纳米乳剂疫苗的制作方法

专利名称：：纳米乳剂疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明提供了用于刺激免疫反应的方法和组合物。特别地，本发明提供了在受试者(例如人受试者)中诱导对试剂(例如，细菌或病毒)的免疫反应的方法和用于该方法的组合物(例如，包含细菌或病毒或其组分的纳米乳剂)。本发明的组合物和方法用于临床(例如，治疗性和预防性医学(例如，接种))和研究应用，及其他。
背景技术：
：免疫是改善人类健康的主要特征。尽管已有抗许多常见疾病的多种成功的疫苗，但感染性疾病的仍然是健康问题和死亡的首要原因。现有疫苗中固有的重要问题包括需要重复免疫和现有疫苗递药系统对于广谱疾病的无效。为了开发抗难于进行疫苗开发的病原体的疫苗，和/或克服由于昂贵、复杂和利用不足而导致市售疫苗的失败，必须开发新的抗原递呈和免疫的方法，为疫苗提供更少的免疫次数、更有效的使用和/或更少的副作用的。发明概述本发明提供了用于刺激免疫反应的方法和组合物。特别地，本发明提供了在受试者(例如人受试者)中诱导对试剂(例如，细菌或病毒)的免疫反应的方法和用于该方法的組合物(例如，包含细菌或病毒或其组分的纳米乳剂)。本发明的组合物和方法用于临床(例如，治疗性和预防性医学(例如，接种))和研究应用，及其他。因此，在一些实施方案中，本发明提供了在人受试者中诱导对正痘病毒的免疫反应的方法，该方法包括提供包含纳米乳剂和免疫原的组合物，其中所述免疫原包括被纳米乳剂灭活的正痘病毒；和在使受试者产生对正痘病毒的免疫反应的条件下，对受试者施用所述组合物。本发明不限于产生的免疫反应的性质。事实上，可在施用包含本发明的纳米乳剂和免疫原的组合物的受试者中产生和测量许多种免疫反应，其中包括但不限于，免疫系统的细胞(例如，B细胞、T细胞、树突细胞、抗原递呈细胞(APC)、巨噬细胞、天然杀伤(NK)细胞等)的激活、增殖或分化；标记和细胞因子的上调或下调的表达；IgA、IgM或IgG滴度的刺激；脾大(例如，增加的脾细胞结构)；各种器官中的超常增生、混合的细胞浸润以及根据本领域内已知的免疫刺激评估的免疫系统的其他反应(例如，细胞的)。在一些实施方案中，施用包括将受试者的粘膜表面与组合物接触。本发明不受限于所接触的粘膜表面。在一些优选实施方案中，所述粘膜表面包括鼻粘膜。在一些实施方案中，施用包括胃肠外施用。本发明不受限于选择用于施用本发明的组合物的途径。在一些实施方案中，诱导免疫反应在受试者中诱导了对正痘病毒的免疫。在一些实施方案中，所述免疫包括全身性免疫。在一些实施方案中，所述免疫包括粘膜免疫。在一些实施方案中，所述免疫反应包括受试者中增加的IFN-Y表达。在一些实施方案中，所述免疫反应包括对灭活的正痘病毒的全身性IgG反应。在一些实施方案中，所述免疫反应包括对灭活的正痘病毒的粘膜IgA反应。本发明不受限于在本发明的组合物中使用的正痘病毒的类型。事实上，可使用多种正痘病毒，其中包括但不限于，类天花病毒、痘苗病毒、牛痘、猴痘、沙鼠痘(gerbilpox)、骆驼痘等等。在一些实施方案中，在对受试者施用的剂量中存在10-103pfu的灭活病毒的条件下，对受试者施用被乳剂灭活的正痘病毒。然而，本发明不受限于该量的施用的正痘病毒。例如，在一些实施方案中，对受试者施用的剂量中存在超过103pfu的灭活的病毒(例如，104pfu、105pfu或更多)。在一些实施方案中，使用10%的纳米乳剂溶液灭活正痘病毒。然而，本发明不受限于该量(例如，百分数)的用于灭活正痘病毒的纳米乳剂。例如，在一些实施方案中，包含低于10°/。的纳米乳剂的组合物用于灭活。在一些实施方案中，包含超过10%的纳米乳剂的组合物用于灭活。在一些实施方案中，所述纳米乳剂包含W2。5EC。本发明不受限于所使用的纳米乳剂的类型。事实上，包括许多种纳米乳剂用于本发明。例如，在一些优选实施方案中，所述纳米乳剂(例如，用于产生免疫反应(例如，用于用作疫苗))包括水包油乳剂、包含在水相中分配的不连续油相的水包油乳剂、包含溶剂(例如，乙醇或甘油)的第一组分和包含表面活性剂或含囟素的化合物的第二组分。水相包括任何类型的水相，其中包括但不限于水(例如，diH20、蒸馏水、自来水)和溶液(例如，磷酸緩冲盐溶液)。油相包括任何类型的油，其中包括但不阴于，植物油(例如，大豆汪、聘梨油、亚麻籽油、椰子油、棉子油、角鲨烯油(squaleneoil)、橄榄油、卡诺拉菜油(canolaoil)、玉米油、菜籽油、红花油和葵花子油)，动物油(例如，鱼油)，调味油，不溶于水的维生素，矿物油和汽油。在一些优选实施方案中，油相包含30-90体积°/。的水包油乳剂(即，组成30-90%的终乳剂的总体积)，更优选50-80%。虽然本发明不受限于醇组分的性质，但在一些优选实施方案中，所述醇是乙醇或甲醇。此外，虽然本发明不受限于表面活性剂的性质，但在一些优选实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨酯表面活性剂(例如，TWEEN20、TWEEN40、TWEEN60和TWEEN80)、苯氧基聚乙氧基乙醇(例如，TRITONX-100、X-301、X-165、X-102和X-200，和TYLOXAPOL)或十二烷基硫酸钠。同样，虽然本发明不受限于含卣素化合物的性质，但在一些优选实施方案中，所述含离素化合物包括卤化十六烷基吡啶、卣化十六烷基三甲基铵、卣化十六烷基二甲基乙基铵、卣化十六烷基二甲基苯甲基铵、卣化十六烷基三丁基磷、囟化十二烷基三甲基铵、g化十四烷基三甲基铵、卣化十六烷基吡啶、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基苯甲基二甲基氯化铵、溴化十六烷基吡啶、溴化十六烷基三曱基铵、溴化十六烷基二曱基乙基铵、溴化十六烷基三丁基磷、溴化十二烷基三甲基铵或溴化十四烷基三甲基铵。本发明的纳米乳剂还包括第三、第四、第五等组分。在一些优选实施方案中，其他的组分是表面活性剂(例如，第二表面活性剂)、萌发增强剂(germinationenhancer)、基于磷酸盐的溶剂(例如，三丁基磷酸盐)、neutramingen、L-丙氨酸、氯化铵、胰胨肉胨营养液、酵母提取物、L-抗坏血酸、卵磷脂、对-羟基苯曱酸甲酯、疏代硫酸钠、柠檬酸钠、肌苷、氢氧化钠、葡萄糖和聚乙二醇(例如，PEG200、PEG2000等)。在一些实施方案中，所述水包油乳剂包含季铵化合物。在一些优选实施方案中，所述水包油乳剂对植物或动物(例如，对人)没有可检测的毒性。在其他优选实施方案中，所述水包油乳剂对植物或动物(例如，对人)不引起可检测的刺激。在一些实施方案中，所述水包油乳剂还包含任何上述组分。季铵化合物包括但不限于糖酸N-烷基二甲基苯甲基铵、1，3，5-三嗪-1，3,5(2H，4H,6H)-三乙醇、l-十烷基铵，N-癸基-N，N-二甲基-，氯(或)二癸基二曱基氯化铵、2-(2-(对-(二异丁基)甲苯氧基)乙氧基)乙基二甲基苯曱基氯化铵、2-(2-(对-(二异丁基)苯氧基)乙氧基)乙基二甲基苯甲基氯化铵、烷基1或3苯甲基-1-(2-羟乙基)-2-氯化咪唑啉；烷基二(2-羟乙基)苯甲基氯化铵、烷基去甲基苯甲基氯化铵、烷基二甲基3，4-二氯苯曱基氯化铵(100%Cl2)、烷基二甲基3，4-二氯苯甲基氯化铵(50%C14、40%C12、10%C16)、烷基二甲基3，4-二氯苯甲基氯化铵(55%C14、23%C12、20%C16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵、烷基二甲基苯曱基氯化铵(100%C14)、烷基二曱基苯甲基氯化铵(100%C16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(41%C14，28%C12)、烷基二曱基苯曱基氯化铵(47%C12、18%C14)、烷基二曱基苯曱基氯化铵(55%C16、20%C14)、烷基二甲基苯曱基氯化铵(58%C14、28%C16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(60%C14、25%C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(61%Cll、23%C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(61%C12、23%C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(65%C12、25%C14)、烷基二曱基苯曱基氯化铵(67°/。C12、24%C14)、烷基二曱基苯曱基氯化铵(67°/。C12、25%C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(90%C14、5。/。C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(93%C14、4%C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(95%C16、5°/C18)、烷基二曱基苯甲基氯化铵(和)二癸基二甲基氯化铵、烷基二曱基苯甲基氯化铵(如在脂肪酸中)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(C12-C16)、烷基二曱基苯甲基氯化铵(C12-C18)、烷基二甲基苯甲基和二烷基二甲基氯化铵、烷基二曱基二曱基苯甲基氯化铵、烷基二甲基乙基溴化铵(90°yiC14、5%C16、5%C12)、烷基二甲基乙基溴化铵(如大豆油的脂肪酸中混合的烷基和链烯基)、烷基二曱基乙基苯甲基氯化铵、烷基二甲基乙基苯甲基氯化铵(60%C14)、烷基二甲基异丙基苯甲基氯化铵(50%C12、30%C14、17%C16、3%C18)、烷基三甲基氯化铵(58%C18、40%C16、1%C14、1%C12)、烷基三曱基氯化铵(90°/。C18、10%C16)、烷基二甲基(乙基苯曱基)氯化铵(C12-18)、二-(C8-10)-烷基二甲基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵、二烷基二曱基氯化铵、二烷基二曱基氯化铵、二烷基甲基苯曱基氯化铵;二癸基二曱基氯化铵、二异癸基二甲基氯化铵、二辛基二曱基氯化铵、十二烷基二(2-羟乙基)辛基氢氯化铵、十二烷基二甲基苯甲基氯化铵、十二烷基氨曱酰曱基二甲基苯曱基氯化铵、七癸基羟乙基氯化咪唑啉、六氢-1，3，5-三(2-羟乙基)-s-三嗪、肉豆蔻基苄基二曱基氯化铵(myristalkoniumchloride)(和)QuatRNIUM14、N，N-二曱基-2-羟丙基氯化铵聚合物、正-烷基二曱基苯曱基氯化铵、正-烷基二甲基乙基苯甲基氯化铵、正-十四烷基二甲基苯甲基氯化铵一水合物、辛基癸基二甲基氯化铵、辛基十二烷基二甲基氯化铵、辛基苯氧基乙氧基乙基二甲基苯曱基氯化铵、氧二乙撑基二(烷基二甲基氯化铵)、季铵化合物、二可可烷基二甲基，氯化物、三甲氧基曱硅烷基丙基二曱基八癸基氯化铵；三甲氧基甲硅烷基季铵化合物、三甲基十二烷基苯曱基氯化铵、正-十二烷基二甲基乙基苯曱基氯化铵、正-六癸基二甲基苯甲基氯化铵、正-十四烷基二曱基苯甲基氯化铵、正-十四烷基二甲基乙基苯甲基氯化铵、和正-八癸基二甲基苯甲基氯化铵。在一些实施方案中，所述乳剂不含任何抗微生物物质(即，抗微生物组合物只是乳剂本身)。在一些实施方案中，所述纳米乳剂是X8P。在一些实施方案中，所述免疫保护受试者免于显示由正痘病毒(例如痘苗病毒)引起的疾病的体征或症状，在一些实施方案中，所述免疫保护受试者免受随后暴露于活的炭疽芽孢杆菌的攻击。在一些实施方案中，对免疫反应的诱导保护受试者免受与正痘病毒感染相关的发病率和/或死亡率，在一些实施方案中，所述组合物还包含佐剂。本发明不受限于所使用的佐剂的类型。本文描述了用于本发明的许多佐剂。在一些实施方案中，所述受试者是人。本发明还提供了用于刺激免疫反应的组合物，其包含纳米乳剂和被该纳米乳剂灭活的正痘病毒，其中配制该组合物以在受试者中诱导对正痘病毒的免疫。在一些实施方案中，纳米乳剂包含W2。5EC。在一些实施方案中，当对受试者施用时，所述组合物为受试者供的10-103pfu的灭活病毒。在一些实施方案中，当对受试者施用时，所述组合物为受试者供的103-105pfu的灭活病毒。在一些实施方案中，给受试者施用的组合物的剂量包括1%的纳米乳剂溶液。在一些实施方案中，灭活的正痘病毒在所述纳米乳剂中是热稳定的。在一些实施方案中，正痘病毒在所述纳米乳剂中稳定超过4周。在一些实施方案中，所述正痘病毒是痘苗病毒。本发明不受限于所使用的正痘病毒的类型。事实上，许多种正痘病毒可用于组合物中用于刺激免疫反应，包括但不限于类天花病毒、牛痘、猴痘和骆驼痘。在一些实施方案中，在对受试者施用之前稀释所述组合物。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，免疫是全身性免疫。在一些实施方案中，免疫是粘膜免疫。在一些实施方案中，所述组合物还包含佐剂。本发明还提供包含用于刺激免疫反应的组合物和用于施用所述组合物的说明书的试剂盒，所述组合物包含纳米乳剂和被所述纳米乳剂灭活的正痘病毒，其中配制所述组合物以在受试者中诱导针对正痘病毒的免疫。在一些实施方案中，本发明提供了在受试者中诱导针对炭疽芽孢杆菌(Aa/U力rac")的免疫反应的方法，该方法包括提供包含纳米乳剂和免疫原的组合物，其中免疫原包含炭疽芽孢杆菌免疫原(例如，炭疽芽孢杆菌的重组保护性抗原(rPA));和在使受试者产生针对炭疽芽孢杆菌的免疫反应的条件下，对受试者施用所述组合物。本发明不受限于所使用的炭疽芽孢杆菌免疫原。例如，在一些实施方案中，免疫原是分离的、纯化的或重组的蛋白或肽抗原或其衍生物或变体，其选自但不限于保护性抗原(PA)、致死因子(LF)、水肿因子(EF)和PA降解产物。本发明不受限于所产生的免疫反应的性质。事实上，可在施用包含本发明的纳米乳剂和免疫原的组合物的受试者中产生和测量许多种免疫反应，包括但不限于，免疫系统的细胞(例如，B细胞、T细胞、树突细胞、抗原递呈细胞(APC)、巨噬细胞、天然杀伤(NK)细胞等)的激活、增殖或分化；标记和细胞因子的上调或下调的表达；IgA、IgM或IgG滴度的刺激；脾大(例如，增加的脾细胞结构)；各种器官中的超常增生、混合的细胞浸润以及根据本领域内已知的免疫刺激评估的免疫系统中的其他反应(例如，细胞的)。在一些实施方案中，施用包括将受试者的粘膜表面与组合物接触。本发明不受限于所接触的粘膜表面。在一些优选实施方案中，所述粘膜表面包括鼻粘膜。在一些实施方案中，施用包括胃肠外施用。本发明不受限于选择用于施用本发明的组合物的途径。在一些实施方案中，诱导免疫反应在受试者诱导了对炭疽芽孢杆菌的免疫反应。在一些实施方案中，所述免疫包括全身性免疫。在一些实施方案中，所述免疫包括粘膜免疫。在一些实施方案中，所述免疫反应包括受试者中增加的IFN-Y的表达。在一些实施方案中，所述免疫反应包括全身性IgG反应。在一些实施方案中，所述免疫反应包括粘膜IgA反应。在一些实施方案中，所述组合物包含1-300jugrPA。然而，本发明不受限于该量的施用的重组保护性抗原。例如，在一些实施方案中，对受者施用的剂量中存在超过300jig的rPA。在一些实施方案中，对受者施用的剂量中存在低于1pg的rPA。在一些实施方案中，所述组合物包含10%的纳米乳剂溶液。然而，本发明不受限于该量(例如，百分数)的纳米乳剂。例如，在一些实施方案中，组合物包含低于10%的纳米乳剂。在一些实施方案中，组合物包含高1oy。的纳米乳剂。在一些实施方案中，本发明的组合物包含本文描述的任何纳米乳剂。在一些实施方案中，所述纳米乳剂包含W2。5EC。本发明不受限于该量的施用的纳米乳剂的类型。在一些实施方案中，所述免疫保护受试者免于显示由炭疽芽孢杆菌引起的疾病的体征或症状。在一些实施方案中，所述免疫保护受试者免受随后暴露于活的炭疽芽孢杆菌的攻击。在一些实施方案中，免疫反应的诱导保护受试者免受与炭疽芽孢杆菌感染相关的发病率和/或死亡率。在一些实施方案中，所述组合物还包含佐剂。本发明不受限于所使用的佐剂的类型。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG寡核苷酸。本文描述了用于本发明的许多其他佐剂。在一些实施方案中，所述受试者是人，在一些优选实施方案中，免疫保护所述受试者免于显示炭疽的体征或症状。本发明还提供了用于刺激免疫反应的组合物，其包含纳米乳剂和炭疽芽孢杆菌的重组保护性抗原，其中配制该组合物以在受试者中诱导对炭疽芽孢杆菌的免疫，在一些实施方案中，所述纳米乳剂包含W2。5EC。在一些实施方案中，当对受试者施用时，所述组合物为受试者提供25-75pg的重组保护性抗原。在一些实施方案中，对受试者施用的组合物的剂量包含iy。的纳米乳剂溶液。在一些实施方案中，重組保护性抗原在纳米乳剂中是热稳定的。在一些实施方案中，重组保护性抗原在纳米乳剂中稳定超过4周。在一些实施方案中，在对受试者施用之前稀释所述组合物。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述免疫是全身性免疫。在一些实施方案中，所述免疫是粘膜免疫。在一些实施方案中，所述组合物还包含佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂包含CpG寡核苷酸。本发明还提供包含用于刺激免疫反应的组合物和用于施用所述组合物的说明书的试剂盒，所述组合物包含纳米乳剂和炭疽芽孢杆菌的重组保护性抗原，其中配制所述组合物以在受试者中诱导针对炭疽芽孢杆菌的免疫。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于施用所述组合物的装置。本发明不受限于用于施用所述组合物的装置的类型。事实上，包括许多种装置可用于试剂盒，其中包括但不限于鼻敷料器(nasalapplicator)、注射器、鼻吸入器和鼻腔喷雾器。在一些实施方案中，所述试剂盒包括与装置(敷料器)接触的，包含纳米乳剂和炭疽芽孢杆菌免疫原的组合物。在一些实施方案中，本发明提供用于大规模施用(例如，对城镇、村庄、城市、州或国家的人群)本发明的组合物的系统和方法(例如响应使用杆菌病原体的攻击)。在一些实施方案中，本发明提供在受试者中诱导针对HIV的免疫反应的方法，该方法包括提供包含纳米乳剂和免疫原的组合物，其中所述免疫原包含重组gpl20;和在使受试者产生针对HIV的免疫反应的条件下对受试者施用所述组合物。本发明不受限于所使用的免疫原的类型(例如，重组gpl20)。例如，在一些实施方案中，免疫原是分离的、纯化的或重组的Tat、Nef或其他免疫原性HIV蛋白或其衍生物。本发明不受限于所产生的免疫反应的性质。事实上，可在施用包含本发明的纳米乳剂和免疫原的组合物的受试者中产生和测量许多种免疫反应，包括但不限于，免疫系统的细胞(例如，B细胞、T细胞、树突细胞、抗原递呈细胞(APC)、巨噬细胞、天然杀伤(NK)细胞等)的激活、增殖或分化；标记和细胞因子的上调或下调的表达；IgA、IgM或IgG滴度的刺激；脾大(例如，增加的脾细胞结构)；各种器官中的超常增生、混合的细胞浸润以及根据本领域内已知的免疫刺激评估的免疫系统的其他反应(例如，细胞的)。在一些实施方案中，施用包括将受试者的粘膜表面与所述组合物接触。本发明不受限于所接触的粘膜表面。在一些优选实施方案中，所述粘膜表面包括鼻粘膜。在一些实施方案中，所述粘膜表面包括阴道粘膜。在一些实施方案中，施用包括胃肠外施用。本发明不受限于选择用于施用本发明的组合物的途径。在一些实施方案中，诱导免疫反应在所述受试者中诱导针对所述HIV的免疫。在一些实施方案中，所述免疫包括全身性免疫。在一些实施方案中，所述免疫包括粘膜免疫。在一些实施方案中，所述免疫反应包括受试者中增加的IFN-Y的表达。在一些实施方案中，所述免疫反应包括全身性IgG反应。在一些实施方案中，所述免疫反应包括粘膜IgA反应。在一些实施方案中，所述组合物包含15-75pg的重组gpl20。然而，本发明不受限于该量的施用的重组gp120。例如，在一些实施方案中，对受试者施用的剂量中存在超过75jig的重组gpl20。在一些实施方案中，对受试者施用的剂量中存在低于15pg的重组gpl20。在一些实施方案中，所述组合物包含10%的纳米乳剂溶液。然而，本发明不受限于该量(例如，百分数)的纳米乳剂。例如，在一些实施方案中，组合物包含低于10°/。的纳米乳剂。在一些实施方案中，组合物包含超过10%纳米乳剂。在一些实施方案中，所述纳米乳剂包含W2。5EC(参见美国专利6，015，832，通过引用将其全部并入本文)。在一些实施方案中，所述纳米乳剂包含X8P(参见美国专利6,015,832，通过引用将其全部并入本文)。本发明提供了包含用于刺激免疫反应的组合物和用于施用组合物的说明书的试剂盒，所述组合物包含纳米乳剂和HIV免疫原(例如重组gpl20)，其中配制所述组合物以在受试者中诱导针对HIV的免疫。在一些实施方案中，所述试剂盒包括与物体(例如敷料器)接触的纳米乳剂。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于施用所述组合物的装置。本发明不受限于用于施用所述组合物的试剂盒中包括的装置的类型。事实上，试剂盒中包括许多不同的装置，其中包括但不限于，鼻敷料器、注射器、鼻吸入器和鼻腔喷雾器。在一些实施方案中，所述试剂盒包括阴道塞药器、阴道喷雾器或阴道施用(例如，至阴道粘膜)本发明的组合物的其他类型的装置。在一些实施方案中，试剂盒包括用本发明的纳米乳剂组合物包被的节育装置(例如，避孕套、IUD、绵条等)。在一些实施方案中，将本发明的纳米乳剂混合在洗液或栓剂或润滑剂(例如，性用润滑剂)中。在一些实施方案中，本发明提供了用于大规模施用(例如，对城镇、村庄、城市、州或国家的人群)的系统和方法(例如使用本发明的纳米乳剂组合物)。在优选实施方案中，以容易使用(例如鼻内投药)和文化敏感性(例如，为了不冒犯施用本发明的组合物的人)的方式进行此类大规模施用。附图概述下列附图构成本说明书的部分和用于进一步说明本发明的某些方面和实施方案。通过参考这些图中的一个或多个，结合本文提供的特定实施方案的描述可更好地理解本发明。图l显示使用纳米乳剂的完全病毒灭活。(A)VV^的空斑数降低测定法(Plaquereductionassay)(PRA)。(B)VV*R-Lu(;的荧光素酶测，以相对光单位(RLU)表示荧光素酶活性定。(C)肺DM的PCR分析。泳道l:DNA大小标记；泳道2:引物，无DNA;泳道3:无Taq;泳道4:107Fk肺DNA;泳道5-7:105/Fk/NE肺DNA;泳道8-10:107NE肺DNA;泳道ll:对照-与肺DNA混合的VVDNA。箭头指示了扩增的病毒模板和引物。(D)在用活的VVi^和105pfu的NE杀死的病毒鼻内感染后的小鼠的生物发光成像。一些图像中可见的圓團指示进行光子通量分析的目的区域(ROI)。图2显示粘膜纳米乳剂疫苗在小鼠中的免疫原性。(A)使用杀死的病毒疫苗的多种制剂接种的小鼠中，血清抗VVIgG抗体反应的发生，所述制剂是107NE(实心圆)、107NE(空心圆)、107Fk/NE(实心三角形)、103/Fk/NE(空心三角形)、107Fk(实心菱形)和107Fk(空实心菱形)。箭头指示疫苗的鼻内(i.n)施用。插图在1次或3次接种107NE的疫苗后，血清抗VVIgG的比较。数据表示为个体抗VVIgG浓度的平均值士sem。(B)BAL中的分泌性抗VVIgA抗体。结果表示为使用个体和混合的BAL液进行的测定中获得的IgA的平均浓度(+/-sem)图3显示病毒中和抗体。使用个体血清和使用在1、2和3次接中后获得的混合血清进行测定。插图BAL中的病毒中和抗体的检测。使用在第16周实验结束时收集的个体和混合的BAL液进行测定。对结果进行标准化并且表示为病毒PRA的NT5。。图4显示牛痘特异性细胞免疫反应。用103和104pfu的活VVWR刺激的脾细胞中的INF-Y的体外表达。数据显示在用NE灭活的痘苗病毒免疫的动物的脾细胞中，针对病毒的特异性INF-Y反应。图5显示使用疫苗病毒的鼻内攻击。(A)在用10xLD2QVVWR—u。真内攻击后，用多种疫苗制剂中的105pfu杀死的VVwK接种的小鼠的存活率曲线，所述多种制剂是VV/NE、VV/Fk/NE和VV/Fk。(B)代表性接种的小鼠(上图)和对照小鼠(下图)的生物发光图像。在攻击后2-5天记录图像。图6显示疫苗制备物的稳定性。(A)在室温下在盐溶液和1%的NE中温育0.5的rPA蛋白24小时，并且使用非还原性的10%PAGE对其进行分析。银染显示在无纳米乳剂(盐溶液)的抗原温育后的低分子量片段。(B)NE和rPA/NE混合物的显微照片显示在与抗原混合后，乳剂中无改变(400x放大倍数)。图7显示纳米乳剂对rPA蛋白质的细胞摄取的影响。将JawsII树突细胞与(A)培养基、(B)单独的0.1jig/mlPA-FITC、(C)与0.001°/。NE混合的0.1jLig/mlPA-FITC或(D)与0.001%NE混合的l|ig/mlPA-FITC—起温育。绿色荧光表示只有当用纳米乳剂施用时，rPA才被有效内化。图8显示小鼠中血清抗PAIgG的时间曲线。用两个剂量的疫苗(箭头)鼻内免疫小鼠。(A)用20|igrPA和浓度不断增加的NE接种的CBA/J小鼠中对抗PAIgG的诱导。(A插图)。用rPA/NE免疫的CBA/J小鼠中的抗PAIgG亚型。数据表示为个体IgG2a、IgG2b和IgG3的滴度对IgGl的滴度的比率。(B)用多种的rPA疫苗制剂接种的Balb/c小鼠中的抗PAIgG。结果表示为个体血清抗PAIgG终点滴度的平均值+/-sem。(*)表示使用rPA/NE接种获得的滴度和其他组中的抗体滴度之间的统计学差异(p〈0.05)。(B插图)使用rPA/Alu免疫的小鼠中的抗PAIgE的记录。来自用rPA/NE(1)、rPA/MPLA(2)、rPA/CpG(3)、对照(4)和rPA/Alu(5)免疫的小鼠的混合血清的1:10-1:80的稀释物的免疫点印迹。图9显示支气管灌洗液中的抗PAIgA和IgG抗体。通过来自用多种疫苗制剂接种的Balb/c小鼠的支气管肺泡灌洗液(BAL)的ELISA测定的抗PAIgA(A)和抗PAIgG(B)。抗PAIgA和抗PAIgG抗体表示为抗体浓度的平均值+/-sem。图10显示体外的致死毒素(LeTx)中和。用已与免疫的、混合的Balb/c血清的系列稀释物预温育的炭疽LeTx处理RAW264.7细胞。标条(Bar)表示其中细胞保持50。/。的存活率(NC5。)的抗体稀释度。图11显示体外脾细胞增殖的PA特异性诱导。用rPA(5pg/ml)刺激从免疫的小鼠分离的脾细胞72小时。将增殖指数计算为rPA刺激的细胞的活性对静息脾细胞的活性的比率。(*)表示组之间的统计学差异(p〈0.05)。图12显示用rPA/NE疫苗鼻内免疫的豚鼠的免疫反应和存活率。用2个剂量的疫苗(如由箭头所指示的第l和第4天)接种Hartley豚鼠。(A)豚鼠血清中的抗PAIgG。按3至4周的间隔通过ELISA测量的抗血清PAIgG来测定抗体滴度(平均终点滴度+/-sem)。(B)皮内攻击。在第6个月，用1000xLDs。的Ames孢子皮下注射豚鼠，监测死亡率，进行14天。对于接种的和对照动物(B插图)，在攻击前第22周进行LeTx中和。根据至少两次测定(各次以一式三份进行)中获得的细胞存活率确定其中RAW264细胞保持50%存活率(NC5。)的抗体滴度。("表示与未接种动物相比统计学显著差异(p<0.001)。图13显示用rPA/NE疫苗鼻内接种的豚鼠的免疫反应和鼻内攻击。在第1天和第4周接种的Hartley豚鼠。(A)血清中的抗PAIgG和LeTx中和抗体滴度。在第3和第6周确定抗体的滴度，并表示为个体血清抗PAIgG终点滴度的平均值+/-sem。在攻击前进行LeTx中和测定细胞，数值代表其中RAW264细胞保持50。/。存活率(NCJ的平均滴度。(B和C)鼻内攻击后的存活率曲线。在第7周，通过10LDs。(B)和100xLD5D(C)的Ames孢子的鼻内滴注感染豚鼠，监测动物达16天。(*)表示与未接种的动物相比所有接种组之间p<0.05。图14显示用两种血清型的重組gpl20和纳米乳剂佐剂鼻内接种的小鼠中的抗体反应。(A)用与0.1%、0.5%和1%NE混合的gpl20BaL免疫的小鼠中的血清抗gpl2(UIgG的诱导。在第6周(在两个剂量后)和第12周(在三个剂量后)测量抗gpl20^IgG抗体。图中指示免疫的鼻内(i.n.)和肌内(i.m.)途径。(B)用两个剂量的单独1%NE中的或加入CpG或MPLA的1°/。NE中的gpl20sn"鼻内免疫小鼠中的抗gpl20SF162IgG的诱导。在第6周测量抗gpl2QIgG抗体。抗gpl20抗体水平表示为个体动物的血清中的终点滴度(+/-s.d.)的平均值。抗gpl20抗体的交叉反应性。来自用(C)gpl2(W或(D)gpl20,2免疫的小鼠的血清IgG与抗原的自体血清型和异体血清型都反应。数据表示为用抗原的gpl20s,或12(W血清型包被的平板上的混合的抗gpl20血清的滴定曲线。图15显示使用gpl20/NE的鼻免疫诱导粘膜IgA。用gpl2(W和NE佐剂接种的小鼠的(A)支气管灌洗液(BAL)中和(B)血清中以及阴道洗液中的分泌性抗gpl20IgA。抗gpl20IgA的浓度表示为用l:2稀释的BAL液(A)、未稀释的阴道洗液和1:50稀释的血清(B)进行的ELISA中获得的平均吸光率(OD405nm+/-s,d.)。在gpl20/盐溶液和各gpl20/NE组之间观察到统计学显著差异(p<0.05)。图16显示(A)抗原特异性脾细胞增殖。用2jiig/ml的自体重组gpl2(U体外刺激来自免疫的动物的脾细胞。将细胞增殖根据对照进行标准化并且表示为个体增殖指数的平均值+/-s.d。gpl20BaL/盐溶液和gpl20BaL/NE组之间的差异是统计学显著的(p<0.05)。(B)体外脾细胞中细胞因子产成的抗原特异性激活。用2ng/ml的自体和异血清型gpl20(分别为BaL和SF162)和用20juM的V3环肽来激活来自免疫的小鼠的脾细胞。通过ELISA测定释放的IFN-y，浓度表示个体样品的平均值+/-s.d。图17显示(A)豚鼠的鼻免疫。在初始-加强方案中，用1%NE中的50yggpl20賜2接种Hartly豚鼠(GP)。在第6周测量对gpl20SF162和m血清型的血清IgG抗体反应。抗gpl20IgG表示为使用l:200的稀释的血清并使用用抗原的gpl20s冊gp(自体的)和120Bat(异源的)血清型包被的平板进行的BLISA中获得的吸收值(0D405nm,+/-s.d.)。(B)通过使用gpl20SF162/NE的鼻内免疫产生的中和抗体。在TZM-BL细胞系统中进行HIV的实验室抹系和原代分离抹的中和。NTs。值表示与病毒对照相比，相对发光单位(RLU)减少50%时的血清稀释度。使用个体免疫前血清估计非特异性抗病毒活性。发明的概述本发明提供了用于刺激免疫反应的方法和组合物。特别地，本发明提供了在受试者(例如人受试者)中诱导抗病原体(例如，牛痘病毒、炭疽芽孢杆菌、HIV等)的免疫反应的方法和用于该方法的组合物(例如，包含由该纳米乳剂灭活的病原体或其免疫原性部分的纳米乳剂)。本发明的组合物和方法用于临床(例如，治疗性和预防性医学(例如，接种))和研究应用，及其他。在一些实施方案中，在施用前将病原体与纳米乳剂混合足以使病原体失活的时间。在其他实施方案中，将来自病原体的蛋白质组分(例如，分离的或纯化的蛋白质或重组蛋白)与纳米乳剂混合。尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，但在一些实施方案中，NE处理(例如，用本发明的NE中和病原体)保护重要的抗原表位(例如，可被受试者的免疫系统识别的)、在乳剂的油和亲水界面中稳定它们的疏水性和亲水性组分(例如，从而提供了一种或多种受试者可针对其产生免疫反应的免疫原(例如，稳定的抗原))。在其他实施方案，因为NE制剂通过孔穿透粘膜，所以它们将免疫原运送至粘膜下层定位的树突细胞(例如，从而起始和/或刺激免疫反应)。尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，但在一些实施方案中，组合NE和免疫原性蛋白(例如，来自炭疽芽孢杆菌的rPA或来自HIV的gpl2Q等)稳定免疫原，并提供用于产生免疫反应的适当的免疫原性材料。树突细胞贪婪地吞噬NE油滴，这提供内化免疫原(例如，抗原性蛋白或其肽片段)用于抗原递呈的方法。尽管其他疫苗依赖于炎性毒素或其他免疫刺激用于佐剂的活性(参见，例如，Holmgren和Czerkinsky，NatureMed,2005，11;45-53)，但当在对动物和人的研究中置于皮肤或粘膜上时，NE未曾显示出炎性。因此，尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，但在一些实施方案中，包含本发明的NE的组合物(例如包含NE和免疫原(例如，NE激活的病原体(例如，病毒(例如，VV))的组合物)可用作"物理"佐剂(例如，转运和/或递呈免疫原(例如，牛痘蛋白)至免疫系统)。在一些优选实施方案中，本发明的组合物的粘膜施用产生粘膜(例如，粘膜免疫的信号(例如，IgA抗体滴度的产生)以及全身性免疫。细胞和体液免疫在抗多种病原体的保护中都起着重要作用，且可使用本发明的NE组合物(例如，包含被纳米乳剂灭活的病原体或病原体的免疫原性部分)诱导两者。例如，据认为牛痘特异性抗体滴度对于接种的人受试者中和动物模型中的保护性免疫是重要的(参见，例如，Hammarlund等人，Nat.Med.2003，9;1131-1137)。几项研究已经鉴定了对于中和抗体的引发重要的蛋白质(参见，例如，Galmiche等人，Virology,1999，254;71-80;Hooper等人，Virology,2003，306;181-195)。获得批准的天花疫苗(Dryvax)稀释物在人志愿者中的最近试验证实脓疱的形成与2种特定抗体的产生和细胞毒T淋巴细胞(CTL)的诱导以及提高的INF-yT细胞反应强烈相关(参见，例如，Greenberg等人，2005，365;398-409)。IFN-y的诱导暗示着特定的匪CI类-限制性的CD8+T细胞的激活。这些类型的细胞牵涉到牛痘感染的细胞的识别和清除，以及接种后免疫的维持(参见，例如，Earl等人，Nature,2004;482;182-185;Hammarlund等人，Nat.Med.2003，9;1131-1137;Edghi11-Smith等人，NatureMed,2005，11;740-747)。因此，在一些实施方案中，对受试者施用(例如，粘膜施用)本发明的组合物(例如，NE杀死的正痘病毒(例如，VV))导致对体液(例如，特定抗体的产生)和细胞(例如，细胞毒T淋巴细胞)免疫反应(例如，抗天花病毒)两者的诱导。在一些优选实施方案中，本发明的组合物(例如，NE杀死的正痘病毒(例如，VV)或NE和一种或多种免疫原)用作疫苗(例如，天花疫苗、炭疽活疫苗和流感疫苗等)。此外，在一些实施方案中，本发明的组合物(例如，包含NE和免疫原的组合物)诱导(例如，当对受试者施用时)全身性和粘膜免疫两者两者。因此，在一些优选实施方案中，对受试者施用本发明的组合物导致抗暴露(例如，致死性粘膜暴露)于病原体(例如，病毒(例如正痘病毒(例如，VV))的保护。尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，但粘膜施用(例如，接种)提供了抗病原体感染(例如，在粘膜表面开始的)的保护。尽管迄今已证明难以刺激分泌性IgA反应和抗在粘膜表面侵入的病原体的保护(参见例如，Mestecky等人，MucosalImmunology.第3版.(AcademicPress,SanDiego,2005))，但本发明提供了用于在受试者中刺激来自病原体的粘膜免疫(例如，保护性IgA反应)组合物和方法。在一些实施方案中，本发明提供了用作粘膜疫苗的组合物(例如，包含NE和免疫原的组合物)。可容易地从纯化的病毒和/或细菌和/或蛋白质或重组蛋白质产生该材料，所述材料诱导粘膜和全身性免疫。快速产生该制剂的能力和通过粘膜滴注施用该制剂提供了可用于一般接种需要以及用于大规模暴发或突发紧急情况的疫苗定义为了帮助理解本发明，下面定义许多术语和短语如本文所使用的，术语"微生物"是指任意物种或类型的微生物，包括但不限于细菌、病毒、古细菌、真菌、原生动物、支原体、朊病毒和寄生生物。术语微生物包括在另一种生物(例如，动物(包括人)和植物)中且它们本身对所述生物是致病的微生物和产生对另一种生物致病的试剂但本身对其他生物不是直接致病或感染的微生物。如本文所使用的，术语"病原体"和语法等同物，是指生物(例如，生物试剂)，包括通过直接感染其他生物或通过产生在另一种生物中引起疾病的试剂来在另一种生物(例如，动物和植物)中引起疾病状态(例如，感染、病理状态、疾病等)的微生物(例如，产生病原性毒素等的细菌)。"病原体"包括，但不限于，病毒、细菌、古细菌、真菌、原生动物、支原体、朊病毒和寄生生物。术语"细菌"和"菌"是指所有原核生物，包括-原核生物界中所有门的生物。该术语旨在包括被认为是细菌的所有微生物，包括支原体属、衣原体属、放线菌属、链霉菌属和立克次氏体属。本定义包括所有形式的细菌，其中包括球菌(cocci)、杆菌(bacilli)、螺旋体(spirochete)、原生质球(spheroplast)、原生质体等。如本文所使用的，术语"真菌"用于指真核生物例如霉菌和酵母，包括双态性真菌。如本文所使用的，除非本文中另外指出，否则术语"疾病"和"病理状态"可互换使用，描述偏离据认为是物种或群体(例如，人)的成员是正常的或平均的状态，所述偏离在对大部分该物种或群体的个体无害的条件下对受影响的个体有害的。这样的偏离可表现为与受试者的正常状态的任何损伤或者干扰或改变正常功能的执行的其器官或组织的任何损伤相关的状态、体征和/或症状(例如，腹泻、恶心、发烧、疼痛、水疱、疗(boil)、渗、免疫抑制、炎症等)。疾病或病理状态可由或通过与微生物(例如，病原体或其他感染剂(例如，病毒或细菌))接触而导致，其可响应环境因素(例如，营养不良、工业危害和/或气候)，其可响应生物的先天缺陷(例如，遗传异常(geneticanomalies))或响应这些和其他因素的组合。如本文所使用的，术语"宿主"或"受试者"是指用本发明的组合物和方法治疗(例如施用)的个体。受试者包括，但不限于，哺乳动物(例如，鼠、猿、马、牛、猪、犬、猫等)，且最优选包括人。在本发明的说明书中，术语"受试者"通常指将被施用或已被施用一种或多种本发明的组合物(例如，用于诱导免疫反应的组合物)的个体。如本文所使用的，术语"使灭活"、"灭活"和语法等同物，当26用于指微生物(例如，病原体(例如，细菌或病毒))时，是指杀死、消除、中和和/或减少微生物(例如，病原体(例如，细菌或病毒))感染和/或在宿主中引起病理反应和/或疾病的能力。