者得出结论，即普通医师应当 告诉他们的患者-"饮料不能帮助防止DVT，因为抗血小板药剂对静脉系 统没有太多作用"。
因此，直到申请人意识到之前，在目前的文献中没有证据显示番茄提 取物在治疗静脉血栓形成中具有任何的益处。此外，在文献中也没有显示 番茄提取物对起始静脉血块形成的凝固级联中有任何的作用。
发明概述
目前已经发现由组织因子(TF)介导的事件受番茄的水溶性提取物的 影响，并且已经发现提取物可以在体外减少血液、血浆(其中包括血小板的 血细胞已经被去除)凝固的时间。到目前为止获得的结果显示番茄提取物应 该在预防静脉血栓形成的起始中是有用的。
因此，在第一个方面，本发明提供番茄提取物或其活性级分(fraction)
用于预防或抑制静脉血栓形成的起始。
在另一个方面，本发明提供番茄提取物或其活性级分用于预防或抑制 静脉中血纤蛋白凝块形成的起始。
用于本文时，术语"活性级分"指从番茄提取物中分离的级分，所述 级分具有预防静脉中血纤蛋白凝块形成的起始或预防静脉血栓形成起始 的能力。
本发明还提供
番茄提取物或其活性级分用于制备预防或抑制静脉血栓形成的起始的药 物的应用。
番茄提取物或其活性级分用于制备预防或抑制静脉中血纤蛋白凝块形成 的起始的药物的应用。
一种包含番茄提取物或其活性级分的组合物，其用于预防或抑制静脉血栓形成的起始。
一种包含番茄提取物或其活性级分的组合物，其用于预防或抑制静脉 中血纤蛋白凝块形成的起始。
一种预防或抑制哺乳动物如人中静脉血栓形成的起始，所述方法包括 向哺乳动物施用有效量的番茄提取物或其活性级分。
一种预防或抑制静脉中血纤蛋白凝块形成的起始的方法，所述方法包 括向所述患者施用有效量的番茄提取物或其活性级分。
本发明的番茄提取物可以涉及预防或抑制患者中静脉血栓形成的起 始(或抑制或预防静脉中血纤蛋白凝块的起始)，所述患者由于属于下列处 于危险中的亚群体中的任何一个或多个(以任何组合)而比正常人遭受更大 的发生静脉血栓形成的危险
-年龄超过50岁，例如超过60岁，或超过70岁或超过80岁的患者；
-经过了长时间的不运动的患者，例如超过3,4,5,6,7, 8,9, 10, 11或12小
时，或超过l，或2，或3，或4，或5天的时期； -临床上肥胖的患者；
-最近经过外科手术的患者(例如在过去的这个月，或过去的21天，或过去
的14天，或过去的7天)
-遭受伤害如骨折的患者；
-口服避孕药物的患者；
-用激素替代疗法治疗的患者；
-怀孕的患者；
-最近分娩的母亲(产褥期)；
-患有癌症的患者和接受癌症治疗的患者；
-患有抗磷脂综合征的患者；
-具有遗传危险因子的患者；和
一具有血浆危险因子的患者。
对于具有遗传危险因子的患者，所述危险因子可以是下列各项中的任 何一项或多项(以任何组合)
-编码抗凝血酶的基因中的突变； -编码蛋白质C的基因中的突变；-编码蛋白质S的基因中的突变；
-因子VLeiden突变；和 -因子IIG20210 A突变。
对于具有血浆Oplasmatic)危险因子的患者，危险因子可以是下列各项 中的任何一种或多种(以任何组合) -hyperhomocysteinemia
-升高浓度的因子n; -升高浓度的因子vm;
-升高浓度的因子IX; -升高浓度的因子XI;和 -升高水平的血纤蛋白原。
因此，在另一个方面中，本发明提供番茄提取物或其活性级分用于 预防患者中静脉血栓形成，所述患者处于如本文定义的处于危险中的亚群 体的任何一个或多个(以任何组合)。
本发明还提供番茄提取物或其活性级分用于制备预防患者中静脉血 栓形成的组合物(例如药物)的应用，所述患者处于如本文定义的处于危险 中的亚群体的任何一个或多个(以任何组合)。
本发明还提供预防患者(例如哺乳动物患者如人患者)中静脉血栓形成 的方法，所述患者处于如本文定义的处于危险中的亚群体的任何一个或多 个(以任何组合)，所述方法包括向所述患者施用有效量的番茄提取物或其 活性级分。
在另一个方面，本发明提供应用，用于应用的提取物，方法或用于应 用的组合物，其中所述患者是遭受静脉血栓形成复发，如深静脉血栓形成 复发的人的亚群体中的成员。
用于本文时，术语"有效量"指的是赋予患者治疗效果的量。所述治 疗效果可以是客观的(即由一些测试或标记物可测量的)或者主观的(即，患 者给出效果的指示或感受)。
本发明的另外方面和实施方案陈述在下面和后附于此的权利要求中。