例如，在一些实施方案中，本发明提供了包含纳米乳剂(NE)灭活的痘苗病毒(VV)的组合物。因此，如本文所提及的，包含"NE灭活的VV"、"NE杀死的V"、"NE中和的V"或语法等同物的组合物是指，当对受试者施用时，其特征在于宿主中VV复制(例如，在一段时间内(例如，在数天、数周、数月或更长的时间内))的不存在或显著减少的存在的组合物。如本文所使用的，术语"融合性的(fusigenic)"意指能够与微生物试剂(microbialagent)(例如，细菌或细菌芽胞)的膜融合的乳剂。本文描述了融合性的乳剂的特定实例。如本文所使用的，术语"溶原性的"是指能够破坏微生物试剂(例如，病毒(例如，病毒包膜)或细菌或细菌芽胞)的膜的乳剂(例如，纳米乳剂)。在本发明的优选实施方案中，溶原性和融合性试剂在相同组合物中的存在产生了与任一单独的试剂相比增强的灭活作用。本文详细地描述了使用该改进的抗微生物组合物的方法和组合物(例如，用于诱导免疫反应(例如，用作疫苗))。如本文所使用的，术语"乳剂"包括经典的水包油或油包水分散体或小滴，以及作为疏水力的结果而形成的其他脂质结构，当将与水混溶的油相与水相混合时，所述疏水力驱动非极性残基(例如，长烃链)远离水并驱动极性头部基团朝向水。这些其他脂质结构包括但不限于单层的、少数层(paucilamellar)和多层的脂质载体、微团和层相(lamellarphase)。类似地，如本文所使用的，术语"纳米乳剂"是指包含小的脂质结构的水包油分散体。例如，在一些实施方案中，所迷纳米孔剂包括具有平均颗粒大小为约0.1-5微米(例如，直径150+/-2511111)的小滴的油相，然而包括更小和更大的颗粒大小。术语"乳剂，，和"纳米乳剂，，在本文中通常可互换使用，是指本发明的纳米乳剂。如本文所使用的，术语"接触"、"接触的"、"暴露"和"暴露的"，当用于指纳米乳剂和活的微生物时，是指将一种或多种纳米乳剂与微生物(例如，病原体)接触以使所述纳米乳剂灭活微生物或病原性试剂(如果存在的话)。本发明不受限于用于微生物灭活的纳米乳剂的量或种类。用于本发明的多种纳米乳剂描述在本文和其他地方中(例如，美国专利申请20020045667和20040043041和美国专利序号6，015，832、6,506,803、6，635，676和6，559,189中描述的纳米乳剂，为了所有目的，其各自通过引用将其全部并入本文)。本发明中包括纳米乳剂(例如，足以用于灭活微生物(例如，病毒灭活)与微生物(例如，足以提供抗原性组合物(例如，能够诱导免疫反应的组合物))的比例和量，包括但不限于本文描述的比例和量。术语"表面活性剂"是指具有极易溶于水的极性头部基团，和难以溶于水的疏水尾部的任何分子。术语"阳离子表面活性剂"是指具有阳离子头部基团的表面活性剂。术语"阴离子表面活性剂，，是指具有阴离子头部基团的表面活性剂。术语"亲水-亲油平衡指数"和"HLB指数"是指使表面活性剂分子的化学结构与它们的表面活性相关联的指数。可通过例如由Meyers,(参见，例如，Meyers,SurfactantScienceandTechnology,VCHPublishersInc.，NewYork,pp.231-245(1992))(通过引用并入本文)描述的多种经验>^式计算HLB指数。如本文所使用的，当合适时，表面活性剂的HLB指数是在McCutcheon"第1巻EmulsifiersandDetergentsNorthAmericanEdition,1996(通过引用合并入本文)中赋值给该表面活性剂的HLB指数。对于商业表面活性剂，HLB指数在0至大约70或更大的范围内。在水中具有高度溶解性和溶解特性的亲水表面活性剂在数值范围的高端，而作为油包水如本文所使用的，术语"相互作用增强子(interactionenhancer)"是指作用以剂与微生物(例如，与细菌(例如，革兰阴性细菌)的细胞壁或与病毒包膜(例如，痘苗病毒包膜))的相互作用的化合物。所包括的相互作用增强子包括但不限于，螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA)、亚乙基双(氧亚乙基次氨基)四乙酸(EGTA)等)和某些生物试剂(例如，牛血清白蛋白(BSA)等)。术语"緩冲液"或"緩沖剂"是指当加入溶液中时引起溶液抵抗pH的变化的材料。术语"还原剂，，和"电子供体，，是指向第二材料提供电子以减少第二材料的一个或多个原子的氧化状态的材料。术语"单价盐"是指其中金属(例如，Na、K或Li)在溶液中具有净l+电荷(即，比电子多一个质子)的任何盐。术语"二价盐"是指其中金属(例如，Mg、Ca或Sr)在溶液中具有净2+电荷的任何盐。术语"螯合剂"或"螯合试剂"是指具有多个含有能够与金属离子成键的孤电子对的原子的任何材料。术语"溶液"是指水性或非水性混合物。如本文所使用的，术语"用于诱导免疫反应的组合物"是指在对受试者施用(例如，1、2、3次或更多次(例如，以数周、数月或数年间隔))后，在受试者中刺激、产生和/或引发免疫反应(例如，导致针对能够引起疾病的微生物(例如，病原体)产生完全或部分免疫)的组合物。在本发明的优选实施方案中，所述组合物包含纳米乳剂和免疫原。在其他优选实施方案中，包含纳米乳剂和免疫原的组合物包含一种或多种其他化合物或试剂，包括但不限于，治疗剂、生理可耐受液、凝胶、载体、稀释剂、佐剂、赋形剂、水杨酸盐、类固醇、免疫抑制剂、免疫刺激剂、抗体、细胞因子、抗生素、粘合剂、充填剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂和/或緩冲剂。免疫反应可以是先天性(例如，非特异性)免疫反应或后天性(例如，获得性)免疫反应(例如，在受试者中减少传染性、发病率或死亡率(例如，通过暴露于病原性微生物引起的)或在受试者中预防传染性、发病或死亡的发生(例如，通过暴露一病原性微生物引起的)的免疫反应)。因此，在一些优选实施方案中，将包含纳米乳剂和免疫原的组合物作为疫苗给受试者施用(例如，以预防或减弱疾病(例如，通过给受试者提供完全或部分抗疾病的免疫或对疾病的体征、症状或病况的完全或部分减弱(例如，抑制))。如本文所使用的，术语"佐剂"是指刺激免疫反应(例如，粘膜免疫反应)的任何物质。'一些佐剂可引起免疫系统的细胞的激活(例如，佐剂可引起免疫细胞产生和分泌细胞因子)。可引起免疫系统的细胞的激活的佐剂的实例包括，但不限于，从皂皮树(Q.saponaria)树的树皮纯化的皂苷例如QS21(使用HPLC分级分离在21.sup.st峰中洗脱的糖月旨；AquilaBiopharmaceuticals，Inc.，Worcester,Mass.);聚(二(羧负离子基苯氧基)磷腈ploy(di(carboxylatophenoxy)phosphazene(PCPP聚合物jVirusResearchInstitute,USA)5月曽多糖的衍生物例如单罅酰月旨质A(MPL;RibiImmunoChemResearch,Inc.,Hamilton,Mont.)、胞壁酰二肽(MDP;Ribi)和苏氨酰-胞壁酰二肽(t-MDP;Ribi);0M-174(与脂质A相关的葡糖胺二糖;0MPharmaSA，Meyrin，Switzerland);和利什曼原虫延4申因子(Leishmaniaelongationfactor)(纯化的利什曼原虫蛋白；CorixaCorporation,Seattle,Wash.)。常规佐剂在本领域内是熟知的，其包括，例如，磷酸铝或氢氧化物盐("明矾")。在一些实施方案中，将本发明的组合物(例如，包含HIV或其免疫原性表位(例如，gpl20))与一种或多种佐剂一起使用(例如，以使免疫反应倾向于Thl或Th2类型的反应)。如本文所使用的，术语"诱导免疫反应的有效量"(例如，用于诱导免疫反应的组合物的)是指在受试者中刺激、产生和/或引发免疫反应所需的剂量水平(例如，当对受试者施用时)。可在一次或多次施用、应用或给药中施用(例如，通过相同或不同的途径)有效量，有效量不意欲受限于特定的制剂或施用途径。如本文所使用的，术语"在使所述受试者产生免疫反应的条件下"是指免疫反应(例如，先天性的或获得性的)的任何定性或定量的诱导、产生和/或刺激。如本文所用的，术语"免疫反应"是指由受试者的免疫系统产生的反应。例如，免疫反应包括，但不限于Toll受体激活、淋巴素(例如，细胞因子(例如，Thl或Th2类型细胞因子)或趋化因子)的表达和/或分泌、巨噬细胞活化、树突细胞活化、T细胞活化(例如，CD4+或CD8+T细胞)、NK细胞活化和/或B细胞活化(例如，抗体的产生和/或分泌)中的可检测的改变(例如，增加)。免疫反应的另外的实例包括免疫原(例如，抗原(例如，免疫原性多肽))对MHC分子的结合和诱导细胞毒T淋巴细胞("CTL")反应、诱导B细胞反应(例如，抗体的产生)和/或T辅助淋巴细胞反应、和/或抗免疫原性多肽所来源的抗原的迟发型超敏反应(DTH)反应、免疫系统的细胞(例如，T细胞、B细胞(例如，任何发育阶段的(例如，浆细胞)))的扩增(例如，细免疫反应可以针对受试者的免'疫系:统识别为外来物的免疫原(例如，来自微生物(例如，病原体)的非自身抗原或识别为外来物的自身抗原)。因此，应当理解，如本文所使用的，"免疫反应"是指任何类型的免疫反应，包括但不限于先天性免疫反应(例如，Toll受体信号转导级联反应的激活)、细胞介导的免疫反应(例如，通过T细胞(例如，抗原特异性T细胞)和免疫系统的非物异性细胞介导的反应)和体液免疫反应(例如，通过B细胞介导的反应(例如，通过将抗体产生和分泌入血浆、淋巴和/或组织液))。术语"免疫反应"意指包括受试者的免疫系统对抗原和/或免疫原的反应(例如，对免疫原(例如，病原体)的初始反应和作为自适应免疫反应(adaptiveimmuneresponse)的结果的获得性(例如，记忆)反应)的能力的所有方面。如本文所使用的，术语"免疫"是指在暴露于能够引起疾病的微生物(例如，病原体)后，保护免受疾病的侵害(例如，预防或减弱(例如，抑制)疾病的体征、症状或病况)。免疫可以是先天性的(例如，在缺少先前暴露于抗原的情况下存在的非适应性的(例如，非获得性的)免疫反应)和/或获得性的(例如，在先前暴露于抗原后由B和T细胞介导的免疫反应(例如展示增加的对抗原的特异性和反应性))。如本文所使用的，术语"免疫原"是指能够在受试者中引发免疫反应的试剂(例如，微生物(例如，细菌、病毒或真菌)或其部分(例如，蛋白质抗原(例如gpl20或rPA)))。在优选实施方案中，当与本发明的纳米乳剂组合施用时，免疫原引发抗该免疫原(例如，微生物(例如，病原体或病原体产物))的免疫。如本文所使用的，术语"病原体产物"是指来自病原体的任何组分或产物，包括但不限于多肽、肽、蛋白质、核酸、膜级分和多糖。如本文所使用的，术语"增强的免疫"是指与未曾施用该组合物(例如，用于诱导本发明的免疫反应的组合物)的受试者中的适应性和/或获得性免疫的水平相比，在施用组合物(例如，用于诱导本发明的免疫反应的组合物)后，受试者中对给定的免疫原(例如，微生物(例如，病原体))的适应性和/或获得性免疫的水平的增加。如本文所使用的，术语"纯化的"或"纯化"是指从样品或组合物中除去污染物或不想要的化合物。如本文所使用的，术语"大体上纯化的，，是指从样品或组合物除去大约70-90%，至多100%的污染物或不想要的化合物。如本文所使用的，术语"施用"和"给药"是指将本发明的组合物(例如，用于诱导免疫反应的组合物(例如，包含纳米乳剂和免疫原的组合物))给予受试者的行为。对人体进行施用的示例性途径包括，但不限于，通过眼睛(经眼的)、嘴(经口的)、皮肤(经皮肤的)、鼻(经鼻的)、肺(吸入的)、口腔粘膜(经口腔的)、耳、直肠，通过注射(例如，静脉内地、皮下地、腹膜内地等)、局部等。如本文所使用的，术语"共施用"和"共给药"是指将至少两种试剂(例如，包含纳米乳剂和免疫原以及一种或多种其他试剂-例如，佐剂)或治疗施用至受试者。在一些实施方案中，两种或更多种试剂或治疗的共施用同时发生。在其他实施方案中，在第二试剂/治疗之前施用第一试剂/治疗。在一些实施方案中，可通过相同或不同的施用途径进行共施用。本领域技术人员理解所使用的多种试剂或治疗的施用的制剂和/或途径可变化。可由本领域技术人员容易地确定用于共施用的合适的剂量。在一些实施方案中，当共施用试剂或治疗时，以比适合于它们单独施用的剂量更低的剂量施用各试剂或治疗。因此，在其中试剂或治疗的共施用降低潜在有害的(例如，有毒的)试剂的所需剂量的实施方案中，和/或当两种或更多种试剂的共施用导致受试者通过与其他试剂的共施用对其中一种试剂的有益作用致敏时，特别需要共施用。在其他实施方案中，共施用优选在受试者中同时或几乎同时引发对两种或更多种不同的免疫原(例如，微生物(例如，病原体))的免疫反应(例如，当受试者不可能进行随后的第二、第三或更多组合物的施用以诱导免疫反应的时候)。如本文所使用的，术语"局部地"是指对皮肤表面和/或粘膜细胞和组织(例如，肺泡、口腔、舌、咀嚼用(masticatory)、阴道或鼻粘膜和覆盖中空器官或体腔内层的其他组织和细胞)施用本发明的组合物(例如，包含纳米乳剂和免疫原的组合物)。在一些实施方案中，以局部乳剂、可注射组合物、可吸收溶液等的形式施用本发明的组合物。当途径是局部的时候，所述形式可以是例如喷雾剂(例如，鼻腔喷雾剂)、乳液或其他粘稠溶液(例如，包含聚乙二醇中的纳米乳剂和免疫原的组合物)。如本文所使用的，术语"药学上可接受的，，或"药理学上可接受的"，是指当对受试者施用时，基本上不产生有害反应(例如，毒性、过敏性或免疫学反应)的组合物。如本文所使用的，术语"药学上可接受的载体"是指任意标准药物载体，包括，但不限于磷酸緩冲盐溶液、水和不同类型的湿润剂(例如，月桂基硫酸钠)、任何和所有溶剂、分散介质、包衣、月桂基硫酸钠、等渗和吸收延迟剂、崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)、聚乙二醇等。所述组合物还可包含稳定剂和防腐剂。栽体、稳定剂和佐剂的实例已被描述且在本领域内是已知的(参见例如，Martin，Remington'sPharmaceuticalSciences,第15版，MackPubl.Co.,Easton，Pa.(1975)，通过引用并入本文)。如本文所使用的，术语"药学上可接受的盐"是指在靶受试者中生理上可耐受的本发明的组合物的任意的盐(例如，通过与酸或碱反33应获得的)。可从无机或有机酸和碱得到本发明的组合物的"盐"。酸的实例包括，但不限于，盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、反丁烯二酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸(toluene-p-sulfonic)、酒石酸、醋酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、曱酸、苯曱酸、丙二酸、磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其他酸，例如草酸，尽管它们本身在药学上是不可接受的，但可用于制备在获得本发明的组合物中作为中间产物的盐和它们的药学上可接受的酸加成盐。碱的实例包括但不限于碱金属(例如，钠)氢氧化物、碱土金属(例如，镁)氢氧化物、铵和式NW/的化合物，其中W是Cw烷基，等等。盐的实例包括但不限于醋酸盐、已二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、重硫酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖苷盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、flucoheptanoate、磷酸甘油、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、2-羟乙基磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、palmoate、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、苯丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐等。盐的其他实例包括与合适的阳离子例如Na+、冊4+和鼎4+(其中W是Ch烷基)等化合的本发明的化合物的阴离子。对于治疗性用途，本发明的化合物的盐被认为是药学上可接受的。然而，非药学上可接受的酸和碱的盐也可用于例如药学上可接受的化合物的制备或纯化。对于治疗性用途，本发明的组合物的盐被认为是药学上可接受的。然而，作为非药学上可接受的酸和碱的盐也可用于例如药学上可接受的组合物的制备或纯化。如本文所使用的，术语"处于疾病的风险中，，是指易于经历特定疾病的受试者。该倾向可以是遗传性的(例如，经历疾病例如可遗传病症的特定遗传倾向)，或归因于其他因素(例如，环境条件、暴露于存在于环境中的有害化合物等)。因此，不希望本发明受限于任何特定的风险(例如，受试者可以只是因为暴露于和与其他人相互作用而"处于疾病的风险中，，)，也不希望本发明受限于任何特定的疾病。如本文所使用的，"鼻应用(Nasalapplication)"，是指通过鼻子进入鼻通道或窦通道或两者的应用。可例如通过用于鼻或窦通道的滴剂、喷雾剂、雾剂(mist)、包衣或其混合物进行该应用。如本文所使用的，"阴道应用"，是指施用入或通过阴道以接触阴道粘膜。该应用可接触尿道、子宫颈、官窿(fornix)、子宫或其他围绕阴道的区域。可例如通过用于阴道或周围组织的滴剂、喷雾剂、雾剂、包衣、润滑剂或其混合物来进行该应用。如本文所使用的，术语"试剂盒"是指用于递送物质的任何递送系统。在免疫原性试剂(例如，包含纳米乳剂和免疫原的组合物)的上下文中，此类递送系统包括允许免疫原性试剂和/或支持材料(例如，用于使用材料的技术说明书等)从一个位置至另一个位置的贮存、运输或递送的系统。例如，试剂盒包括一个或多个包含相关免疫原性试剂(例如，纳米乳剂)和/或支持材料的包装物(例如，盒子)。如本文所使用的，术语"部分试剂盒(fragmentedkit)"是指包含两个或多个各自包含总的试剂盒组分的分部分的分开的容器的递送系统。可一起或分开地将容器递送至目的接受者。例如，第一容器可含有包含用于特定用途的包含纳米乳剂和免疫原的组合物，而第二容器含有第二试剂(例如，抗生素或喷雾器(sprayapplicator))。事实上，包含两个或更多个各自包含总的试剂组分的分部分的分开的容器的任何递送系统包括在术语"部分试剂盒"中。相反地，"组合试剂盒"是指在单个容器(例如，在装有各所需组分的单个盒子)中，含有特定用途所需的免疫原性试剂的所有组分的递送系统。术语"试剂盒"包含部分和组合试剂盒。发明详述本发明提供了用于刺激免疫反应的方法和组合物。特别地，本发明提供了在受试者(例如人受试者)中诱导对试剂(例如，细菌或病毒)的免疫反应的方法和用于该方法的组合物(例如，包含细菌或病毒或其组合的纳米乳剂)。本发明的组合物和方法用于临床(例如，治疗性和预防性医学(例如，接种))和研究应用，及其他。几种病原性微生物通过附着至内附于胃肠道、口咽道、呼吸道或生殖泌尿道的粘膜上皮细胞而引发感染。一些病原体，例如流感病毒、百曰咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)或霍乱弧菌(Vibriocholerae)，保留在粘膜组织上或其内，然而其他病原体，例如，伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)或曱型肝炎病毒，具有允许穿透至更深层组织和全身性扩散的机制。粘膜的特异性和非特异性防御机制提供了抗两种类型的病原体的第一线保护。非特异性效应器包括，例如，驻留型巨噬细胞、抗微生物肽、乳铁蛋白和溶菌酶、极端pH、胆汁酸、消化酶、粘液、上皮细胞的脱落、沖洗机制(flushingmechanism)(蠕动、纤毛搏动、排尿等)和来自区域植物区系的竟争。然而，成功存活"方法，分泌性免k系统在;;免受由许多细菌和病毒病原体引起的疾病中起着主要作用，抗病原体的主要效应器限定在粘膜表面。对于全身性扩散的生物，最佳免疫似乎需要局部和全身性免疫反应两者。正痘病毒(例如，天花、牛痘、猴痘、沙鼠痘(gerbilpox)、骆驼痘和其他)疫苗的现有形式已过时。。例如，用于实现天花根除的所有现有的批准的天花疫苗基于从感染的小牛的皮肤和淋巴节获得的活痘苗病毒(VV)。尽管这些疫苗赋予了抗几种不同正痘病毒的长效免疫，但制造它们的材料不满足用于人疫苗的当前标准。此外，这些疫苗还产生传染性皮肤脓疱(痘疮)和罕见的但严重的副作用，从而限制了它们在具有免疫缺陷、湿渗、异位性皮炎或心脏疾病的个体(和它们的紧密接触)中的用途(参见，例如，EichnerandSchwehm，Epidemiology.2004,15(3):258-60)。预期正痘病毒疫苗(例如，天花、牛痘、猴痘、沙鼠痘(gerbilpox)、骆驼痘和其他)的未来应用会是对生物恐怖袭击或其他正痘病毒感染，例如猴痘或牛痘病毒的暴发的反应(参见，例如，Edghi11-Smith等人，NatureMed.2005，11;740-747)。因此，接种的风险/利益比要求新天花疫苗将安全放在高度优先的位置。此外，为了用于突发公共卫生情况，将必需用快速施用的疫苗(例如，粘膜疫苗)替代通过划痕法施用的疫苗。除了可提供接种和长期免疫保护外，此类施用可还可提供免疫反应的快速、现场产生器(例如，减少疾病的传染性、症状和/或病程)。因此，本发明提供了在受试者(例如，人受试者)中诱导响应正痘病毒(例如，痘苗病毒)的免疫反应的方法和用于该方法的组合物(例如，包含正痘病毒(例如，痘苗病毒(VV))的纳米乳剂)。在优选实施方案中，将本发明提供的诱导免疫反应的方法用于接种。由于现有正痘病毒(例如，天花)疫苗的有害事件的发生率，本发明在不削弱疫苗功效的情况下，提供了正痘病毒(例如，天花)接种安全性的显著提高。例如，本发明描述了在粘膜施用(例如，粘膜接种)独特类型的灭活的正痘病毒(例如，VV)制备物(在本发明的开发过程中鉴定和表征的)后，受试者中免疫(例如，VV免疫)的发生。将纳米乳剂(NE)(表面活性抗微生物材料)与高度纯化的细胞培养物来源的VV混合，从而得到在室温下稳定的(例如，在一些情况下，稳定超过2周，更优选超过3周，甚至更优选超过4周和最优选超过5周)的制剂(例如，NE杀死的VV组合物)和可用于在受试者中诱导抗正痘病毒(例如，VV)的免疫反应的制剂(例如，可单独地使用或作为佐剂用于诱导抗VV免疫反应)。对受试者粘膜施用包含NE和VV(例如，NE杀死的VV)的组合物产生高滴度的粘膜和全身性抗体反应以及特定的Thl细胞免疫(参见，例如，实施例2-4和6)。此外，所有动物完全受到保护而免受使用10xLDs。VV的鼻滴注攻击(参见，例如，实施例7，图5)。在已接种的动物中，感染完全被预防或只有低水平和自身限制，并在4至5天感染消失。相反地，所有未免疫的动物在该时期内死亡。使用100xLD的VV-WR的对已免疫的小鼠进行随后的再攻击确证了保护性免疫。施用甚至单剂量的包含NE-杀死的VV的组合物的小鼠在施用后10至12周产生显著的抗VVIgG血清浓度(参见，例如，实施例2)。该水平的反应与在相似的时间点通过肌内注射活VVWyeth免疫的Balb/c小鼠中获得的结果相当(参见，例如，Coulibaly等人，Virology,2005;341;91-101)。因此，在一些实施方案中，本发明提供单次施用(例如，反应(例如，保护性免疫(例如，粘膜和全身性免疫;)。在一些实施方案中，对受试者的随后施用(例如，在初次施用后的一次或多次增强施用)在受试者中诱导针对VV的增强的免疫反应。因此，本发明证明对受试者施用包含NE杀死的VV的组合物提供了抗天花的保护性免疫。相反，具有或不具有纳米乳剂的福尔马林杀死的VV的鼻内滴注产生不一致的和低的抗体反应，该抗体反应甚至在第三次免疫后仍然不增强(参见，例如，实施例2)。在血清和支气管肺泡灌洗液(BAL)中也检测到相似的中和活性模式，中和活性在用福尔马林杀死的病毒粘膜接种的小鼠中不存在。在通过IP或SQ注射活病毒的接种的动物的BAL中未检测到中和活性。尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，但在一些实施方案中，NE处理(例如，用本发明的NE中和正痘病毒(例如，VV))保护了重要的病毒中和表位(例如，可被受试者的免疫系统识别的)、在乳剂的油和水交界面中稳定它们的疏水和亲水组分(例如，从而提供了一种或多种受试者可对其发动免疫反应的免疫原(例如，稳定的抗原))。在其他实施方案中，因为已知NE制剂通过小孔穿过粘膜，因此，它们可将病毒蛋白质运送至粘膜下层定位的树突细胞(例如，从而引发和/或刺激免疫反应)。树突细胞贪婪地吞噬NE油滴，这可提供内化免疫原性蛋白用于抗原递呈的方法。尽管其他疫苗依赖于炎性毒素或用于佐剂活性的其他免疫刺激(参见，例如，Holmgren和Czerkinsky，NatureMed.2005，11;45-53)，但当在对动物和人的研究中置于皮肤或粘膜上时，NE未曾显示出炎性。因此，尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，但在一些实施方案中，包含本发明的NE的组合物(例如包含NE灭活的正痘病毒(例如，VV)的组合物)可用作"物理，，佐剂(例如，转运和/或递呈正痘抗原(例如，牛痘蛋白)至免疫系统)。在一些优选实施方案中，本发明的组合物的粘膜施用产生粘膜以及全身性免疫(例如，粘膜免疫的信号(例如，IgA抗体滴度的产生))。细胞和体液免疫都在抗正痘病毒的保护中起作用，使用NE制剂诱导这两种免疫(参见，例如，实施例2-4和6)。据认为牛痘特异性抗体滴度对于估计接种的人受试者中和动物模式中的保护性免疫是重要的(参见，例如，Hammarlund等人，Nat.Med.2003，9;1131-1137)。几项研究已鉴定了对于中和抗体的引发重要的蛋白质(参见，例如，Galmiche等人，Virology,1999，254;71-80;Hooper等人，Virology,2003,306;181-195)。获得批准的天花疫苗(Dryvax)稀释物在人志愿者中的最近试验证实脓疱的形成与2种特定抗体的产生和细胞毒T淋巴细胞(CTL)的诱导以及提高的INF-yT细胞反应强烈相关(参见，例如，Greenberg等人，2005,365;398-409)。IFN-y的诱导暗示着特定的MHCI类限制性的CD8+T细胞的活化。这些类型的细胞牵涉到牛痘感染的细胞的识别和清除，以及接种后免疫的维持(参见，例如，Earl等人，Nature,2004;482;182-185;Hammarlund等人，Nat.Med.2003，9;1131-1137;Edghill-Smith等人，NatureMed.2005，11;740-747)。因此，在一些实施方案中，对受试者施用(例如，粘膜施用)本发明的组合物(例如，NE杀死的正痘病毒(例如，VV))导致对体液(例如，特定抗体的产生)和细胞(例如，细胞毒T淋巴细胞)免疫反应(例如，抗天花病毒)两者的诱导。在一些优选实施方案中，本发明的組合物(例如，NE杀死的正痘病毒(例如，VV))用作天花疫苗。此外，在一些实施方案中，本发明的组合物(例如，NE杀死的正痘病毒(例如，VV))诱导(例如，当对受试者施用时)全身性和粘膜免疫两者。因此，在一些优选实施方案中，对受试者施用本发明的组合物导致抗暴露(例如，致死性粘膜暴露)于正痘病毒(例如，VV))的保护。尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，但粘膜施用(例如，接种)提供了抗病正痘病毒(例如，VV)感染(例如，在粘膜表面开始的)的保护。尽管迄今已证明难以刺激分泌性IgA反应和抗在粘膜表面侵入的病原体的保护(参见例如，Mestecky等人，MucosalImmunology.第3版.(AcademicPress,SanDiego,2005))，但本发明提供了用于在受试者中刺激来自病原体的粘膜免疫(例如，保护性IgA反应)的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明提供了用作粘膜疫苗的组合物(例如，NE灭活的正痘病毒(例如，VV)制剂)。可容易地从纯化的病毒产生该材料(参见，例如，实施例1)，所述材料诱导粘膜和全身性免疫(参见，例如，实施例2-7)。快速产生该制剂的能力和通过粘膜滴注施用该制剂提供了可用于大规模暴发或突发紧急情况的疫苗在一些实施方案中，本发明提供了用于产生免疫反应的组合物和使用该组合物(例如，以用作疫苗)的方法。在一些优选实施方案中，用于产生免疫反应的组合物包含NE和免疫原(例如，被纳米乳剂灭活的正痘病毒(例如，VV))。当对受试者施用时，本发明的组合物在受试者中刺激抗免疫原(例如，正痘病毒(例如，VV))的免疫反应。尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，但在一些实施方案中，免疫反应的产生(例如，由施用包含纳米乳剂和正痘病毒(例如，VV)的组合物导致的)的产生提供了对受试者的完全或部分免疫(例如，根据疾病(例如，天花)的体征、病症或病况)。不受任何特定理论的束绰，在暴露于包含正痘病毒(例如，VV)的纳米乳剂后的针对疾病的防护和/或免疫(例如，受试者的免疫系统预防或减弱(例如，抑制)疾病的体征、症状或病况的能力)40归因于适应性(例如，获得性)免疫反应(例如，在暴露于本发明的包含正痘病毒(例如，VV)的NE后，由B和T细胞介导的免疫反应(例如，表现出增加的对正痘病毒(例如，VV)的特异性和反应性的免疫反应))。在一些实施方案中，单独地施用包含免疫原(例如，被NE灭活的正痘病毒(例如，VV))的NE。在一些实施方案中，包含NE和免疫原(例如，被NE灭活的正痘病毒(例如，VV))的组合物包含一种或多种其他试剂(例如，药学上可接受的栽体、佐剂、赋形剂等)。在一些实施方案中，以诱导体液免疫反应的方式施用用于刺激本发明的免疫反应的组合物。在一些实施方案中，以诱导细胞(例如，细胞毒T淋巴细胞)免疫反应而非体液反应的方式施用用于刺激本发明的免疫原的组合物。在一些实施方案中，包含NE和本发明的免疫原的组合物诱导细胞和体液免疫反应两者。本发明不受限于所使用的(例如，在包含免疫原的免疫原性组合物中使用的)NE的类型。事实上，多种NE组合物可用于本发明。例如，在一些实施方案中，纳米乳剂(例如，用于正痘病毒(例如，VV)的灭活)包含(i)水相；(ii)油相；和至少一种其他的化合物。在本发明的一些实施方案中，将这些其他的化合物混合入组合物的水相或油相。在其他实施方案中，将这些其他的化合物混合入具有之前乳化的油和水相的组合物。在某些实施方案中，在即将使用之前，将一种或多种其他的化合物混合入现有的乳剂组合物。在其他实施方案中，在即将使用组合物之前，将一种或多种其他的化合物混合入现有的乳化组合物。适合用于本发明的纳米乳剂的其他化合物包括但不限于一种或多种有机物，更特别地，基于有机磷酸盐的溶剂、表面活性剂和去垢剂、含阳离子卣素的4匕合物(cationichalogencontainingcompound)、萌发增强剂、相互作用增强剂、食品添加剂(例如，调味剂、增甜剂、膨胀剂等)和药学上可接受的化合物。下面提供用于本发明的组合物的各种化合物的某些示例性实施方案。几种病原性微生物通过附着至内附胃肠道、口咽道、呼吸道或生殖泌尿道的粘膜上皮细胞而引发感染。一些病原体，例如流感病毒、百曰咳博德特氏菌或霍乱弧菌，保留在粘膜组织上或其内，然而其他病原体，例如，伤寒沙门氏菌或甲型肝炎病毒，具有允许穿透至更深层组织和全身性扩散的机制。粘膜的特异性和非特异性防御机制提供了抗两种类型的病原体的第一线保护。非特异性效应器包括驻留型巨噬细胞、抗微生物肽、乳铁蛋白和溶菌酶、极端pH、胆汁酸、消化酶、粘液、上皮细胞的脱落、冲洗机制(蠕动、纤毛搏动、排尿等)和来自区域植物区系的竟争。然而，成功的病原体通常已进化出经历它们感染的位置上出现的非特异性防御而存活的方法，分泌性免疫系统在保护免受由许多细菌和病毒病原体引起的疾病中起着主要作用，抗病原体的主要效应器限定在粘膜表面。对于全身性扩散的生物，最佳免疫需要局部和全身性免疫反应两者。炭疽是由炭疽芽胞杆菌(Ac/7/"fl/7"rac/s)引起的传染性细菌疾病。其最主要发生在野生的和驯养的食草动物(绵羊、山羊、骆驼、羚羊、牛等)，但也可发生在人中。感染可通过皮肤暴露，通过摄食(胃肠道炭疽)或通过吸入(肺炭疽)发生。人中95%的炭疽感染通过皮肤感染发生，在农业环境中与未接种的、受感染的动物接触，或通过在工业环境中处理被污染的动物产品(肉、皮革、兽皮、毛发、羊毛等)。如果不治疗，在大约20°/。的病例中的皮肤炭疽(Cutaneousanthrax)是致命的，但其通常可通过合适的抗菌疗法克服。吸入性炭疽或胃肠道炭疽感染要严重得多且更难以治疗。吸入性炭疽导致呼吸休克，在90%-100%的病例中是致命的；胃肠道炭疽导致严重的发烧、恶心和和呕吐，在25%-75%的病例中导致死亡。在1950年代和1960年代在美国开发了抗炭疽的有效疫苗，疫苗在1970获得FDA的批准。炭疽空气传播的威胁仍然处于历史上最高度威胁，因为炭疽芽胞杆菌已被鉴定为用于生物战的可能的试剂。然而，历史上只有处于高风险的个体例如兽医、家畜管理者、剪羊毛者、屠宰场工人等需要考虑接受接种，部署生物武器的可能性的对军事人员的威胁使美国军队在1997年采用大规模的炭疽接种程序，在该程序下，旨在对所有服务部门中的二百四十万军事人员施用炭疽疫苗。(参见，例如，SecretaryofDefense,MemorandumforSecretariesoftheMilitaryDepartments等人，May18，1998，ImplementationoftheAnthraxVaccinationProgramfortheTotalForce)。唯一的大规模生产的炭疽疫苗，吸附性炭疽疫苗(AnthraxVaccineAdsorbed或AVA，商业名称BI0THRAX)，是加入了<0.02%的甲醛和0.0025%的千索氯铵的，吸附至氢氧化铝(明矾)佐剂的炭疽芽胞杆菌的减毒林的非传染性无菌滤液。(参见，例如，Friedlander等人，JAMA，282(22):2104-2106(1999))。接种过程由在18个月内6次皮下注射0.5mL剂量的疫苗组成，一年一次加强以保持免疫。基于动物研究和偶发的人数据，据认为该接种提供了具有90%-100°/。有效抗气溶胶炭疽攻击的免疫。(参见，例如，Friedlander等人，同上)。虽然AVA具有适度的功效，但所使用的疫苗林系(炭疽芽胞杆菌的非蛋白水解、不包有囊膜的的突变林，V770-NP1-R)具有几个不利的特征虽然其发生突变，但该林系保留了产孢子和完全产毒素的表型，在疫苗生产中使用完整的林系导致保护性抗原(PA)水平在批次与批次之间的差异，以及包含PA降解产物和其他细菌产物(参见，例如，Farchaus，J.，等人，Applied&EnvironmentalMicrobiol.,64(3):982-991(1998))。此外，报导的施用引起的副作用从常见的注射部位的肺胀和触痛至全身反应(不适、疲乏、发烧、风寒)以及脱发、肌痛、慢性疲劳、牙痛和牙龈痛、唾液粘稠、灼伤样皮肤反应、快速体重减轻、一过性黑蒙(blackout)和至少一个死亡。(参见，例如，ChicagoTribune,Mysteriousillnessesstrikesomegulfvets,Mar.26，1992，p.2;TheWashingtonPost,TheNationinBrief,Sep.29，2000，SectionA，p.34)。有些人声称炭疽疫苗被角篁烯污染(参见，例如，Garret,L.，BigBattleOverVaccine:DetractorsSayImmunizationforAntrhaxHazardous;PentagonSaysNo,TheBeaconJournal(Akron),SundayJul.4，1999，SectionB，p.1)，其已导致数百军事人员拒绝接种(参见，例如，Graham,B.，SomeinMilitaryFearAnthraxInoculationSideEffects,ThePlainDealer(Cleveland),第26巻，1998,Section:National,p.6E;AirForceReservePilotsQuittingDuetoVaccine,ThePlainDealer(Cleveland),Feb.27，1999，Section:National,p.6A)。等级高至少校的军事人员已接受来自军事部门的军法审判和免职而不接受炭疽疫苗。(参见，例如，Eskenazi,M.，HowAnthraxCausesEarlyRetirement,TIME,com,Mar.31,2000.)。因此，存在对用于抗炭疽和由杆菌属的细菌引起的疾病的免疫的改进型组合物的巨大需要，该改进型组合物有效地产生抗炭疽芽胞杆菌的免疫反应。可理想地配制无污染物(例如，能够产生不想要的副作用)的这种组合物，其不需要长时间的接种而有效。因此，本发明提供了在受试者(例如，人受试者)中诱导对芽胞杆菌属的细菌(例如，炭疽芽胞杆菌)的免疫反应的方法和用于该方法的组合物(例如，包含芽胞杆菌属(例如，炭疽芽胞杆菌)的细菌或细菌组分(例如，分离的或重组的蛋白质)的纳米乳剂)。在优选实施方案中，将本发明提供的诱导免疫反应的方法用于接种。由于现有芽胞杆菌(例如，炭疽芽胞杆菌)的有害事件的比率，本发明在不削弱疫苗功效的情况下，提供了芽胞杆菌(例如，炭疽芽胞杆菌)接种安全性的显著提高。例如，本发明描述了在用包含纳米乳剂和来自炭疽芽胞杆菌的免疫原性蛋白(例如，rPA)的组合物(在本发明的开发过程中产生和表征的免疫原性蛋白)粘膜施用(例如，粘膜接种)后，受试者中免疫(例如，炭疽芽胞杆菌免疫)的发生(参见实施例8-16)。将纳米乳剂(NE)(表面活性抗菌材料)与重组保护性抗原(rPA)混合，得到包含NE和rPA的免疫原性组合物，其在室温下稳定(例如，在一些实施方案中，稳定超过2周，更优选超过3周，甚至更优选超过4周和最优选超过5周)并可用于在受试者中诱导抗炭疽芽胞杆菌的免疫反应(例如，可单独或作为佐剂使用用于诱导抗炭疽芽杆菌的免疫反应)。对受试者粘膜施用包含NE和rPA的组合物导致高滴度粘膜和全身性抗体反应以及特异性Thl细胞免疫(参见，例如，实施例11-12、14-16)。此外，来自用包含NE和rPA的组合物鼻内免疫的小鼠的血清能够中和PA对其受体(ATR受体)的结合(参见实施例13)。施用了两个剂量的包含NE和rPA的组合物的小鼠和只施用了单个剂量的包含NE和rPA的组合物的豚鼠在施用后，产生了显著的抗rPAIgG的血清浓度(参见，例如，实施例ll)。此外，施用了该组合物的小鼠产生粘膜免疫反应(例如，针对rPA的IgA抗体)(参见实施例12)。因此，在一些实施方案中，本发明提供了，施用(例如，粘膜施用)包含NE和炭疽芽胞杆菌免疫原(例如，rPA)的组合物足以在受试者中诱导抗炭疽芽胞杆菌的保护性免疫反应(例如，保护性免疫(例如，粘膜和全身性免疫))。在一些实施方案中，对受试者的随后施用(例如，在初次施用后一次或多次加强施用)在受试者中提供了对炭疽芽胞杆菌的增强的免疫反应的诱导。因此，本发明证明对受试者施用包含NE和炭疽芽胞杆菌免疫原(例如，rPA)的组合物提供了抗炭疽的保护性免疫(例如，通过持久的抗PAIgG反应)。相反地，单独的NE或NE与CpG佐剂一起的鼻内滴注不能诱导抗炭疽芽胞杆菌的免疫反应(参见实施例11-13)。此外，单独施用rPA(例如，在盐溶液中)在小鼠中不诱导显著的IgG或IgA抗体产生。尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，但在一些实施方案中，组合NE和免疫原性蛋白(来自炭疽芽胞杆菌的rPA)稳定rPA(参见实施例9)并提供了用于产生免疫反应的合适的环境。在其他实施方案中，因为已知NE制剂通过小孔穿过粘膜，因此它们可以将免疫原性蛋白运送至粘膜下层定位的树突细胞(例如，从而引发和/或刺激免疫反应)。在一些实施方案中，当NE用于灭活牙胞杆菌属的细菌(例如，炭疽芽胞杆菌)时，组合细菌和NE保护了重要的免疫原性表位(例如，可被受试者的免疫系统识别的)、稳定了乳剂的油和水交界面中的它们的疏水性和亲水性组分(例如，从而提供了一种或多种抗受试者可对其产生免疫反应的免疫原(例如，稳定的抗原))。树突细胞贪婪地吞噬NE油滴，这可提供内化免疫原性蛋白用于抗原递呈的方法。尽管其他疫苗依赖于炎性毒素或用于佐剂活性的其他免疫刺激(参见，例如，Holmgren和Czerkinsky，NatureMed.2005,11;45-53)，但当在对动物和人中的研究中置于皮肤或粘膜上时，NE未曾显示出炎性。因此，尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，但在一些实施方案中，包含本发明的NE的组合物(例如，包含NE和一种或多种芽胞杆菌蛋白(例如，rPA)的组合物)可用作"物理"佐剂(例如，转运和/或递呈芽胞杆菌蛋白至免疫系统(例如参见实施例10))。在一些优选实施方案中，本发明的组合物的粘膜施用产生粘膜以及全身性免疫(例如，粘膜免疫的信号(例如，IgA抗体滴度的产生))。细胞和体液免疫都在抗芽胞杆菌(例如，炭疽芽胞杆菌)的保护中起作用，都被NE制剂所诱导(参见，例如，实施例11-16)。因此，在一些实施方案中，对受试者施用(例如粘膜施用)本发明的组合物导致对体液(例如，特定抗体的发生)和细胞(例如，细胞毒T淋巴细胞)免疫反应(例如，抗芽胞杆菌蛋白的)。在一些优选实施方案中，本发明的组合物(例如，包含NE和芽胞杆菌蛋白(例如，rPA)的组合物)用作炭疽疫苗。此外，在优选实施方案中，本发明的组合物诱导(例如，当对受试者施用时)全身性和粘膜免疫两者。因此，在一些优选实施方案中，对受试者施用本发明的组合物导致抗暴露(例如，致死粘膜暴露)于炭疽芽胞杆菌的保护(参见实施例8和9)。尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，但粘膜施用(例如，接种)提供了抗芽胞杆菌感染(例如，在粘膜表面引发的)保护。虽然迄今已证明难以刺激分泌性IgA反应和抗在粘膜表面侵入的病原体的保护(参见例如，Mestecky等人，MucosalImmunology.46第3版.(AcademicPress,SanDiego，2005))，但本发明提供了用于在受试者中刺激来自病原体的粘膜免疫(例如，保护性IgA反应)的纟且合物和方法。在一些实施方案中，本发明提供了用作粘膜疫苗的组合物(例如，包含NE和炭疽芽胞杆菌免疫原(例如，rPA)的组合物)。可用NE和重组蛋白容易地产生该材料(参见，例如，实施例1)，该材料诱导粘膜和全身性免疫两者(参见，例如，实施例11-16)。快速产生该制剂和通过经鼻滴注法施用该制剂的能力提供了可用于大规模暴发或紧急突发情况的疫苗。在一些优选实施方案中，本发明提供了用于产生免疫反应的组合物，其包含NE和免疫原(例如纯化的、分离的或合成的芽胞杆菌蛋白或其衍生物、变体或类似物；或被纳米乳剂灭活的芽胞杆菌属的细菌)。当对受试者施用时，本发明的组合物在体内刺激抗免疫原的免疫反应。尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，但在一些实施方案中，免疫反应的产生(例如，由于施用包含纳米乳剂和重组芽胞杆菌蛋白的组合物导致的)对受试者提供了完全或部分免疫(例如，根据疾病(例如，炭疽)的体征、症状和病况)。不受任何特定理论的束縳，在暴露于本发明的免疫原性组合物后，对疾病的保护和/或免疫(例如，受试者的免疫系统预防或减弱(例如，抑制)疾病的体征、症状或病况的能力)源于适应性(例如，获得性)免疫反应(例如，在暴露于包含本发明的重组芽胞杆菌蛋白的NE后，由B和T细胞介导的免疫反应(例如，显示增加的对芽胞杆菌的特异性和反应性的免疫反应))。在一些实施方案中，单独地施用包含免疫原(例如，重组芽胞杆菌蛋白)的NE。在一些实施方案中，包含NE和免疫原(例如，重组芽胞杆菌蛋白)的组合物包含一种或多种其他试剂(例如，药学上可接受的栽体、佐剂、赋形剂等)。在一些实施方案中，以诱导体液免疫反应的方式施用用于刺激本发明的免疫反应的组合物。在一些实施方案中，以诱导细胞(例如，细胞毒T淋巴细胞)免疫反应而非体液反应的方式施用刺激本发明的免疫反应的组合物。在一些实施方案中，本发明的包含NE和免疫原的组合物诱导细胞和体液免疫反应两者。本发明不受限于所使用的NE(例如，包含免疫原的免疫原性组合物中的)的类型。事实上，多种NE组合物可用于本发明。例如，在一些实施方案中，纳米乳剂包含(i)水相；(ii)油相；和至少一种其他的化合物。在本发明的一些实施方案中，将这些其他的化合物混合入组合物的水相或油相。在其他实施方案中，将这些其他的化合物混合入之前乳化的油相和水相的组合物中。在这些实施方案的某些实施方案中，将一种或多种其他化合物在其即将使用之前混合入现有的乳剂组合物。在其他实施方案中，在将一种或多种其他的化合物在组合物即将使用之前混合入现有的乳剂组合物。适合用于本发明的纳米乳剂的其他化合物包括，但不限于，一种或多种基于有机物，和更特别地有机磷酸盐的溶剂、表面活性剂和去垢剂、含阳离子囟素的化合物、萌发增强剂、相互作用增强剂、食品添加剂(例如，调味剂、增甜剂、膨胀剂等)和药学上可接受的化合物。下面显示涉及用于本发明的组合物的各种化合物的某些示例性实施方案。HIV包膜糖蛋白gpl20是用于附着至宿主细胞的病毒蛋白。通过与辅助T细胞的两个表面分子和噬菌体(称为CD4和两个趋化因子受体CCR-4或CXCR-5中的一个)结合来介导该附着。gpl20蛋白首先表达为更大的前体分子(gp160)，然后翻译后切割得到gpl20和gp41。gpl2t)蛋白通过与插入病毒膜的gp41分子连接而保留在病毒体的表面。gpl20蛋白是中和抗体的主要的靶。gpl20蛋白的最具免疫原性的区域(V3环)也是该蛋白质的最可变的部分。gpl20蛋白还包含被细胞毒T淋巴细胞(CTL)识别的表位。这些效应细胞能够消除病毒感染的细胞，从而构成了第二个主要的抗病毒免疫机制。与中和抗体的靶区相反，一些CTL表位在不同的HlV林系之间表现相对保守。为此，gp120和gpl60被认为是旨在引起细胞介导的免疫反应(特别地CTL)的疫苗中的有用的抗原性组分。已开发了几种类型的gpl20免疫性抗原(l)从HIV感染的组织培养细胞获得的纯化的gpl20(本文称为"病毒衍生的gpl20");(2)在重组病毒例如牛痘或杆状病毒感染的细胞中产生的gpl20(本文称为"活病毒载体来源的gpl20和gpl60，，)；(3)哺乳动物细胞中产生的重组gpl20(本文称为"重组哺乳动物gpl20");(4)代表gpl20和gp41的所有或不同部分的重组变性多肽(本文称为"重组变性抗原")；和(5)代表gpl20和gp41的小片段的肽(本文称为"肽")。一般而言，这些免疫原性抗原中的每一个作为佐剂，在多种物种是具有高度免疫原性的。它们已产生能够中和HIV-1的同源分离林的抗体。中和的水平未(大体上)达到被感染的人中发现的中和滴度的水平，并且在产生免疫原性组合物中存在许多困难，所述免疫原性组合物产生对HIV的多个林系(例如，除了免疫原性抗体所来源的林系外的林系)的免疫。当制备HIV-l疫苗时，特别难以克服的另一个因素是序列多样性。HIV-1和HIV-2的特征在于具有非常高水平的序列多样性，这在包膜的gpl20部分中最明显。该序列多样性聚集在称为高可变区的区域。许多人提出使用包含来源于多种HIV分离林的抗原性物质的疫苗混合物，以提供抗广i瞽性感染源的保护。本发明非常适合用于递送包含来源于多种HIV分离林的多种HIV抗原性物质。因此，仍然需要能够诱导抗HIV的中和抗体的免疫原性物质，优选使用诱导抗广谱的HIV分离株的中和抗体的单个原料物质。此外，十分需要能够诱导对HIV的全身性和粘膜免疫的物质，因为人最通常暴露于HIV的表面之一是阴道粘膜。因此，本发明提供了在受试者(例如人受试者)中诱导针对HIV的免疫反应的方法和用于该方法的组合物(例如，包含HIV或HIV组分(例如，分离的或重组的HIV蛋白)的纳米乳剂)。在一些实施方案中，由本发明提供的诱导免疫反应的方法用于接种。由于现有HIV疫苗的有害事件的比率，在不削弱疫苗的功效的情况下，本发明提供了HIV接种安全性上的显著提高。例如，本发明描述了在用包含纳米乳剂和来自HIV的免疫原性蛋白(例如，重组gpl20)(在本发明的开发过程中产生和表征的)粘膜施用(例如，粘膜接种)后，受试者中免疫(例如，HIV免疫)的发生(参见实施例17-23)。将纳米乳剂(NE)(表面活性抗微生物材料)与来自BaL或SF162血清型的重组gpl20混合，产生包含NE和重组gpl20的免疫原性组合物，其在室温下稳定(例如，在一些实施方案中，稳定超过2周，更优选超过3周，甚至更优选超过4周和最优选超过5周)并可用于在受试者中诱导抗HIV的免疫反应(例如，可单独地使用或作为佐剂用于诱导抗HIV免疫反应)。对受试者粘膜施用包含NE和HIV免疫原(例如，重组gpl20)的组合物导致高滴度粘膜和全身性抗体反应并产生Thl型细胞免疫反应(参见，例如，实施例17、18和21)。此外，产生的抗gpl20的一种血清型的抗体与其他gpl20血清型交叉反应(参见，例如，实施例19)。此外，用包含NE和重组gpl20的组合物鼻内免疫的小鼠产生粘膜分泌的抗gpl20特异性IgA抗体，其在支气管和阴道粘的膜表面都可检测到的(参见实施例20)。因此，施用了本发明的组合物的小鼠产生针对HIV的粘膜免疫反应。施用了包含NE和重组gpl20的小鼠中产生的免疫反应也能够中和HIV(参见实施例22)。因此，在一些实施方案中，本发明提供了，施用(例如，粘膜施用)包含NE和HIV免疫原(例如，重组gpl20)的组合物足以在受试者中诱导抗HIV的保护性免疫反应(例如，保护性免疫(例如，粘膜和全身性免疫))。在一些实施方案中，对受试者的随后施用(例如，在最初的施用之后的一次或多次加强施用)在受试者中提供了对HIV的增强的免疫反应的诱导。因此，本发明证明对受试者施用包含NE和HIV免疫原(例如，重组gpl20)的组合物提供了抗AIDS的保护性免疫。尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，但在一些实施方案中，组合NE和来自一个或多个HIV的血清型的HIV免疫原(例如，重组gpl20)稳定HIV免疫源(例如，重组gpl20)并提供了用于产生免疫反应的合适的物质。在其他实施方案中，因为已知NE制剂通过小孔穿过粘膜，因此它们可以将免疫原性蛋白运送至粘膜下层定位的树突细胞(例如，从而引发和/或刺激免疫反应)。尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，但在一些实施方案中，NE处理(例如，用本发明的NE中和HIV)保护了重要的病毒中和表位(例如，可被受试者的免疫系统识别的表位)、在乳剂的油和水交界面中稳定它们的疏水和亲水组分(例如，从而提供了一种或多种受试者可对其发动免疫反应的免疫原(例如，稳定的抗化))。在其他实施方案中，因为已知NE制剂通过小孔穿过粘膜，因此，它们可以将病毒蛋白质运送至粘膜下层定位的树突细胞(例如，从而引发和/或刺激免疫反应)。树突细胞贪婪地吞噬NE油滴，这可提供内化免疫原性蛋白以进行抗原递呈的方法。尽管其他疫苗依赖于炎性毒素或用于佐剂活性的其他免疫刺激(参见，例如，Holmgren和Czerkinsky，NatureMed.2005，11;45-53)，但当在对动物和人的研究中置于皮肤或粘膜上时，NE未曾显示出炎性。因此，尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，但在一些实施方案中，包含本发明的NE的组合物(例如包含NE和来自HIV的一个或多个血清型的重组HIV蛋白(例如，gpl20)的组合物)可用作"物理"佐剂(例如，转运和/或递呈HIV蛋白(例如，gpl20)至免疫系统)。在一些优选实施方案中，本发明的组合物的粘膜施用产生粘膜以及全身性免疫(例如，粘膜免疫的信号(例如，IgA抗体滴度的产生))。细胞和体液免疫都在抗HIV的保护中起作用，使用NE制剂诱导这两种免疫(参见，例如，实施例18-22)。因此在一些实施方案中，对受试者施用(例如，粘膜施用)本发明的组合物导致体液(例如，特定抗体的产生)和细胞(例如，细胞毒T淋巴细胞)免疫反应(例如，抗HIV蛋白(gpl20))两者的诱导。在一些优选实施方案中，本发明的组合物(例如，包含NE和来自HIV的一种或多种血清型的重组gpl20)用作AIDS疫苗。此外，在一些实施方案中，本发明的组合物诱导(例如，当对受试者施用时)全身性和粘膜免疫两者。因此，在一些优选实施方案中，对受试者施用本发明的组合物导致抗暴露(例如，粘膜暴露)于HIV的保护。尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，但粘膜施用(例如，接种)提供了抗病HIV感染(例如，在粘膜表面开始的)的保护。尽管迄今已证明难以刺激分泌性IgA反应和抗在粘膜表面侵入的病原体的保护(参见例如，Mestecky等人，MucosalImmunology.第3版.(AcademicPress,SanDiego，2005))，但本发明提供了用于在受试者中刺激来自病原体的粘膜免疫(例如，保护性IgA反应)的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明提供用作粘膜疫苗的组合物(例如，包含NE和来自HIV的免疫原性蛋白抗原(gpl20)的组合物)。可用NE和HIV蛋白(例如，病毒来源的gpl20、活病毒载体来源的gpUO和gpl60、重组哺乳动物gpl20、重组变性抗原、gpl20和gp41的小肽片段、V3环肽(参见例如实施例17))容易地产生该材料，该材料诱导粘膜和全身性免疫(参见，例如，实施例18-22)。快速产生该制剂和通过粘膜(例如，鼻的或阴道的)滴注法施用该制剂的能力提供了可用于大规模施用(例如，对城镇、乡村、城市、州或国家的人群)的疫苗。在一些优选实施方案中，本发明提供了用于产生免疫反应的组合物，其包含NE和免疫原(例如纯化的、分离的或合成的HIV蛋白或其衍生物、变体或类似物；或被纳米乳剂灭活的HIV的一种或多种血清型)。当对受试者施用时，本发明的组合物在受试者中刺激抗免疫原的免疫反应。尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，但在一些实施方案中，免疫反应的产生(例如，由于施用包含纳米乳剂和免疫原的组合物导致的)对受试者提供了完全或部分免疫(例如，根据疾病(例如，AIDS)的体征、症状或病况)。不受任何特定理论的束缚，在暴露于本发明的免疫性组合物后，对疾病的保护和/或免疫(例如，受试者的免疫系统预防或减弱(例如，抑制)疾病的体征、症状或病况的能力)源于适应性(例如，获得性)免疫反应(例如，在暴露于包含本发明的免疫原的NE后，由B和T细胞介导的免疫反应(例如，显示增加的对HIV的特异性和反应性的免疫反应))。因此，在一些实施方案中，本发明的组合物和方法预防性或治疗性地用于预防或减弱与AIDS相关的体征、症状或病况。在一些实施方案中，单独地施用包含免疫原(例如，重组HIV蛋白)的NE。在一些实施方案中，包含NE和免疫原(例如，重組HIV蛋白)的组合物包含一种或多种其他试剂(例如，药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂等)。在一些实施方案中，以诱导体液免疫反应的方式施用用于刺激本发明的免疫反应的组合物。在一些实施方案中，以诱导细胞(例如，细胞毒T淋巴细胞)免疫反应而非体液反应的方式施用用于刺激本发明的免疫原的组合物。在一些实施方案中，包含NE和本发明的免疫原的组合物诱导细胞和体液免疫反应两者。B.病原体本发明不限于任何一种特定类型的病原体的用途。事实上，用于产生针对多种病原体的免疫反应(例如，用作疫苗)的组合物(例如，包含NE和免疫原)在本发明的范围内。因此，在一些实施方案中，本发明提供了用于产生针对细菌病原体(例如，营养或芽孢形式)的免疫反应的组合物，所述细菌病原体包括但不限于蜡状芽胞杆菌(勘ci7/i/scerezAJ)、环状芽胞杆菌(勘c/"^c/價/a/)和巨大芽胞杆菌(^sc/77i/s迈egsfei"/i/iZ7)、炭症芽胞軒菌(Aac/7/usa/^力rac/s)、布鲁氏菌属(Srwce//fl)的细菌、霍^L弧菌(f76r/'oc力o/era)、4白氏立克次氏体(Co;r/e77a6i/i7ze〃/)、土拉热弗朗西丝氏菌(^"c/se/Zfl^/are"^)、鹦鹬热衣原体(C力/a/zzWaps/〃ac/)，荛麻(A/c/z7i^co鹏"/7/s)、普氏立克次氏体(A/ci:e""'a/i"o附zeh7)、沙门氏菌属的细菌(例如，伤寒沙门氏菌(S.typhi))、志贺氏菌属(sA/ge//a)的细菌、小球隐孢子虫(Co77"s/7or/cr/w/z7/7sr「咖)、类鼻疽伯克氏菌(Swrir力oif/er/flpsei/i/o/za//e/)、产气荚膜梭菌("o"r//"边尸er/V/;^e/^)、肉毒梭菌(C7o"r/d/"边60&///2"迈)、霍乱弧菌(K/6Woc力o/erae)、化脓链球菌("Te;7fococcws/7"ge"es)、无乳链球菌(5^re/7tococcwsaga/a"/ae)、肺炎链球菌(^repCoccus/w3e咖0/2/a)、金色链球菌(5^fl/7力jK/ococcwsaurei/s)、淋病奈瑟氏球菌(^s/sser/s《o"ori"力ea)、流感嗜血杆菌(i^se節/7力//7/7we/7zae)、大肠杆菌(^yc力er/c力/aco//)、鼠4另寒沙'门氏菌(^<3/边0/76//3OT^^^r/z;/z7)、痢疾志贺氏菌(5^e"a加e/7fer/ae)、奇异变形菌(户rofe"s范/ra6/7/s)、绿脓假单胞菌(aer"^7/2c^a)、鼠疫杆菌(rers//7/ape"/s)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(rers/"iae自roco"〃ca)和假结核耶尔森菌(fers/"yfl/^ew^^6erci/7os")。在其他实施方案中，本发明提供了用于产生针对病毒病原体的免疫反应的组合物，所述病原体包括，但不限于，甲型流感病毒、家禽流感病毒、H5N1流感病毒、西尼罗病毒、SARS病毒、马尔堡病毒(Marburgvirus)、沙粒病毒(Arenaviruses)、尼帕病毒、曱病毒(alphaviruses)、纤丝病毒(filoviruses)、单纯疱渗病毒I、单纯疱渗病毒II、仙台病毒、辛德毕斯病毒、牛痘、细小病毒(parvovirus)、人免疫缺陷症病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、细巨胞病毒、人乳头状瘤病毒、细小RNA病毒(picornavirus)、汉坦病毒、胡宁病毒(juninvirus)和埃博拉病毒)。在其他实施方案中，本发明提供了用于产生针对真菌病原体的免疫反应的组合物，所述真菌病原体包括但不限于白色念珠菌(Candidaalbicnas)和平滑假丝酵母(Ca/2i/油para/^/Zos/s)、烟曲霉(Js/7erg/77us/""/s/gatws)和黑曲霉(Js/7er^7//"s"iger)、镰刀菌属(,wsar/咖)、毛发裤菌属(7!r/c力o/7/^0/7。可从商业来源(包括但不限于美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得用于配制用于产生本发明的免疫反应的细菌。在一些实施方案中，在与纳米乳剂混合之前，将细菌在动物中传代5-10代以增强它们对于每个特定的动物宿主的病原性(Sinai等人，J.Infect.Dis.，141:193(1980)).在一些实施方案中，然后从宿主动物分离所述细菌，通过培养进行扩增，然后在-80C下贮存。在即将使用前，将细菌解冻，然后在适当的固体细菌培养基上培养过夜。第二天，从琼脂平板收集细菌，将其悬浮于合适的液体溶液(例如，脑心浸液(BHI)肉汤)中。基于用于杀菌试验的McFarland标准(Hendrichson和Krenz，1991)，调整细菌的浓度以使细菌计数为每ml大约1.5xl()8个菌落形成单位(CFU/ml)。可从商业来源(包括，但不限于ATCC)获得用于配制用于产生本发明的免疫反应的组合物的病毒。在一些实施方案中，将病毒在预期的动物模型中传代5-10次以增强对于各自特定的动物宿的病原性(Ginsberg和Johnson,Infect.Im隠，，13:1221(1976))。在一些实施方案中，在组织培养物中收集和繁殖病毒，然后使用密度梯度离心和超速离心纯化病毒(Garlinghouse等人，LabAnimSci.，37:437(1987);和Mahy，Br.Med.Bull.，41:50(1985))。在合适的组织培养细胞中计算噬菌斑形成单位(PFU)。可使用任何合适的方法，包括但不限于通过对动物施用(通过感染途径)不同剂量的病原体，然后基于之前的出版物(Fortier等人，InfectImmun.，59:2922(1991);Jacoby，ExpGerontol.，29:89(1994);和Salitetal,CanJMicrobiol.，30:1022(1984))鉴定导致动物疾病或死亡的剂量来计算各病原体的致死剂量和/或感染剂量。C.纳米乳剂本发明的纳米乳剂疫苗组合物不受限于任何特定纳米乳剂。本发明的疫苗组合物中可使用许多合适的纳米乳剂组合物，包括，但不限于Hamouda等人，J.InfectDis.，180:1939(1999);Hamouda和Baker,J.Appl，Microbiol.,89:397(2000);和Donovan等人，Antivir.Chem.Chemother.,11:41(2000)中公开的纳米乳剂以及表1和表2以及图4和9中所显示的纳米乳剂。本发明的优选纳米乳剂是有效杀死或灭活病原体且对于动物是无毒的纳米乳剂。因此，优选乳剂制剂使用无毒溶剂，例如乙醇，和在更低的乳剂浓度下获得更有有效的杀伤，在优选实施方案中，用于本发明的方法的纳米乳剂是稳定的，且在长期贮存(例如，一年或多年)后不分解。此外，优选乳剂甚至在暴露于高温和冷冻后仍保持稳定。这在它们用于极端条件(例如，在战场上)时特别有用，在一些实施方案中，使用表l和/或图4或9中描述的纳米乳剂中的一种。在一些优选实施方案中，乳剂包含(i)水相；(ii)油相；和至少一种其他的化合物，在本发明的一些实施方案中，将这些其他的化合物混合入组合物的水或油相。在其他实施方案中，将这些其他的化合物混合入具有之前乳化的油和水相的组合物。在某些实施方案中，在即将使用之前，将一种或多种其他的化合物混合入现有的乳剂组合物。在其他实施方案中，在即将使用组合物之前，将一种或多种其他的化合物混合入现有乳剂组合物。适合用于本发明的组合物的其他的化合物包括但不限定于一种或多种有机物，更特别地，基于有机磷酸盐的溶剂、表面活性剂和去垢剂、包含季铵的化合物、含阳离子卤素的化合物、萌发增强剂、相互作用增强剂和药学上可接受的化合物。下面显示涉及用于本发明的组合物不同化合物的某些示例性实施方案。表1纳米乳剂的制剂<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>本发明的一些实施方案使用包含乙醇的油相。例如，在一些实施方案中，本发明的乳剂包含(i)水相和(ii)和包含乙醇作为有机溶剂以及任选的萌发增强剂的油相，和(iii)作表面活性剂的TYLOXAPOL(优选2-5%，更优选3%)。该制剂高度有效地抗微生物，且对于哺乳动物使用者是无刺激性和无毒性的(从而可将其与粘膜接触)。在一些其他实施方案中，本发明的乳剂包含在第二乳剂中乳化的第一乳剂，其中(a)第一乳剂包含(i)水相；和(ii)包含油和有机溶剂的油相；和(iii)表面活性剂；和(b)第二乳剂包含(i)水相；和(ii)包含油和含阳离子的化合物的油相；(iii)表面活性剂。下面的描述提供了许多示例性乳剂，包括用于组合物X8P和X^。PC的制剂。X8P包含油包水乳剂，其中从大豆、三-正-丁基磷酸酯和80%的水中的TRITONX-100产生油相。X8W6。PC包含等体积的X8P与W8。8P的混合物。W8。8P由单硬脂酸甘油酯、精制大豆固醇(例如，GENEROL固醇)、TWEEN60、大豆油、含阳离子卣素CPC和薄荷油制成的脂质体样混合物。GENER0L家庭是一组聚乙氧基化的大豆固醇(HenkelCorporation,Ambler，Pennsylvania)。表l中给出了用于本发明的某些实施方案的乳剂制剂。这些特定的组成可以见于美国专利5，700，679(NN);5,618,840;5，549，901(WJP)和5，547，677，通过引用将它们的全部并入本文。制造X8W6。PC首先分别产生W8。8P乳剂和X8P乳剂。然后将这两种乳剂的混合物再乳化，从而产生称为X8W6。PC的新鲜乳剂组合物。产生此类乳剂的方法描述于美国专利5，103，497和4，895，452(通过以它们的全文引用合并入本文)。这些化合物具有广镨抗微生物活性，能够通过膜的破坏来灭活植物细菌(vegetativebacteria)。上面所列的组合物只是示例性的，本领域技术人员能够改变组分的量，从而实现适合本发明目的的纳米乳剂组合物。本领域技术人员应当理解，油相对水以及个别油载体、表面活性剂CPC和有机磷酸盐緩冲剂、各组合物的组分的比例可以改变。尽管某些包含X8P的组合物具有4:1的水对油比例，但要理解X8P可配制成具有更多或更少的水相。例如，在一些实施方案中，3、4、5、6、7、8、9、IO或更多部分的水相对油相中的一个部分。对于Ws。8P制剂也是如此。类似地，三(N-丁基)磷酸酯TRITONX-100:大豆油的比例也可以改变。尽管表1列出了用于W8。8P的甘油单油酸酯、聚山梨醇酯60、GENER0L122、十六烷基氯化吡啶和基底油(carrieroil)的特定量，但这些仅仅是示例性的。配制具有Ws。8P的性质的乳剂，所述乳剂具有不同浓度的这些组分中的每一种组分或事实上不同组分，其可实现相同的功能。例如，乳剂可在初始的油相中具有大约80-大约100g甘油单油酸酯。在其他实施方案中，乳剂在初始的油相中可具有大约15-大约30g聚山梨醇酯60。在另一个实施方案，组合物可在初始油相中包含大约20-大约30g的GENER0L固醇。本发明的乳剂的某些实施方案的纳米乳剂结构在它们的杀生物活性中起作用并有助于这些乳剂的无毒性。例如，X8P中的活性组分TRITON-X100在等于11%X8P的浓度时，显示较低的杀生物活性。将油相加入至去垢剂和溶剂显著地减少在相同浓度时，这些试剂在组织培养中的毒性。尽管不束縛于任何理论(对机制的理解不是实施本发明所必需的，且本发明不受限于任何特定的机制)，暗示纳米乳剂增强其组分与病原体的相互作用，从而促进病原体的灭活并减少个体组分的毒性。应当指出，当将X8P的所有组分组合入一种组合物但不在纳米乳剂结构中时，则混合物不如当组分在纳米乳剂结构中时的抗微生物活性有效。下面以具有相似组合物的制剂种类提供了许多其他实施方案。图9中提供了许多此类组合物作为抗菌材料的功效。下列组合物引述了活性组分的多种比例和混合物。本领域技术人员应当理解下列引述的制剂是示例性的，包含引述的组分的相似百分数范围的其他制剂在本发明的范围内。在本发明的某些实施方案中，本发明的制剂包含大约3-8体积％的TYL0XAP0L、大约8体积°/。的乙醇、大约1体积％的十六烷基氯化吡咬(CPC)、大约60-70体积％的油(例如，大豆油)、大约15-25体积％的水相(例如，DiH20或PBS)，和在一些制剂中低于大约1体积°/。的INNaOH。这些实施方案中的一些实施方案包含PBS。这些实施方案的一些实施方案中加入1NNaOH和/或PBS使得用户有利地控制制剂的pH，这样pH的范围在大约4.0-大约10.0，更优选大约7.1-8.5。例如，本发明的一个实施方案包含大约3体积°/。的TYL0XAP0L、大约8体积％的乙醇、大约l体积y。的CPC、大约64体积y。的大豆油，和大约24体积％的DiH20(本文称为Y3EC)。另一个相似的实施方案包含大约3.5体积°/。的TYL0XAP0L、大约8体积°/。的乙醇，和大约1体积°/。的CPC、大约64体积％的大豆油，和大约23.5体积％的DiH20(本文称为Y3.5EC)。另一个实施方案包含大约3体积％的TYL0XAP0L、大约8体积％的乙醇、大约1体积°/。的CPC、大约0.067体积％的1NNaOH(这样制剂的pH为大约7.1)、大约64体积°/。的大豆油，和大约23.93体积°/。的DiH20(本文称为Y3ECpH7.1)。另一个实施方案包含大约3体积％的TYL0XAP0L、大约8体积°/。的乙醇、大约1体积％的CPC、大约0.67体积％的1NNaOH(这样制剂的pH为大约8.5)和大约64体积％的大豆油，和大约23.33体积°/。的DiH20(本文称为Y3ECpH8.5)。另一个相似的实施方案包含大约4%TYLOXAPOL、大约8体积°/。的乙醇、大约1%CPC，和大约64体积％的大豆油，和大约23体积°/。的DiH20(本文称为Y4EC)。在另一个实施方案中制剂包含大约8%TYL0XAP0L、大约8%乙醇、大约1体积%的CPC，和大约64体积％的大豆油，和大约19体积％的DiH20(本文称为Y8EC)。另一个实施方案包含大约8体积°/。的TYLOXAPOL、大约8体积°/。的乙醇、大约1体积％的CPC、大约64体积y。的大豆油，和大约19体积°/。的lxPBS(本文称为Y8ECPBS)。在本发明的一些实施方案中，本发明的制剂包含大约8体积％的乙醇，和大约1体积W的CPC,和大约64体积°乂的油(例如，大豆油)，和大约27体积°/。的水相(例如，DiH20或PBS)(本文称为EC)。在本发明，一些实施方案包含大约8体积％的十二烷基硫酸钠(SDS)、大约8体积％的三丁基磷酸酯(TBP)，和大约64体积°/。的油(例如，大豆油)，和大约20体积y。的水相(例如，DiH20或PBS)(本文称为S8P)。在本发明的某些实施方案中，本发明的制剂包含大约1至2体积%的TRITONX-100、大约1至2体积°/。的TYL0XAP0L、大约7至8体积％的乙醇、大约1体积°/。的十六烷基氯化吡啶(CPC)、大约64至57.6体积％的油(例如，大豆油)，和大约23体积％的水相(例如，DiH20或PBS)。此外，这些制剂中的一些还包含大约5mML-丙氨酸/肌苷和大约10mM氯化铵。这些制剂中的一些包含PBS。在这些实施方案中的一些实施方案中加入PBS使得用户有利地控制制剂的pH。例如，本发明的一个实施方案包含大约2体积％的TRITONX-100、大约2体积％的TYL0XAP0L、大约8体积％的乙醇、大约1体积。/。CPC、大约64体积%的大豆油和大约23体积％的水相DiH20。在另一个实施方案中制剂包含大约1.8体积％的TRITONX-IOO、大约1.8体积°/。的TYL0XAP0L、大约7.2体积％的乙醇、大约0.9体积°/。的CPC、大约5mML-丙氨酸/肌苷，和大约10mM氯化铵、大约57.6体积。/4的大豆油和剩余lxPBS(本文称为90%X2Y2EC/GE)。在本发明的备选实施方案中，制剂包含大约5体积°/。的TWEEN80、大约8体积°/。的乙醇、大约1体积°/。的CPC、大约64体积°/。的油(例如，大豆油)，和大约22体积％的DiH20(本文称为W8。5EC)。在本发明的其他实施方案中，制剂包含大约5体积％的TWEEN20、大约8体积％的乙醇、大约1体积W的CPC、大约64体积％的油(例如，大豆油)和大约22体积％的DiH20(本文称为W2。5EC)。在本发明的其他实施方案中，制剂包含大约2至8体积％的TRITONX-100、大约8体积°/。的乙醇、大约1体积°/。的CPC、大约60至70体积°/。的油(例如，大豆或橄榄油)和大约15至25体积％的水相(例如，DiH20或PBS)。例如，本发明涉及包含大约2体积％的TRITONX-100、大约8体积°/。的乙醇、大约64体积％的大豆油和大约26体积％的DiH20的制剂(本文称为X2E)。在其他相似的实施方案中，制剂包含大约3体积°/。的TRITONX-IOO、大约8体积。/n的乙醇、大约64体积%的大豆油和大约25体积％的DiH20(本文称为X3E)。在其他实施方案中，制剂包含大约4体积°/。TRITONX-100、大约8体积％的乙醇、大约64体积°/。的大豆油和大约24体积％的DiH20(本文称为X4E)。在其他实施方案中，制剂包含大约5体积。/。的TRITONX-100、大约8体积°/。的乙醇、大约64体积％的大豆油和大约23体积％的DiH20(本文称为X5E)。本发明的另一个实施方案包含大约6体积°/。的TRITONX-IOO、大约8体积％的乙醇、大约64体积°/。的大豆油和大约22体积％的DiH20(本文称为X6E)。在本发明的其他实施方案中，制剂包含大约8体积％的TRITONX-IOO、大约8体积°/。的乙醇、大约64体积°/。的大豆油和大约20体积％的DiH20(本文称为X8E)。在本发明的其他实施方案中，制剂包含大约8体积％的TRITONX-100、大约8体积％的乙醇、大约64体积°/。的橄榄油和大约20体积％的DiH20(本文称为X8E0)。另一个实施方案包含8体积％的TRITONX-100、大约8体积°/。乙醇、大约1体积。/。CPC、大约64体积％的大豆油和大约19体积％的DiH20(本文称为X8EC)。在本发明的备选的实施方案中，制剂包含大约1至2体积％的TRITONX-100、大约1至2体积％的TYLOXAPOL、大约6至8体积VTBP、大约0.5至1.0体积°/。的CPC、大约60至70体积％的油(例如，大豆)和大约1至35体积°/。的水相(例如，DiH20或PBS)。此外，这些制剂中的某些制剂可包含大约1至5体积y。的胰胨肉胨营养液、大约0.5至1.5体积％的酵母提取物、大约5mML-丙氨酸/肌苷、大约10mM氯化铵和大约20-40体积％的液体嬰儿配方。在一些包含液体嬰儿配方的实施方案中，该配方包含酪蛋白水解物(例如，Neutramigen或Progestimil等)。在这些实施方案中的一些实施方案，本发明的制剂还包含大约0.1至1.0体积°/。的硫代硫酸钠和大约0.1至1.0体积％的柠檬酸钠。其他包含这些基本组分的相似的实施方案使用磷酸緩沖盐溶液(PBS)作为水相。例如，一个实施方案包含大约2体积％的TRITONX-100、大约2体积％TYLOXAPOL、大约8体积WTBP、大约1体积％的CPC、大约64体积°/。的大豆油和大约23体积°/。的DiH20(本文称为X2Y2EC)。在其他实施方案中，本发明的制剂包含大约2体积％的TRITONX-100、大约2体积％TYL0XAP0L、大约8体积。/。TBP、大约1体积°/。的cpc、大约o.9体积。/。的硫代硫酸钠、大约o.i体积°/。的杵檬酸钠、大约64体积％的大豆油，和大约22体积°/。的DiH20(本文称为X2Y2PCSTS1)。在另一个相似的实施方案中，制剂包含大约1.7体积％TRITONX-100、大约1.7体积。/。TYL0XAP0L、大约6.8体积y。TBP、大约0.85%CPC、大约29.2%NEUTRAMIGEN、大约54.4体积％的大豆油和大约4.9体积％的DiH20(本文称为85%X2Y2PC/baby)。在本发明的另一个实施方案中，制剂包含大约1.8体积°/。的TRITONX-IOO、大约1.8体积°/。的TYLOXAPOL、大约7.2体积％的TBP、大约0.9体积％的CPC、大约5mML-丙氨酸/肌苷、大约10mM氯化铵、大约57.6体积％的大豆油和剩余体积％的0.lxPBS(本文称为90%X2Y2PC/GE)。在另一个实施方案中，制剂包含大约1.8体积°/。的TRITONX-100、大约1.8体积％的TYLOXAPOL、大约7.2体积。/。TBP、大约0.9体积％的CPC，和大约3体积°/。的胰胨肉胨营养液、大约57.6体积y。的大豆油，和大约27.7体积°/。的DiH20(本文称为90°/。X2Y2PC/TSB)。本发明的在另一个实施方案中，制剂包含大约1.8体积°/。TRITONX-IOO、大约1.8体积％TYLOXAPOL、大约7.2体积y。TBP、大约0.9体积y。CPC、大约1体积％酵母提取物、大约57.6体积％的大豆油和大约29.7体积％的DiH20(本文称为90%X2Y2PC/YE)。在本发明的一些实施方案中，本发明的制剂包含大约3体积％的TYLOXAPOL、大约8体积°/。的TBP和大约1体积％的CPC、大约60至70体积％的油(例如，大豆或橄榄油)，和大约15至30体积°/。的水相(例如，DiH20或PBS)。在本发明的特定的实施方案中，本发明的制剂包含大约3体积％的TYLOXAPOL、大约8体积％的TBP，和大约1体积％的CPC、大约64体积％的大豆和大约24体积％的DiH20(本文称为Y3PC)。在本发明的一些实施方案中，本发明的制剂包含大约4至8体积%的TRITONX-IOO、大约5至8体积％的TBP、大约30至70体积％的油(例如，大豆或橄榄油)，和大约0至30体积°/。的水相(例如，DiH20或PBS)。此外，这些实施方案中的某些实施方案，还包含大约l体积%的cpc、大约i体积％的氯化苯曱烃铵、大约i体积。/。的氯代十六烷基吡啶、大约1体积％的溴化十六烷基二甲基乙基铵、500)iMEDTA、大约10mM氯化铵、大约5mM肌苷，和大约5mML-丙氨酸。例如，在这些实施方案的某些实施方案中，本发明的制剂包含大约8体积％的TRITONX-100、大约8体积％的TBP、大约64体积°/。