已经发现本发明的番茄提取物以数种方式发挥作用来预防或抑制组 织因子(TF)的活性。首先，己经发现番茄提取物影响血浆凝固时间(PT,TCT,aPTT)，由此 显示对凝血因子的可能的调节。
其次，己经发现番茄提取物减少在活化的血小板上的p-选择蛋白的表 达。如上述讨论，认为具有组织因子的微泡与在血小板和内皮细胞表面上 的p-选择蛋白的结合涉及凝固级联的起始。
第三，己经发现提取物阻断TF与人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)表面 上的PAR2受体的相互作用。所述PAR2受体是TF/FVIIa复合物和FXa的底
基于上述的三个发现，认为本发明的番茄提取物和活性级分在抑制静 脉血栓形成的起始和血纤蛋白凝块的形成中是有效的。
提取物的制备和表征
尽管完整的番茄或已经被切过或分割但未被级分的番茄可以用于本 发明的目的，优选使用番茄的水性提取物。
这样的提取物可以通过如下制备匀浆有或者没有皮的番茄果肉，然 后过滤所述匀浆物以除去固体。优选地，例如通过离心和/或过滤基本上除 去全部水不溶性固体。
备选地，可以将市场上可买到的番茄酱(tomato paste)用作制备所述提 取物的原材料。 一般将所述番茄酱用水稀释，然后例如通过离心和/或过滤 除去水不溶性固体，以产生基本上澄清的溶液。
在每种情况中，所述固体的除去具有除去含有番茄红素的表皮部分的 作用。由此，本发明的优选番茄提取物是基本上不含番茄红素的水溶性提 取物。
可以将水滤液进行另外的分级分离以提供含有负责本文所述的生物 学或治疗效果的一种或多种化合物的活性级分。备选地，可以蒸发滤液以 产生干燥的水溶性提取物。
番茄匀浆物的过滤可以在单一阶段或在一系列过滤步骤中实现，起始 用相对粗滤或离心步骤以除去较大的番茄皮颗粒和/或番茄果肉的其它水 不溶部分。然后可以进行另外的过滤歩骤以产生基本澄清的溶液，例如在 不损失固体情况下经过0.2 li过滤器的溶液。由此，在本发明的一个优选实施方案中，所述番茄提取物是基本上不
含番茄红素并且能在不损失固体情况下经过0.2 u过滤器的水溶性提取物。
在一个实施方案中，从番茄提取物中去除天然糖。去除糖的优势是提 取物的活性被浓縮并且提取物倾向于粘性更小并且更易于以固体形式处 理。
在制备提取物用的原材料是番茄酱的情况下，优选地是，通过"冷破 碎(cold-break)"方法而不是"热破碎(hot-break)"方法而产生。术语"冷 破碎"和"热破碎"在番茄加工领域是众所周知的并且市场上可买到的番 茄酱一般是作为热破碎或冷破碎酱而销售。冷破碎酱可以通过包括番茄匀 浆,接着是热加工歩骤的方法制备，其中将番茄加热到至多约6(TC的温度， 与之相反，热破碎酱，其中匀浆的番茄在约95"C的温度经受热加工，参见 例如，Anthon 等，J.Agric.Food Chem.(农业食品化学杂 志)2002,50,6153-6159。
在备选方法中，番茄或番茄酱的水性提取物可以通过下列步骤产生 酶促消化匀浆的果实或酱中的果胶和淀粉，接着从所述匀浆物中去除悬浮 的固体，并以微量过滤或超滤去除较大分子量蛋白质和余下的多糖。提取 物可以通过去除简单糖，例如葡萄糖，果糖和蔗糖来进行提纯，留下浓縮 的水溶性提取物，其包含多种低分子量(〈1000Da)的非糖番茄成分。去除 简单糖可以通过结晶进行，例如使用低温超声波辅助的结晶，或结晶的葡 萄糖和果糖的乙醇沉淀进行。备选地，简单糖可以通过色谱法，例如将来 自水溶液的生物活性提取物成分选择性吸附到基于聚苯乙烯的树脂材料 上，使葡萄糖，果糖和蔗糖在废弃物流中选择性去除，来从其它提取物成 分进行分离。接着，将吸附的非糖化合物通过用乙醇洗脱，随后通过蒸发 去除乙醇而从吸附的树脂材料中回收。可以将非糖的成分通过喷雾干燥或 转鼓式干燥干燥为水溶性粉末或备选地重悬于水中以得到水性糖浆。以这 种方式制备的水性提取物代表本发明的另一个方面。
无糖番茄提取物，例如在上述讨论的那些，典型地包含多种分子量< 1000Da的化合物并且表示用于根据本发明的应用的优选的提取物。
本发明人还已经发现番茄提取物如果不具有或具有低含量的核苷，则它们是有功效的。因此，优选的提取物在其中不具有核苷，或具有少于
10nM的核苷。
本发明的番茄提取物包含许多生物活性成分。优选的提取物包含选自
下列各项中的生物活性成分酚化合物，氨基酸和氨基酸缀合物，和番茄 香味化合物。
所述提取物优选地包含酚化合物，其选自黄酮类化合物和黄酮类化合 物衍生物，例如栎皮酮，山奈素和柚皮素的衍生物；羟基肉桂酸和衍生物， 例如阿魏酸，香豆酸和它们的缀合物；苯甲酸和衍生物如苯甲酸，羟基苯 甲酸，没食子酸，水杨酸和缀合物。
提取物优选地包含选自酪氨酸，羟基酪氨酸，苯丙氨酸，谷氨酰胺和 它们的缀合物的氨基酸。
所述香味化合物可以选自已醛衍生物，二甲基硫化物，b-大马酮，3-甲 基丁酸，丁子香酮和methional。
基于极性，番茄提取物可以通过HPLC进行亚分级分离以得到三个亚 级分，AF1, AF2和AF3。在下面的实验部分中，将未分级分离的提取物(tAF) 和级分AF1- 3用于进行体外实验。
药物和营养品制剂
可以配制提取物或其活性级分用于口服。因而，例如，可以将它们 配制为溶液、混悬剂、糖浆剂、片剂、胶囊、锭剂和小吃棒(snackbars)、 插入物和贴片。可以依照本身众所周知的方法制备这样的剂型。
例如，在选自糖、维生素、调味剂、着色剂、防腐剂和增稠剂的一种 或多种赋形剂存在下，可以将提取物或活性级分形成糖浆剂或其它用于经 口施用的溶液，例如保健饮料。
可以加入张力调节剂诸如氯化钠或糖以提供特定渗透强度的溶液，例 如等张溶液。还可以将一种或多种pH调节剂诸如缓冲剂用于调节pH至 特定值，并且优选将它保持在那个值。缓冲剂的实例包括柠檬酸钠/柠檬酸 缓冲液和磷酸盐缓冲液。备选地，例如可以通过喷雾干燥或冷冻干燥千燥提取物或其活性级 分，并且干燥产物以固体或半固体剂型配制，例如作为片剂、锭剂、胶囊、 散剂、粒剂或凝胶形式配制。
简单的干燥提取物可以在不加入任何另外的成分的情况下进行制备。 备选地，可以通过吸附到固体载体上制备干燥提取物；例如糖诸如蔗糖、 乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖或糖醇诸如木糖醇、山梨糖醇或甘露糖醇； 或纤维素衍生物。其它特别有用的吸附剂包括基于淀粉的吸附剂诸如谷类 面粉例如小麦粉和玉米粉。对于片剂形成，所述干燥提取物一般与稀释剂 混合，所述稀释剂诸如糖，例如蔗糖和乳糖，以及糖醇诸如木糖醇、山梨 糖醇和甘露糖醇；或改性纤维素或纤维素衍生物诸如粉末状纤维素或微晶 纤维素或羧甲基纤维素。所述片剂也将典型含有选自成粒剂、粘合剂、润 滑剂和崩解剂的一种或多种赋形剂。崩解剂的实例包括淀粉和淀粉衍生 物，及其它可膨胀的聚合物，例如交联聚合的崩解剂诸如交联羧甲基纤维 素，交联聚乙烯吡咯烷酮和淀粉甘醇酸酯。润滑剂的实例包括硬脂酸化合 物诸如硬脂酸镁和硬脂酸。粘合剂和成粒剂的实例包括聚乙烯吡咯烷酮。 在所述稀释剂不是天然非常甜的情况下，可以加入甜味剂，例如甘草酸铵 (ammonium glycyrrhizinate)或人工甜味剂诸如阿斯巴甜、或糖精钠。
还可以将干燥提取物配制为装入胶囊的散剂、粒剂或半固体。当以散 剂形式使用时，所述提取物可以连同以上限定的与片剂有关的任何一种或 多种赋形剂配制，或者可以以未稀释的形式存在。对于以半固体形式的存 在，所述干燥提取物可以溶解或悬浮在粘性液体或半固体载体诸如聚乙二 醇，或者液体载体诸如二醇例如丙二醇或甘油，或者植物油或鱼油例如选 自橄榄油、向日葵油、红花油、月见草油、豆油、鳕鱼肝油、鲱鱼油等的 油中。这样的提取物可以填充到硬明胶或软明胶类型或者由硬或软明胶等 价物制成的胶囊中，对于粘性液体或半固体填料，软明胶或明胶等价物胶 囊是优选的。
还可以以散剂形式提供干燥提取物，用于结合到小吃食品棒例如水果 棒、坚果棒、和谷物棒中。对于以小吃食品棒形式的提供，可以将所述干 燥提取物与选自干果诸如晒干番茄、葡萄干和苏丹葡萄(sultanas)、落花生 或谷类诸如燕麦和小麦的任何一种或多种组分混合。可以以散剂形式提供干燥提取物，用于再生为溶液。因而它们还可以 含有可溶赋形剂诸如糖，缓冲剂诸如柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液，和由碳酸 盐形成的泡腾剂，例如碳酸氢盐如碳酸氢钠或碳酸氢铵，和固体酸，例如 柠檬酸或酸性柠檬酸盐。
在一个优选实施方案中，以散剂形式任选连同优选的固体(例如粉末状) 赋形剂提供干燥提取物用于结合到胶囊例如硬明胶胶囊中。
在另一个实施方案中，干燥提取物是其中去除了基本上所有的天然糖 的干燥提取物。