的大豆油和大约20体积°/。的DiH20(本文称为X8P)。在本发明的另一个实施方案中，本发明的制剂包含大约8体积％的TRITONX-100、大约8体积°/。的TBP、大约1%ofCPC、大约64体积°/。的大豆油和大约19体积°/。的DiH20(本文称为X8PC)。在另一个实施方案中，制剂包含大约8体积％TRITONX-IOO、大约8体积°/。的TBP、大约1体积W的CPC、大约50体积％的大豆油，和大约33体积°/。的DiH20(本文称为ATB-X1001)。在另一个实施方案中，制剂包含大约8体积°/。的TRITONX-IOO、大约8体积％的TBP、大约2体积％的CPC、大约50体积％的大豆油和大约32体积％的DiH20(本文称为ATB-X002)。本发明的另一个实施方案包含大约4体积％的TRITONX-100、大约4体积％的TBP、大约0.5体积％的CPC、大约32体积°/。的大豆油和大约59.5体积°/。的DiH20(本文称为50%X8PC)。另一个相关的实施方案包含大约8体积％的TRITONX-IOO、大约8体积％的TBP、大约0.5体积。/。CPC、大约64体积°/。的大豆油和大约19.5体积％的DiH20(本文称为X8PC1/2)。在本发明的一些实施方案中，本发明的制剂包含大约8体积°/。的TRITONX-IOO、大约8体积°/。的TBP、大约2体积°/。的CPC、大约64体积°/。的大豆油和大约18体积％的DiH20(本文称为X8PC2)。在其他实施方案中，本发明的制剂包含大约8体积％的TRITONX-100、大约8。/。的TBP、大约1%的氯化苯甲经铵、大约50体积％的大豆油和大约33体积％的DiH20(本文称为X8PBC)。在本发明的备选的实施方案中，制剂包含大约8体积°/。的TRITONX-100、大约8体积％的TBP、大约1体积％的溴代十六烷基吡啶、大约50体积%的大豆油和大约33体积％的DiH20(本文称为X8PCPB)。在本发明的另一个示例性实施方案中，制剂包含大约8体积°/。的TRITONX-IOO、大约8体积％的tbp、大约i体积y。的溴化十六烷基二甲基乙基铵、大约50体积°/。的大豆油和大约33体积°/。的DiH20(本文称为X8PCTAB)。在其他实施方案中，本发明包含大约8体积％的TRITONX-IOO、大约8体积y。的TBP、大约1体积°/。的CPC、大约500juMEDTA、大约64体积°/。的大豆油和大约15.8体积仰iH20(本文称为X8PCEDTA)。其他的相似的实施方案包含8体积°/。的TRITONX-100、大约8体积°/。的TBP、大约1体积°/。的CPC、大约10mM氯化铵、大约5mM肌苷、大约5mML-丙氨酸、大约64体积°/。的大豆油和大约19体积°/。的DiH20或PBS(本文称为X8PCGElx)。在本发明的另一个实施方案中，本发明的制剂还包含大约大约5体积％的TRITONX-IOO、大约5%的TBP、大约1体积％的CPC、大约40体积°/。的大豆油和大约49体积°/。的DiH20(本文称为X5P5C)。在本发明的一些实施方案中，本发明的制剂包含大约2体积°/。的TRITONX-100、大约6体积％的TYLOXAPOL、大约8体积。/。的乙醇、大约64体积％的大豆油和大约20体积％的DiH20(本文称为X2Y6E)。在本发明的其他的实施方案中，制剂包含大约8体积％的TRITONX-100和大约8体积°/。的甘油、大约60至70体积°/。的油(例如，大豆或橄榄油)和大约15至25体积％的水相(例如，DiH20或PBS)。某些相关的实施方案，还包含大约1体积°/。的确L-抗坏血酸。例如，一个特定的实施方案包含大约8体积°/。的TRITONX-100、大约8体积％的甘油、大约64体积％的大豆油和大约20体积％的DiH20(本文称为X8G)。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含大约8体积％的TRITONX-100、大约8体积％的甘油、大约1体积°/。的L-抗坏血酸、大约64体积％的大豆油和大约19体积％的DiH20(本文称为X8GVC)。在其他实施方案中本发明的制剂包含大约8体积％的TRITONX-IOO、大约0.5至0.8体积％的TWEEN60、大约0.5至2.0体积％的CPC、大约8体积°/。的TBP、大约60至70体积％的油(例如，大豆或橄榄油)，和大约15至25体积°/。的水相(例如，DiH20或PBS).例如，在一个特定的实施方案中，制剂包含大约8体积y。的TRITONX-100、大约0.70体积°/。的TWEEN60、大约1体积％的CPC、大约8体积％的TBP、大约64体积°/。的大豆油和大约18.3体积％的DiH20(本文称为X8W60Pd)。另一个相关的实施方案包含大约8体积％的TRITONX-IOO、大约0.71体积％的TWEEN60、大约1体积°/。的CPC、大约8体积％的TBP、大约64体积％的大豆油和大约18.29体积％的DiH20(本文称为W60。.7X8PC)。在其他实施方案中，本发明的制剂包含大约8体积％的TRITONX-IOO、大约0.7体积°/。的TWEEN60、大约0.5体积。yi的CPC、大约8体积％的TBP、大约64至70体积％的大豆油和大约18.8体积％的DiH20(本文称为X8W60PC2)。在其他实施方案中，本发明包含大约8体积％的TRITONX-100、大约0.71体积°/。的TWEEN60、大约2体积％的CPC、大约8体积°/。的TBP、大约64体积°/。的大豆油和大约17.3体积。/。的DiH20。在本发明的另一个实施方案中，制剂包含大约0.71体积％的TWEEN60、大约1体积°/。的CPC、大约8体积°/。的TBP、大约64体积%的大豆油，和大约25.29体积°/。的DiH20(本文称为W60。.7PC)。在本发明的另一个实施方案中，本发明的制剂包含大约2体积％的二辛基磺基琥珀酸酯、大约8体积°/。的甘油或大约8体积VTBP，此外，大约60至70体积％的油(例如，大豆或橄榄油)和大约20至30体积％的水相(例如，DiH20或PBS)。例如，本发明的一个实施方案包含大约2体积％的二辛基磺基琥珀酸酯、大约8体积％的甘油、大约64体积％的大豆油和大约26体积％的DiH20(本文称为D2G)。在另一个相关实施方案中，本发明的制剂包含大约2体积％的二辛基磺基琥珀酸酯和大约8体积°/。的TBP、大约64体积％的大豆油和大约26体积°/。的DiH20(本文称为D2P)。在本发明的其他实施方案中，本发明的制剂包含大约8至10体积y。的甘油、和大约i至10体积°/。的cpc、大约50至7o体积y。的油(例如，大豆或橄榄油)和大约15至30体积W的水相(例如，DiH2O或PBS),此外，在这些实施方案的某些实施方案中，组合物还包含大约1体积％的L-抗坏血酸。例如，一个特定的实施方案包含大约8体积％的甘油、大约1体积°/。的CPC、大约64体积％的大豆油和大约27体积°/。的DiH20(本文称为GC)。另一个相关的实施方案包含大约10体积％的甘油、大约10体积％的CPC、大约60体积％的大豆油和大约20体积％的DiH20(本文称为GCIO)。在本发明的另一个实施方案中，本发明的制剂包含大约10体积％的甘油、大约1体积％的CPC、大约1体积％的L-抗坏血酸、大约64体积％的大豆或油和大约24体积％的DiH20(本文称为GCVc)。在本发明的一些实施方案中，本发明的制剂包含大约8至10体积％的甘油、大约8至10体积°/。的SDS、大约50至70体积°/。的油(例如，大豆或橄榄油)和大约15至30体积％的水相(例如，DiH20或PBS)。此外，在这些实施方案的某些实施方案中，组合物还包含大约1体积％的卵磷脂和大约1体积％的对羟基苯甲酸甲酯。此类试剂的示例性实施方案包含大约8体积％的SDS、8体积°/。的甘油、大约64体积％的大豆油和大约20体积°/。的DiH20(本文称为S8G)。相关制剂包含大约8体积％的甘油、大约8体积°/。的SDS、大约1体积°/。的卵磷脂、大约1体积％的对羟基苯曱酸甲酯、大约64体积％的大豆油，和大约18体积°/。的DiH20(本文称为S8GL1B1)。在本发明的另一个实施方案中，本发明的制剂包含大约4体积％的TWEEN80、大约4体积°/。的TYL0XAP0L、大约1体积°/。的CPC、大约8体积°/。的乙醇、大约64体积％的大豆油和大约19体积％的DiH20(本文称为W8。4Y4EC)。在本发明的一些实施方案中，本发明的制剂包含大约0.01体积％的CPC、大约0.08体积°/。的TYL0XAP0L、大约10体积°/。的乙醇、大约70体积°/。的大豆油和大约19.91体积％的DiH20(本文称为Y.08EC.01)。在本发明的另一个实施方案中，本发明的制剂包含大约8体积％的月桂基硫酸钠、和大约8体积％的甘油、大约64体积°/。的大豆油和大约20体积％的DiH20(本文称为SLS8G)。上述特定的制剂只是举例说明本发明中使用的多种组合物的简单示例。本发明包括上述制剂的许多变体以及用于本发明的方法的其他纳米乳剂。为了确定候选乳剂是否适合用于本发明，分析3个标准，通过使用本文描述的方法和标准，可容易地检测候选乳剂以确定它们是否合适。首先，使用本文描述的方法制备想要的组份，以确定是否可形成乳剂。如果不能形成乳剂，弃去该候选物。例如，由4.5%的硫代硫酸钠、0.5%柠檬酸钠、10%正丁醇、64°/。大豆油和21%DiH20制备的修饰组合物不形成乳剂。第二，在优选实施方案中，候选乳剂应当形成稳定的乳剂。如果其以乳剂的形式保持足以允许其想要的用途的时间，则乳剂是稳定的。例如，对于待贮存、运输等的乳剂，希望组合物以乳剂的形式保持数月至数年。相对不稳定的典型乳剂将在一天内失去它们的形式。例如，由8%l-丁醇、5%TWEEN10、1%CPC、64%大豆油和22%DiH20制备的候选组合物不形成稳定的乳剂。通过使用本文描述的方法显示下列候选乳剂是稳定的0.08%TRITONX-100、0.08%甘油、0.01%十六烷基氯化吡啶、99%黄油和0.83%diH20(本文称为1%X8GC黄油)；0.8%TRITONX-100、0.8%甘油、0.1°/。十六烷基氯化吡咬、6.4%大豆油、1.9%diH20和90%黄油(本文称为10。/。X8GC黄油);2。线。5EC、"/oNatroso1250LNF和97%diH20(本文称为2%W2。5ECLGEL);1%十六烷基氯化吡咬、5%TWEEN20、8%乙醇、64%70粘稠矿物油和22%diH20(本文称为W2。5EC70矿物油)；1%十六烷基氯化吡啶、5VTWEEN20、8%乙醇、64%350粘稠矿物油和22°/。diH20(本文称为W2。5EC350矿物油)。第三，候选乳剂应当对于其想要的用途具有功效。例如，抗菌乳剂应当杀死或使病原体丧失能力至可检测的水平。如本文所显示的，本发明的某些乳剂具有抗特定微生物的功效，但不具有抗其他微生物的功效。通过使用本文描述的方法，人们能够确定特定候选乳剂抗目的微生物的适合性。通常，这包括在使用合适的对照样品(例如，阴性对照例如水)的并行实验中，将微生物暴露于乳剂进行一个或多个时期，然后确定乳剂是否杀死或使微生物丧失能力和确定进行该能力的程度。例如，显示由1%氯化铵、5%TWEEN20、8%乙醇、64%大豆油和22%DiH20制备的候选组合物不是有效的乳剂。用本文描述的方法显示下列候选乳剂是有效的乳剂5%TWEEN20、5°乂十六烷基氯化吡啶、10%甘油、60°/。大豆油和20%diH20(本文称为W2。5GC5);1%十六烷基氯化吡咬、5%TWEEN20、10%甘油、64°/。大豆油和20%diH20(本文称为W2。5GC);1%十六烷基氯化吡咬、5%TWEEN20、8%乙醇、64%橄榄油和22。/。diH20(本文称为W2。5EC橄榄油)；1%十六烷基氯化吡啶、5%TWEEN20、8%乙醇、64%亚麻子油和22%diH20(本文称为W2。5EC亚麻子油)；1。/d"六烷基氯化吡咬、5%TWEEN20、8%乙醇、64%玉米油和22%diH20(本文称为W2。5EC玉米油)；1%十六烷基氯化吡啶、5%TWEEN20、8%乙醇、64%椰子油和22%diH20(本文称为W2。5EC椰子油)；1%十六烷基氯化吡啶、5%TWEEN20、8°/。乙醇、64%棉子油和22%diH20(本文称为Wm5EC棉子油)；8%葡萄糖、5。/。TWEEN10、1°/。十六烷基氯化吡啶、64%大豆油和22%diH20(本文称为W2。5C葡萄糖);8%PEG200、5%TWEEN10、1%十六烷基氯化吡啶、64%大豆油和22。/。diH20(本文称为W2。5CPEG200);8%甲醇、5%TWEEN10、1%十六烷基氯化吡啶、64%大豆油和22%diH20(本文称为W2。5C甲醇)；8%PEG1000、5%TWEEN10、1%十六烷基氯化吡啶、64%大豆油和22%diH20(本文称为W2。5CPEG1000);2%W2。5EC、2%Natrosol250HNF和96%diH20(本文称为2线。5ECNatrosol2,也称为2%W2。5ECGEL);2%W2。5EC、1%Natrosol250HNF和97%diH20(本文称为2%W2。5ECNatrosol1);2°/。W2。5EC、3%Natrosol250HNF和95%diH20(本文称为2%W2。5ECNatrosol3);2%W2。5EC、0.5%Natrosol250HNF和97.5%diH20(本文称为2%W2。5ECNatrosol0.5);2%W2。5EC、2%MethocelA和96%diH20(本文称为2%W2。5ECMethocelA);2%W2。5EC、2%MethocelK和96%diH20(本文称为2%W2。5ECMethocelK);2%Natrosol、0.1%X8PC、0.lxPBS、5mML-丙氨酸、5mM肌苷、10mM氯化铵和diH20(本文称为0,1%X8PC/GE+2%Natrosol);2%Natrosol、0.8%TRITONX-IOO、0.8°/。三丁基磷酸酯、6.4°/。大豆油、0.1%十六烷基氯化吡咬、0.lxPBS、5mML-丙氨酸、5迈M肌苷、10mM氯化铵和diH20(本文称为10%X8PC/GE+2°/。Natrosol);1%十六烷基氯化吡啶、5%TWEEN20、8%乙醇、64%猪油(Lard)和22%diH20(本文称为W2。5EC猪油)；1%十六烷基氯化吡咬、5%TWEEN20、8°/。乙醇、64°/。矿物油和22%diH20(本文称为W2。5EC矿物油)；0.W十六烷基氯化吡咬、2°/。橙花叔醇(Nerolidol)、5%TWEEN20、10%乙醇、64%大豆油和18.9%diH20(本文称为W2。5ECuN);0.1%十六烷基氯化吡啶、2%法呢醇(Farnesol)、5°/。TWEEN20、10°/。乙醇、64%大豆油和18,9%diH20(本文称为W2。5ECuF);0.1%十六烷基氟化吡啶、5%TWEEN20、10%乙醇、64°/。大豆油和20.9%diH20(本文称为W2。5ECu);10%十六烷基氯化吡咬、8%三丁基磷酸酯、8%TRITONX-IOO、54%大豆油和20%diH20(本文称为X8Pd。);5%十六烷基氯化吡咬、8%TRIT0NX-100、8%三丁基磷酸酯、59%大豆油和20%diH20(本文称为X8PC5);0.02%十六烷基氯化吡啶、0.1%TWEEN20、10%乙醇、70%大豆油和19.88%diH20(本文称为W2。0.1EC。.。2);1%十六烷基氯化吡啶、5%TWEEN20、8%甘油、64%Mobil1和22%diH20(本文称为W2。5GCMobi11);7.2%TRITONX-IOO、7.2%三丁基磷酸酯、0.9%十六烷基氯化吡梵、57.6°/。大豆油、0.lxPBS、5mML-丙氨酸、5mM肌苷、10mM氯化铵和25.87%diH20(本文称为90%X8PC/GE);7.2%TRITONX-IOO、7.2°/。三丁基磷酸酯、0.9°/。十六烷基氯化吡咬、57.6°/。大豆油、1°/。EDTA、5mML-丙氨酸、5mM肌苷、10mM氯化铵、0.lxPBS和diH20(本文称为90%X8PC/GEEDTA);和7.2%TRITONX-IOO、7,2%三丁基磷酸酯、0.9%十六烷基氯化吡咬、57.6%大豆油、1°/。硫代硫酸钠、5mML-丙氨酸、5mM肌苷、10mM氯化铵、0.lxPBS;和diH20(本文称为90%X8PC/GESTS)。1.水相在一些实施方案中，乳剂包含水相。在某些优选实施方案中，乳剂基于乳剂的总体积(尽管还涉及其他浓度)包含大约5至50，优选10至40，更优选15至30体积°/。的水相。在优选实施方案中，水相包含pH为大约4至10，优选大约6至8的水。水优选是去离子的(在下文中"DiH20")。在一些实施方案中，水相包含磷酸緩冲盐溶液(PBS)。在一些优选实施方案中，水相是无菌和无热原的。2.油相在一些实施方案中，乳剂包含油相。在某些优选实施方案中，本发明的乳剂的油相(例如，基底油)基于乳剂的总体积(尽管还涉及其他浓度)包含30-90，优选60-80和更优选60-70体积°/。的油。合适的油包括但不限于大豆油、鳄梨油、角鲨烯油、角鲨烯油、橄榄油、卡诺拉菜油、玉米油、菜籽油、红花油、葵花子油、鱼油、调味油、水溶性唯生素和其混合物。在特别优选实施方案中，使用大豆油。在本发明的优选实施方案中，油相优选以具有大约1-2微米，更优选0.2至0.8范围内和最优选大约0.8微米的平均颗粒大小的小滴分配在水相中。在其他实施方案中，可将水相分配在油相中。在一些实施方案中，油相基于乳剂的总体积包含3-15，和优选5-10体积％的有机溶剂。尽管本发明不受限于任何特定的机制，但包括将乳剂中使用的基于有机磷酸酯的溶剂用于除去或破坏病原体的膜中的脂质。因此，除去微生物膜中的固醇或磷脂的任何溶剂可用于本发明的方法。合适的有机溶剂包括但不限于基于有机磷酸酯的溶剂或醇，在一些优选实施方案中，无毒性醇(例如，乙醇)用作佐剂。油相和油相中提供的任何其他的化合物优选是无菌的和无热原的。3.表面活性剂和去垢剂在一些实施方案中，乳剂还包含表面活性剂或去垢剂。在一些优选实施方案中，乳剂包含大约3至15%，和优选大约10%的一种或多种表面活性剂或去垢剂(尽管也涉及其他浓度)。尽管本发明不受限于任何特定的机制，但包括当存在于乳剂中时，表面活性剂帮助稳定乳剂。包括非离子(非阴离子)和离子表面活性剂。此外，来自表面活性剂的BRIJ家族的表面活性剂用于本发明的组合物。以液相或油相的形式提供表面活性剂。适合用于乳剂的表面活性剂包括多种阴离子和非离子表面活性剂，以及能够促进水包油乳剂的形成的其他乳化剂。通常，乳化剂是相对亲水的，乳化剂的混合物可用于获得必需的性质。在一些制剂中，非离子表面活性剂具有优于离子活性剂，因为与离子(例如，肥皂类型)乳化剂相比，它们基本上与宽广的pH范围更相容和通常形成更稳定的乳剂。因此，在某些优选实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种非离子表面活性剂，例如聚山梨酯表面活性剂(例如，聚氧乙烯基醚)、聚山梨酯去垢剂、聚氧聚乙氧基乙醇等。用于本发明的聚山梨酯去垢剂的实例包括但不限于TWEEN20、TWEEN40、TWEEN60、TWEEN80等。TWEEN60(聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯)和TWEEN20、TWEEN40和TWEEN80—起包含在许多药物组合物中用作乳化剂的聚山梨酯。在本发明的一些实施方案中，这些化合物也与佐剂用作共组分。TWEEN表面活性剂也似乎具有对脂包膜病毒的杀病毒效应(参见例如，Eriksson等人，BloodCoagulationandFibtinolysis5(Suppl.3):S37-S44(1994))。用于本发明的苯氧基聚乙氧基乙醇和其聚合物的实例包括但不限于TRITON(例如，X-100、X-301、X-165、X-102、X-200)和TYL0XAP0L。TRITONX-100是广泛用于从生物结构中提取脂质和蛋白质的强非离子去垢剂和分散剂。其还有抗广谦包膜病毒的杀病毒效应(参见例如，Maha和Igarashi，SoutheastAsianJ.Trop.Med.Pub.Health28:718(1997);和Portocala等人，Virologie27:261(1976))。由于该抗病毒活性的原因，其用于在活新鲜冷冻的人血浆中的失活病毒病原体(参见例如，Horowitz等人，Blood79:826(1992))。本发明不受限于本文公开的表面活性剂。可从参考工作(例如，包括但不P艮于，McCutheon's第l巻EmulsionsandDetergents-NorthAmericanEdition,2000)和商业来源中确定用于本发明的其他表面活性剂和去垢剂。4.含阳离子卣素的化合物在一些实施方案中，乳化剂还包含含阳离子卣素的化合物。在一些优选实施方案中，乳剂基于乳剂的总重量(尽管也涉及其他浓度)包含大约o.5至i.owt.y。或更多的含阳离子卣素的化合物。在优选实施方案中，将含阳离子卣素的化合物优选与油相混合；然而，应当理解，可将含阳离子卣素的化合物和乳剂组合物提供于不同的制剂中。合适的含卣素化合物可以选自含氯、氟、溴和碘例子的化合物。在优选实施方案中，合适的含阳离子卣素的化合物包括但不限于十六烷基卣化吡啶、十六烷基三甲基g化铵、十六烷基二甲基乙基g化铵、十六烷基二曱基苯甲基卣化铵、十六烷基三丁基囟化磷、十二烷基三甲基卣化铵或十四烷基三甲基卣化铵。在一些特定的实施方案中，合适的含阳离子卣素的化合物包含介不限于十六烷基氯化吡啶(CPC)、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基苯甲基二甲基氯化铵、十六烷基溴化吡啶(CPB)和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基二甲基乙基溴化铵、十六烷基三丁基溴化磷、十二烷基三甲基溴化铵和十四烷基三甲基溴化铵.在特别优选实施方案中，含阳离子卣素化合物是CPC，尽管本发明的组合物不受限于具有任何特定含阳离子的化合物的制剂。5.萌发增强剂在本发明的其他实施方案中，纳米乳剂还包含萌发增强剂。在一些优选实施方案中，乳剂包含大约1mM至15fflM，和更优选大约5mM至10mM的一种或多种增强萌发的化合物(尽管还涉及其他浓度)。在优选实施方案中，在乳剂的配制之前在水相中提供增强萌发的化合物。本发明包括，当向纳米乳剂组合物中加入萌发增强剂时，增强纳米乳剂的杀孢子特性。本发明还包括，此类萌发增强剂在接近中性pH(pH6-8，和优选7)处引发杀孢子活性。可以例如通过用磷酸緩沖盐溶液(PBS)稀释或通过制备中性乳剂获得此类中性pH乳剂。纳米乳剂的杀孢子活性优选当孢子开始萌发时发生。在特定实施方案中，已证明用于本发明的疫苗的乳剂具有杀孢子活性。尽管本发明不受限于任何特定的机制且对机制的理解不是实施本发明所必需的，但据认为乳剂的融合性组分(fusigeniccomponent)作用于引发萌发，在逆转至营养体形式完成之前，乳剂的溶原性组分作用于裂解和重新萌发孢子。因此，乳剂的这些组分协同作用以使孢子易于受到乳剂的破坏。萌发增强剂的加入还通过例如加速杀孢子活性发生的速度来促进乳剂的抗杀孢子活性。细菌内生孢子和真菌孢子的萌发与增加代谢和对热和化学试剂减少的抗性相关。对于发生的萌发，孢子必须感觉环境足以支持生长和生殖。氨基酸L-丙氨酸刺激细菌孢子萌发(参见例如，Hills,J.Gen.Micro.4:38(1950);以及Halvorson和Church,BacteriolRev.21:112(1957))。据报导L-丙氨酸和L脯氨酸也引发真菌孢子萌发(Yanagita，ArchMikrobiol26:329(1957))。简单的ct氨基酸例如苷氨酸L-丙氨酸在代谢中占据中心位置。ct氨基酸的氨基转移或脱氨基产生了新陈代谢和生长所需的生糖原的或生酮的碳水化合物和氮。例如，L-丙氨酸的氨基转移或脱氨基产生作为糖酵解代谢(恩布顿-迈耶霍夫-帕纳斯途径)的终产物的丙酮酸酯。丙酮酸脱氢酶复合物氧化丙酮酸产生乙酰-CoA、NADH、H+和C02。乙酰-CoA是三羧酸循环(Kreb's循环)的起始底物，其反过来供给线粒体电子传递链。乙酰-CoA还是脂肪酸合成以及固醇合成的最终碳源。简单的oc氨基酸可提供萌发和随后的代谢活性所需的氮、C02、生糖原和/或生酮的等同物。在某些实施方案中，本发明的合适的萌发增强剂包括但不限于oc氨基酸，包括甘氨酸和丙氨酸的L-对映体、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和其烷基酯。关于氨基酸对萌发的作用的其他信息可见于美国专利5,510,104;通过全文引用合并入本文。在一些实施方案中，还可使用葡萄糖、果糖、天冬酰胺、氯化钠(NaCl)、氯化铵(NH4C1)、氯化钙(CaCU和氯化钾(KC1)的混合物。在本发明的特别优选实施方案中，制剂包括萌发增强剂L-丙氨酸、CaCl2、肌苷和NH4C1。在一些实施方案中，组合物还包括一种或多种形式的生长培养基(例如，胰胨肉胨营养液等)，其附加地包含或其本身不可包含萌发增强剂和緩冲剂。上述化合物只是示例性萌发增强剂，应当理解其他已知的萌发增强剂可用于本发明的一些实施方案中使用的纳米乳剂。候选萌发增强剂应当满足两个标准以包括在本发明的组合物内其应当能够与本文公开的乳剂相结合且当并入本文公开的乳剂时，其应当增加靶孢子的萌发率。本领域技术人员通过对靶使用特定试剂和本文公开的纳米乳剂，然后将当与混合物接触时对靶的灭活作用与不含所述试剂的本发明的组合物对同样的靶产生的灭活作用比较，可确定该试剂是否具有用作萌发增强剂的想要的功能。增加萌发，从而减少或抑制生物的生剂。。'、、、1在其他实施方案中，向中性乳剂组合物中加入萌发增强剂(或生长培养基)产生组合物，所述组合物用于灭活细菌孢子，以及包膜病毒、革兰阴性细菌和革兰阳性细菌，用于本发明的疫苗组合物中。6.相互作用增强剂在其他实施方案中，纳米乳剂包含一种或多种能够增加组合物与靶病原体(例如，革兰阴性细菌例如弧菌(Vibrio)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)和假单胞菌(Pseudomonas的细胞壁))的相互作用的化合物(即，"相互作用增强剂")。在优选实施方案中，优选将相互作用增强剂与油相预混合；然而，在其他实施方案中，在乳化后，将相互作用增强剂与组合物一起提供。在某些优选实施方案中，相互作用增强剂是螯合剂(例如在緩冲液(例如，tris緩冲液)中的乙二胺四乙酸(EDTA)或亚乙基双(氧亚乙基次氨基)四乙酸(EGTA))。要理解，螯合剂只是示例性的增强相互作用的化合物。事实上，包括增加用于本发明的一些实施方案中的纳米乳剂与微生物试剂和/或病原体的相互作用的其他试剂。在特别优选实施方案中，相互作用增强剂以大约50至大约250)LiM的浓度存在。本领域技术人员通过对靶使用特定试剂和本文公开的纳米乳剂，然后将当与混合物接触时对靶的灭活作用与不含所述试剂的本发明的组合物对同样的靶产生的灭活作用比较，可确定该试剂是否具有用作相互作用增强剂的想要的功能。增加乳剂与细菌的相互作用，从而减少或抑制细菌的生长(与在其不存在的情况下的参数相比)的任何试剂，被认为是用于本文公开的纳米乳剂组合物的合适的增强剂。在一些实施方案中，向纳米乳剂中加入相互作用增强剂产生组合物，所述组合物用于灭活有包膜病毒、革兰阳性细菌和一些革兰阴性细菌，用于本发明的疫苗组合物中。7.季胺类化合物在一些实施方案中，本发明的纳米乳剂包含含有季铵的化合物。示例性季铵化合物包括但不限于烷基二甲基苯甲基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、烷基二甲基苯曱基和二烷基二甲基氯化铵、N，N-二甲基-2-羟丙基氯化铵聚合物、二癸基二甲基氯化铵、正-烷基二甲基苯甲基氯化铵、正-烷基二甲基乙基苯曱基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵、正-烷基二曱基苯甲基氯化铵、正-十四烷基二甲基苯甲基氯化铵一水合物、正-烷基二曱基苯曱基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵、六氢-1，3,5-三(2-羟乙基)-s-三漆、肉豆蔻基节基二甲基氯化铵(和)QuatRNIUM14、烷基二(2-羟乙基)苯甲基氯化铵、烷基去甲基千基氯化铵、烷基二曱基3，4-二氯苯甲基氯化铵、烷基二曱基苯甲基氯化铵、烷基二甲基苯曱基二曱基苯甲基铵、烷基二甲基二甲基苯甲基氯化铵、烷基二甲基乙基溴化铵、烷基二甲基乙基溴化铵、烷基二甲基乙基苯曱基氯化铵、烷基二甲基异丙基苯甲基氯化铵、烷基三甲基氯化铵、烷基1或3苯甲基-1-(2-羟乙基)-2-咪唑啉氯化物、二烷基甲基苯甲基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵、二癸基二曱基氯化铵、2-(2-(对-(二异丁基)甲苯氧基)乙氧基)乙基二曱基苯甲基氯化铵、2-(2-(对-(二异丁基)苯氧基)乙氧基)乙基二曱基苯甲基氯化铵、二辛基二甲基氯化铵、十二烷基双(2-羟乙基)辛基氢氯化铵、十二烷基二甲基苯甲基氯化铵、十二烷基氨甲酰甲基二乙基苯甲基氯化铵、七癸基羟乙基咪唑啉氯化物、六羟基-1，3，5-三(2-羟乙基)-s-三溱、辛基癸基二曱基氯化铵、辛基十二烷基二甲基氯化铵、辛基苯氧基乙氧基乙基二曱基苯甲基氯化铵、氧二乙烯基双(烷基二甲基氯化铵)、季胺类化合物、二可可烷基二曱基、氯化物、三甲氧基甲硅烷基季铵化合物和三曱基十二烷基苯甲基氯化铵。8.其他组分在一些实施方案中，纳米乳剂包含一种或多种为纳米乳剂提供想要的性质或功能性的其他组合物。这些组分可并入纳米乳剂的水相或油相和/或可在乳化之前或进行乳化时加入。例如，在一些实施方案中，纳米乳剂还包含酚类(例如，三氯生、苯酴)、酸化试剂(例如，柠檬酸(例如，1.5-6%)、乙酸、柠檬汁)、烷化剂(例如，氢氧化钠(例如，0.3%))、緩冲剂(例如，柠檬酸盐緩冲剂、乙酸盐緩冲剂和用于保持特定pH的其他緩冲剂)和卣素(例如，聚乙烯吡咯烷酮、次氯酸钠、过氧化氢)。下面描述用于制备纳米乳剂(例如，用于灭活病原体和/或产生本发明的免疫原性组合物的纳米乳剂)的示例性技术。此外，下面也显示许多特定的(尽管是示例性的)制剂配方。配制技术可使用经典的乳剂形成技术形成本发明的纳米乳剂。简而言之，在相对高的剪切力(例如，使用高液压和机械力)下将油相与水相混合，从而获得水包油纳米乳剂。通过以范围在大约1:9至5:1，优选大约5:1至3:1内，最优选4:1的体积比体积的油相比水相，将油相与水相混合来形成乳剂。可使用能够产生足以形成乳剂的剪切力的任何装置，例如弗氏细胞压碎器(FrenchPresses)或高剪切力搅拌器(highshearmixers)(例如，可以例如从Admix,Inc.,Manchester,NH获得的FDA批准的高剪切力搅拌器)混合油相和水相。产生此类乳剂的方法描述于美国专利5,103,497和4,895,452，通过以它们的全文引用合并入本文。在优选实施方案中，用于本发明的方法的组合物包括分散在水性连续相(例如水)中的油性不连续相的小滴。在优选实施方案中，本发明的纳米乳剂是稳定的，且甚至在长期贮存(例如，超过一年或多年)后不分解。此外，在一些实施方案中，纳米乳剂在与免疫原(例如，病原体)混合后是稳定的(例如，在一些实施方案中稳定超过3个月，在一些实施方案中稳定超过6个月，在一些实施方案中稳定超过12个月，在一些实施方案中稳定超过18个月)。在优选实施方案中，本发明的纳米乳剂，当对受试者施用(例如，通过喷雾或接触粘膜表面、吞咽、吸入等)时是无毒的和安全的。在一些实施方案中，乳剂的部分是脂质结构的形式，包括但不限于单层、多层和少数层脂质载体、微团和片层相。本发明的一些实施方案使用包含乙醇的油相。例如，在一些实施方案中，本发明的乳剂包含(i)水相和(ii)包含乙醇作为有机溶剂和任意地萌发增强剂的油相，和(iii)作表面活性剂的TYL0XAP0L(优选2-5%，更优选3W。该制剂对于病原体的灭活高度有效，对于哺乳动物受试者也是非刺激性和无毒性的(例如，从而可用于对粘膜表面施用)。在一些其他实施方案中，本发明的乳剂包含在第二乳剂中乳化的第一乳剂，其中(a)第一乳剂包含(i)水相；和(ii)包含油和有机溶剂的油相；和(iii)表面活性剂；和(b)第二乳剂包含(i)水相；和(ii)包含油和含阳离子化合物的油相；和(iii)表面活性剂。示例性制剂下列描述提供了许多示例性乳剂，其中包括用于组合物BCTP和X^。PC的制剂。BCTP包含油包水纳米乳剂，其中油相由大豆油、三-正-丁基磷酸盐和在80%的水中的TRITONX-100制备而来。X8W6。PC包括等体积的BCTP与W8。8P的混合物。Ws。8P是由甘油单硬脂酸酯、精制大豆固醇(例如，GENEROL固醇)、TWEEN60、大豆油、含阳离子卤素的CPC和薄荷油制备的脂质体样化合物。GENER0L家族是一组聚乙氧基化的大豆固醇(HenkelCorporation,Ambler,Pennsylvania),表1B提供了用于本发明的示例性乳剂制剂。这些特定的制剂可见于美国专利5,700,679(NN)、5,618,840、5,549,901(W8。8P);和5，547，677，其各自通过以它们的全文引用合并入本文。美国专利申请系列10/669,865提供了某些其他乳剂制剂，通过以其全文引用合并入本文。产生X8W6。PC乳剂首先分别制备W8。8P乳剂和BCTP乳剂来。然后将这两种乳剂的混合物再乳化以产生称为X8W6。PC的新鲜的乳剂组合物。产生此类乳剂的方法见于美国专利5,103,497和4,895,452(其各自通过以它们的全文引用合并入本文)。表IB<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>上面所列组合物只是示例性的，本领域技术人员能够改变组分的量以实现适合本发明的目的的纳米乳剂组合物。本领域技术人员应当理解，油相对水以及个别的油载体、表面活性剂CPC和有机磷酸盐緩沖剂、各组合物的组分的比例可以改变。尽管包含BCTP的某些组合物具有4:1的水对油的比例，但要理解，可BCTP配制成具有更多或更少的水相。例如，在一些实施方案中，3、4、5、6、7、8、9、10或更多个水相的部分对油相中的一个部分。对于Ws。8P制剂也是如此。类似地，三(N-丁基)磷酸酯TRITONX-100:大豆油的比例也可以改变。尽管表IB列出了用于W8。8P的甘油单油酸酯、聚山梨醇酯60、GENER0L122、十六烷基氯化吡啶和基底油(carrieroil)的特定量，但这些仅仅是示例性的。配制具有Ws。8P的性质的乳剂，所述乳剂具有不同浓度的这些组分中的每一种组分或事实上不同的组分，其可实现相同功能。例如，乳剂可在初始的油相中具有大约80至大约100g甘油单油酸酯。在其他实施方案中，乳剂在初始的油相中可具有大约15至大约30g聚山梨醇酯60。在另一个实施方案，组合物可在初始油相中包含大约20至大约30g的GENEROL固醇。纳米乳剂的个别组分(例如本发明的免疫原性组合物中)可用于灭活病原体以及赋予乳剂的无毒性。例如，BCTP中的活性组分-TRITON-X100在等于11%BCTP的浓度时，显示较低的灭活病毒的能力。将油相加入至去垢剂和溶剂显著减少相同浓度时，这些试剂在组织培养中的毒性。尽管不束绰于任何理论(对机制的理解不是实施本发明所必需的，且本发明不受限于任何特定的机制)，但暗示纳米乳剂增强其组分与病原体的相互作用，从而促进病原体的灭活和减少个体组分的毒性。此外，当将BCTP的所有組分混合入一种组合物但不在纳米乳剂结构中时，则混合物不如当组分存在于纳米乳剂结构中时在灭活病原体上有效。下面以具有相似组合物的制剂种类提供了许多其他实施方案。下列组合物引述活性组分的不同比例和混合物。本领域技术人员应当理解下列引述的制剂是示例性的，包含引迷的组分的相似百分数范围的其他制剂在本发明的范围内。在本发明的某些实施方案中，纳米乳剂包含大约3至8体积％的TYL0XAP0L、大约8体积°/。的乙醇、大约1体积％的十六烷基氯化吡啶(CPC)、大约60至70体积％油(例如，大豆油)、大约15至25体积％的水相(例如，DiH20或PBS)，在些制剂中低于大约1体积°乂的1NNaOH。这些实施方案中的一些实施方案包含PBS。这些实施方案中的一些实施方案中加入1NNaOH和/或PBS使得用户能够有利地控制制剂的pH,这样可获得在大约7.0至大约9.0，和更优选大约7.1至8.5的pH的范围。例如，本发明的一个实施方案包含大约3体积％的TYL0XAP0L、大约8体积％的乙醇、大约1体积％的CPC、大约64体积％的大豆油，和大约24体积°/。的DiH20(本文称为Y3EC)。另一个相似的实施方案包含大约3.5体积％的TYL0XAP0L、大约8体积％的乙醇，和大约1体积%的CPC、大约64体积°/。的大豆油和大约23.5体积°/。的DiH20(本文称为Y3.5EC)。另一个实施方案包含大约3体积％的TYLOXAPOL、大约8体积％的乙醇、大约1体积°/。的CPC、大约0.067体积％的1NNaOH，这样制剂的pH为大约7.1、大约64体积°/。的大豆油和大约23.93体积％的DiH20(本文称为Y3ECpH7.1)。另一个实施方案包含大约3体积％的TYL0XAP0L、大约8体积％的乙醇、大约1体积％的CPC、大约0.67体积％的1NNaOH，这样制剂的pH为大约8.5，和大约64体积％的大豆油和大约23.33体积°/。的DiH20(本文称为Y3ECpH8.5)。另一个相似的实施方案包含大约4。/。TYL0XAP0L、大约8体积％乙醇、大约1°/。CPC，和大约64体积％的大豆油和大约23体积°/。的DiH20(本文称为Y4EC)。在另一个实施方案中制剂包含大约8。/。TYL0XAP0L、大约8%乙醇、大约1体积％的CPC，和大约64体积°/。的大豆油以及大约19体积％的DiH20(本文称为Y8EC)。其他实施方案包含大约8体积°/。的TYL0XAP0L、大约8体积％的乙醇、大约1体积％的CPC、大约64体积％的大豆油和大约19体积％的lxPBS(本文称为Y8ECPBS)。在本发明的一些实施方案中，纳米乳剂包含大约8体积％的乙醇，和大约1体积％的CPC，和大约64体积％的油(例如，大豆油)和大约27体积％的水相(例如，DiH20或PBS)(本文称为EC)。在一些实施方案中，纳米乳剂包含大约8体积。/。的十二烷基^i酸钠(SDS)、大约8体积°/。的三丁基磷酸酯(TBP)，和大约64体积°/。的油(例如，大豆油)和大约20体积°/。的水相(例如，DiH20或PBS)(本文称为S8P)。在一些实施方案中，纳米乳剂包含大约1至2体积°/。的TRITONX-IOO、大约1至2体积％的TYL0XAP0L、大约7至8体积°/4的乙醇、大约1体积°/。的十六烷基氯化吡啶(CPC)、大约64至57.6体积％的油(例如，大豆油)，和大约23体积°/。