本发明的固体或半固体剂型可以含有高达约1000 mg的干燥提取物， 例如高达约800 mg。
所述提取物可以作为食品增补剂或食品添加剂存在，或者可以结合到 食品例如功能性食品或营养制品中。
本发明的组合物可以以含有限定浓度的提取物或其活性级分的单位 剂型的形式存在。可以选择这样的单位剂型以便实现所需水平的生物活 性。例如，单位剂型可以含有高达1000 mg(干重)的量的提取物或活性级 分，更典型地是高达800 mg，例如50 mg至800 mg，例如100 mg至500 mg。可以包括在单位剂型中的提取物或活性级分的特定量可以选自50 mg、 ]OOmg、 150 mg、 200 mg、 250 mg、 300 mg、 350 mg、 400 mg、 450 mg、 550 mg、 600 mg、 650 mg、 700 mg、 750 mg禾口 800 mg。
本发明的组合物可以连同施用说明书一起包括在容器、包装物或分样 器中。
对于用于预防或抑制静脉血栓形成的起始中，每天施用至患者的提取 物或活性级分的量将取决于提取物的浓度、在治疗下的特定病症或疾病以 及它的严重性，并且最终它将按照医师的判断而定。然而施用的量将典型 地是有效带来所需要结果的非毒性量。
例如，对于处于遭受静脉血栓形成的潜在危险中的人患者，典型每日 剂量方案可以是每公斤体重0.0001至0.1，优选0.001至0.05克。当分离 并施用活性级分时，可以减少施用的固体材料的量，所述减少的量与级分
药物用途增加的纯度一致。典型地，每天将至少100mg(干重或干重等价物)并优选 至少200mg，并且更通常是至少500 mg的所述提取物施用至人类患者。
可以以每天单一或多个剂量单位施用所述组合物，例如每天一至四 次，优选每天 一或两次。
本发明的提取物可以以固体、液体或半固体形式施用。例如，可以以 番茄汁或其浓縮物形式单独或与其它果汁诸如橙汁混合的形式施用所述 提取物。
附图简述
现在将通过下列实施例并参考


来举例说明本发明，但其不限
制本发明，其中
图l是显示将本发明的番茄提取物(tAF)亚分级分离为三个亚级分AFl-AF3的HPLC色谱图，这如实施例2中所讨论。
图2显示，如在实施例3中所讨论的，AF1 - AF3对体外凝固时间参数 的影响。tAF的亚级分(AFl- AF3)在用PT, TCT或aPTT试剂起始凝结之前， 与血浆进行了预温育。将所有的抑制剂溶液以0.08g/L的最终浓度进行使
图3显示，如在实施例4中所讨论，在将全血与番茄提取物活性级分， tAF及其亚级分AFl- AF3进行预先温育后，对血小板活化标志物p-选择蛋 白的ADP诱导的表达的抑制。将所有的抑制剂以0.05g/L的最终浓度进行使 用；对于每次测量，n=5。所有的抑制剂显示与对照的显著不同0^0.001)。
图4显示，如在实施例4中所讨论，对于tAF抑制p-选择蛋白在活化的 血小板中的表达(在图3中显示)观察到的剂量反应关系。
图5说明与本发明的番茄提取物的预温育减少了由人脐静脉内皮细胞 (HUVEC细胞)产生的白介素-6和白介素-8的水平。在图中显示与对照(con -) 的显著差异，并且在实施例5中进行讨论。
实施例1
番茄提取物的制备利用市场上可买到的28-30°白利糖度(即28-30%固体，重量/重量) 的具有褐变指数(browningindex)(褐变指数定义为12.5 g溶解性固体/L浓 度的溶液在420 nm的吸光度)<0.350 AU的冷破碎(cold-break)番茄酱作 为原材料制备本发明治疗方法中使用的番茄提取物。将酱用超纯水稀释 ( 1: 5)并用离心过滤除去大的颗粒物质，接着利用Westfalia MSB-14分 离器(离心圆盘澄清器)在室温下澄清。然后用微量过滤在不超过45。C的温 度除去较小的颗粒物质，以产生不含有不溶的沉淀下来(spin down)的固体 的并且能在不损失可溶性固体情况下经过0.2 U过滤器的澄清草色 (straw-coloured)溶液。利用仔细受控条件和不超过80°C的温度，通过蒸 发将该溶液浓縮成62-65°白利糖度的糖浆剂，以限制非酶促褐变反应的 进行。将快速巴氏灭菌法步骤O^105'C， 3秒)结合在蒸发程序的开始。最 终产品特征在于褐变指数<0.600 AU，以及微生物总平板计数为<1000。 可以将浓縮的提取物加入橙汁基质中以施用于患者。
实施例2
番茄提取物及其亚级分的备选制备
通过将新鲜的番茄(番茄(Aycopem'cow6^CM/e"&m)，当地来源)匀浆， 离心，并通过超滤(超滤膜，MW截断值1000 Da,密理博(Millipore )(英 国)Ltd.，沃特福德，UK)澄清得到的草色液体来制备来自成熟番茄果实的 水性提取物。分析显示番茄水性提取物主要由可溶性糖组成(85 - 90 %的 干物质)。这些成分用苯乙烯二乙烯基苯(SDVB)柱体(JT Baker， Mallinckrodt Baker BV, Deventer, Holland),在pH 2.5使用固相分离去除。 非糖成分保留在柱体中，并在甲醇中洗脱。分离的非糖物质(总活性级分, tAF)占水性提取物干物质的约4 %。将半制备HPLC用于将tAF组分亚分级 分离成三个宽纟且(broad groups)(Synergy Polar- RP， 4 u , 250 x 10 mm禾口 Luna CI8(2), 3 U ， 250 x 10 mm柱，菲尼克斯(Phenomenex) , Macclesfield, 英国乙腈/0.05。/。TFA梯度)。将这三个组根据减少的极性的顺序标记为
'AF1， ， 'AF2，禾。'AF3，，显示在图1中的HPLC色谱图中。将分离的 tAF和亚级分AFl - AF3在磷酸盐缓冲液(PBS,西格玛-奥尔德里奇
(Sigma-Aldrich),普尔，英国)中重构为已知的浓度，并将溶液pH调节到7.4，之后用于体外实验。 实施例3
番茄提取物中的成分抑制凝固时间
在前面已经显示了番茄提取物成分在体外和离体抑制血小板聚集(见 我们以前的专利申请WO 99/55350)。血小板代表止血系统的一个部分，与 凝固级联协同作用从而平衡血液流动性和血液凝固。设计该实验来检验番 茄提取物是否还能够影响凝固级联，而与其对血液血小板的已知作用无 关。将血浆凝固时间(在去除了血小板的血浆中测量)用于提供反映凝固级 联状态的测量，这与血小板功能无关。使用凝血酶原和凝血酶凝固时间 (分别为PT和TCT)来提供对外部系统的充足性的特定测量，结合因子I (血纤蛋白原),II(凝血酶原),V, VII和X的凝固能力。必须从外部来源加入 组织因子从而容许外部系统(extrinsic system)发挥功能。使用活化的部分促 凝血酶原激酶时间(aPTT)限定内部系统(intrinsic system),并且检验因子XII, XI,IX，V和VIII的凝固能力，所述因子在正常情况下全部存在于血浆中。
实验细节按照生产商所指定的方法，在CoaData 4001血凝度计(Helena生 物科学(Helena Biosciences),英国)上进行凝固时间测量。简而言之，从 Helena生物科学(Helena Biosciences)获得PT, TCT和aPTT试剂以及 Norm-Trol质量控制血浆，并且使用来自相同供应商的校准试剂盒将血凝 度计校准到。/。PT/TCT/aPTT。将加温到37。C的柠檬酸盐化的血浆与对照(盐 水)或处理(见下)溶液一起温育15分钟。接着，将处理的血浆与PT/TCT /aPTT试剂一起温育，伴随搅拌，并且通过血凝度计一式二份地记录在凝 块形成之前所用的时间。接受差异系数少于5%的一式二份的测量。将 Norm-TrolQC血浆用作对照。
处理将如实施例2中所述的番茄提取物AF1, AF2, AF3用作处理。制备 所有的处理溶液以得到80 u g/ mL血浆的最终浓度。将生理盐水(0.9% NaCl) 用作对照。在使用前，将所有的对照和处理溶液调节到pH 7.4并加温到37 。C。结果获得的数据显示与对照血浆相比，在处理的血浆中凝块形成发生的 时间的量增加。图2显示与对照值相比，以％抑制凝固时间表示的获得的结
果。番茄提取物级分AF1和AF2显示对凝固吋间参数最明显的作用。与内 部途径相比，外部途径(通过PT和TCT测量)更加强烈地受到影响。
结论获得的结果显示在体外，番茄提取物的一些成分能够与在一起构成 了凝固级联的血液因子相互作用，并且当考虑止血系统的总体功能时，这 种效果是令人感兴趣的。对外部系统的增加的影响显示组织因子介导的凝 固途径通过使用本发明的番茄提取物可以被有利地抑制，所述组织因子介 导的凝固途径已知对于静脉血栓形成是特别重要的。
实施例4