的水相(例如，DiH20或PBS)。此外，这些制剂中的一些还包含大约5mML-丙氨酸/肌普，和大约10mM氯化铵。这些制剂中的一些包含PBS。这些实施方案中的一些实施方案中加入PBS使得用户有利地控制制剂的pH。例如，本发明的一个实施方案包含大约2体积％的TRITONX-100、大约2体积°/0的TYL0XAP0L、大约8体积％的乙醇、大约1体积。/。CPC、大约64体积％的大豆油，和大约23体积％的水相DiH20。在另一个实施方案中，制剂包含大约1.8体积％的TRITONX-100、大约1.8体积°/。的TYL0XAP0L、大约7.2体积％的乙醇、大约0.9体积％的CPC、大约5mML-丙氨酸/肌苷，和大约10mM氯化铵、大约57.6体积y。的大豆油和剩余lxPBS(本文称为90%X2Y2EC/GE)。在备选的实施方案中，纳米乳剂包含大约5体积°/。的TWEEN80、大约8体积％的乙醇、大约1体积％的CPC、大约64体积°/。的油(例如，大豆油)和大约22体积y。的DiH20(本文称为W8。5EC)。在本发明的其他实施方案中，纳米乳剂包含大约5体积％的TWEEN20、大约8体积。/。的乙醇、大约1体积％的CPC、大约64体积％的油(例如，大豆油)和大约22体积°/。的DiH20(本文称为W2。5EC)。在本发明的其他实施方案中，纳米乳剂包含大约2至8体积％的TRITONX-100、大约8体积°/。的乙醇、大约1体积％的CPC、大约60至70体积％的油(例如，大豆或橄榄油)和大约15至25体积°/。的水相(例如，DiH20或PBS)。例如，本发明涉及包含大约2体积°/。的TRITONX-100、大约8体积y。的乙醇、大约64体积％的大豆油和大约26体积°/。的DiH20的制剂(本文称为X2E)。在其他相似的实施方案中，乳剂包含大约3体积％的TRITONX-100、大约8体积％的乙醇、大约64体积°/。的大豆油和大约25体积°/。的DiH20(本文称为X3E)。在其他实施方案中，制剂包含大约4体积°/。的TritonX-IOO、大约8体积％的乙醇、大约64体积％的大豆油和大约24体积°/。的DiH20(本文称为X4E)。在其他实施方案中，纳米乳剂包含大约5体积％的TRITONX-100、大约8体积°/。的乙醇、大约64体积°/。的大豆油和大约23体积°/。的DiH20(本文称为X5E)。在一些实施方案中，纳米乳剂包含大约6体积°/。的TRITONX-IOO、大约8体积％的乙醇、大约64体积°/。的大豆油和大约22体积％的DiH20(本文称为X6E)。在本发明的其他实施方案中，纳米乳剂包含大约8体积°/。的TRITONX-100、大约8体积％的乙醇、大约64体积％的大豆油和大约20体积％的DiH20(本文称为X8E)。在其他实施方案中，纳米乳剂包含大约8体积°/。的TRITONX-IOO、大约8体积％的乙醇、大约64体积％的橄榄油和大约20体积％的DiH20(本文称为X8E0)。在另一个实施方案中，纳米乳剂包含8体积°/。的TRITONX-100、大约8体积％的乙醇、大约1体积％的CPC、大约64体积％的大豆油和大约19体积％的DiH20(本文称为X8EC)。在本发明的备选的实施方案中，纳米乳剂包含大约1至2体积％的TRITONX-IOO、大约1至2体积°/。的TYL0XAP0L、大约6至8体积％的TBP、大约0.5至1.0体积％的CPC、大约60至70体积％的油(例如，大豆)和大约1至35体积°/。的水相(例如，DiH20或PBS)。此外，这些纳米乳剂中的某些可包含大约1至5体积％的胰胨肉胨营养液、大约0.5至1.5体积°/。的酵母提取物、大约5mML-丙氨酸/肌苷、大约10mM氯化铵和大约20-40体积°/。的液体嬰儿配方。在一些包含液体嬰儿配方的实施方案中，配方包含酪蛋白水解物(例如，Neutramigen或Progestimil等)。在这些实施方案中的一些实施方案中，纳米乳剂还包含大约0.1至1.0体积％的硫代硫酸钠和大约0.1至1.0体积％的柠檬酸钠。包含这些基本组分的其他相似的实施方案使用磷酸緩冲盐溶液(PBS)作为水相。例如，一个实施方案包含大约2体积％的TRITONX-100、大约2体积°/。的TYL0XAP0L、大约8体积％的TBP、大约1体积％的CPC、大约64体积％的大豆油和大约23体积y。的DiH20(本文称为X2Y2EC)。在其他实施方案中，本发明的制剂包含大约2体积°/。的TRITONX-100、大约2体积％的TYL0XAP0L、大约8体积％的TBP、大约1体积％的CPC、大约0.9体积°/。的疏代硫酸钠、大约0.1体积°/。的柠檬酸钠、大约64体积％的大豆油主大约22体积％的DiH20(本文称为X2Y2PCSTS1)。在另一个相似的实施方案中，纳米乳剂包含大约1.7体积％的TRITONX-100、大约1.7体积％的TYL0XAP0L、大约6.8体积％的TBP、大约0.85%CPC、大约29.2%NEUTRAMIGEN、大约54.4体积％的大豆油和大约4.9体积％的DiH20(本文称为85%X2Y2PC/baby)。在本发明的另一个实施方案中，纳米乳剂包含大约1.8体积°/。的TRITONX-100、大约1.8体积°/。的TYL0XAP0L、大约7.2体积°/。的TBP、大约0.9体积％的CPC、大约5mML-丙氨酸/肌苷、大约10mM氯化铵、大约57.6体积°/。的大豆油和剩余体积％的0.lxPBS(本文称为90%X2Y2PC/GE)。在另一个实施方案中，纳米乳剂包含大约1.8体积％的TRITONX-100、大约1.8体积％的TYL0XAP0L、大约7.2体积％的TBP、大约0.9体积％的CPC、和大约3体积％的胰胨肉胨营养液、大约57.6体积。/。的大豆油和大约27.7体积°/。的DiH20(本文称为90%X2Y2PC/TSB)。在本发明的另一个实施方案中，纳米乳剂包含大约1.8体积°/。的TRITONX-IOO、大约1.8体积°/。的TYL0XAP0L、大约7.2体积％的TBP、大约0.9体积%的CPC、大约1体积％的酵母提取物、大约57.6体积％的大豆油和大约29.7体积°/。的DiH20(本文称为90%X2Y2PC/YE)。在本发明的一些实施方案中，纳米乳剂包含大约3体积％的TYL0XAP0L、大约8体积％的TBP，和大约1体积°/。的CPC、大约60至70体积％的油(例如，大豆或橄榄油)和大约15至30体积％的水相(例如，DiH20或PBS)。在本发明的特定实施方案中，纳米乳剂包含大约3体积％的TYLOXAPOL、大约8体积°/。的TBP、和大约1体积％的CPC、大约64体积％的大豆和大约24体积％的DiH20(本文称为Y3PC)。在本发明的一些实施方案中，纳米乳剂包含大约4至8体积％的TRITONX-IOO、大约5至8体积°/。的TBP，大约30至70体积％的油(例如，大豆或橄榄油)和大约0至30体积％的水相(例如，DiH20或PBS)。此外，这些实施方案中的某些实施方案还包含大约1体积％的CPC、大约l体积y。的氯化苯甲烃铵、大约i体积％的十六烷基氯化吡啶、大约1体积°/。的十六烷基二甲基乙基溴化铵、500pMEDTA、大约10mM氯化铵，大约5mM肌苷和大约5mML-丙氨酸。例如，在某些实施方案中，纳米乳剂包含大约8体积％的TRITONX-IOO、大约8体积％的TBP、大约64体积％的大豆油和大约20体积％的DiH20(本文称为X8P)。在本发明的另一个实施方案中，纳米乳剂包含大约8体积°/。的TRITONX-IOO、大约8体积。/。的TBP、大约1%CPC、大约64体积°/。的大豆油和大约19体积％的DiH20(本文称为X8PC)。在另一个实施方案中，纳米乳剂包含大约8体积°/4的TRITONX-100、大约8体积％的TBP、大约1体积％的CPC、大约50体积°/。的大豆油和大约33体积％的DiH20(本文称为ATB-X1001)。在另一个实施方案中，制剂包含大约8体积y。的TRITONX-100、大约8体积°/。的TBP、大约2体积°/。的CPC、大约50体积％的大豆油和大约32体积％的DiH20(本文称为ATB-X002)。在一些实施方案中，乳剂包含大约4体积°/。的TRITONX-100、大约4体积％的TBP、大约0.5体积°/。的CPC、大约32体积％的大豆油和大约59.5体积％的DiH20(本文称为50%X8PC)。在一些实施方案中，纳米乳剂包含大约8体积°/。的TRITONX-100、大约8体积°/。的TBP、大约0.5体积％的CPC、大约64体积％的大豆油和大约19.5体积°/。的DiH20(本文称为X8PC1/2)。在本发明的一些实施方案中，纳米乳剂包含大约8体积%的TRITONX-100、大约8体积％的TBP、大约2体积％的CPC、大约64体积％的大豆油和大约18体积°/。的DiH20(本文称为X8PC2)。在其他实施方案中，纳米乳剂包含大约8体积°/。的TRITONX-100、大约8°/。TBP、大约1°/。氯化苯甲烃铵、大约50体积％的大豆油和大约33体积％的DiH20(本文称为X8PBC)。在本发明的备选的实施方案中，纳米乳剂包含大约8体积％的TRITONX-IOO、大约8体积％的TBP、大约1体积％的十六烷基氯化吡啶、大约50体积°/。的大豆油和大约33体积°/。的DiH20(本文称为X8PCPB)。在本发明的另一个实施方案中，纳米乳剂包含大约8体积％的TRITONX-IOO、大约8体积％的TBP、大约1体积％的十六烷基二曱基乙基溴化铵、大约50体积°/。的大豆油和大约33体积°/。的DiH20(本文称为X8PCTAB)。在其他实施方案中，纳米乳剂包含大约8体积%的TRITONX-100、大约8体积°/。的TBP、大约1体积％的CPC、大约500ILiMEDTA、大约64体积°/。的大豆油和大约15.8体积°/。的DiH20(本文称为X8PCEDTA)。在一些实施方案中，纳米乳剂包含8体积°/。的TRITONX-IOO、大约8体积°/。的TBP、大约1体积。/。的CPC、大约10mM氯化铵、大约5mM肌苷、大约5mML-丙氨酸、大约64体积°/。的大豆油和大约19体积％的DiH20或PBS(本文称为X8PCGElx)。在本发明的另一个实施方案中，纳米乳剂包含大约5体积％的TRITONX-100、大约5%TBP、大约1体积％的CPC、大约40体积％的大豆油和大约49体积°/。的DiH20(本文称为X5P5C)。在本发明的一些实施方案中，纳米乳剂包含大约2体积％的TRITONX-IOO、大约6体积％的TYL0XAP0L、大约8体积％的乙醇、大约64体积％的大豆油和大约20体积％的DiH20(本文称为X2Y6E)。在本发明的另外的实施方案中，纳米乳剂包含大约8体积％的TRITONX-IOO、和大约8体积％的甘油、大约60至70体积％的油(例如，大豆或橄榄油)和大约15至25体积％的水相(例如，DiH20或PBS)。某些纳米乳剂组合物(例如，用于产生免疫反应(例如，用作疫苗)包含大约1体积。/fl的L-抗坏血酸。例如，一个特定的实施方案包含大约8体积％的TRITONX-IOO、大约8体积％的甘油、大约64体积％的大豆油和大约20体积。/。的DiH20(本文称为X8G)。在另一个实施方案中，纳米乳剂包含大约8体积％的TRITONX-100、大约8体积％的甘油、大约1体积％的L-抗坏血酸、大约64体积％的大豆油和大约19体积％的DiH20(本文称为X8GVC)。在其他实施方案中，纳米乳剂包含大约8体积％的TRITONX-100、大约0.5至0.8体积°/。的TWEEN60、大约0.5至2.0体积°/。的CPC、大约8体积％的TBP、大约60至70体积°/。的油(例如，大豆或橄榄油)和大约15至25体积°/。的水相(例如，DiH20或PBS)。例如，在一个特定的实施方案中，乳剂包含大约8体积°/。的TRITONX-100、大约O.70体积％的TWEEN60、大约1体积°/。的CPC、大约8体积％的TBP、大约64体积％的大豆油和大约18.3体积°/。的DiH20(本文称为X8W60PCJ。在一些实施方案中，纳米乳剂包含大约8体积°/。的TRITONX-IOO、大约0.71体积°/。的TWEEN60、大约1体积°/。的CPC、大约8体积％的TBP、大约64体积％的大豆油和大约18.29体积°/。的DiH20(本文称为W60。.J8PC)。在其他实施方案中，乳剂包含大约8体积°/。的TRITONX-IOO、大约0.7体积°/。的TWEEN60、大约0.5体积°/。的CPC、大约8体积％的TBP、大约64至70体积％的大豆油和大约18.8体积％的DiH20(本文称为X8W60PC2)。在其他实施方案中，乳剂包含大约8体积％的TRITONX-100、大约0.71体积°/。的TWEEN60、大约2体积°/。的CPC、大约8体积％的TBP、大约64体积°/。的大豆油和大约17.3体积％的DiH20。在本发明的另一个实施方案中，乳剂包含大约0.71体积％的TWEEN60、大约1体积°/。的CPC、大约8体积°/。的TBP、大约64体积％的大豆油和大约25.29体积y。的DiH20(本文称为W60。.7PC)。在本发明的另一个实施方案中，纳米乳剂包含大约2体积°/。的二辛基磺基琥珀酸酯、大约8体积°/。的甘油、或大约8体积。/。的TBP，此外，大约60至70体积％的油(例如，大豆或橄榄油)和大约20至30体积％的水相(例如，DiH20或PBS)。例如，在一些实施方案中，纳米乳剂包含大约2体积％的二辛基磺基琥珀酸酯，大约8体积％的甘油、大约64体积％的大豆油和大约26体积^的DiH20(本文称为D2G)。在另一个相关的实施方案中，纳米乳剂包含大约2体积％的二辛基磺基琥珀酸酯和大约8体积％的TBP、大约64体积％的大豆油和大约26体积％的DiH20(本文称为D2P)。在本发明的其他实施方案中，纳米乳剂包含大约8至10体积％的甘油和大约1至10体积％的CPC、大约50至70体积°/。的油(例如，大豆或橄榄油)，和大约15至30体积％的水相(例如，DiH20或PBS)。此外，在这些实施方案中的某些实施方案，纳米乳剂还包含大约1体积％的L-抗坏血酸。例如，在一些实施方案中，乳剂包含大约8体积。/。的甘油、大约1体积°/。的CPC、大约64体积°/。的大豆油和大约27体积％的DiH20(本文称为GC)。在一些实施方案中，纳米乳剂包含大约10体积%的甘油、大约10体积y。的CPC、大约60体积％的大豆油和大约20体积％的DiH20(本文称为GCIO)。在本发明的另一个实施方案中，纳米乳剂包含大约10体积％的甘油、大约i体积y。的cpc、大约1体积％的L-抗坏血酸、大约64体积°/。的大豆或油和大约24体积°/。的DiH20(本文称为GCV6)。在本发明的一些实施方案中，纳米乳剂包含大约8至10体积％的甘油、大约8至10体积％的SDS、大约50至70体积％的油(例如，大豆或橄榄油)和大约15至30体积％的水相(例如，DiH20或PBS)。此外，在这些实施方案中的某些实施方案，纳米乳剂还包含大约1体积％的卵磷脂和大约1体积°/。的对-羟基苯甲酸曱酯。此类制剂的示例性实施方案包含大约8体积％的SDS、8体积％的甘油、大约64体积％的大豆油和大约20体积y。的DiH20(本文称为S8G)。相关制剂包含大约8体积%的甘油、大约8体积％的SDS、大约1体积°/。的卵磷脂、大约1体积°/。的p-羟基苯甲酸甲酯、大约64体积％的大豆油和大约18体积°/。的DiH20(本文称为S8GL1B1)。在本发明的另一个实施方案中，纳米乳剂包含大约4体积°/。的TWEEN80、大约4体积％的TYLOXAPOL、大约1体积％的CPC、大约8体积％的乙醇、大约64体积°/。的大豆油和大约19体积％的DiH20(本文称为W8。4Y4EC)。在本发明的一些实施方案中，纳米乳剂包含大约0.01体积％的CPC、大约0.08体积°/。的TYLOXAPOL、大约10体积％的乙醇、大约70体积％的大豆油和大约19.91体积°/。的DiH20(本文称为Y.08EC.01)。在本发明的另一个实施方案中，纳米乳剂包含大约8体积％的月桂基疏酸钠和大约8体积％的甘油、大约64体积％的大豆油和大约20体积％的DiH20(本文称为SLS8G)。上述特定的制剂只是举例说明用于本发明(例如，灭活和/或中和病原体，和用于在受试者中产生免疫反应(例如，用于用作疫苗))的多种纳米乳剂的简单示例。本发明包括用于本发明的方法的上述制剂的许多变体以及另外的纳米乳剂。可容易地检测候选乳剂以确定它们是否合适。首先，使用本文描述的方法制备想要的组分，以确定是否可形成乳剂。如果不能形成乳剂，弃去该候选物。例如，由4.5%疏代硫酸钠、0.5%柠檬酸钠、10%正-丁醇、64%大豆油和2ly。DiH20制备的候选物不形成乳剂。第二，候选乳剂应当形成稳定的乳剂。如果其以乳剂的形式保持足以允许其想要的用途(例如，在受试者中产生免疫反应)的时间，则乳剂是稳定的。例如，对待贮存的、运输等的乳剂，希望组合物以乳剂的形式保持数月至数年。相对不稳定的常见乳剂将在1天内失去它们的形式。例如，由8°/。1-丁醇、5%Tween10、1%CPC、64。yi大豆油和22%DiH20制备的候选组合物不形成稳定的乳剂。已显示为稳定的纳米乳剂包括但不限于8体积％的TRITONX-IOO、大约8体积％的TBP、大约64体积°/。的大豆油和大约20体积％的DiH20(本文称为X8P);5体积％的TWEEN20、大约8体积％的乙醇、大约1体积°/4的CPC、大约64体积°/。的油(例如，大豆油)和大约22体积°/。的DiH20(本文称为W2。5EC);0.08%TritonX-100、0.08%甘油、0.01%十六烷基氯化吡啶、99%黄油和0.83%diH20(本文称为1%X8GC黄油)；0,8%TritonX-IOO、0.8%甘油、0.1°/。十六烷基氟化吡咬、6.4%大豆油、1.9%diH20和90%黄油(本文称为10%X8GC黄油)；2%W2。5EC、1%Natrosol250LNF和97。/。diH20(本文称为2%W2。5ECLGEL);1%十六烷基氯化吡啶、5%Tween20、8%乙醇、64%70粘稠矿物油和22%diH20(本文称为W2Q5EC70矿物油)；1%十六烷基氯化吡啶、5%Tween20、8%乙醇、64%350粘稠矿物油和22%diH20(本文称为W2Q5EC350矿物油)，在一些实施方案中，本发明的纳米乳剂稳定超过一周、超过一个月或超过一年。第三，候选乳剂应当对其想要的用途具有功效。例如，纳米乳剂应当灭活(例如杀死或抑制其生长)病原体至想要的水平(例如，llog、21og、31og、41og、…的减少)。通过使用本文描述的方法，人们能够确定特定的候选乳剂抗目的病原体的适合性。通常，这包括在使用合适的对照样品(例如，阴性对照例如水)的并行实验中将病原体暴露于乳剂进行一个或多个时期，然后确定乳剂是否灭活(例如，杀死和/或中和)微生物和确定其达到的程度。例如，显示由1°/。氯化铵、5%TWEEN20、8%乙醇、64%大豆油和22%DiH20制备的候选组合物不是有效的乳剂。使用本文描述的方法显示下列候选乳剂是有效的乳剂5%TWEEN20、5%十六烷基氯化吡咬、10°/。甘油、60%大豆油和20%diH20(本文称为W2。5GC5);ly。十六烷基氯化吡啶、5%TWEEN20、10%甘油、64%大豆油和20%diH20(本文称为W2。5GC);1。/。十六烷基氯化吡啶、5%TWEEN20、8%乙醇、64%橄榄油和22°/。diH20(本文称为W2。5EC橄榄油)；1%十六烷基氯化吡咬、5%TWEEN20、8%乙醇、64%亚麻子油和22%diH20(本文称为W2。5EC亚麻子油)；1%十六烷基氯化吡啶、5%TWEEN20、8%乙醇、64%玉米油和22%diH20(本文称为W2。5EC玉米油)；1%十六烷基氯化吡啶、5%TWEEN20、8%乙醇、64%椰子油和22%diH20(本文称为W2。5EC椰子油)；1°/。十六烷基氯化吡啶、5%TWEEN20、8%乙醇、64°/。棉子油和22%diH20(本文称为W2。5EC棉子油);8%葡萄糖、5%TWEEN10、1%十六烷基氯化吡咬、64%大豆油和22°/。diH20(本文称为W2。5C葡萄糖)；8%PEG200、5%TWEEN10、1°/。十六烷基氯化吡啶、64%大豆油和22%diH20(本文称为W205CPEG200);8%甲醇、5%TWEEN10、1%十六烷基氯化吡啶、64%大豆油和22。/。diH20(本文称为W2。5C曱醇)；8%PEG1000、5%TWEEN10、1。/。十六烷基氯化吡咬、64%大豆油和22°y4diH20(本文称为W2。5CPEG1000);2%W2。5EC、2%Natrosol250HNF和96%线0(本文称为2。线。5ECNatrosol2，也称为2%W2。5ECGEL);2%W2。5EC、1%Natrosol250HNF和97%diH20(本文称为2%W2。5ECNatrosol1);2%W2。5EC、3%Natrosol250HNF和95°/。diH20(本文称为2%W2。5ECNatrosol3);2%W2。5EC、0.5°/。Natrosol250HNF和97.5%diH20(本文称为2%W2。5ECNatrosol0.5);2%W2。5EC、2%MethocelA和96%diH20(本文称为2%W2。5ECMethocelA);2%W2。5EC、2%MethocelK和96%diH20(本文称为2%W2。5ECMethocelK);2%Natrosol、0.1%X8PC、0.lxPBS、5mML-丙氨酸、5mM肌苷、10mM氯化铵和diH20(本文称为0.l%X8PC/GE+2%Natrosol);2%Natrosol、0.8%TRITONX-IOO、0.8。/。三丁基磷酸酯、6.4°/。大豆油、0.1%十六烷基氯化吡啶、0.lxPBS、5mML-丙氨酸、5mM肌苷、10mM氯化铵和diH20(本文称为10%X8PC/GE+2°/。Natrosol);1%十六烷基氯化吡咬、5%TWEEN20、8°/。乙醇、64%猪油和22%diH20(本文称为W2D5EC猪油)；1%十六烷基氯化吡啶、5%TWEEN20、8%乙醇、64%矿物油和22%diH20(本文称为W2。5EC矿物油)；0.1%十六烷基氯化吡啶、2%橙花叔醇、5%TWEEN20、10%乙醇、64%大豆油和18.9%diH20(本文称为W2。5ECuN);0.1%十六烷基氯化吡啶、2°/。法呢醇、5°/。TWEEN20、10%乙醇、64%大豆油和18.9%diH20(本文称为W2。5EC。」F);0.1°/。十六烷基氯化吡咬、5%TWEEN20、10%乙醇、64°/。大豆油和20.9%diH20(本文称为Wm5EC。.J;10。/。十六烷基氯化吡啶、8。/fl三丁基磷酸酯、8%TRITONX-IOO、54%大豆油和20%diH20(本文称为X8Pd。)；5°/。十六烷基氯化吡咬、8簡T0NX-100、8°/。三丁基磷酸酯、59°/。大豆油和20%diH2O(本文称为X8PC》；0.02%十六烷基氯化吡啶、0.1%TWEEN20、10%乙醇、70%大豆油和19.88%diH20(本文称为W2。0.1EC。.。2);1。/o十六烷基氯化吡咬、5%TWEEN20、8%甘油、64%Mobil1和22%diH20(本文称为W2。5GCMobil1);7.2°/。TRITONX-100、7.2°/。三丁基磷酸酯、0.9°/。十六烷基氯化吡啶、57.6%大豆油、0.lxPBS、5mML-丙氨酸、5mM肌苷、10mM氯化铵和25.87%diH20(本文称为90%X8PC/GE);7.2%TRITONX-IOO、7.2°/。三丁基磷酸酯、0.9°/。十六烷基氯化吡咬、57.6%大豆油、1%EDTA、5mML-丙氨酸、5mM肌苷、10mM氯化铵、0.lxPBS和diH20(本文称为90%X8PC/GEEDTA);和7,2°/。TRITONX-IOO、7.2%三丁基磷酸酯、0.9%十六烷基氯化吡咬、57.6°/。大豆油、1°/。硫代硫酸钠、5mML-丙氨酸、5mM肌苷、10mM氯化铵、0.lxPBS;和diH20(本文称为90%X8PC/GESTS)。在本发明的优选实施方案中，纳米乳剂是无毒的(例如，对人、植物或动物)、非刺激性的(例如，对人、植物或动物)和无腐蚀性的(例如，对人、植物或动物或环境)，同时具有抗广泛微生物(包括细菌、真菌、病毒和孢子)的潜能。虽然许多上述纳米乳剂满足这些条件，但下列描述提供本发明的许多优选无毒的、非刺激性的、无腐蚀性的、抗微生物纳米乳剂(在下文中在Thl部分称为"无毒性纳米乳剂")。在一些实施方案中，无毒性纳米乳剂包含用作有效地抗细菌和它们的孢子、有包膜病毒和真菌的广镨抗微生物剂的表面活性剂脂质制备物(SLP)。在优选实施方案中，这些SLP包含油、去垢剂、溶剂和含阳离子囟素化合物，以及几种增强它们的杀生物活性的离子的混合物。与具有高刺激性和/或毒性的商购可获得的杀菌剂和杀孢子剂相比，这些SLP特征是稳定的、非刺激性的和无毒性的化合物。用于无毒性纳米乳剂的组分包括但不限于去垢剂(例如，TRITONX-IOO(5-15%)或TRITON家族的其他成员、TWEEN60(0.5-2%)或TWEEN家族的其他成员、或TYL0XAP0L(1-10°/。))；溶剂(例如，三丁基磷酸酯(5-15%));醇(例如，乙醇(5-15%)或甘油(5-15°/。))；油(例如，大豆油(40-70°/。))；含阳离子卣素化合物(例如，十六烷基氯化吡啶(0.5-2%)、十六烷基溴化吡啶(0.5-2%))或十六烷基二甲基乙基溴化铵(O.5-2%));季铵化合物(例如，氯化苯甲烃铵(0.5-2°/。)，N-烷基二甲基苯甲基氯化铵(0.5-2%));离子(氯化钙(lmM-40mM)、氯化铵(lmM-20mM)、氯化钠(5mM-200mM)、磷酸钠(lmM-20mM));核苷(例如，肌苷(50uM-20mM));和氨基酸(例如，L-丙氨酸(50|iM-20mM))。通过例如，在高剪切力搅拌器中混合3至IO分钟来制备乳剂。在82。C下混合l小时之前可以加热或可以不加热乳剂。用于本发明的季铵化合物包括但不限于N-烷基二甲基苯甲基糖精铵、1，3，5-三溱-l，3，5(2H，4H，6H)-三乙醇、l-十烷基铵、N-癸基-N，N-二甲基-，氯(或)二癸基二甲基氯化铵、2-(2-(对-(二异丁基)甲苯氧基)乙氧基)乙基二甲基苯甲基氯化铵、2-(2-(对-(二异丁基)苯氧基)乙氧基)乙基二甲基苯甲基氯化铵、烷基1或3苯甲基-1-(2-羟乙基)-2-氯化咪唑啉；烷基二(2-羟乙基)苯曱基氯化铵、烷基去甲基苯甲基氯化铵、烷基二甲基3，4-二氯苯甲基氯化铵(100。/4C12)、烷基二甲基3，4-二氯苯甲基氯化铵(50°/。C14、40%C12、10%C16)、烷基二曱基3,4-二氯苯曱基氯化铵(55°/。C14、23%C12、20%C16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵、烷基二甲基苯甲基氯化铵(100%C14)、烷基二曱基苯甲基氯化铵(100%C16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(41%C14、28%C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(47°/。C12、18%C14)、烷基二曱基苯甲基氯化铵(55%C16、20%C14)、烷基二曱基苯甲基氯化铵(58%C14、28%C16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(60%C14、25%C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(61%Cll、23%C14)、烷基二甲基苯曱基氯化铵(61°/。C12、23%C14)、烷基二曱基苯甲基氯化铵(65%C12、25%C14)、烷基二曱基苯甲基氯化铵(67%C12、24%C14)、烷基二甲基苯曱基氯化铵(67%C12、25%C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(90%C14、5%C12)、烷基二曱基苯甲基氯化铵(93%C14、4%C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(95yoC16、5°/C18)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(和)二癸基二曱基氯化铵、烷基二曱基苯曱基氯化铵(如在脂肪酸中)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(C12-C16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(C12-C18)、烷基二曱基苯甲基和二烷基二甲基氯化铵、烷基二甲基二甲基苯甲基氯化铵、烷基二曱基乙基溴化铵(90°/。C14、5°/。C16、5%C12)、烷基二曱基乙基溴化铵(如大豆油的脂肪酸中混合的烷基和链烯基)、烷基二曱基乙基苯曱基氯化铵、烷基二甲基乙基苯曱基氯化铵(60y。C14)、烷基二曱基异丙基苯甲基氯化铵(50XC12、30%C14、17%C16、3%C18)、烷基三甲基氯化铵(58%C18、40%C16、1%C14、1%C12)、烷基三曱基氯化铵(90°/。C18、10%C16)、烷基二甲基(乙基苯甲基)氯化铵(C12-18)、二-(C8-10)-烷基二曱基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵、二烷基二曱基氯化铵、二烷基甲基苯甲基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、二异癸基二甲基氯化铵、二辛基二甲基氯化铵、十二烷基二(2-羟乙基)辛基氢氯化铵、十二烷基二曱基苯甲基氯化铵、十二烷基氨曱酰甲基二甲基苯甲基氯化铵、七癸基羟乙基氯化咪唑啉、六氢-1，3,5-三(2-羟乙基)-s-三嗪、肉豆蔻基苄基二甲基氯化铵(和)QuatRNIUM14、N，N-二甲基-2-羟丙基氯化铵聚合物、正-烷基二曱基苯曱基氯化铵、正-烷基二甲基乙基苯甲基氯化铵、正-十四烷基二甲基苯甲基氯化铵一水合物、辛基癸基二曱基氯化铵、辛基十二烷基二甲基氯化铵、辛基苯氧基乙氧基乙基二甲基苯甲基氯化铵、氧二乙撑基双(烷基二甲基氯化铵)、季铵化合物、二可可烷基二曱基，氯化物、三曱氧基曱硅烷基丙基二甲基八癸基氯化铵、三甲氧基甲硅烷基季铵化合物、三曱基十二烷基苯曱基氯化铵、正-十二烷基二曱基乙基苯曱基氯化铵、正-六癸基二甲基苯甲基氯化铵、正-十四烷基二甲基苯甲基氯化铵、正-十四烷基二甲基乙基苯甲基氯化铵、和正-八癸基二曱基苯曱基氯化铵。一般而言，优选无毒性纳米乳剂的特征为它们直径大约为200-800nm，尽管包括更大和更小的直径的纳米乳剂；电荷取决于组分；它们在相对长的时间(例如，多至两年)内是稳定的，保持它们的杀生物活性；由于(至少部分由于)它们的显著减少去垢剂和溶剂的毒性的油内含物的原因，与它们的个别组分相比，它们是非刺激性的和无毒的；它们在低至0.1。/。的浓度上是有效的；它们具有在15分钟内抗大多数植物细菌(包括革兰阳性和革兰阴性的生物)、真菌和有包膜和无包膜的病毒的抗微生物活性(例如，99.99%的杀死)；和当使用萌发增强剂产生地，它们在1至4小时内具有杀孢子活性(例如，99.99%的杀死)。D.动物模型在一些实施方案中，在感染性疾病的动物模型中检测潜在的纳米乳剂组合物(例如，用于产生免疫反应(例如，用于用作疫苗))。使用良好建立的(well-developed)动物模型提供了在对人受试者施用之前测量疫苗的有效性和安全性的方法。表3显示疾病的示例性动物模型。这些动物是商购可获得的(例如，来自JacksonLaboratoriesCharlesRiver;Portage,MI)。蜡状芽胞杆菌(与炭疽芽胞杆菌紧密相关的)的动物模型用于检测本发明的炭疽菌苗。两种细菌都是形成孢子的革兰阳性棒状杆菌，由各细菌产生的疾病症状主要归因于毒素的产生和这些毒素对感染的宿主的作用(Brown等人，J.Bact，75:499(1958);Burdon和Wende，J.InfectDis.，107:224(1960);Burdon等人，J.Infect.Dis.，117:307(1967))。蜡状芽胞杆菌感染模拟由炭疽芽胞杆菌引起的疾病症状。据报导小鼠迅速死于蜡状芽胞杆菌毒素的作用，其是用于急性感染的有用模型。豚鼠在用蜡状芽胞杆菌皮下注射后产生与炭疽的表皮形式相似的皮肤病损。小鼠和豚鼠中的产气荚膜梭菌(C/o^rAf/wz^er/V/z^e/)感染已用作用于体内抗生素药物的模型系统(Stevens等人，Antimicrob.AgentsChemother.,31:312(1987);Stevens等人，J.Infect.Dis.，155:220(1987);Alttemeier等人，Surgery,28:621(1950);Sandusky等人，Surgery,28:632(1950))。众所周知破伤风梭状芽胞杆菌("0Wi7Wz/迈在许多哺乳动物种类中感染和引起疾病。小鼠、豚鼠和兔子已全都用于实验(Willis，Topley和Wilson'sPrinciplesofBacteriology,VirologyandImmunity.Wilson,G.，A.Miles,和M.T.Parker,eds.pages442-4751983)。已在小鼠、豚鼠和兔子中成功引发霍乱弧菌感染。根据公开的报导，优选改变正常肠道菌群以在这些实验宿主中建立感染。通过施用抗生素以抑制正常肠道菌群和在一些情况下，停止喂食动物以抑制正常肠菌群来实现(Butterton等人，Infect.Immun.，64:4373(1996);Levine等人，Microbiol.Rev.，47:510(1983);Finkelstein等人，J.Infect.Dis.，114:203(1964);Freter，J.Exp.Med,，104:411(1956);和Freter，J.Infect.Dis.，97:57(1955))。已在小鼠、豚鼠中成功引发福氏志贺氏菌(/7ej7er/2')感染。与使用弧菌感染的情况一样，优选改变正常肠道菌群以帮助在这些实验宿主中建立感染。通过施用抗生素以抑制正常肠道菌群和在一些情况下，停止喂食动物以抑制正常肠菌群来实现(Levine等人，Microbiol.Rev.，47:510(1983);Freter，J.Exp.Med.，104:411(1956);Formal等人,J.Bact,85:119(1963);LaBrec等人，J.Bact88:1503(1964);Takeuchi等人，Am.J.Pathol.，47:1011(1965))。小鼠和大鼠已广泛用于使用鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌(W節"e/7ae/^erjW〃s)的实验研究(Naughton等人，LAppl.Bact.，81:651(1996);Carter和Col1ins，J.Exp.Med.，139:1189(1974);Collins,Infect.Immun.，5:191(1972);Col1ins和Carter，Infect.Immun.，6:451(1972))。小鼠和大鼠是使用仙台病毒的感染的良好建立的实验模型(Jacoby等人，Exp.Gerontol.,29:89(1994);Massion等人，Am.J.Respir.CellMol.Biol.9:361(1993);Castleman等人，Am.J.Path.,129:277(1987);Castleman,Am.J.Vet.Res.，44:1024(1983);Mims和Murphy,Am.J.Path.,70:315(1973))。通常通过新生小鼠的脑内接种来实现小鼠的辛德比斯病毒感染。任选地，在足垫(footpad)皮下接种刚断奶的小鼠(Johnson等人，J.Infect.Dis.,125:257(1972);Johnson,Am.J.Path.，46:929(1965))。优选，在航运后将动物关养3至5天以事休息，使其在用于实验之前适应新的关养环境。在各实验开始起，杀死对照动物，获取组织以建立基线参数。通过任何合适的方法(例如包括但不限于氟醚的吸入(用于短时间操作)或氯胺酮/甲苯噻溱注射(用于长时间操作)麻醉动物。表3感染性疾病的动物模型微生物实验动物种系实验动物林系性别年龄感染途径小鼠BALB/CM6W腹膜内脑膜炎奈瑟菌f/2e/'wer/a小鼠BALB/CF6-10W腹膜内大鼠C0BS/CDM/F4D鼻内肺炎链球菌小鼠BALB/CF6W鼻内大鼠C0BS/CDM6-8W鼻内豚鼠HartleyM/F4-5W鼻内假结核炎耶尔森氏菌小鼠BALB/CF6W鼻内流感病毒小鼠BALB/CF6W鼻内仙台病毒小鼠CD-1F6W鼻内大鼠Sprague-DawleyM6-8W鼻内辛德毕斯病毒小鼠CD-1M/F1-2D脑内/sc牛痘小鼠BALB/CF2-3W鼻内96E.用于疫苗的估计的测定法在一些实施方案中，使用几种合适的模型系统中的一种评估候选纳米乳剂疫苗。例如，可体外评估细胞介导的免疫反应。此外，可使用动物模型体内评估对病原体攻击的免疫反应和免疫。可使用任何合适的动物模型，包括但不限于表3中公开的动物模型。在于动物系统中检测纳米乳剂疫苗之前，研究足以灭活病原体的病原体对纳米乳剂的暴露的量。为了充分中和至允许进行免疫，病原体例如细菌孢子需要更长的时间通过纳米乳剂进行灭活。使用任何合需的时间。此外，特别地在一段时间内和贮存条件下，估计乳剂开发的疫苗的稳定性，以确保疫苗长期有效。也估计其他稳定材料(例如，树枝状聚合物)增强疫苗的稳定性和免疫原性的能力。在配制给定的纳米乳剂/病原体疫苗从而导致病原体灭活后，优化疫苗引发免疫反应和提供免疫的能力。用于测定疫苗功效的方法的非限定性实例描述于下面的实施例14中。例如，疫苗的施用时间和剂量可以变化，确定最有效的剂量和施用时间表。通过测量血清抗体水平来定量免疫反应的水平。此外，使用体外测定，通过测量113-胸苷的摄取来监视增殖活性。除增殖外，测量Thl和Th2细胞因子反应(例如，包括但不限于IL-2、TNF-y、IFN-y、IL-4、IL-6、IL-ll、IL-12等的水平)以定量评估免疫反应。最后，使用动物模型评估纳米乳剂粘膜疫苗的功效。将纯化的病原体混合在乳剂(或将乳剂与预感染的动物的接触)中，施用其，然后确定免疫反应。然后通过用特定的病原体攻击动物，和之后评估疾病症状的水平来评估保护的水平。在一段时间内测量免疫的水平以确定加强免疫的必要性和时间间隔。III.治疗剂和预防剂此外，在优选实施方案中，本发明的組合物诱导(例如，当对受试者施用时)全身性和粘膜免疫两者。因此，在一些优选实施方案中，对受试者施用本发明的组合物导致抗暴露于HIV(例如，粘膜暴露)的保护。尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，粘膜施用(例如，接种)提供了抗HIV感染(例如，在粘膜表面开始的)的保护。尽管迄今已证明难以刺激分泌性IgA反应和抗在粘膜表面侵入的病原体的保护(参见，例如，Mestecky等人,MucosalImmunology.第3版.(AcademicPress,SanDiego,2005))，但本发明提供了用于在受试者中刺激来自病原体的粘膜免疫(例如，保护性IgA反应)的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明提供了用作粘膜疫苗的组合物(例如，包含NE和来自HIV的免疫原性蛋白抗原(例如，gpl20)的组合物)。可用NE和HIV蛋白(例如，病毒来源的gpl20、活病毒栽体来源的gpl20和gpl60、重组哺乳动物gpl20、重组变性多肽、gpl20和gp41的小肽片段、V3环肽)容易地产生该材料，所述材料诱导粘膜和全身性免疫。快速产生该制剂和通过粘膜(例如，鼻或阴道粘膜)滴注法施用其的能力提供了可用于大规模施用(例如，对城镇、乡村、城市、州或国家的人群施用)的疫苗。在一些优选实施方案中，本发明提供了用于产生免疫反应的组合物，其包含NE和免疫原(例如纯化的、分离的或合成的HIV蛋白或其衍生物、变体或类似物；或被纳米乳剂灭活的HIV的一种或多种血清型)。当对受试者施用时，本发明的组合物在受试者中刺激抗免疫原的免疫反应。尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，但在一些实施方案中，免疫反应的产生(例如，由于施用包含纳米乳剂和免疫原的组合物导致的)对受试者提供了完全或部分免疫(例如，根据疾病(例如，AIDS)的体征、症状或病况)。不受任何特定理论的束繂，在暴露于本发明的免疫性组合物后，对疾病的保护和/或免疫(例如，受试者的免疫系统预防或减弱(例如，抑制)疾病的体征、症状或病况的能力)源于适应性(例如，获得性)免疫反应(例如，在暴露于包含本发明的免疫原的NE后由B和T细胞介导的免疫反应(例如，显示增加的对HIV的特异性和反应性的免疫反应))。因此，在一些实施方案中，本发明的组合物和方法预防性或治疗性地用于预防或减弱与AIDS相关的体征、症状或病况。在一些实施方案中，单独地施用包含免疫原(例如，重组HIV蛋白)的NE。在一些实施方案中，包含NE和免疫原(例如，重组HIV蛋白)的组合物包含一种或多种其他试剂(例如，药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂等)。在一些实施方案中，以诱导体液免疫反应的方式施用用于刺激本发明的免疫反应的组合物。在一些实施方案中，以诱导细胞(例如，细胞毒T淋巴细胞)免疫反应而非体液反应的方式施用用于刺激本发明的免疫原的组合物。在一些实施方案中，包含NE和本发明的免疫原的组合物诱导细胞和体液免疫反应两者。本发明不受限于所使用的正痘病毒的类型或林系(例如，包含NE和免疫原(例如，被纳米乳剂灭活的正痘病毒))。事实上，可单独地或与另一个家族成员一起使用各正痘病毒家族成员，用于产生本发明的包含NE和免疫原(例如，用于产生免疫反应)的组合物。正痘病毒家族成员包括但不限于类天花病毒、痘苗病毒、牛痘、猴痘、沙鼠痘、骆驼痘和其他病毒。本发明不受限于所使用的痘苗病毒的株系。事实上，包括多种痘苗病毒林系用于本发明，包括但不限于痘苗病毒的经典林系(例如，EM-63、Lister、纽约城市健康委员会(NewYorkCityBoardofHealth)、Elestree和TempleofHeaven林系)、减毒林系(例如，Ankara)、非复制林系、改良的抹系(例如，通过遗传地或机械地改造(例如，以变得更强毒性或更低毒性)的林系)、哥本哈根林系(Copenhagenstrain)、改良的牛痘Ankara、纽约痘苗病毒、痘苗病毒to(VacciniaVirusWR)和痘苗病毒職-Luc，或痘苗病毒的其他系列稀释的林系。包含NE和免疫原的组合物可包含痘苗和/或其他类型的正痘病毒的一种或多种林系。此外，包含NE和免疫原的组合物可包含痘苗病毒的一种或多种株系和，另外的非痘苗病毒的一种或多种林系的免疫原或其免疫原性表位(例如，细菌(例如，炭疽芽胞杆菌)或其免疫原性表位(例如，重组保护性抗原)或者病毒(例如，西尼罗病毒、禽流感病毒、埃博拉病毒、HSV、HPV、HCV、HIV等)或其免疫原性表位(例如，gpl20))。在一些实施方案中，免疫原可包含来源于病原体(例如，正痘病毒)的一个或多个抗原。例如，在一些实施方案中，免疫原是纯化、重组、合成或分离的蛋白质(例如，加入至NE中以产生免疫原性组合物)。类似地，免疫原性蛋白可以是来自病原体的蛋白质的衍生物、类似物或修饰(例如，PEG化的)的形式。本发明不受限于所使用的芽胞杆菌的类型或林系或来源于其的免疫原性蛋白。例如，已鉴定的89种不同的炭疽芽胞杆菌的林系，范围从具有生物战争和生物恐怖主义用途的有毒Ames和^Z/咖株系至用于接种的良性J^ne林系(参见，例如，Easterday等人.，JClinMicrobiol.200543(4):1995-7)。抹系的差异在于确定它们的毒性和抗原及毒素的产生的不同基因的存在和活性。这些林系中的任一种株系或待鉴定或产生的株系可用于包含本发明的NE的免疫原性组合物。在一些实施方案中，免疫原可包含一种或多种来源于病原体(例如，炭疽芽胞杆菌)的抗原。例如，在一些实施方案中，免疫原是纯化、重组、合成或分离的蛋白质(例如，加入至NE中以产生免疫原性组合物)。类似地，免疫原性蛋白可以是来自病原体的蛋白质的衍生物、变体、类似物或修饰的形式。本发明不受限于用于产生本发明的免疫原性组合物的蛋白质(例如，来源于芽胞杆菌属的细菌)的类型。事实上，可使用多种免疫原性蛋白，包括但不限于保护性抗原(PA)、致死因子(LF)、水肿因子(EF)、PA降解产物(参见，例如，Farchaus，J.，等人.，Applied&EnvironmentalMicrobiol.，64(3):982-991(1998)),以及其类似物、衍生物和被修饰的形式。例如，本发明的芽胞杆菌的蛋白以它们的天然构象使用，或更优选，经修饰用于疫苗用途。这些修饰可以是与纯化的方法相关的技术原因所必需的，或它们可能用于在生物学上灭活芽胞杆菌的蛋白(的一种或几种功能特性例如，或者有毒性的)。因此本发明包括芽胞杆菌的蛋白的衍生物，所述衍生物可以是例如突变的蛋白质(例如，已经历使用熟知的用于定向诱变的技术或任何其他常规技术进行的一个或多个氨基酸的缺失、添加或置换的蛋白质)。可在纯化过程中通过化学方法修饰本发明的芽胞杆菌的蛋白质(例如，rPA)以使该蛋白质稳定和单体化。防止蛋白质的氧化聚集的一个方法是使用蛋白质的巯基的化学修饰。在第一步骤中，通过用还原剂例如DTT、p-巯基乙醇或谷胱甘肽处理来减少二疏桥。在第二步骤中，通过与烷化剂反应来封闭所得的巯基(例如，使用碘乙酰胺对蛋白质进行羧酰胺化(carboxyamidated)/脲基甲基化(carbamidomethylated))。可单独地或与另一个家族成员一起使用各芽胞杆菌家族成员用于产生本发明的包含NE和免疫原(例如，用于产生免疫反应)的组合物。包含NE和免疫原的组合物可包含炭疽芽胞杆菌的一种或多种林系。此外，包含NE和免疫原的组合物可包含一种或多种炭疽芽胞杆菌林系和，另外一种或多种非炭疽芽胞杆菌林系的免疫原(例如，病毒例如西尼罗病毒、禽流感病毒、埃博拉病毒、HSV、HPV、HCV、HIV等)或其免疫原性表位(例如，gpl20))。本发明不受限于所使用的HIV或从其产生的免疫原性蛋白的类型(例如，血清型、组或分化枝(clade))。例如，目前存在两种类型的HIV:HIV-1和HIV-2。两种类型通过性接触、通过血液以及从母亲至孩子传递，它们似乎引起临床上不可区分的AIDS。然而，似乎HIV-2较不容易被传递，初始感染和疾病之间的时间在HIV-2的情况下更长。世界上，占优势的病毒是HIV-l,当人们提及HIV而不明确指出病毒的类型，则他们是指HIV-1。相对不常见的HIV-2类型集中在西非且极少在其他地方见到它们。存在HIV分类的不同水平。将每一个类型分组，每一个组被分成亚型和流行重组模式(circulatingrecombinantform,CRF)。HIV-1的林系可分成三组"主要"群M、"局外(outlier)"群0和"新"群N。在群M内，已知存在HIV-1的至少9个遗传上不同的亚型(或分化枝)。这些亚型是亚型A、B、C、D、F、G、H、J和K。这些亚型中的任一个或有待鉴定或产生的血清型、群或分化枝可用于本发明的包含NE的免疫原性组合物。在一些实施方案中，免疫原可包含来源于病原体(例如，HIV)的一种或多种抗原。例如，在一些实施方案中，免疫原是纯化、重组、合成或分离的蛋白质(例如，加入至NE中以产生免疫原性组合物的蛋白质)。类似地，免疫原性蛋白可以是来自病原体的蛋白质的衍生物、变体、类似物或被修饰的形式。本发明不受限于用于产生本发明的免疫原性组合物的蛋白质(例如，来源于HIV的蛋白质)的类型。事实上，可使用多种免疫原性蛋白，包括但不限于gpl60、gpl20、gp41、Tat和Nef;以及其类似物、衍生物和被修饰的形式。例如，本发明的HIV蛋白以它们的天然构象使用，或更优选，经修饰以用于疫苗用途。这些修饰可以是与纯化的方法相关的技术原因所必需的，或它们可能用于在生物学上灭活HIV蛋白的一种或几种功能特性。因此本发明包括HIV蛋白质的衍生物，所述蛋白质衍生物可以是例如突变的蛋白质(例如，已经历使用熟知的用于定向诱变的技术或任何其他常规技术进行的一个或多个氨基酸的缺失、添加或置换的蛋白质)。例如，可突变HIV蛋白质以使其无生物学活性但同时保持其免疫原性表位(参见，例如，Clements,Virology235:48-64，1997)。此外，可在纯化过程中通过化学方法修饰本发明的HIV蛋白质以使蛋白质稳定和单体化。防止HIV蛋白的氧化聚集的一个方法是使用蛋白质的巯基的化学修饰。在第一步骤中，通过用还原剂例如DTT、e-巯基乙醇或谷胱甘肽处理来减少二硫桥。在第二步骤中，通过与烷化剂反应来封闭所得的巯基(例如，可使用碘乙酰胺对蛋白质进行羧酰胺化/脲基甲基化)。可单独地或与另一个家族成员一起使用各HIV的血清型、组或分化枝用于产生本发明的包含NE和免疫原(例如，用于产生免疫反应)的组合物。包含NE和免疫原的组合物可包含HIV的一种或多种血清型、组或分化枝。此外，包含NE和免疫原的组合物可包含HIV的一种或多种血清型、组或分化枝和，另外非HIV的一种或多种林系的免疫原(例如，病毒例如西尼罗病毒、禽流感病毒、埃博拉病毒、HSV、HPV、HCV、HIV等或其免疫原性表位)。本发明不受限于本发明的包含NE和免疫原的组合物的特定制剂。事实上，除了NE和免疫原外，本发明的包含NE和免疫原的组合物可包含一种或多种不同的试剂。这些试剂或辅助因子包括但不限于佐剂、表面活性剂、添加剂、緩冲剂、增溶剂、螯合剂、油、盐、治疗剂、药物、生物活性剂、抗菌剂和抗微生物剂(例如，抗生素、抗病毒剂等)。在一些实施方案中，本发明的包含NE和免疫原的组合物包含增强免疫原诱导免疫反应的能力的试剂和/或辅助因子(例如，佐剂)。在一些优选实施方案中，一种或多种辅助因子或试剂的存在减少了诱导免疫反应(例如，保护性免疫反应(例如，保护性免疫))所需要的免疫原的量。在一些实施方案中，一种或多种辅助因子或试剂的存在可用于使免疫反应偏向细胞(例如，T细胞介导的)或体液(例如，抗体介导的)免疫反应。本发明不限受限于用于本发明的治疗剂的辅助因子或试剂的类型。在佐剂通常描述于VaccineDesign-theSubunitandAdjuvantApproach,由Powel1和Newman编著；PlenumPress,NewYork,1995。本发明不受限于所使用的佐剂的类型(例如，用于包含NE和免疫原的组合物(例如，药物组合物)中)。例如，在一些实施方案中，合适的佐剂包括铝盐例如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝。在一些实施方案中，佐剂可以是钙、铁或锌的盐，或可以是酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生的多糖或聚磷腈的不溶性悬浮液。在一些实施方案中，优选本发明的包含NE和免疫原的组合物包含一种或多种诱导Thl型反应的佐剂。然而，在其他实施方案中，优选本发明的包含NE和免疫原的组合物包含一种或多种诱导Th2型反应的佐剂。通常，通过抗原与免疫系统的细胞的相互作用产生对抗原的免疫反应。免疫反应广泛地可以分为两类体液和细胞介导的免疫反应(例如，常规地分别表征为保护的抗体和细胞效应机制)。这些反应的种类称为Thl型反应(细胞介导的反应)和Th2型免疫反应(体液反应)。免疫反应的刺激可由免疫系统的细胞或组分对干涉(例如，对免疫原的暴露)的直接或间接反应引起。可以通过许多方法测量免疫反应，所述方法包括免疫系统的细胞(例如，B细胞、T细胞、树突细胞、APC、巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞等)的活化、增殖或分化；标签和细胞因子的上调或下调表达；IgA、IgM、或IgG滴度的刺激；脾大(包括增加的脾细胞结构)；各种器官中的超常增生、混合的细胞浸润。根据在本领域已知的免疫刺激进行估量的免疫系统的其他反应、细胞和组分。尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，但在一些实施方案中，本发明的组合物和方法诱导细胞因子的表达和分泌(例如，由巨噬细胞，树突细胞和CD4+T细胞表达和分泌)。可局部和全身性地发生特定细胞因子的表达的调控。已知细胞因子镨可确定疫反应中T细胞的调控和效应器功能。在一些实施方案中，可诱导Thl型细胞因子，从而本发明的免疫刺激组合物可促进Thl型抗原特异性免疫反应(包括细胞毒性T细胞)。然而在其他实施方案中，可诱导Th2型细胞因子，从而促进Th2型抗原特异性免疫反应。细胞因子在指导T细胞反应中起作用。辅助(CD4+)T细胞通过产生作用于其他免疫系统细胞(包括B细胞和其他T细胞)的可溶性因子来协调哺乳动物的免疫反应。大多数成熟CD4+T辅助细胞表达两个细胞因子谱Thl或Th2中的一个。Thl型CD4+T细胞分泌IL-2、IL-3、IFN-y、GM-CSF和高水平的TNF-oc。Th2细胞表达IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、GM-CSF和低水平的TNF-oc。Thl型细胞因子促进细胞介导的免疫和特征在于免疫球蛋白类转换至IgG2a(小鼠中)和IgGl(人中)的体液免疫。Thl反应还可与延迟型过敏和自身免疫性疾病相关。Th2型细胞因子诱导初级体液免疫并诱导类型转换至IgGl和IgE。与Thl反应相关的抗体同种型通常具有中和和调理能力，然而与Th2反应的抗体同种型更多地与过敏反应相关。已显示几种因子影响免疫反应偏转至Thl或Th2型反应。表征最佳的调控剂是细胞因子。IL-12和IFN-Y是阳性Thl和阴性Th2调控剂。IL-12促进IFN-Y的产生，IFN-Y为IL-12提供阳性反馈。IL-4和IL-10对于Th2细胞因子镨的建立和Thl细胞因子的产量的下调似乎重要。因此，在一些优选实施方案中，本发明提供了在受试者中刺激Thl型免疫反应的方法，其包括对受试者施用包含NE和免疫原的组合物。然而，在其他优选实施方案中，本发明提供了在受试者中刺激Th2型免疫反应的方法，其包括对受试者施用包含NE和免疫原的组合物。在其他优选实施方案中，可使用(例如，可与本发明的组合物共施用)佐剂以使免疫反应偏向Thl或Th2型免疫反应.例如，诱导Th2或弱化Thl反应的佐剂包括但不限于，明矾、急苷和SB-As4。诱导Thl反应的佐剂包括但不限于MPL、MDP、ISCOMS、IL-12、IFN-y和SB-AS2。几种其他类型的Thl型免疫原可用于(例如，作为佐剂)本发明的组合物和方法。这些免疫原包括但不限于下列免疫原。在一些实施方案中，使用单磷酰脂质A(例如，特别地3-去-0-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL))。3D-MPL由RibiImmunochem，Montana生产的熟知的佐剂。在化学上，其通常以3-去-O-酰化单磷酰脂质A与4、5或6酰化链的混合物提供。在一些实施方案中，使用二磷酰基脂质A和其3-0-脱酰变体。可通过GB2122204B(通过以其全文引用合并入本文)中描述的方法纯化和制备这些免疫原中的每一个免疫原。已描述了其他纯化和合成的脂多糖类(参见，例如，美国专利6，005，099和EP0729473;Hilgers等人，，1986，Int.Arch.Allergy.Immunol.，79(4):392-6;Hilgers等人.，1987，Immunology,60(1):141-6;和EP0549074,其各自通过以其全文引用合并入本文)。在一些实施方案中，以颗粒制剂的形式(例如，具有直径小于0.2jim的小颗粒大小，描述于EP0689454，通过以其全文引用合并入本文)使用3D-MPL。在一些实施方案中，皂苷在本发明的组合物中用作免疫原(例如，Thl型佐剂)。皂苷是熟知的佐剂(参见，例如，Lacaille-Dubois和Wagner(1996)Phytomedicine第2巻pp363-386)。皂苷的实例包括QuilA(来源于南美的树智利皂荚树(QuillajaSaponariaMolina)的树皮)和其级分(参见，例如，美国专利5，057，540;Kensil，CritRevTherDrugCarrierSyst，1996，12(1-2):1-55;和EP0362279，其各自通过以其全文引用合并入本文)。还用于本发明的是溶血皂苷QS7、QS17和QS21(QuilA的HPLC纯化的级分；参见，例如，Kensil等人.(1991).J.Immunology146,431-437，美国专利5，057，540;W096/33739;W096/11711和EP0362279，其各自通过以其全文引用合并入本文)。还可使用的是QS21与聚山梨酯或环糊精的混合物(参见，例如，W099/10008，通过以其全文引用合并入本文)。在一些实施方案中，包含未甲基化的CpG二核苷酸("CpG")的免疫原性寡核苷酸在本发明中用作佐剂。CpG是存在于DM中的胞嘧啶-鸟嘌呤核二核苷酸基序的缩写。在本领域内已知，CpG当通过全身性和粘膜途径施用时为佐剂(参见，例如，W096/02555、EP468520，Davis等人.，J.Immunol,1998，160(2):870-876;McCluskie和Davis,J.Immunol.，1998，161(9):4463-6;和美国专利申请20050238660，其各自通过以其全文引用合并入本文)。例如，在一些实施方案中，免疫刺激序列嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶；其中CG基序列未被甲基化。尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，在一些实施方案中，一个或多个CpG寡核苷酸的存在激活多种免疫亚群，包括天然杀伤细胞(其产生IFN-y)和巨噬细胞。在一些实施方案中，将CpG寡核苷酸配制入本发明的组合物以诱导免疫反应。在一些实施方案中，将CpG的自由溶液(freesolution)与抗原(例如，存在于NE溶液内的抗原(参见，例如，WO96/02555;通过引用合并入本文))一起共施用。在一些实施方案中，将CpG寡核苷酸共价缀合至抗原(参见，例如，WO98/16247,通过引用合并入本文)，或用载体例如氢氧化铝进行配制(参见，例如，Brazolot-Millan等人，Proc.Natl.AcadSci.，USA，1998，95(26)，15553-8)。在一些实施方案中，将佐剂例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂，细胞因子(例如，白细胞介素(例如，IL-2、IFN-y、IL-4等)、巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子等)、细菌ADP核糖基化毒素(例如a乱毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或大肠杆菌不耐热毒素(LT))的脱毒突变体，特别地LT-K63(其中在位点63上赖氨酸置换野生型氨基酸)、LT-R72(其中在位点72上精氨酸置换野生型氨基酸)、CT-S109(其中在位点109上丝氨酸置换野生型氨基酸)和PT-K9/G129(其中在位点9上赖氨酸置换野生型氨基酸且在位点129上甘氨酸置换野生型氨基酸)(参见，例如，WO93/13202和W092/19265，其各自通过引用合并入本文)和其他免疫原性物质(例如，增加本发明的组合物的功效的物质)与本发明的包含NE和免疫原的组合物一起使用。用于本发明的佐剂的另外的实例包括聚(二(羧负离子基苯甲基)磷腈(PCPP聚合物；VirusResearchInstitute,USA);脂质多糖的矛汙生物命'J:i(口单碌醜月旨质A(MPL;RibiImmunoChemResearch,Inc.,Hamilton,Mont.)、胞壁酰二肽(MDP;Ribi)和苏氨酰-胞壁酰二肽(t-MDP;Ribi);OM-174(与脂质A相关的葡糖胺二糖;OMPharmaSA，Meyrin，Switzerland);和利什曼原虫延伸因子(纯化的利什曼原虫蛋白；CorixaCorporation,Seattle,Wash.)。可向包含NE和免疫原的组合物中加入佐剂，或可在与包含NE和免疫原的组合物混合或共施用之前，使用载体例如脂质体或金属盐(例如，铝盐(例如，氢氧化铝))配制佐剂。在一些实施方案中，包含NE和免疫原的组合物包含单种佐剂。在其他实施方案中，包含NE和免疫原的组合物包含两种或更多种佐剂(参见，例如，WO94/00153、W095/17210、W096/33739、W098/56414、WO99/12565、WO99/11241和WO94/00153，其各自通过以其全文引用合并入本文)。在一些实施方案中，本发明的包含NE和免疫原的组合物包含一种或多种粘膜粘着剂(参见，例如，美国专利申请20050281843，通过以其全文引用合并入本文)。本发明不受限于所使用的粘膜粘着剂的类型。事实上，包括许多种粘膜粘着剂用于本发明，其包括但不限于聚(丙烯酸)的交联衍生物(例如，聚羧乙烯和聚卡波非(polycarbophil))、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖(例如，藻酸盐和壳聚糖)、羟丙基甲基纤维素、凝集素、菌毛蛋白(fimbrialprotein)和羧甲基纤维素。尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，在一些实施方案中，归因于与在不使用粘膜粘着剂的情况下对免疫原的暴露的持续时间和/或量相比，当使用粘膜粘着剂时受试者经历的对免疫原的暴露的持续时间和/或量的增加，粘膜粘着剂的使用(例如，用于包含NE和免疫原的组合物中)在受试者中增强免疫反应的诱导(例如，施用本发明的组合物)。在一些实施方案中，本发明的组合物可包含无菌水性制备物。可接受的媒介物和溶剂包括但不限于水、林格氏溶液、磷酸緩冲盐溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌、不挥发性油常规用作溶剂或悬浮介质。对于该目的，可使用任何温和的不挥发性矿物油或非矿物油包括合成的单-ordi-甘油酯。此外，脂肪酸例如油酸用于可注射的制备物。适合于粘膜、皮下、肌内、腹膜内、静脉内或通过其他途径施用的栽体制剂可见于Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCompany,Easton，Pa。可治疗性(例如，以增强免疫反应)或预防性(例如，用于免疫(例物。可通过许多不同的递送途径和方法对受试者施用本发明的包含NE和免疫原的组合物。例如，可通过多种方法对受试者(例如，通过粘膜(例如，鼻粘膜、阴道粘膜等))施用本发明的组合物，所述方法包括但不限于悬浮于溶液中，然后用于表面悬浮于溶液中，然后使用喷雾敷料器喷雾在表面上；与粘膜粘着剂混合，然后用于(例如，喷雾或擦拭)在表面(例如，粘膜表面)；置于或浸渍在鼻和/或阴道敷料器上，然后使用；通过受控释放机制使用；以脂质体的形式使用；或用于聚合物上。在一些优选实施方案中，粘膜施用(例如，使用标准技术；参见，例如，Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,MackPublishingCompany,Easton，Pa.，第19版，1995(例如,关于粘膜递送技术，包括鼻内、经肺、阴道和直肠技术)，以及欧洲申请517，565和Ilium等人.，J.ControlledRel.，1994，29:133-141(例如，关于鼻内施用的技术)，其各自通过以其全文引用合并入本文)本发明的组合物。备选地，可使用标准技术(参见，例如，Remington:TheSciencearidPracticeofPharmacy,MackPublishingCompany,Easton，Pa.，第19版，1995)通过皮肤或透皮施用本发明的组合物。本发明不受限于施用的途径。尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，在一些实施方案中，粘膜接种是优选施用途径，因为已显示抗原的粘膜施用具有更大的在粘膜表面(许多病原体的进入的路径)诱导保护性免疫反应(例如，粘膜免疫)的功效。此外，粘膜接种，例如鼻内接种，不仅在鼻粘膜中诱导粘膜免疫，而且还可在远处的粘膜位置例如生殖器粘膜诱导粘膜免疫(参见，例如，Mestecky，JournalofClinicalImmunology,7:265-276，1987)。更有利地，在其他优选实施方案中，除了诱导粘膜免疫反应外，粘膜接种还诱导全身性免疫。在一些实施方案中，非胃肠外施用(例如，疫苗的粘膜施用)提供了有效的和常规的增强全身性免疫(例如，通过胃肠外或粘膜接种诱导(例如，在其中使用多次加强以维持强烈的全身性免疫的情况下)的)的方法。在一些实施方案中，通过粘膜途径(例如，口服/饮食或经鼻途保护或治疗对疾病易感的，或遭受疾病的受试者。备选的粘膜途径包括阴道内和直肠内途径。在本发明的优选实施方案中，使用施用的经鼻途径，本文称为"鼻内施用"或"鼻内接种"。鼻内接种的方法在本领域内是熟知的，包括将疫苗的小滴或喷雾形式施用入待免疫的受试者的鼻咽。在一些实施方案中，提供包含NE和免疫原的喷雾或雾化的组合物。用于口服施用的肠制剂例如肠溶胶嚢剂、用于直肠或阴道施用的栓剂也形成了本发明的部分。还可通过经口途径施用本发明的组合物。在这些情况下，包含NE和免疫原的组合物可包含药学上可接受的赋形剂和/或包括碱緩沖剂、或肠溶胶嚢。用于鼻递送的制剂可包括使用葡聚糖或环糊精和皂苷作为佐剂的制剂，还可通过阴道途径施用本发明的组合物。在该情况下，包含NE和免疫原的组合物可包含药学上可接受的赋形剂和/或乳化剂、聚合物(例如，CARBOPOL)和其他已知的阴道霜剂和栓剂的稳定剂。在一些实施方案中，通过直肠途径施用本发明的组合物。在该情况下，包含NE和/或蜡和聚合物。在一些实施方案中，选择相同的施用途径(例如，粘膜施用)以进行初次接种和加强接种。在一些实施方案中，为了刺激免疫反应(例如，使用本发明的包含NE和免疫原的组合物)，(例如，同时或备选地，相继)使用多种施用的途径。例如，在一些实施方案中，在初次或加强接种方案中，对受试者的粘膜表面施用包含NE和免疫原的组合物。备选地，在一些实施方案中，在初次或加强接种方案中，全身性施用包含NE和免疫原的组合物。在一些实施方案中，在初次接种方案中通过粘膜施用和在加强方案中通过全身性施用，对受试者施用包含NE和免疫原的组合物。在一些实施方案中，在初次接种方案中通过全身性施用和在加强方案中通过粘膜施用，对受试者施用包含NE和免疫原的组合物。施用的全身性途径的实例包括包括但不限于胃肠外、肌内、皮内、经皮肤、皮下、腹膜内或静脉内施用。可将包含NE和免疫原的组合物用于预防性和治疗性目的。在一些实施方案中，通过肺递送(pulmonarydelivery)施用本发明的组合物。例如，可通过吸入(例如，从而穿过肺上皮层进入血流(参见，例如，Adjei，等人.PharmaceuticalResearch1990;7:565-569;Adjei，等人Int.J.Pharmaceutics1990;63:135-144;Braquet,等人J.CardiovascularPharmacology1989143-146;Hubbard,等人.(1989)AnnalsofInternalMedicine,第3巻，pp.206-212;Smith,等人.J.Clin.Invest.1989;84:1145-1146;Oswein，等人."AerosolizationofProteins",1990;ProceedingsofSymposiumonRespiratoryDrugDeliveryIIKeystone,Colorado;Debs，等人.J.Immunol.1988;140:3482-3488;和属于Platz，等人的美国专利5,284,656,其各自通过以其全文引用合并入本文))将本发明的组合物递送至受试者(例如，人)的肺。用于药物的肺递送以产生全身性效应的的方法和组合物描述于属于Wong，等人的美国专利5,451,569,通过引用全并入本文；也参见属于Licalsi等人的美国专利6，651,655,通过以其全文引用合并入本文))。用于实施本发明的还包括许多设计用于药物试剂的肺和/或鼻粘膜递送的机械装置，包括但不限于喷雾器、压力定量气雾剂和千粉吸入器，其全都对于本领域技术人员来说是熟悉的。适合用于实施本发明的商购可获得的装置的一些特定实例是Ultravent喷雾器(MallinckrodtInc.,St.Louis,Mo.);AcornII喷雾器(MarquestMedicalProducts,Englewood,Colo.);Ventolin压力定量气雾剂(GlaxoInc.,ResearchTrianglePark,N.C.)和Spinhaler干粉吸入器(FisonsCorp.,Bedford,Mass.)。所有此类装置需要使用适合用于分散治疗剂的制剂。通常，各制剂对于所使用的装置是特异性的且除了常用的释放剂、佐剂、表面活性剂、栽体和/或用于治疗的其他试剂，还可包括合适的喷射剂材料的使用。此外，包括脂质体、微囊或小球(microsphere)、包合复合物(inclusioncomplexe)或其他类型的载体的使用。因此，在一些实施方案中，通过粘膜、肌内、腹膜内、皮内、经皮肤、经肺、静脉内、皮下或本文描述的其他施用途径施用包含NE和免疫原的组合物来将本发明的包含NE和免疫原的组合物可用于保护和/或治疗对疾病易感或遭受疾病的受试者。疫苗制备物的全身性施用的方法可包括常规注射器和针头或经设计用于固体疫苗的轰击递送的装置(参见，例如，WO99/27961，通过引用合并入本文)或无针压力液体注射装置(needlelesspressureliquidjetdevice)(参见，例如，美国专利4,596,556;美国专利5,993,412，其各自通过引用包含入本文)或透皮贴片(参见，例如，WO97/48440;WO98/28037，其各自通过引用合并入本文)。本发明还可用于增强用于皮肤(经皮或经皮下，参见，例如，WO98/20734;WO98/28037,其各自通过引用合并入本文)的抗原的免疫原性。因此，在一些实施方案中，本发明提供了用于全身性施用、预先装有本发明的疫苗组合物的递送装置。本发明不受限于施用了(例如，为了刺激免疫反应(例如，为了产生保护性免疫(例如，粘膜和/或全身性免疫)))本发明的组合物的受试者的类型。事实上，许多种受试者受益于本发明的组合物的施用。在优选实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，是已经或可能会暴露于微生物的任何年龄(例如，成人、儿童、嬰儿等)的人试者。在一些实施方案中，人受试者是更可能接受对病原性微生物的直接暴露或更可能在暴露病原体后显示疾病的体征和症状的受试者(例如，免疫抑制的受试者)。在一些实施方案中，对普通人群施用(例如，用接种)本发明的组合物(例如，以预防疾病的发生或扩散)。例如，在一些实施方案中，为了他们自身的健康(例如，以预防或治疗疾病)，将本发明的组合物和方法用于接种人群(例如，区域、城市、州和/或国家的人群)。在一些实施方案中，受试者是非人哺乳动物(例如，猪、牛、山羊、马、绵羊或其他牲畜；或小鼠、大鼠、兔子或其他动物)。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法用于研究背景(例如，用于研究动物)。配制本发明的组合物用于通过任何途径例如粘膜、口服、局部、胃肠外或本文描迷的其他途径施用。组合物可以是以任何一种或多种不同形式，所述形式包括但不限于片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、泡沫剂、乳骨或液体制剂。可以以例如软骨剂、霜剂或洗剂、泡沫剂和烟雾剂的形式提供本发明的局部制剂，其中包含合适的常规添加剂例如防腐、溶剂(例如，以帮助穿透)和软化剂。局部制剂还可包括增强活性组分通过皮肤的穿透的试剂。示例性试剂包括N-(羟乙基)吡咯烷酮和破坏细胞被膜的化合物的二元组合、与亚砜或氧化磷组合的糖酯以及蔗糖单油酸酯、癸基曱基亚砜和醇。增加皮肤穿透的其他示例性材料包括表面活性剂或湿润剂，包括但不限于聚氧乙烯基山梨糖醇单油酸酯(聚山梨醇酯80)、山梨糖醇单油酸酯(Span80)、对-异辛基聚乙烯基-酚聚合物(TritonWR-1330)、聚乙烯基山梨糖醇三油酸酯(Tween85)、二辛基磺琥辛酯钠(sodiumsulfosuccinate)、和肌氨酸钠(SarcosylNL-97)和其他药学上可接受的表面活性剂。在本发明的某些实施方案中，组合物还还包含一种或多种醇、含锌化合物、软化剂、湿润剂、增稠和/或胶凝剂、中和剂和表面活性剂。制剂中使用的水优选是具有中性pH的去离子水。局部制剂中的其他添加剂包括但不限于硅油(siliconefluids)、染料、芳香剂(fragrance)、pH调节剂和维生素。局部制剂还可包含某些相容性常规载体，例如霜剂或软骨基质以及用于洗剂的乙醇或油醇。此类栽体可以占制剂的大约1%至大约98%。软骨基质可包含一种或多种凡士林、矿物油、地蜡、羊毛脂醇、泛醇、甘油、甜没药醇(bisabolol)、可可脂等。在一些实施方案中，以泡沫的形式配制和使用本发明的药物组合物。药物泡沫包括但不限于以下制剂，例如乳剂、微乳剂、霜剂、凝胶剂和脂质体。尽管本质上基本相似，但这些制剂在终产物的组分和稠度上变化。本发明的组合物可另外包含常规见于药物组合物中的其他佐剂组分。因此，例如，组合物可包含其他的、相容性的、药物活性材料例如，止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或可包含其他的用于物理配制不同剂型的本发明的组合物的材料，例如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当加入时，此类物质优选不过度干扰本发明的组合物的组分的生物学活性。可对制剂灭菌，如果想要，可将其与不与制剂NE和免疫原不利地相互作用的辅助试剂(auxiliaryagent)(例如，润滑剂、防腐剂、秀t定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、緩沖剂、着色剂、调味剂和/'或芳香物质等)混合。在一些实施方案中，以药学上可接受的盐的形式施用本发明的免疫刺激组合物。当使用时，盐应当是药学上可接受的，但非药学上可接受的盐可方便地用于制备其药学上可接受的盐。此类盐包括但不限于从下列酸制备的盐盐酸、氢溴酸、磺酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。此外，可将此类盐配制为碱金属盐或碱土金属盐，例如羧酸基团的钠、钾或钙盐。合适的緩冲剂包括但不限于乙酸和盐(1-2%w/v);柠檬酸和盐(l-3°/。w/v);硼酸和盐(O.5-2.5%w/v);以及磷酸和盐(0.8-2%w/v).合适的防腐剂可包括氯化苯甲烃铵(O.003-0.03%w/v);三氯叔丁醇(0.3-0.9%w/v);对羟苯曱酸酯(0.01-0.25°/。w/v)和硫柳汞(0.004-0.02%w/v)。在一些实施方案中，将包含NE和免疫原的组合物与一种或多种抗生素共施用。例如，可在施用包含NE和免疫原的组合物之前和/或之后施用将一种或多种抗生素。本发明不受限于共施用的抗生素的类型。事实上，可共施用多种抗生素，包括但不限于P-内酰胺类抗生素、青霉素(例如天然青霉素、氨基青霉素、耐青霉素酶青霉素、羧基青霉素类、脲基青霉素)、头孢菌素(第一代、第二代和第三代头孢菌素)和其他0-内酰胺(例如亚胺培南、单胺茵素)、e-内酰胺酶抑制剂，万古霉素、氨基糖苷类和壮观霉素、四环素类、氯霉素、红霉素、林可霉素、克林霉素、利福平、甲硝唑、多粘菌素、强力審素(doxycycline)、会诺酮类(例如，环丙沙星)、磺胺类药物、甲氧节氨嘧啶和喹啉。目前可获得大量的用于治疗细菌、真菌和病毒感染的抗微生物剂。对于关于此类药物的一般分类和它们的作用机制的全面协定，请本领域技术人员参照Goodman&Gilman's"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics"Hardman等人编辑，第9版，Pub.McGrawHill,第43至50章，1996，(通过以其全文引用合并入本文)。一般而言，这些试剂包括抑制细胞壁合成的试剂(例如，青霉素类、头孢菌素类、环丝氨酸、万古霉素、杆菌肽)；和咪唑抗真菌剂(例如，咪康唑、酮康唑和克霉唑)；直接作用于破坏微生物的细胞壁的试剂(例如，去塘剂例如多粘菌素(polmyxin)和粘菌素E(colistimethate)和抗真菌制霉素和两性霉素B);影响核糖体亚基从而抑制蛋白质合成的试剂(例如，氯霉素、四环素类、红霉素和克林霉素)；改变蛋白质合成并导致细胞死亡的试剂(例如，氨基糖苷类)；影响核酸代谢的试剂(例如，利福霉素类和喹诺酮类)；抗代谢剂(例如，甲氧苄氨嘧啶和磺胺类药物)；和用于抑制DM合成所必需的病毒的酶的核酸类似物，例如齐多夫定(zidovudine)、gangcyclovir、阿糖腺苷和阿昔洛维。可使用抗微生物剂的不同组合。本发明还包括参与包含NE和免疫原的组合物与一种或多种其他的活性和/或免疫刺激剂(例如，包含NE和不同免疫原、抗生素、抗氧化剂等的组合物)的共施用的方法。事实上，本发明的另一个方面是提供用于通过共施用本发明的组合物增强现有技术免疫刺激方法(例如.免疫方法)和/或药物组合物的方法。在共施用方法中，可同时或相继地施用试剂。在一个实施方案中，在其他活性剂之前施用本文描述的组合物。药物制剂和施用的模式可以是本文描述的药物制剂和施用的模式的任一种。此外，可使用不同的模式(例如，途径)或不同制剂各自施用两种或更多种共施用的试剂。待共施用的其他试剂(例如，抗生素、佐剂等)可以是本领域内熟知的任何试剂，包括但不限于目前临床上使用的试剂。在一些实施方案中，通过多种途径对受试者施用包含NE和免疫原的组合物。例如，受益于具有针对病原性微生物的保护性免疫反应(例如，免疫)的受试者可受益于接受粘膜施用(例如，鼻内施用或本文描述的其他粘膜途径)和，另外地接受一种或多种其他施用途径(例如，胃肠外或肺部施用(例如，通过喷雾器、吸入器或本文描述的其他方法))。在一些实施优选实施方案中，通过粘膜途径的施用足以诱导针对免疫原或免疫原所来源的生物的粘膜和全身性免疫。在其他实施方案中，通过多种途径的施用用于提供粘膜和全身性免疫。因此，尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，但在一些实施方案中，通过多种施用途径(例如，免疫(例如，本发明的包含NE和免疫原的组合物的粘膜、气道或胃肠外施用))施用了本发明的组合物的受试者可具有比只通过一种途径施用了组合物的受试者更强的对免疫原的免疫反应。其他递送系统可包括延时释放(time-release)、緩释或持续释放递送系统。此类系统可避免组合物的重复施用，增加受试者和医生的方便性。许多类型的释放递送系统是可获得的且对于本领域技术人员来说是已知的。它们包括基于聚合物的系统，例如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯(copolyoxalate)、聚已酸内酯、聚酯酰胺(polyesteramide)、多正酯类、聚羟基丁酸和聚酐。包含药物的上述聚合物的微胶嚢描述于例如美国专利5,075,109，通过引用合并入本文。递送系统还包括非聚合物系统，所述系统是包含固醇类例如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪(例如甘油单酯、二酯和三酯)的脂质；水凝胶释放系统；珪橡胶系统(sylasticsystem);基于肽的系统；蜡包衣；使用常规粘合剂和赋形剂的压制片剂；部分融合的埋植体等。特定的实施方案包括但不限于(a)其中以在基质内的形式包含本发明的试剂4曼蚀系统(erosionalsystem)，例如美国专利4，452，775、4，675，189和5，736，152(其各自通过引用合并入本文)中描述的系统和(b)其中活性组分以受控制的速度从聚合物中渗透的扩散系统(diffusionalsystem)，例如美国专利3，854，480、5，133，974和5,407,686(其各自通过引用合并入本文)中描述的系统。此外，可使用基于泵的硬件递送系统，其中一些适合植入。在优选实施方案中，本发明的包含NE和免疫原的组合物包含合适量的免疫原，从而当受试者施用时在受试者中诱导免疫反应。在优选实施方案中，免疫反应足以为受试者提供抗随后暴露于免疫原或免疫原所来源的微生物(例如，细菌或病毒)的保护(例如，免疫保护)。本发明不受限于所使用的免疫原的量。在一些实施优选实施方案中，选择包含NE和免疫原的组合物中免疫原(例如，被NE中和的病毒或细菌，或重组蛋白)的量(例如，用作免疫剂的量)作为诱导免疫保护性反应而无显著的有害副作用的量。所述量根据所使用的特定免疫原或其组合而变化，根据许多因素包括但不限于受试者的物种、年龄和总体状况(例如，健康)以及施用模式而在受试者之间变化。用于确定对受试者施用以在受试者中引发免疫反应(例如，保护性免疫反应(例如，保护性免疫))的免疫原的合适量的方法对于本领域技术人来说是熟知的。在一些实施方案中，预期每一个剂量(例如，包含NE和免疫原的组合物(例如，对受试者施用以诱导免疫反应(例如，保护性免疫反应(例如，保护性免疫))的量)包含O.05-5000jig的各免疫原(例如，重组和/或纯化的蛋白质)，在一些实施方案中，每一个剂量包含1-50Qjig，在一些实施方案中，每一个剂量将包含350-750|ug，在一些实施方案中，每一个剂量将包含50-200jug，在一些实施方案中，每一个剂量将包含25-75mg的免疫原(例如，重组和/或纯化的蛋白)。在一些实施方案中，每一个剂量包含足以产生免疫反应的免疫原的量。不需要对剂量中免疫原的有效量定量，只要当对受试者施用时免疫原的量在受试者中产生免疫反应。可由本领域技术人员通过使用涉及受试者中抗体滴度和其他反应的观察的标准研究来确定用于特定施用(例如,以诱导免疫反应(例如，保护性免疫反应(例如，保护性免疫)))的最佳量。在一些实施方案中，预期每一个剂量(例如，包含NE和免疫原的组合物(例如，对受试者施用以诱导免疫反应)的量)是按免疫原(例如，被中和的细菌或病毒，或重组和/或纯化的蛋白)的重量计算0.001至15°/。或更多(例如，0.001-10%、0.5-5%、1-3%、2%、6%、10%、15%或更多)。在一些实施方案中，初始或初次施用剂量包含比随后的加强剂量更多的免疫原。在一些实施方案中，当使用本发明的NE灭活活的微生物(例如，病毒(例如，HIV))时，预期每一个剂量(例如，对受试者施用以诱导免疫反应))包含每剂10至109pfu的病毒；在一些实施方案中，每一个剂量包含每剂105至l()8pfu的病毒；在一些实施方案中，每一个剂量包含每剂103至1()5pfu的病毒；在一些实施方案中，每一个剂量包含每剂102至1()4pfu的病毒；在一些实施方案中，每一个剂量包含每剂10pfu的病毒；在一些实施方案中，每一个剂量包含每剂102pfu的病毒；和在一些实施方案中，每一个剂量包含每剂104pfu的病毒。在一些实施方案中，每一个剂量包含超过每剂109pfu的病毒。在一些实施优选实施方案中，每一个剂量包含每剂103pfu的病毒。在一些实施方案中，当使用本发明的NE的灭活活的微生物(例如，细菌(例如，芽胞杆菌属的细菌(炭疽芽胞杆菌)的群体)时，预期每一个剂量(例如，对受试者施用以诱导免疫反应))包含每剂10至10"个细菌；在一些实施方案中，每一个剂量包含每剂105至108个细菌；在一些实施方案中，每一个剂量包含每剂103至105个细菌；在一些实施方案中，每一个剂量包含每剂102至104个细菌；在一些实施方案中，每一个剂量包含每剂10个细菌；在一些实施方案中，每一个剂量包含每剂102个细菌；和在一些实施方案中，每一个剂量包含每剂l(T个细菌。在一些实施方案中，每一个剂量包含每剂超过10"个细菌。在一些实施方案中，每一个剂量包含每剂103个细菌。本发明不受限于用于灭活活的微生物(例如，病毒(例如，一种或多种类型的HIV))的NE的量。在一些实施方案中，使用0.1%-5%NE溶液，在一些实施方案中，使用5°/。-20%NE溶液，在一些实施方案中，使用20。/。NE溶液，和在一些实施方案中，为了灭活病原性微生物使用大于20。/。的NE溶液。在优选实施方案中，使用10%NE溶液。类似地，本发明不受限于活的微生物为了被灭活而在本发明的NE中温育的持续时间。在一些实施方案中，微生物在NE中温育1-3小时。在一些实施方案中，微生物在NE中温育3-6小时。在一些实施方案中，微生物在NE中温育超过6小时。在优选实施方案中，微生物在NE(例如，10%NE溶液)中温育3小时，在一些实施方案中，在37X:下进行温育。在一些实施方案中，在高于或低于37匸的温度下进行温育。本发明也不受限于用于灭活的微生物的量。微生物的量可取决于许多因素，包括但不限于想要的免疫原性组合物(例如，NE和免疫原)的总量、想要的溶液的浓度(例如，在稀释以用于施用之前)、微生物和NE。在一些实施优选实施方案中，用于灭活方法的微生物的量是这样的量，即该量产生想要的以单剂量(例如，从浓缩的原液稀释的)对受试者施用的免疫原(例如，本文描述的免疫原)的量。在一些实施方案中，以浓缩的剂量配制本发明的包含NE和免疫原的组合物，所述浓缩的组合物可在对受试者施用之前进行稀释。例如，可将浓缩的组合的稀释物对受试者施用，这样受试者接受任何一种或多种本文提供的特定剂量。在一些实施方案中，可制备浓缩的组合物的稀释物，以对受试者施用(例如，以单剂量)包含0.5-50%的存在于浓缩的组合物中的NE和免疫原的组合物。在一些实施优选实施方案中，以单剂量对受试者施用包含1%的存在于浓缩的组合物中的NE和免疫原的组合物。包括浓缩的组合物用于其中可对众多受试者施用本发明的组合物的场所(例如，免疫临床、医院、学校等)。在一些实施方案中，本发明的包含NE和免疫原的组合物(例如，浓缩的组合物)在室温下稳定超过l周，在一些实施方案中超过2周，在一些实施方案中超过3周，在一些实施方案中超过4周，在一些实施方案中超过5周和在一些实施方案中超过6周。一般而言，本发明的乳剂组合物将包含每ml液体组合物至少0.001%至100°/fl，优选0.01至90%的乳剂。预期制剂包含每ml液体组合物大约0.001%、大约0.0025%、大约0.005%、大约0.0075%、大约0.01%、大约0.025°/。、大约0.05%、大约0.075%、大约0.1%、大约0.25%、大约0.5%、大约1.0%、大约2.5%、大约5%、大约7.5°/。、大约10%、大约12.5%、大约15%、大约20°/。、大约25%、大约30°y4、大约35%、大约40%、大约50%、大约55%、大约60%、大约65%、大约70%、大约75°/。、大约80%、大约85°/。、大约90°/。、大约95%或大约100%的乳剂。应当理解，任何两个上述数字之间的范围明确地包括在本发明的边界和范围内。剂量取决于特定病原体和被免疫的受试者的状况，必然发生变化。在一些实施方案中，在初次施用本发明的组合物的(例如，初次接种)后，受试者可在第1次、第2次、第3次、第4次、第5次、第6次、第7次、第8次、第9次、第10次和/或超过10次施用后接受一次或多次加强施用(例如，大约2周、大约3周、大约4周、大约5周、大约6周、大约7周、大约8周、大约10周、大约3月、大约4月、大约6月、大约9月、大约1年、大约2年、大约3年、大约5年、大约10年)。尽管对机制的理解不是实施本发明所必需的且本发明不受限于任何特定的作用机制，但在一些实施方案中，加强剂量中免疫原的再引入使得能够在受试者中产生很强的全身性免疫。可以使用提供用于进行初次免疫反应的相同制剂进行加强，或可使用包含该免疫原的不同制剂进行加强。剂量给药方案还将，至少部分，由受试者的需要来确定和取决于执业者的判断。剂量单位可基于几个因素(包括但不限于受试者的体重、年龄和健康状况)按比例地加或减小。此外，可增加或减少剂量单位用于随后的施用(例如，加强施用)。包含本发明的免疫原的组合物用于其中引起感染和/或疾病的试剂(例如，寻找针对其引发的保护性免疫的试剂)的性质是已知的情况，以及用于其中引起感染和/或疾病的试剂的性质是未知的情况(例如，在紧急突发性疾病(例如，全国流行的比例(例如，流感或其他疾病的暴发))的情况下)。例如，本发明包括本发明的组合物在治疗或预防(例如，通过使用引起感染和/或疾病的HIV或HIV样试剂(其通过本发明的NE中和)的免疫)与仍待鉴定的引起紧急突发性感染和/或疾病的试剂(例如，从患者分离和/或培养的但无引起感染和/或疾病的试剂的遗传、生物化学或其他特征的试剂)相关的感染中的用途。本发明的组合物和方法将用于不同的场所，包括研究场所。例如，本发明的组合物和方法还用于免疫系统的研究(例如，适应性免疫反应(例如，保护性免疫反应(例如，粘膜或全身性免疫))的表征)。本发明提供的组合物和方法的用途包括人和非人受试者和来自所述受试者的样品，还包括使用这些受试者的研究应用。本发明的组合物和方法还用于研究和优化纳米乳剂、免疫原和其他组分以及用于筛选新的组分。因此，不希望本发明限定于任何特定的受试者和/或应用场所。可在许多开发用于研究粘膜递送和其他递送途径的动物模型中体内检测制剂。很明显，本发明的组合物用于预防和/或治疗由病毒、细菌、寄生虫和真菌引起的许多种疾病和感染，以及用于引发抗多种抗原的免疫反应。如上所述，不仅可以预防性或治疗性使用所述组合物，而且还可将所述组合物用于制备抗体(多克隆抗体和单克隆抗体)(例如，用于诊断目的)，以及用于目的抗原的免疫纯化。如果想要多克隆抗体，可用本发明的组合物免疫选择的哺乳动物(例如，小鼠、兔子、山羊、马等)。通常在2-6周后用一次或多次施用所述抗原来加强动物。然后可从免疫的动物获得多克隆抗血清，然后按照已知的方法使用所述多克隆抗血清(参见，例如，Jurgens等人，J.Chrom.1985，348:363-370)。在一些实施方案中，本发明提供了包括包含NE和免疫原的组合物的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒还提供了用于施用组合物的装置。本发明不受限于试剂盒中包括的装置的类型。在一些实施方案中，设计装置用于鼻部应用本发明的组合物(例如，鼻敷料器(例如，注射器)或鼻吸入器或鼻腔喷雾剂)。在一些实施方案中，试剂盒包括以浓缩形式(例如，可在对受试者施用前稀释的浓缩形式)存在的包含NE和免疫原的组合物。在一些实施方案中，所有试剂盒组分存在于单个容器(例如，小瓶或试管)中。在一些实施方案中，各试剂盒组分置于单个容器(例如，小瓶或试管)。在一些实施方案中，一个或多个试剂盒组分置于单个容器(例如，小瓶或试管)，同一个试剂盒的其他组分置于分开的容器(例如，小瓶或试管)。在一些实施方案中，试剂盒包含緩沖液。在一些实施方案中，试剂盒还包括使用说明书。实施例下列实施例用于说明本发明的某些优选实施方案和方面且不被解释为限定其范围。实施例1材料和方法纳米乳剂灭活的痘苗病毒动物。从CharlesRiver实验室购买无病原体、5至6周龄雌性Balb/c小鼠。按照美国实验动物照护评鉴协^(AmericanAssociationforAccreditationofLaboratoryAnimalCare)标准分另'J关养接种组，一个笼子5只动物。按照UniversityofMichigan的关于动物的使用和照护的大学委员会(UniversityCommitteeonUseandCareofAnimals,UCUCA)进行涉及小鼠的所有方法。病毒。在本发明的开发过程中使用两种示例性痘苗病毒(VV)，VVWR和VV昏luc。从美国美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得VVWR(NIHTC-适应性(NIHTC-adapted))。重组VVwR—ue通过p7.5早期/晚期启动子表达萤火虫荧光素酶，并且已被描述(参见，例如，Luker等人，Virology.2005，341(2):284-300)。VV—^在体外或体内未被减弱，因为该病毒是使用不需要缺失任何病毒基因的方法构建的(参见，例如，Blasco和Moss(1995).Gene158(2)，157-162;Luker等人，Virology.2005，341(2):284-300)。使用具有一些改进的、Lorenzo等人(参见，例如，Lorenzo等人，MethodsMolBiol.2004;269:15-30)的方法产生所有病毒的原液。在以O.5的复合感染感染的"维洛"细胞上繁殖病毒。在第48至72小时收获细胞，从培养上清液和细胞裂解物分离病毒。通过快速冻融细胞沉淀，然后在Dounce匀浆器中于ImMTrispH9.0中匀浆来获得细胞裂解物。通过以2000rpm离心除去细胞碎片。通过在以25，000xg离心1小时的4%至40。/。的蔗糖梯度上分层，从澄清的上清液获得纯化的病毒原液。收集包含病毒颗粒的浑浊条带，将其稀释于lmMTrispH9中，然后以25,000xg离心1小时来进行浓缩。将病毒沉淀重悬浮于lmMTrispH9中，然后在-80X:下作为病毒原液冷冻贮存。在维洛细胞上滴定VVWR原液(参见，例如，Myc等人，疫苗.21:3801-3814)。VVm具有与天然株系相同的表面蛋白，但在感染期间表达荧光素酶。这使得能够进行敏感的细胞毒性和发病率的估量和使用成像技术监测动物中的病毒感染。通过ELISAWestern印迹法或病毒中和测定法进行的VV做免疫的动物中的血清学反应的比较，显示对于VL或VV昏w滴度没有差异。纳米乳剂(NE)。从MNOBIOCorporation,AnnArbor,MI获得获得NE(W2。5EC)(参见属于NANOBIOCorporation(AnnArbor,MI)的美国专利6，015,832，通过以其全文引用合并入本文)。通过使用高速乳化剂在含有大豆油(64%)的水中乳化十六烷基氯化吡啶(1%)、Tween20(5%)和乙醇(8%)来制造纳米乳剂。所得的小滴具有直径为300+/-25nm的平均颗粒大小。使用被FAD认为是"公认为安全的"(GRAS)的表面活性剂和食物材料配制W2。5EC。W2。5EC可在药品生产和质量管理(GoodManufacturingPractice)(GMP)下进行经济地制造且在40C下稳定至少18个月。基于NE的疫苗的制备。在本发明的开发期间产生的痘苗病毒(VV)中和数据表明使用10%NE或0.1%福尔马林的1小时温育足以灭活病毒(例如，6logVV滴度的减少)。基于这些结果，产生几种用于诱导免疫反应(例如，疫苗制剂)的制剂(例如，组合物)以用于动物免疫。如下制备组合物(例如，用于刺激免疫反应)对于NE杀死的VV，为确保完全的病毒中和(例如，病毒灭活)，将包含每剂lx103pfu至5x105pfu的VV的样品在下在10%W2。5ECNE中温育3小时，然后稀释至1%NE以用于鼻内滴注(例如，每剂1x103至1x105pfu)。对于包含福尔马林杀死的病毒的疫苗制剂，在室温下在0.1%福尔马林中进行VV的福尔马林(Sigma)灭活3小时。将福尔马林杀死的病毒稀释在盐溶液或1%NE中至每剂103或105pfu，从而将福尔马林减少至对于鼻内免疫是无毒的浓度。对于各实验中的每一种制剂，通过感染维洛细胞，然后在3至4天的温育后进行培养物上清液的两次传代来在体外确认使用NE或福尔马林进行的病毒灭活。没有一个对照感染显示病毒斑(viralplaque)的存在。此外，如下所述在维洛细胞和接受处理的动物的肺中进行病毒DNA的PCR检测测定以确认活的复制的病毒的存在。免疫。在初次免疫之前从小鼠收集预免疫血清的样品。用异氟醚麻醉所有动物，然后使用移液器尖头(tip)进行接种(例如，使用每鼻孔10-15jLi1的疫苗制剂)。緩慢地施用乳剂以使材料的吞咽减少至最低程度。在接种后，就不利的反应观察动物。在初次(例如，初始)施用(例如，接种)后3周和当进行其他的施用时，在第二和第三次施用(例如，接种)以2至3周的间隔在血液样品中测量特异性抗VV抗体。通过在尾巴基部表面划破，在被麻醉的小鼠中进行通过划破的免疫。在进行该方法之前，用大剪刀除去毛发以暴露大约0.5-0.7平方厘米，用70%的乙醇对棵露的皮肤消毒。使用灭菌的分叉针头表面擦破表皮，使用于IOnlPBS中的1x105pfu剂量的活VVwR。固定动物至10分钟以确保病毒吸收入皮肤。生物发光成像。如其他地方所述(参见，例如，Luker等人，(2002).JVirol76(23)，12149-12161;CookandGriffin，(2003).JVirol77(9)，5333-5338)使用低温冷却的CCD照相机(IVIS)进行生物发光成像。通过感染的小鼠的头、胸和腹部的目的区(ROI)分析定量光子通量的数据。从所有测量中减去来自荧光素注射的未感染的小鼠的背景光子通量。血液、支气管肺泡灌洗液(BAL)和脾细胞的收集。在本发明的开发过程中进行的试验的过程中，在不同的时间点从隐静脉获得血液样品。通过心脏穿刺从无痛致死的、发病前的小鼠获得终样品。在血液于室温下凝固30-60分钟后，通过以1500xg离心5分钟从血液获得血清。血清样品贮存在-20*€直至使用。从通过异氟醚吸入麻醉的小鼠获得BAL液。在切开气管后，将附加至1ml注射器的22号导管(Angiocath，B-D)插入气管。用0.5ml包含10jiMDTT和0.5mg/ml抑肽酶的PBS灌注肺2次'用注射器回收大约1.0ml的吸出物(aspirate)。BAL样品贮存在-20匸下直至被分析。机械分离小鼠脾细胞以获得PBS中的单细胞悬浮物。通过用ACK緩冲液(150mMNH4C1、10mMKHC03、0.1mMNa2EDTA)裂解来除去红细胞(RBC)，将剩余的细胞在PBS中清洗2次。为了进行抗原特异性增殖或细胞因子表达测定，将脾细胞(2-4x106/ml)重悬浮于补充有5%FBS、200nML-谷氨酰胺和青霉素/链霉素(100U/ml和100ng/ml)的RPMI1640培养基中。病毒DNA的PCR检测。使用正向引物(SEQIDNO.1:5'-ATGACACGATTGCCAATAC30和反向引物(SEQIDNO.2:5'-CTAGACTTTGTTTTCTG30(参见，例如，Ropp等人，J.Clin.Microbiol，，1995:2069-2076)。这些引物是针对所有正痘病毒(例如，VV)的HA基因的保守区的，且通过集成DM技术(IntegratedDNATechnologies)(IDT,Coralville,IA)合成。使用Trireagent才艮据厂商的方案(MRC，Cincinnati,OH)，从维洛细胞或从肺组织匀浆中分离DNA。使用O.5iuM各引物、0.2mM的各dNTP、2.5mM的MgCl2和0.1U/pl的Taq腿聚合酶(ROCHEMolecularBiochemicals，Indianapolis,IN),用10jig的完整细胞或肺DM进行PCR扩增。通过在20|u1的总体积中，在94X:下温育1分钟，然后进行25个循环的在55X:下退火，在72X:下延伸和在94C下变性来进行PCR反应。在用于电泳的Tris硼酸緩冲液和用于DNA染色的溴化乙锭中的1%的琼脂糖凝胶上使用电泳进行PCR产物分析。使用来自BioRad(Hercules,CA)的photoimaging照相机和软件进行分析。将与肺DNA混合的纯化的VVDM(1ng)用作阳性对照。使用来自BIORAD(Hercules,CA)的photoimaging照相才几和软件进行凝胶分析。特异性抗病毒IgA和IgG的测定。通过ELISA测定小鼠抗牛痘抗体。用包含PBS中至少5x104pfu/孔的痘苗病毒的感染的维洛细胞的裂解物的稀释物包4皮微量滴定96孔平底NUNC-PolySorp聚苯乙烯板。将板在4"C下温育过夜，然后在-201C下用50%的乙醇/丙酮混合物(EtOH/丙酮)固定1小时。在除去固定液后，用包含O.001%Tween20的PBS清洗板2次，然后在37匸下用包含0.2°/。Tween20的PBS中的1%脱脂奶粉封闭1小时。在含有0."/。BSA的PBS中，系列稀释小鼠血清或BAL液，向孔中加入IOOpl等分，将板在37C下温育2小时。用PBS-O.05%Tween20清洗板3次，然后与抗小鼠IgG或抗小鼠IgA碱性磷酸酶(AP)缀合的抗体温育1小时，之后清洗3次。按照厂商的方案使用AP底物SIGMAFAST(SIGMA，St.Louis,M0)进行比色反应。使用SPECTRAMAX340ELISA读取器(MOLECULARDEVICES,Sunnyvale,CA)在405nm处和69Qnm的参照波长处进行分光光度计测量的读取。终点滴度和抗体浓度计算为导致吸光率大于两个标准差(高于对照孔中的吸光率)的血清稀释度。按照使用缀合AP的抗IgG抗体产生的标准曲线的线性部分的对数转换计算IgG抗体的浓度，然后乘以血清稀释因子。血清抗体的浓度表示为平均值+/-标记误(86111)。来自幼小鼠的血清用作非特异性吸附的对照。使用上述具有几个改进的ELISA，测量靶向至醇变性的对比福尔马林烷基化的病毒表位的抗VVIgG抗体的活性。用1x1()5pfu/孔的纯化的痘苗病毒包被96孔板，然后在41C下温育过夜。在除去病毒后，用50%EtOH/丙酮在-20C下或用PBS中的1°/。福尔马林溶液在4X3处理孔1小时。如上所述清洗和封闭板。将来自用不同的疫苗制剂(VV/NE、VV/Fk/NE、VV/Fk)免疫的小鼠的混合血清和来自经历用活痘苗病毒(VV活的)进行的亚致死(sub-lethal)感染而存活的小鼠的血清系列稀释在0.1%BSA中，将100pL等分加入至EtOH/丙酮和向福尔马林固定的孔中。如上所述就抗牛痘IgG的测定进行测定。比较EtOH/丙酮和福尔马林固定的病毒抗原之间的405nm处的光密度(OD)值。通过在相同的0D405nm值上，EtOH/丙酮对比福尔马林的IgG滴度的比率来估计抗牛痘抗体的活性的差异。中和抗体。使用标准标准菌斑减少测定法(PRA)(参见，例如，Newman等人，J.Chem.Microbiol.2003，3154-3157)和使用重组VVwBu。的荧光素活性的抑制来测定中和抗体。通过在使用10Ml包含200-300pfu的VV的无血清RPMI培养基的连续的二倍稀释物中，混合10jli1的热灭活的小鼠血清来进行PM。在37"C下温育血清6小时，然后将血清置于维洛细胞单层上覆盖的0.5ml无血清培养基中。1小时温育后，除去病毒/血清接种物，将新配制的培养基置于细胞单层上。在48至72小时后，固定细胞，用0.1%结晶紫(crystalviolet)对其进行染色。通过两个独立的观察者计数菌斑，使用非免疫血清作为对照计算中和滴度。关于VViu。中和滴度的评估，将10nl的连续二倍稀释物中的热灭活的小鼠血清与lOnil的包含2x103pfu的病毒的无血清RPMI培养基混合。与基于PRA的中和测定相同，将样品在3X:下温育6小时，重悬浮于100m1的无血清RPMI中，然后与维洛细胞一起在24孔板中温育1小时。在24-36小时后，裂解感染的细胞，通过上述荧光素酶测定法估量病毒依赖性荧光素酶的活性。使用PBS中的非免疫血清作为对照，从荧光素酶抑制曲线计算中和滴度(NTs。)。针于各样品，获得PRA和荧光素酶抑制活性之间的关系。脾细胞中牛痘特异性细胞因子表达。在初次接种后12周收获来自已接种的小鼠的脾。通过机械破坏脾获得脾细胞，将脾细胞以3xl06个细胞/ml悬浮于补充有5°/。FBS、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的RPMI1640中。将细胞与每孔1x103或1x104pfu的痘苗病毒一起在37x:温育72小时。收获细胞培养物上清液，就细胞因子的产生对其进行分析。将PHA-P(ljLig/孔)与细胞一起温育作为阳性对照。按照厂商的指导，4吏用QUANTIKINEMELISA试剂盒(R&DSYSTEMSInc，Minneapolis,MN)测定脾细胞上清液中的IFN-y的浓度。痘苗病毒的攻击。使用活的痘苗病毒攻击已免疫的小鼠以估计疫苗的功效。在牛痘攻击前2天收集血清样品，在攻击的当天对动物称重。解冻等分的纯化的重组VVwR或VV肌u。(使用前进行超声处理和滴定)，然后在攻击的当天将其稀释在盐溶液中。通过吸入异氟醚麻醉小鼠，然后使用20ji1相应于10xLDs。的2x106pfu的活VV^^的悬浮物或使用5倍稀释物中的范围在lxl(T至3.2x103之间变化的活VVwK剂量对其鼻内攻击。在攻击后每天测量重量和体温，进行3周。无痛致死显示减少30%初始体重的小鼠。致死剂量(LDJ和感染剂量(ID5。)的计算分别基于动物死亡率以及基于核心体温和体积减轻(参见，例如，Reed和Muench，AmJHyg1938;27:493-7)。如下计算抗致死攻击(IP")的保护指数IPLD=1ogi。最大剂量-1ogi。LDs。对照。相似地，如下计算抗感染(IPID)的保护指数IPID=1ogi。免疫的ID5。-1ogi。LDs。对照。统计分析。使用AN0VA和用于p值的确定的学生T检验对结果进行统计分析。实施例2使用纳米乳剂灭活的痘苗病毒的鼻免疫导致诱导特异性全身性IgG反应。为在体外估计NE的杀病毒活性，将一系列NE浓度与VVwr或VVwhuc混合，和在37C下温育1至3小时。菌斑减少(PRA)和荧光素酶生物发光测定的结果都显示了两种病毒的NE浓度依赖性灭活。10。/。NE在1小时的温育内可完全灭活超过106pfu的牛痘(参见图1A和B)。来自用VV(使用10%NE灭活的)感染的细胞的培养物上清液的随后传代显示没有存活的病毒。在鼻内施用灭活的VVwr后，通过使用从施用后小鼠肺分离的DNA的PCR扩增，在体内进一步证明了NE制剂中的病毒的完全灭活。在任何处理的小鼠(参见图1C)中没有检测到病毒DNA，然而对照PCR(搀入VVwrDNA的肺DNA)得到预期大小〉950bp的产物。此外，小鼠的体内生物发光成像也表明，与来自1x105或1x106pfu的活VVwHuc鼻感染的小鼠的强信号相比，在施用105pfu的NE灭活的VVm-u。后不存在病毒感染和没有病毒扩增的迹象(参见图1D)。因此，体外和体内128结果表明与10%NE温育至少60分钟导致VV完全灭活。因此，使用10%NE进行所有病毒灭活，进行3小时，然后稀释至1%NE以用于进行免疫。然后，设计实验以估计本发明的组合物(例如，NE杀死的VV)是否可产生与在通过划破用活的、复制的VV接种的人中看到的相似的保护性免疫(参见，例如，Hammarlund等人，Nat.Med.2003，9;1131-1137)。用6个包含105或103pfu剂量的用NE(分别为105/NE和107NE)杀死的VVWR、与1%NE(分别为107Fk/NE和107Fk/NE)混合的福尔马林杀死的病毒以及盐溶液(107Fk和107Fk)中的福尔马林杀死的病毒的制剂鼻内(i.n.)免疫小鼠。单独地用1%NE处理对照小鼠。在初始疫苗施用后3周表征抗体反应(参见图2)。在第5和第9周用随后的施用加强免疫(图2A)。在加强免疫后，在来自用107NE或107Fk/NE接种的小鼠的血清中检测到显著的抗VVIgG水平，平均抗VVIgG浓度分别为1.5pg/ml和lng/ml。在第二次加强后，所有组中抗VV抗体的浓度增加，在实验结束时(第16周)使用107NE和107NE的免疫，产生最高的反应，抗VVIgG的平均浓度分别为44pg/ml和70jag/ml，然后是使用105/Fk/NE(17jug/ml)的免疫。使用107Fk/NE，和107Fk或107Fk的疫苗制剂的免疫始终产生低水平的抗VV抗体，所述抗体在加强施用后不显著增加(参见图2A)。使用107NE的单剂量与三剂免疫方案的比较显示，在免疫后12周，单剂量疫苗产生显著的(大约4jug/ml)(虽然比三剂低)血清抗VVIgG的浓度。因此，在一些实施方案中，本发明提供了，单剂量VV/NE疫苗可能足以引发免疫反应(例如，粘膜或全身性免疫反应)，所述免疫反应可通过随后的免疫所增强(参见图2A插图)。在任何对照小鼠中未检测到特异性抗VV抗体。交叉反应性抗VV抗体的分析表明，来自用NE杀死的病毒免疫的小鼠的血清IgG与福尔马林交联的(烷基化的)病毒蛋白和与醇固定的(变性但未烷基化的)病毒蛋白发生反应。使用VV/NE疫苗的接种产生抗VVIgG，其具有比天然的、非烷基化的表位高25倍的反应性129(与来自暴露于活病毒的小鼠的血清相似)，这些抗体也有效地识别福尔马林固定的病毒蛋白。相反地，来自用福尔马林杀死的病毒(单独的或与NE混合的)接种的动物的血清不具有增加的与天然VV表位的反应性。实施例3施用了纳米乳剂杀死的痘苗病毒的受试者具有针对痘苗病毒的粘膜免疫通过支气管肺泡灌洗液(BAL)中的VV特异性分泌性IgA抗体测定粘膜免疫。在来自使用107NE或107NE免疫的动物的BAL中检测抗VVIgA。用包含福尔马林杀死的病毒的制剂(无论在盐溶液中稀释的还是在NE中稀释的)接种的动物不产生可测量的粘膜反应，尽管存在血清抗VVIgG(参见图2B)。因此，本发明提供了，包含NE杀死的VV的组合物在受试者中产生粘膜免疫(例如，如通过受试者的BAL中的VV特异性分泌性IgA抗体的存在所证明的)，然而不包含NE杀死的VV(例如，福尔马林杀死的VV)的组合物不能产生针对VV的粘膜免疫。实施例4来自施用了纳米乳剂杀死的痘苗病毒的受试者的血清和支气管肺胞灌洗液(BAL)具有病毒中和抗体在病毒中和测定中估量抗VV抗体反应的生物关联性。在一次接种后的一些小鼠的血清中检测中和活性(图3A)。然而，在使用107NE10VNE或107Fk/NE的两次免疫后，出现血清中和抗体中的一致的滴度。这些组中的每一个的平均50。/。中和滴度(NT5。)>20。相反地，用107Fk/NE、107Fk或105/Fk接种的动物，只在最低血清稀释度中观察到病毒中和。随后的免疫产生大于10倍的NTs。滴度的增加，但只存在于用NE杀死的病毒(107NE和107NE，分别为NTs。=180和NT5。=500)接种的小鼠中。使用包含福尔马林杀死的病毒的任何制剂的第三接种不显著增加VV的中和。也在来自用107NE或107NE接种的小鼠的BAL液中检测到显著的中和活性，所述中和活性在来自使用107Fk/NE或107Fk/NE免疫的小鼠的BAL中更低(参见图3插图)。中和活性在用盐溶液中稀释的福尔马林杀死的病毒免疫的小鼠和对照、未接种的动物的BAL中不存在。因此，本发明提供了，尽管存在VV的灭活(例如完全中和)，但包含本发明的灭活的VV的纳米乳剂保留重要的免疫原性表位(例如，被受试者的免疫系统(例如，体液免疫系统)识别和反应)。实施例5对天然VV_WR和VV—WR-Lue的反应的比较VV,-k具有与天然林系相同的表面蛋白，但在感染期间表达荧光素酶蛋白。这允许使用成像技术对受攻击的动物中的病毒感染进行死亡率估计和监测。ELISA、Western印迹或病毒中和测定中，VV,免疫的动物对比两种病毒林系中的抗体的比较显示VV-WR和VV-WR-Lu。之间没有差异。实施例6NE杀死的VV的施用产生VV特异性细胞免疫反应使用体外细胞因子表达测定法在脾细胞中研究基于NE的疫苗对细胞反应的作用。用103和l(Tpfu的活牛痘刺激小鼠脾细胞的个体培养物。通过来自用107NE或107NE免疫的动物的脾细胞中的IFN-y的体外表达证明了VV特异性细胞免疫反应。相反地，在来自用福尔马林杀死的病毒(甚至当将其与纳米乳剂混合时)免疫的动物的脾细胞中未观察到增加的VV特异性IFN-y产物。来自用VV/NE疫苗处理的小鼠的细胞中的IFN-y的产生表明细胞反应的Thl极化。在对照脾细胞培养物中没有检测到抗原特异性细胞因子表达(参见图4)。实施例7施用了NE杀死的VV的受试者受到针对活的、感染性VV的攻击的保护在攻击研究中估计由粘膜免疫产生的保护性免疫。用3剂107NE、107Fk/NE或107Fk疫苗鼻免疫三组小鼠。用盐溶液处理对照动物。在第12周，用小鼠IOxLD5。(2x106pfu)的活VV—wHu。攻击小鼠。每天测量体重和体温2次，每天就VV-肌u。发光照像一次。所有107NE接种的小鼠经历病毒的攻击而存活(参见图5A)。用107Fk/NE和107Fk接种的小鼠分别具有40%和20%的存活率。尽管未获得完全保护，但使用107Fk/NE的接种也将平死亡前时间(TTD)延长了5至7天。对照小鼠没有一只活过攻击。用于估量病毒感染的生物发光成像显示五只107NE感染的小鼠中有二只具有最低可检测限度的病毒复制，这不影响它们的重量和体温，然而其他三只具有可在攻击后6天内减退的更具攻击性的复制(参见图5B)。然而，这些动物没有一只具有感染的临床迹旬。相反地，所有未接种的对照生病或死亡，或在病毒攻击的4至7天内对其进行富有人情的无痛至死。如光子通量数据中所显示的，这些动物在整个鼻咽道、肺和腹部具有大量的病毒复制和感染传播。在107NE接种的小鼠中，在鼻内攻击后低度感染被限定于接种的动物的头(鼻)部，而不扩散至胸部和腹部(参见下面的表4)。已接种的对照_天数__§^51_§Xg_ssm头27.03.333.812.0326.113.1135.986.1475.216.5431.0252.0556.617.1924.7355.6胸28.21.824.03.8313.32.0119.825.0422.16.3216.362.0516.61.3618.2135.8腹212.11.019.25.1313.71.323.88.2423.02.828.310.0514.81.832.16.9表4总之，成像研究表明感染的扩散和存活之间的负相关。一些免疫的动物中的自限性感染的存在与个体动物中中和抗体的水平相关。为进一步研究基于粘膜NE的疫苗的功效，将使用3剂107NE的鼻内免疫与通过划破使用活的VVwJ107sJ的接种比较。在第12周，使用增高剂量的活的VL对小鼠进行鼻内攻击。存活数据表明粘膜免疫产生的保护性免疫等同于通过通常用于人天花疫苗的划破的接种(参见下面的表5)。攻击存活a剂量[pfu]XLD^NE疫苗皮下接种对照1.0,E+07775/55/50/52.0.E+06155/55/50/54.0.E+0535/55/51/58.0.E+040.625/55/53/51.6.E+040.125/55/55/53.2.E+030.025/55/55/5a表示为存活小鼠对所有小鼠的比率6计算的1xLDs。是5.13x105pfu的VVWR表5用粘膜VV/NE疫苗或通过划破接种的所有小鼠活过使用最大剂量1x107pfu的VVWR(77xLDs。)的鼻内攻击。抗致死攻击的保护指数(IPJ对于基于NE的疫苗和划破都是l.9。在用15xLD5。VVwK攻击后，所有对照非接种的动物死亡。在存活小鼠的体重减轻分析中，也看到使用鼻内免疫获得的高水平保护作用。尽管粘膜接种不能完全保护小鼠针对使用高剂量的VL的呼吸感染(参见下面的表6)，但用NE疫苗免疫的动物不具有疾病的临床迹象，但具有10。/。或更少的平均体重减轻，然而对照组中的存活小鼠在低得多的VVwK的剂量下丢失25%的体重。统计分析表明在免疫的小鼠和对照小鼠的体重之间存在p值<0.01的差异。抗感染保护指数(IPJ对于VV/NE疫苗是1，对于皮下接种是2.2。攻击受保护的小鼠4剂量[pfu]XLD50ft_NE疫苗皮下~^种_对照1.0.E+07770/53/50/52.0.E+06150/55/50/54.0.E+0531/55/50/58.0.E+040.622/55/50/51.6.E+040.124/55/50/53.2.E+03_^_^_^_^Zia表示为在攻击后任何时间体重和体温不减少的小鼠对所有小鼠的比率6计算的1xLDs。是5.13x105pfu的VVWR。表6实施例8材料和方法rPA/NE疫苗动物。从CharlesRiver实验室(Wilmington，MA)购买无病原体、雌性Balb/c,CBA/J小鼠(5-6周龄)和Hartley豚鼠(雌性，250g)。按照美国实验动物照护评鉴协会标准关养小鼠和豚鼠。按照UniversityofMichigan的关于动物的使用和照护的大学委员会(UniversityCommitteeonUseandCareofAnimals,UCUCA)、UniversityofTexasMedicalBranchatGalveston,TX的实验动物管理及使用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)(IACUC)和BattelleMemorialInstitute,Columbus,OH的标准操作方法进行所有涉及动物的方法。