研究番茄提取物对ADP-诱导的血小板p-选择蛋白表达的影响 设计下列的实验以进一歩研究血液凝固可被番茄提取物成分改变的 机制。血小板活化导致前凝血剂信号传导分子从活化的血小板的表面的释 放。随后与血管壁的相互作用导致凝固级联的活化。这些前凝血剂血小板 衍生的信号传导分子的最主要的一个是p-选择蛋白。在该实验中，我们使 用针对p-选择蛋白的荧光标记的抗体来测量p-选择蛋白在活化的血小板表 面的表达。通过流式细胞术来定量p-选择蛋白衍生的荧光的水平。接着， 定量番茄提取物成分对p-选择蛋白表达的影响。
实验细节将用HEPES-Mg缓冲液(pH 7.4)稀释1: 10的新鲜取出的全血与处 理溶液(见下)或对照溶液(HEPES-Mg缓冲液)一起预温育10分钟。为了诱 导p-选择蛋白在血小板上的表达，接着将这些混合物的等分试样(40 ^L)与 或不与ADP (最终浓度为3 )imol/L) —起在Falcon聚苯乙烯试管(BD Biosciences(BD生物科学)，Cowley， UK)中，在室温温育5分钟。接着，将 10)LiL的饱和浓度的两种荧光标记的单克隆抗体加入温育试管中。将异硫氰 酸荧光素标记的抗-CD61(抗-CD61-FITC)加入以阳性鉴定测试样品中的 所有的血小板(CD61是血小板特异性的蛋白质，不由其它的血细胞表达)。将藻红蛋白标记的抗-p-选择蛋白(抗-CD62P-PE)加入以结合表达在血小板 表面上的p-选择蛋白。将FITC & PE标记的小鼠IgG抗体用作同种型对照。 将温育在室温，黑暗中进行温育20分钟。接着，加入冰冷的磷酸盐缓冲液 (2ml)并用CellQuest软件(BD生物科学(BD Biosciences) , Cowley,英国)， 在FACSCalibur流式细胞仪上分析所述样品。将活化的血小板定义为共表 达CD62P受体的CD61-阳性事件的百分比。
处理将如在实施例2中所述的番茄提取物tAF和AFl- AF3用作处理。制 备所有的处理溶液以得到50 pg/mL的最终浓度。将HEPES-Mg缓冲液用作 对照。将所有的对照和处理溶液在使用前调整为pH 7.4并加温到37t:。对 于每次测量，n = 5。
结果在用3 |imol/L ADP刺激后，在对照样品中记录41.2 - 68.2 % p-选择蛋 白阳性的血小板，其中中位值为51.1%。实验偏差低于5%。与对照值比较 (P < 0.001,图3)将稀释的全血与tAF禾口AF1 - AF3—起预温育导致活化诱 导的p-选择蛋白表达的显著抑制。tAF对p-选择蛋白表达的影响显著不同于 亚级分AF1 - AF3的每一种的效果，尽管在个体亚级分之间没有检测到任 何差异。在tAF抑制p-选择蛋白中观察到剂量反应(范围O - 100叱/mL终浓 度，图4)。
结论获得的结果显示在体外，番茄提取物防止p-选择蛋白在血小板表面 上的表达，减少响应于ADP激动剂的血小板活化。这种效果对于凝固级联 是相当显著的。p-选择蛋白在活化的血小板上的表达导致将p-选择蛋白释 放到血流中(可溶性的p-选择蛋白，或sP-选择蛋白)，导致了在己经抑制了 血小板活化后可以持续的蛋白质的来源。更高水平的可溶性p-选择蛋白与 静脉血栓形成疾病相关，这是由于其作为在血小板和单核细胞之间结合的 调节剂的功能和其与组织因子相互作用以提供在血小板活化和凝固级联 之间的关联。我们的结果显示这种与凝固级联的关联可以由于番茄提取物 对p-选择蛋白表达的正向作用而被打破；因此，番茄提取物通过减少血小 板结合和循环p-选择蛋白，可以潜在地减少静脉血栓形成的危险。实施例5
在培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)中研究提纯的番茄提取物 及其亚级分对TF诱导的细胞因子释放的作用
实施例4证明，番茄提取物由于其对p-选择蛋白在血小板上的表达的抑 制而可以潜在地有利于防止静脉血栓形成的起始。P-选择蛋白是组织因子 介导的凝固级联起始的整合部分，所述凝固级联被认为是对静脉血栓形成 的起始阶段负责的途径。我们假定通过减少p-选择蛋白在活化的血小板或 内皮细胞的表面上的表达，番茄提取物可以防止携带组织因子的微泡粘附 于内皮细胞，并出此预防对于凝血酶产生和凝块形成所需要的紧密接触。
为了证明在存在番茄提取物的情况下可以抑制组织因子对内皮细胞 的作用，我们设计了涉及人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)的实验。HUVEC 细胞表达蛋白酶激活的受体PAR1和PAR2。 PAR2是TF/FVIIa和FXa的底 物，并且当激活时，刺激促炎性细胞因子IL-6和IL-8的释放。由此，通过 测量TF-介导的IL-6和IL-8的产生，可以评估用番茄提取物成分预温育的作 用。
实验细节将HUVEC细胞培养(至多5代)在BGM-2培养基中。将细胞血清-饥饿5小时，接着在存在或不存在番燕提取物成分的情况下，用25 nM TF/10nM FVIIa和lOO nM FX处理(处理在下面详细解释)。将处理的细胞温 育20小时，在所述时间后，收集上清液并且在-80。C冷冻直到通过EL:SA分 析IL陽6和L-8。
处理将用作"基础"处理的番茄提取物活性成分(如在实施例2中所述的 tAF)的浓度计算为在正常个体(血液体积5.5L)的循环中可获得的最大浓 度，所述个体消耗了2.5个新鲜番茄，假定其充分吸收了全部的成分。对于 tAF，这种量是43 mg/L。还以反映了AFl, AF2和AF3在干重基础上对tAF 的贡献的浓度，即对于AFl, AF2和AF3分别为13.6 mg/L, 5.5 mg/L和23.4 mg/L测试了如在实施例2中所述的tAF的三种亚级分，AF1-AF3 。所有的 4种处理在这些基础浓度上测试，并且也在基础浓度的2倍和10倍。将盐水用作对照处理。
结果用番燕提取物成分进行预温育减少了由HUVECs产生的IL-6的水平 达多到12%，减少其所产生的IL8的水平达10 - 50% (见图5)。这显示 了已知抑制p-选择蛋白表达的番茄提取物的成分也通过PAR受体减少了 TF诱导在内皮细胞中的信号传导级联的能力。
AF2和AF3成分比AFl成分更有效-这是由p-选择蛋白抑制的结果所反 映的。所用的最高浓度是效果最低的，这可能反映了在温育阶段中更高的 压力(发生明显的细胞死亡)。IL8产生明显地比IL6产生更受影响，尽管这 可能是由于在用所用的TF浓度诱导两种细胞因子的容易性上的差异。
结论该实验的结果显示水性番茄提取物减少了 TF与内皮细胞的相互作 用。我们认为(见实施例4)，这至少部分是通过其对p-选择蛋白表达的作 用而发生的。在内皮细胞中对TF-介导的事件的影响提示作为TF/VIIa与 内皮细胞或活化的血小板相互作用的结果的凝血酶的产生将被减少，防止 了凝固级联的活化和凝块形成。这是由在实施例3中给出的结果所支持的， 其中我们显示番茄提取物成分可以抑制通过外部系统的血浆凝固。我们认 为番茄提取物可能对影响静脉血栓形成的关键机制具有有益影响，并且此 外，对更广泛的炎性系统具有有益影响。对IL-6的影响显示肝CRP合成 可以潜在地在体内被降低。CRP是对于动脉粥样硬化和CVD的独立的危 险因子。对IL-8的影响显示还可以由番茄提取物成分抑制嗜中性粒细胞活 化。
实施例6 制剂
(i)胶囊制剂
通过冷冻干燥如实施例1中所描述的番茄提取物并且将得到的冷冻干 燥粉末填充到硬明胶胶囊壳中以产生每胶囊800 mg的胶囊内含物来制备 胶囊制剂。(ii) 含有稀释的番茄提取物的胶囊
向实施例1的番茄的水性提取物添加选自蔗糖、乳糖和山梨糖醇的稀 释剂。然后将得到的混合物冷冻干燥而产生填充到硬明胶胶囊壳中的粉
末，产生每一胶囊800 mg的胶囊内含物(200 mg番茄提取物和600 mg稀 释剂)。
(iii) 水果饮料
可以将实施例1的水性提取物加入到橙汁基质中，例如新鲜压榨的 橙汁中以得到50 mL和200 mL体积的饮料，其每一种包含18 g番茄提取 物的果汁，其等价于在6个新鲜番茄中得到的番茄提取物的量(总的 500g 果肉重量)。
提出上述实施例是为了说明本发明，并且不应当理解为对于本发明的 范围施加任何限制。将显而易见的是，可以对上述和在实施例中说明的本 发明特定实施方案进行许多修改和改变，而不背离本发明有关的原则。意 欲将全部这样的修改由本申请所包含。
权利要求
1. 番茄提取物或其活性级分用于制备药物的应用，所述药物用于预防或抑制静脉血栓形成的起始。
2. 番茄提取物或其活性级分用于制备药物的应用，所述药物用于预防或抑 制静脉中血纤蛋白凝块形成的起始。
3. 番茄提取物或其活性级分，其用于预防或抑制静脉血栓形成的起始。
4. 番茄提取物或其活性级分，其用于预防或抑制静脉中血纤蛋白凝块形成 的起始。
5. —种用于预防或抑制静脉血栓形成的起始的组合物，其包含番茄提取物 或其活性级分。
6. —种用于预防或抑制静脉中血纤蛋白凝块形成的起始的组合物，其包含 番茄提取物或其活性级分。
7. —种预防或抑制哺乳动物如人中的静脉血栓形成的起始的方法，所述方 法包括向所述哺乳动物施用有效量的番茄提取物或其活性级分。
8. —种预防或抑制静脉中血纤蛋白凝块形成的起始的方法，所述方法包括 向所述患者施用有效量的番茄提取物或其活性级分。
9. 如前述权利要求中任一项所定义的应用，用于应用的提取物，方法或组 合物，其中所述番茄提取物是水性提取物。
10. 根据权利要求9的应用，用于应用的提取物，方法或组合物，其中所 述番茄提取物基本上不含番茄红素。
11. 根据权利要求9或权利要求10的应用，用于应用的提取物，方法或 组合物，其中所述水性番茄提取物基本不含水不溶性的颗粒物质。
12. 根据权利要求9-11中任一项的应用，用于应用的提取物，方法或组合 物，其中所述水性番茄提取物基本上不含颗粒物质。
13. 根据权利要求9-12中任一项的应用，用于应用的提取物，方法或组合 物，其中所述水性番燕提取物能够通过0.2ii的过滤器而不损失固体。
14. 根据前述权利要求中任一项的应用，用于应用的提取物，方法或组合 物，其中所述番茄提取物已经被脱水以得到水溶性的干燥提取物。
15. 根据前述权利要求中任一项的应用，用于应用的提取物，方法或组合 物，其中从完整的番茄或冷破碎的番茄酱制备番茄提取物。
16. 根据前述权利耍求中任一项的应用，用于应用的提取物，方法或组合 物，其中所述番茄提取物基本上不含天然糖。
17. 根据前述权利要求中任一项的应用，用于应用的提取物，方法或组合 物，其中所述应用是预防或抑制患者中静脉血栓形成的起始(或预防或抑制 静脉中血纤蛋白凝块形成的起始)，所述患者由于属于下列处于危险中的亚 群体中的任何一个或多个(以任何组合)而比正常人遭受更大的发生静脉血栓形成的危险(a) 年龄超过50岁，例如超过60岁，或超过70岁或超过80岁的患者；(b) 经过了长时间的不运动的患者，例如超过3， 4， 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11或12 小时，或超过l，或2，或3，或4，或5天的时期；(c) 临床上肥胖的患者；(d) 最近经过外科手术的患者(例如在过去的这个月，或过去的21天，或过 去的14天，或过去的7天)；(d) 遭受伤害如骨折的患者；(e) 口服避孕药物的患者；(f) 用激素替代疗法治疗的患者；(g) 怀孕的患者；(h) 最近分娩的母亲(产褥期)；(i) 患有癌症的患者和接受癌症治疗的患者；(D患有抗磷脂综合征的患者； (k)具有遗传危险因子的患者；和Cl)具有血浆危险因子的患者。
18. 根据权利要求7的应用，用于应用的提取物，方法或组合物，其中所 述患者具有遗传危险因子，所述危险因子可以是下列各项中的任何一项或 多项(以任何组合)(k-i)编码抗凝血酶的基因中的突变； Ck-ii)编码蛋白质C的基因中的突变； (k-iii)编码蛋白质S的基因中的突变；(k-iv)因子VLeiden突变；禾口 (k-v)因子II G20210 A突变。
19. 根据权利要求17的应用，用于应用的提取物，方法或组合物，其中所 述患者具有血浆危险因子，所述危险因子可以是下列各项中的任何一种或多种(以任何组合)(l-i) hyperhomocysteinemia(l-ii)升高浓度的因子U;(l-iii)升高浓度的因子VIII;(1-iv)升高浓度的因子IX;(l-v)升高浓度的因子XI;禾口(l-vi)升高水平的血纤蛋白原。
20. 根据前述权利要求中任一项的应用，用于应用的提取物，方法或组合 物，其用于在患者中预防或抑制静脉血栓形成的起始(或预防或抑制静脉中 血纤蛋白凝块形成的起始)，所述患者是遭受静脉血栓形成的复发，如深静 脉血栓形成的复发的人的亚群体的成员。
全文摘要
本发明涉及番茄提取物或其活性级分用于预防或抑制静脉血栓形成的起始和静脉中血纤蛋白凝块形成的起始。
文档编号A61K36/81GK101460186SQ200780020435
公开日2009年6月17日 申请日期2007年6月1日 优先权日2006年6月2日
发明者宋炫周, 尼亚姆·奥肯尼迪 申请人:普鲁维克斯天然产物有限公司