试剂。以纯化的蛋白质的冻干制剂的形式，从ListBiologicalLaboratories,Inc.(Campbell,CA)和BEI资源仓库(BEIResourceRepository)(ATCC)获得重组炭疽芽胞杆菌保护性抗原(rPA)和致死因子(rLF)。在无菌MILLI-Q水(5mg/ml)中重建后，将等分在-80匸下贮存。通过集成DNA技术(IDT，Coralville,IA)合成包含非甲基化CpG重复的20-mer的聚核苷酸(ODN)5'-TCCATGACGTTCCGTACGTT-3'(SEQIDNO.:3)(参见，例如，Moldoveanu等人，1999.15:1469-1476)。从SIGMA-ALDRICHCorporation(St.Louis,MO)购买大肠杆菌单磷酰脂质A(MPLA，#L-6638)、PHA-P、BSA、DTT和用于緩冲液的其他化学药品。分别从GIBCO(GrandIsland,NY)和HYCLONB(Logan,UT)购买磷酸緩冲盐溶液(PBS)、细胞培养基和胎牛血清(FBS)。从SIGMA购买牛血清白蛋白(BSA)、碱性磷酸酶(AP)缀合的抗体、山羊抗小鼠IgG(fA-3562)和山羊抗小鼠IgA(ot链特异性的，并A-4937)和从BETHYL(#A90-115P,Montgomery,TX)购买山羊抗小鼠IgEHPR缀合物。从ROCHEDIAGNOSTICS(NewJersey,NY)购买细胞增殖试剂盒(XTT)。rPA/佐剂制剂。从NANOBIOCorporation,AnnArbor，MI获得纳米乳剂(制剂W2。5EC)。通过使用高速乳化器(例如，按照属于MNOBIOCorporation(AnnArbor，MI)的美国专利6,015，832(通过以其全文引用全并入本文)通过两步骤法制备的)，用热压大豆油(64%)乳化水中的十六烷基氯化吡啶(CPC，1%)、Tween20(5%)和乙醇(8%)来制造该纳米乳剂。除了CPC外，使用被FAD认为是"公认为安全的"(GRAS)的表面活性剂和食物材料配制W2。5EC。W2。5EC可在药品生产和质量管理(GoodManufacturingPractice)(GMP)下进行经济地生产，其在40t:下稳定至少18个月而无需任何特殊的贮存条件。通过动态光散射(DLS)，使用NICOMP380ZLS(PSSNICOMPParticleSizingSystems,SantaBarbara,CA)确定纳米乳剂的直径。平均小滴大小始终小于400nm。在免疫之前30至60分钟通过将rPA蛋白溶液与NE混合，使用盐溶液作为稀释剂来制备rPA/纳米乳剂。使用与浓度为0.1%、0,5%、1%和2°/。的纳米乳剂混合的20剂量的rPA进行小鼠免疫研究。关于使用免疫刺激剂的免疫，将20jugrPA与5jugMPLA或lOjagCpG寡核苷酸在盐溶液中混合。在进行所描述的吸附方法(SeeLittle等人，2004Vaccine22:2843-2852)后，制备rPA氢氧化铝制剂(Alu，#A-8222,SIGMA)。使用与1%NE和作为佐剂的盐溶液混合的10jug、50pg和100iig剂量的rPA进行豚鼠免疫研究。免疫体积是10Hl/鼻孔(对小鼠)和50pil/鼻孔(对于豚鼠)。重組PA的PAGE分析。使用用于电泳的XCELLSURELOCKMini-Cell平台，在10%NUPAGENOVEXBis-Tris凝胶(INVITROGEN，#NP0301BOX)上对盐溶液中的或与1%NE混合的0.5rPA蛋白进行PAGE分析。按照INVITROGENSILVERXPRESS(#LC6100)法进行4艮染。使用分子量标记MARK12(INVITROGEN;#LC5677)确定rPA蛋白的大小。抗原的体外摄取。按照厂商的方案使用FLUOROTAGFITCConjugation试剂盒(并FITCl，SIGMA)制备荧光标记的rPA蛋白。将小鼠树突细胞(JawsII)在37匸下与PBS中的PA-FITC缀合物或与纳米乳剂中混合的PA-FITC—起温育30分钟。选择0.001%的NE浓度以确保以单层培养物的形式生长的细胞的完全存活力。在温育后，用PBS清洗细胞3次，然后用PBS中的1.25%福尔马林固定细胞。然后通过荧光显微镜分析细胞的摄取。用配有IXFLA倒置反射荧光观察附件(invertedreflectedfluorescenceobservationattachment)的OLYMPUS1X70显微镜拍摄显微照片。使用SPOT基础和SPOT高级程序处理影象。免疫方法。对于各实验，使用1次或2次实验疫苗(间隔3周)鼻内(i.n.)免疫成组的小鼠。就不利反应监测动物，在长达12周期的时期内以3至4周的间隔测量抗体反应。首先通过用异氟醚麻醉小鼠，然后将它们倒置抓起来来进行免疫。使用移液器尖头(IO"l/鼻孔)将rPA/NE混合物用于鼻孔，然后让动物吸入材料。间隔4周使用一次或两次疫苗施用(50pl/鼻孔)鼻内(i.n.)接种Hartley豚鼠，在长达22周的时期内以3至4周间隔测量反应。血液收集、支气管肺泡灌洗液(BAL)和脾细胞。在试验过程中在不同的时间点从隐静脉获得血液样品。通过心脏穿刺从无痛致死的、发病前的小鼠获得终样品。在血液于室温下凝固30-60分钟后，通过以1500xg离心5分钟从血液获得血清。血清样品贮存在-20"C直至分析。从通过异氟醚吸入麻醉的小鼠获得BAL液。在切开气管后，将附加至注射器的22号导管(ANGIOCATH，B-D)插入气管。用0.5ml包含10jnMDTT和0.5mg/ml抑肽酶(蛋白酶抑制剂)的PBS灌注肺2次，然后回收大约1ml的吸出物。BAL样品贮存在-20lC下以待进一步研究。机械分离小鼠脾细胞以获得PBS中的单细胞悬浮物。通过用ACK緩冲液(150mMNH,C1、10mMKHC03、0.1mMNa2EDTA)裂解来除去红细胞(RBC)，将剩余的细胞在PBS中清洗2次。为了进行抗原特异性增殖或细胞因子表达测定，将脾细胞(2-4x106/ml)重悬浮于补充有2%FBS、200nML-谷氨酰胺和青霉素/链霉素(100U/ml和100jig/ml)的RPMI1640培养基中。抗PAIgG和IgA的确定。通过ELISA确定小鼠抗PA特异性IgG和IgA的水平。用包衣緩沖液(50mM碳酸钠、50mM碳酸氢钠，pH9.6)中的5pg/ml(100rPA包被微量滴定板(NUNC)，然后在4。C下温育过夜。在除去蛋白质溶液后，用包含1%奶粉的PBS封闭板，进行30分钟。抽吸封闭溶液，立即使用板或将其在4C下贮藏直到需要。在PBS中的0.1%BSA中系列稀释血清或BAL样品，将100p1/孔等分在rPA包被的板中在37X:下温育1小时。用PBS-O.05%Tween20清洗板3次，然后与抗小鼠IgG或抗小鼠IgA碱性磷酸酶(AP)缀合的抗体(ROCKLAND)温育1小时，之后清洗3次，然后与AP底物SIGMAFAST(SIGMA)—起温育。按照厂商的方案使用1NNaOH终止比色反应，使用SPECTRAMAX340ELISA读取器(MOLECULARDEVICES,Sunnyvale,CA)在405nm处和690nm的参照波长处进行读取。记录终点滴度，在BAL液的情况下，根据对于各测定板获得(即，使用山羊F(ab。2抗小鼠IgG作为捕获剂和已知浓度的小鼠IgG和IgA免疫球蛋白，然后用抗IgG或抗IgA-AP缀合物进行检测获得)的标准曲线计算终抗体浓度(参见Rhie等人，2003PNAS100:10925-10930)。通过相同的方法(除了将兔抗豚鼠豚鼠IgG碱性磷酸酶(AP)缀合物用于检测(ROCKLAND)外)测定豚鼠抗PAIgG。抗体浓度表示为终点滴度的平均数+/-sem(平均值的标准误)。IgE的点印迹检测。将盐溶液rPA溶液(2nl，5jug/ml)吸附至NYTRAN膜(O.2jim的孔，SchleicherandSchuell，Keene，NH)，然后在室温下风干30分钟。用含有1%奶粉的PBS封闭膜30分钟，然后用PBS清洗3次，之后风干。对于IgE的检测，将来自所有组的动物的混合血清以1:10、1:20、1:40和1:80稀释在含有0.1%BSA的PBS中。将一式两份各稀释度的样品(2置于抗原斑上，在室温下温育30分钟在PBS中清洗3次后，将点印迹与1:1000稀释的抗小鼠IgE辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的抗体一起温育。在用PBS清洗5次后，将点印迹与HPR底物一起温育直至印迹可见。致死毒素(LeTx)细胞毒性和中和抗体测定法。使用与LeTx(PBS中含O.1"g/mlrPA和0.1jig/mlrLF)—起温育1小时的血清的系列稀释物进行中和抗体测定。然后向RAW264.7(20,000-30，000个细胞/孔)中加入抗体-毒素混合物，然后在37X:下温育4-6小时。使用XTT测定法估计细胞的存活力。根据细胞存活率曲线计算导致50%的抗LeTx细胞毒性的保护的血清滴度(中和浓度NC5。)，其表示为个体血清的平均值。138活孢子攻击。分另'J在BattelleMemorialInstitute(Columbus,OH)和UniversityofTexasMedicalBranch(Galveston,TX)的BSL4和BSL3实验室进行攻击实验。按照Battelle研究号556-G607602进行皮内(i.d.)攻击。简而言之，计数炭疽芽胞杆菌(Ames抹系)孢子，然后将其稀释以用于i.d.孢子攻击。将AmesBattelleLotB22的浓缩的原液在无菌水中稀释至预期的5x103个集落形成单位/ml(cfu/ml)的浓度。在研究的当天，用大约500个孢子(O.1ml)的靶剂量i.d.攻击豚鼠。攻击后孢子的计数显示实际数目为1380个，这相应于i.d.1000LD5。。在攻击后，就临床疾病的症状或死亡每天观察豚鼠2次，进行14天。记录死亡记至最近的观察期。将经历攻击后存活所有动物麻醉以进行末端血液收集(terminalbloodcollection)，然后在攻击后第14天无痛杀死动物。按照JWP-004-0012NasalChallengeSOP方案进行鼻内(i.n.)攻击。简而言之，计数炭疽芽胞杆菌(Ames株系)孢子，然后将其在不含钙但含镁的PBS中稀释以用于鼻内孢子攻击。通过鼻内施用1.2x106或1.2x107个孢子(这分别相应于鼻内10xLDs。和100xLDs。的剂量)来攻击麻醉的豚鼠。如上对于皮内攻击所描述的进行豚鼠的攻击后观察。增殖测定法。使用细胞增殖ELISA(CELLPROLIFERATIONELISA，ROCHEMolecularBiochemicals,Mannheim,Germany),通过5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)整合的测定来测量小鼠脾细胞的增殖。在rPA(5ug/ml)或PHA-P分裂素(2pg/ml)存在的情况下将细胞温育48小时，然后用BrdU脉冲24小时。按照厂商说明书，使用SPECTRAMAX340ELISA读取器在370nm和492nm的参照波长处测量细胞的增殖。体外细胞因子表达的分析。将新分离的小鼠脾细胞以2x106个细胞/0.5ml(RPMI1640，2XFBS)接种,并与rPA(5yg/ml)或PHA-P有丝分裂原(2jug/ml)—起温育72小时。收获细胞培养物上清液，就细胞因子的存在对其进行分析。按照厂商说明书，使用QUANTIKINEELISA试剂盒(R&DSYSTEMS,Inc.，Minneapolis,MN)进行IL-2、IL-4、IFN-y和TNF-oc细胞因子的测定。统计分析。来自个别实验的数据表示为平均值±平均值的标准误。通过AN0VA方差分析，使用学生氏t检验和Fisher确切检验(Fisherexacttest)确定统计学显著性。在在95%置信度(双尾检验)上进行所有检验。p值〈0.05被认为是统计学显著的。实施例9混合的rPA/NE疫苗的物理性质。将rPA与纳米乳剂(NE)混合显示不改变抗原的蛋白质结构，因为它在非变性PAGE上保持单个分离的条带，该条带相应于具有83kD的分子量的完整的、全长蛋白质(参见图6A)。NE表现出提高rPA的稳定性，这防止了在緩沖溶液中温育的抗原中所观察到的由于脱酰胺而引起的逐渐降解(参见，例如，Gupta等人，2003.FEBSLetters554:505-510;Zomber等人，2005JournalofBiologicalChemistry280:39897-39906)。rPA蛋白的加入不改变纳米乳剂的大小(359+/-109nm)、表观或稳定性，如在单独的和与抗原混合的NE的显微照片(参见图6B)中所显示的。实施例10纳米乳剂增加树突细胞对rPA的摄取而不诱导炎症反应在施用后24小时至第4天，用单独的NE或与rPA混合的NE鼻内免疫的小鼠的鼻粘膜的组合病理学没有显示炎症反应的迹象。相反地，体外研究证明将rPA与NE混合显著地增加了蛋白质在JawsII树突细胞中的摄取(参见图7)。因此，在一些实施方案中，本发明提供了，体内的NE佐剂活性涉及抗原通过抗原递呈细胞至鼻粘膜的摄取的增加(例如，在不诱导炎症的情况下)。实施例11rPA/NE免疫诱导血清抗PA抗体在CBA/J和Balb/c小鼠中测量纳米佐剂对抗体反应的影响。用140与0.1%、0.5%、1%或2%浓度的NE混合的20|igrPA鼻内免疫CBA/J小鼠.在所有接种的动物中获得了血清中抗PA抗体的快速诱导，并部分地依赖于纳米乳剂的浓度。所有CBA/J小鼠在只进行2次疫苗施用(第l和第3周)后的第5周产生了高滴度的血清抗PAIgG(终点滴度在104至105范围内)。第8至12周的进一步测定表明虽然在用0.1%和0.5%NE免疫的动物中存在更低的滴度，但在用1°/。或2%rPA/NE免疫的动物中的滴度之间没有统计学上的差异。相反地，在用盐溶液中的rPA鼻内免疫的动物中发现无血清阳性小鼠(参见图8A)。IgG亚型抗体的模式表明相对于IgGl，IgG2和IgG2b占主体。因此，在一些实施方案中，对受试者施用与NE混合的rPA诱导免疫反应的Thl极化(参见图8A,插图)。为进一步表征由鼻内纳米乳剂产生的免疫反应，用与1。/。NE(rPA/NE)混合的20jugrPA免疫Balb/c小鼠，然后将其与使用与MPLA(rPA/MPLA)、未甲基化的CpG0DN(rPA/CpG)或氢氧化铝(rPA/Alu)混合的20jigrPA的免疫进行比较(参见,例如，Peterson等人，2006.InfectionandImmunity74:1016-1024;Pittman等人，2001.疫苗20:972-978;Pittman等人，2002.疫苗20:2107-2115;Reuveny等人，2001.InfectImmun69:2888-2893)。在施用各制剂2次后，用rPA/NE免疫的所有小鼠为血清阳性的，抗PAIgG终点滴度至少为105。将该结果与rPA/MPLA、rPA/CpG和rPA/Alu免疫组中的102至103范围内的滴度进行比较(参见图8B)。在用盐溶液中的rPA鼻免疫的动物中未检测到抗PA抗体。还就抗PAIgE抗体的存在分析血清，显示在用rPA/Alu肌内免疫的小鼠中但不在任何其他组中存在IgE抗PA(以至少1:80的稀释度在点印迹中可检测的)(参见图8B，插图)。这与基于明矾的佐剂的疫苗诱导Th2反应的报导(参见，例如，Johansson等人，2004.Vaccine22:2873-2880;Lindblad，2004.Vaccine22:3658-3668)—致。实施例12鼻内rPA/NE接种产生粘膜免疫确定鼻免疫是否诱导粘膜免疫(例如，保护免受呼吸感染的粘膜免疫(参见,例如，Davis,2001AdvancedDrugDeliveryReviews51:21-42;Zuercher，2003.ViralImmunology16:279-289))。在来自用rPA/NE接种的Balb/c小鼠的支气管灌洗液(BAL)样品中观察到显著水平的抗PA特异性分泌性IgA抗体(参见图9A)。就BAL中的抗PAIgG检测具有更高抗体浓度的相似模式(参见图9B).在BAL中具有分泌性IgA的滴度的动物也具有可检测水平的血清抗PAIgA。因此，本发明提供了，通过鼻内施用(而非肌内免疫)包含NE中的rPA的疫苗诱导显著的粘膜免疫反应。在施用具有或不具有抗原的NE后，在动物的鼻粘膜的组织病理学检查中未观察到炎症反应，表明纳米乳剂不是促炎症反应的。实施例13rPA/NE疫苗在小鼠中产生抗炭疽毒素的中和抗体为了估计基于粘膜纳米乳剂的疫苗是否可产生毒素中和抗体，就中和炭疽致死毒素(LeTx)的能力检测来自已免疫的小鼠的血清。来自用rPA/NE免疫的小鼠的血清在有效中和LeTx并防止RAW264.7细胞死亡，其NC5。>103。相反地，来自用rPA/MPLA、rPA/CpG或rPA/Alu免疫的小鼠的血清具有NC5。<10。未实验的(Naive)对照血清或来自用盐溶液中的rPA免疫的小鼠的血清在任何浓度上不抑制LeTx细胞毒性(参见图10)。实施例14rPA/NE免疫产生Thl细胞反应在增殖测定中(参见图5)和通过对从用rPA体外刺激的脾细胞分泌的细胞因子的分析(参见下面的表7)来测量PA抗原特异性细胞反应。如图11中所显示的，rPA刺激获自用rPA/NE免疫的小鼠的脾细胞的增殖。在来自用单独rPA或与CpG0DN—起的rPA免疫的动物的脾细胞中没有检测到抗原特异性增殖。当与对照(非刺激的)细胞相比，PA活化的脾细胞显示大量产生INF-y、TNF-oc和IL-2，但不能产生IL-4。因此，在一些实施方案中，本发明提供了，使用rPA/NE的免疫(例如，鼻内施用)产生特定Thl型极化的细胞反应(参见表7)。相反地，与PHA—起温育的脾细胞培养物诱导Thl和Th2细胞因子的显著增殖和分泌。PA/NECtrl-PA+PA-PA+PAifn-y26.37±8.1093.30±24.40*13.23±2.3315.40±3.70TNF-oc4.74±2.6222.62±12.85*3.51±2.342.50±2.50il-227.10±2.6259.00±16.9*33.00±17.3035.00±16.90il-417.44±2.1721.76±9.7619.00±2.7318.17±2,69表7实施例15rPA/NE疫苗保护豚鼠免受皮内活孢子攻击使用与1。/。NE混合的10、50和100jig剂量的rPA鼻内接种三组豚鼠。在单次接种后观察到IgG反应，在第二次施用(第4周)后IgG反应继续增加，从而产生大于1x105的终点抗体滴度。随后让动物进行6个月以估计免疫的持续时间。三组动物中的鼻免疫产生至少6个月的持久的具有高抗体滴度(>104)持续免疫反应(参见图12A)。在第6个月，用1000xLD5。Ames林系的孢子皮下(i.d.)攻击动物。存活数据表明使用NE中的rPA的三种浓度中的任一种进行的豚鼠的粘膜接种产生100°/。的抗i.d.攻击的保护，然而没有一个对照动物存活(参见图12B)。攻击前的LeTx中和测定显示在10jagrPA/NE组中具有3x102的平均血清NC5。，在50pg和100jagrPA/NE免疫的组中具有约1x103的NCso(参见图12B，插图)。实施例16rPA/NE疫苗保护免受鼻内孢子攻击也在吸入攻击试验中检测鼻内免疫的保护效应。用包含与1%NE混合的10、50和100jug的rPA的制剂免疫三组豚鼠。免疫在免疫的动物中产生100°/。的血清转换和显著的抗PAIgG反应。第4周的加强导致血清中的抗PAIgG快速增加，从而在所有组中产生高于lx105的终点抗体滴度。攻击前的LeTx中和测定显示在所有接种的组中具有1-2x103的平均NC"离度(参见图13A)。在第7周，用10xLD5。(1.2x106个孢子)或100xLD5。(1.2x107个孢子)的炭疽芽胞杆菌Ames林系孢子鼻内攻击动物。虽然没有一个对照豚鼠存活，但使用rPA/NE的各制剂的鼻内免疫产生了保护性免疫。rPA/NE免疫在10xLDs。攻击后产生70°/。的存活率，在100xLDs。攻击后产生40%的存活率(分别参见图13B和13C)。10xLD5。攻击的结果提供了，粘膜rPA/NE疫苗产生可与使用rPA和明矾的肌内接种相当的保护性免疫(参见，例如，Patton等人，2006.ASMBodefenseMeeting:Abstract232)。尽管在多个rPA浓度上用rPA/NE接种的豚鼠的总体存活中没有差异，但在已免疫的动物中存在显著的剂量依赖性的平均死亡前时间(TTD)的延长(参见下面的表8)。<table>tableseeoriginaldocumentpage144</column></row><table>表8实施例17材料和方法动物。从CharlesRiver实验室(Wilmington,MA)购买无病原体、雌性Balb/c小鼠(5至6周龄)和Hartley豚鼠(雌性，250g)。按照美国实验动物照护评鉴协会标准分别关养接小鼠(一个笼子5只动物)和豚鼠(每个笼子1只动物)。按照UniversityofMichigan的关于动物的使用和照护的大学委员会(UCUCA)进行涉及小鼠的所有方法。试剂。通过Dr.DavidMarkovitz从Dr.JosephSodorski(分另'J在HarvardMedicalSchool和UniversityofMichigan)获得酵母中产生的重组HIVgpl2(W和gpl20sn62血清型蛋白。将5mg/ml无菌盐水中的蛋白质溶液的等分在-80"C下贮存直至使用。从Dr.StevenKing(UniversityofMichigan)获得合成的V3环肽(BaL)。通过集成DNA技术(IDT,Coralville,IA)合成包含非甲基化CpG重复的20-mer寡核苷酸(0DN)5'-TCCATGACGTTCCGTACGTT-(SEQIDNO.:4)(参见，例如，Moldoveanu等人，Vaccine1998;16(11-12):1216-24)。从SIGMA-ALDRICHCorporation(St.Louis,MO)购买明尼苏达沙门氏菌/Z7/加"o")单磷酰脂质A(MPLA，#L-6638)、PHA-P、BSA、DTT和用于緩沖液的其他化学药品。分别从GIBCO(GrandIsland,NY)和HYCLONE(Logan,UT)购买磷酸緩冲盐溶液(PBS)、细胞培养基和胎牛血清(FBS)。从SIGMA购买碱性磷酸酶(AP)缀合的抗体、山羊抗小鼠IgG(#A-3562)和山羊抗小鼠IgA(oc链特异性的，#A-4937)和从ROCKLAND(#606-408)购买兔抗豚鼠IgG。gpl20/佐剂制剂的制备。从NANOBIOCorporation,AnnArbor，MI获得用于这些研究的水包油纳米乳剂(NE)。通过使用高速乳化器，用热压大豆油(64W在水中乳化十六烷基氯化吡啶(CPC，1°/。)、非离表面活性剂(5%)和乙醇(8%)和通过两步骤法(参见属于NAN0BI0Corporation.AnnArbor.MI.的美国专利6，015，832，对于所有目的，通过以其全文引用全并入本文)来制备。除了CPC外，使用被FAD认为是"公认为安全的"(GRAS)的表面活性剂和食物材料配制该纳米乳剂。通过动态光散射(DLS)使用NIC0MP380ZLS(PSSNIC0MPParticleSizingSystems,SantaBarbara,CA)确定NE平均小滴大小(大约300+/-25nm)。通过将gpl20蛋白溶液与NE混合，使用盐溶液作为稀释剂来制备gpl20/NE制剂。使用与浓度为0.1%、0.5%、1%的NE浓度混合的20iug剂量的gpl20进行小鼠免疫研究。对于使用免疫刺激剂的免疫，向1VNE中的20jig的gpl20或向盐溶液中的20jLig的gpl20中加入5jigMPLA或10jagCpGODN。使用50ng剂量的与l。/。NE和作为稀释剂的盐溶液混合的gpl20进行豚鼠免疫研究。免疫方法。以3周的间隔使用2次(在偶尔情况下使用3次)鼻内(i.n.)施用gpl20/NE制剂来免疫Balb/c小鼠。通过緩慢地将gpl20/NE混合物(每鼻孔10pl)用于经异氟醚麻醉的小鼠的鼻孔中来进行免疫。在递送过程中，将动物倒立抓起直至小滴完全吸入。在对照组中，用盐溶液中的gpl20和用单独的NE或单独的盐溶液免疫小鼠。使用2剂(以3周的间隔)的50p1盐溶液或1%NE中的20jLiggpl20注射进行肌内施用(i.m.)。使用氯胺酮注射液(40mg/kg)麻醉Hartley豚鼠(每组3只动物)，然后通过以3周的间隔两次鼻内施用gpl20/NE混合物(每鼻孔50pl)来鼻内免疫豚鼠。血液、支气管肺泡灌洗液和阴道洗液以及脾细胞样品的收集。在实验过程中在不同的时间点从隐静脉获得血液样品，或通过心脏穿刺从无痛致死的、发病前的小鼠获得血液样品。通过以1500xg离心5分钟从凝固的血液(于室温下凝固放置30-60分钟)获得血清。在56。C下进行1小时来加热灭活收集的血清样品，然后在-20匸下贮存血清品直至分析。从通过异氟醚吸入麻醉的小鼠获得小鼠支气管肺泡灌洗液(BAL)。用含有10pMDTT和0.5mg/ml抑肽酶的0.5mlPBS灌注肺2次，然后回收大约lml的吸出物。在-20r下贮存BAL样品直至分析。通过用含有IOjaMDTT和0.5mg/ml抑肽酶的100y1PBS输注阴道腔来从麻醉的小鼠收集阴道洗液样品。在4匸下以10，000xg离心样品5分钟，然后在-20C下贮藏上清液直至分析。146从脾脏机械分离小鼠脾细胞以获得PBS中的单细胞悬浮物。通过用ACK緩冲液(150mMNH4C1、10mMKHC03、0.1mMNa2EDTA)裂解来除去红细胞UBC)，将剩余的细胞在PBS中清洗2次。为了抗原特异性增殖或细胞因子表达测定，将脾细胞(2-4x106个细胞/011)重悬浮于补充有2。/。FBS、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素(100U/ml和100jng/ml)的RPMI1640培养基。抗gpl2QIgG和IgA抗体的测定。通过ELISA确定小鼠抗gp120特异性IgG和IgA的水平。用包衣緩沖液(50mM碳酸钠、50mM碳酸氢钠，pH9.6)中的5jag/ml(100pi)gpl2(U或gpl20s丽血清型包膜蛋白包,皮;敞量滴定板(MAXISORP;NALGENUNCInternational,Rochester,NY),然后在4'C下温育过夜。在除去蛋白质溶液后，用PBS-iy。奶粉溶液封闭板，在37n进行30分钟。抽吸封闭溶液，立即使用板或将其在4C下贮藏直到需要。在PBS中的0.1M的BSA中系列稀释血清或BAL液，将IOOp1/孔等分在gpl20包被的板中于37匸下温育1小时。按照厂商的方案用PBS-O.05^TweenW清洗板3次，然后与抗小鼠IgG或抗小鼠IgA碱性磷酸酶(AP)缀合的抗体温育1小时，之后清洗3次，然后与AP底物SIGMAFAST(SIGMA，St.Louis,MO)一起温育。使用SPECTRAMAX340ELISA读取器(MOLECULARDEVICES,Sunnyvale,CA)在405nm处和69Qnm的参照波长进行分光光度计测量的读取。终止抗体滴度定义为系列血清稀释的最后稀释度(在该稀释度上405nm处的吸收比阴性对照高2倍)的倒数。通过相同的方法(除了将抗豚鼠IgG碱性磷酸酶(AP)缀合物用于检测(ROCKLAND)外)测定豚鼠抗gp120IgG。抗体浓度表示为平均值+/-终点滴度的标准差(s.d.)。HIV-1单轮中和测定(single-roundneutralizationassay)。用于本研究的进化枝BHIV-1的8个林系组包含实验室林系BaL、SF162和MN以及原代HIV-1分离林SS1196.01、BG1168,01、QH0692.42，3988.25和5768.04(Li05)。病毒中和测量为所描述的第一轮病毒感染TZM-bl细胞后，荧光素酶报告基因表达的减少的函数(参见，例如，Montefiori,editor.EvaluatingneutralizingantibodyagainstHIV，SIVandSHIVinluciferasereportergeneassays.NewYork,NY:JohnWiley&Sons,2004)。对TZM-bl细胞进行基因工程改造，从而使其表达CD4和CCR5和包含用于在HIV-1LTR的控制下的萤火虫荧光素酶和大肠杆菌P-半乳糖苷酶的整合的报告基因。将原代HIV-1分离抹(TCID5。，100至200)与血清的系列稀释物一起在37。C下温育l小时。然后，将病毒/血清加入包含粘附的TZM-bl细胞的96孔平底培养板。对照包含细胞+病毒(病毒对照)，和只有细胞(背景对照)。如提供商(PR0MEGA，Madison,WI)所述,48小时后，使用BRIGHTGL0底物溶液测量生物发光。中和滴度(NT5。)是在减去背景相对光单位(RLU)后与病毒对照细胞的RLU相比，RLU减少50%时所处的稀释度。增殖测定。使用商购可获得的标记和检测试剂盒(CellProliferationELISA，ROCHEMolecularBiochemicals，Mannheim,Germany),通过5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)的整合的测定来测量小鼠脾细胞的增殖。为了估量抗原特异性增殖，将细胞(2x1(^个细胞/ml)在单独的培养基中和在gpl20BaL(5pg/ml)存在的情况下，或作为对照与PHA-P(2jig/ml)—起温育，进行48小时，然后用BrdU脉冲进行24小时。按照厂商说明书，使用SPECTRAMAX340ELISA读取器(MOLECULARDEVICES,Sunnyvale,CA)在370nm处和492nm的参照波长处测量细胞的增殖。细胞因子体外表达的分析。以4x106个细胞/ml(RPMI1640，2%FBS)接种小鼠脾细胞，然后将其与gpl20BaL、gpl20,(5jig/ml)或与V3环肽(20nM)—起在37C下温育72小时。收获细胞培养物上清液，就细胞因子的存在对其进行分析。按照厂商说明书，使用Q腦TIKINEELISA试剂盒(R&DSYSTEMS,Inc.，Minneapolis,MN)进行细胞因子的测定。统计分析。使用AN0VA、学生t检验进行结果的统计学分析，用于p值的确定。实施例18使用与纳米乳剂混合的重组HIVgpl20蛋白的鼻免疫在血清中诱导了有效的IgG反应。为了确定NE在使用重组HIVgpl20蛋白的粘膜免疫中是否具有佐剂的活性，用抗原的gpl20^或gpl20SF162血清型鼻内(i.n.)免疫Balb/c小鼠。使用盐溶液中的或与0.1°/。、0.5°/。和1。/。的多个NE浓度混合的20pg的gpl20BaL来估量NE的浓度效应。在2次免疫后第6周和在第3次免疫后第12周收集血液，就gp120-特异性抗体通过ELISA对所述血液进行分析。用gpl20BajNE制备物中的任一个免疫的所有小鼠只在2次免疫后呈血清阳性的。抗gpl20^IgG反应显示NE的浓度依赖性，gpl2(W0.1%NE中具有最低滴度和gpl20BaL/l°/。NE免疫组中具有最高滴度(分别为1.3x104和2.6x1()5的平均滴度)。使用gpl20BaL/盐溶液免疫的小鼠不具有可检测的抗gpl20BaL抗体。在使用0.5。/。或l。/。NE的鼻内免疫后，血清抗gp120IgG滴度可与在使用gpl20BaL(盐溶液中的或与1°/。NE混合的)的肌内注射后产生的抗体反应相当，或甚至比其高。第三鼻内免疫在任一免疫组中不显著增加抗体滴度(参见图14A)。因此，本发明提供了，只需要两次鼻内施用gpl20^和NE佐剂来在小鼠中发动有效的全身性IgG反应。NE足以用作有力的粘膜佐剂。将NE产生的免疫反应与已知的免疫刺激物、未甲化的CpGODN和MPLA的效应进行比较。使用与1^NE混合的20jug的gpl20SF162(gpl20SF162/NE)来养内免疫小鼠，然后与使用与CpGODN(gpl20s冊/CpG)或与MPLA(gpl20SF162/MPLA)相混合的抗原的免疫进行比较。为了研究組合NE和免疫刺激物的效应，用gpl20SF162/NE和另外地用CpG(gpl20SF162/NE+CpG)或MPLA(gpl20SF162/NE+MPLA)免疫小鼠。与使用gpl20BaL的免疫相似，用gpl20s围/NE免疫的小鼠响应高抗gpl20sFH2IgG滴度。NE与MPLA(但不与CpG)的组合导致平均抗体滴度的适当增加(2至3倍于单独使用gpl20s,/NE的免疫)，然而差异不具有统计学显著性(p>0,05)。相反地，使用与CpG混合的抗原或单独的MPLA的免疫只产生微弱的免疫反应(参见图14B)。实施例19产生的抗gpl20的一种血清型的抗体与其他gpl20血清型交叉反应。在本发明的开发期间进行的实验确定了使用gpl20蛋白的任一种血清型的鼻内免疫产生高度交叉反应的IgG抗体。例如，产生的抗gpl2(W或gpl20s,的IgG抗体与异源血清型交叉反应，交叉反应的活性与对自体包膜蛋白的结合相当(参见图14C和14D)。因此，本发明提供了，使用gpl20血清型的粘膜免疫可诱导相当的免疫反应。因此，在一些实施方案中，NE佐剂可产生能够识别gpl20免疫原的可变和保守表位的IgG库(例如，参针对不同类型的HIV-1的保护性免疫)(参见，例如，Mascola，CurrMolMed2003;3(3):209-16)。实施例20pgl20/NE的鼻内施用产生在支气管和阴道粘膜表面中可检测的抗gpl2Q特异性IgA抗体。分析BAL液、阴道洗液和血清以估量粘膜反应。使用gpl20SF162/NE免疫的小鼠在BAL液中具有显著水平的gpl20SF162-特异性分泌性IgA和IgG抗体(参见图15A和15B)。与血清相似，IgA和IgG抗体都显示与异源gpl2(W免疫原交叉反应。也在血清和远处的粘膜位置检测到抗gp120BaLIgA抗体(例如，如在阴道洗液样品中测量的(参见图15C))。使用盐溶液中的任一种类型的gpl20的免疫不能产生可在BAL、血清和阴道分泌物中检测到的粘膜IgA和IgG反应。因此，本发明提供了，可响应使用用NE佐剂递送的抗原(例如，gpl20)的鼻内免疫而局部地(例如，在支气管粘膜中)和在远处的位置(例如，阴道分泌物)诱导显著的粘膜反应。实施例21细胞介导的免疫反应。通过抗原特异性T-细胞增殖测定以及T辅助类型细胞因子的产生的表征来体外估量细胞免疫反应。在来自用gpl2(W/NE免疫的动物的再刺激的脾淋巴细胞中检测到抗原特异性增殖反应，但在用gpl20B"/盐溶液免疫的小鼠或对照小鼠(单独用盐溶液或NE处理)中不存在该反应(参见图16A)。使用gpl2(W/NE的鼻内免疫产生强细胞介导的免疫反应，如通过脾IFN-y的产生所测量的(参见图16b)。使用gpl2(W或gpl20s,血清型的体外刺激产生对自体(BaL)和异源(SF162)类型的gpl20的高IFN-y反应。使用V3环的寡肽片段也获得IFN-y的显著诱导，这表明存在对于参与病毒结合和中和的优势表位(dominantepitope)是特异性的CTL(参见，例如，Kwong等人，Nature1998;393(6686):648-59;Takahashi等人，Science1992;255(5042):333-6)。抗原特异性诱导或IFN-y和缺少可检测的IL-4的表达证明了细胞免疫反应的Thl极化。在来自对照小鼠或用盐溶液中的gpl2(W免疫的小鼠的脾细胞中没有检测到细胞因子的显著表达。实施例22使用gpl20/NE的免疫诱导HIV-1中和抗体为了表征由粘膜免疫诱导的gp120-特异性抗体的潜在中和活性，对豚鼠施用两剂与1%NE混合的gpl20SF162。免疫在个体动物中产生显著的(虽然变化的)血清抗gpl20IgG抗体水平(参见图17A)。如在小鼠中所观察到的，豚鼠抗gp120IgG与异源gpl20免疫源交叉反应，就抗HIV-1的中和活性检测来自豚鼠的免疫血清。在具有8种病毒(包括3种实验室林系和5个原代HIV分离林)的组中估计中和反应的广度。在来自响应最高的动物的血清中检测到针对HIVSF162的自体M嗜性抹的最高中和滴度(NTs。)(NT5。=225)(参见图17B)。然而，还在两种其他动物中检测到显著的中和活性(NTs,50)，尽管抗gpl20IgG水平低得多。异源M嗜性林HIVBaL的中和作用在所有豚鼠中相当，NTs。大于50。对于T嗜性HIVMN病毒的实验室林系没有观察到中和作用。使用来自已接种的豚鼠的血清有效地中和了所有5个受试原代HIV分离株。对于原代HIV分离林的中和活性与两个实验室林系相当。取决于血清，BG1168.1、SS1196.11和3988.25的NTs。值在50至100的范围内。分离抹QH0692，42和5768.4被有效中和，NTs。值大于100。上述说明书中提及的所有出版物和专利通过引用合并入本文。本说将是显而易见的，不背离本发明的范围和精神。尽管结合特定:优选实施方案描述本发明，但应当理解，所要求保护的发明不应当过度地限定于此类特定的实施方案。事实上，对于相关领域技术人员来说显而易见的是，用于进行本发明的所述方法的各种修饰意在本发明的范围内。15权利要求1.在受试者中诱导针对正痘病毒的免疫反应的方法，该方法包括a)提供包含纳米乳剂和免疫原的组合物，其中所述免疫原包括被所述纳米乳剂灭活的正痘病毒；和b)在使所述受试者产生针对所述正痘病毒的免疫反应的条件下，对所述受试者施用所述组合物。2.权利要求1的方法，其中所述施用包括将所述受试者的粘膜表面与所述组合物接触。3.权利要求2的方法，其中所述粘膜表面包括鼻粘膜。4.权利要求1的方法，其中所述诱导免疫反应在所述受试者中诱导针对所述正痘病毒的免疫。5.权利要求4的方法，其中所述免疫包括全身性免疫。6.权利要求4的方法，其中所述免疫包括粘膜免疫。7.权利要求1的方法，其中所述免疫反应包括所述受试者中增加的INF-y的表达。8.权利要求1的方法，其中所述免疫反应包括针对所述灭活的正痘病毒的全身性IgG反应。9.权利要求1的方法，其中所述免疫反应包括针对所述灭活的正痘病毒的粘膜IgA反应。10.权利要求1的方法，其中在使10-103pfu的所述灭活病毒存在于对所述受试者施用的剂量中的条件下，对所述受试者施用被所述乳剂灭活的所述正痘病毒。11.权利要求1的方法，其中将10%的纳米乳剂溶液用于灭活所述痘苗病毒。12.权利要求l的方法，其中所迷纳米乳剂包含W2。5EC。13.权利要求l的方法，其中所述免疫保护所述受试者免于显示由所述正痘病毒引起的疾病的体征或症状。14.权利要求l的方法，其中所迷免疫保护所述受试者免于随后暴露于活正痘病毒的攻击。15.权利要求l的方法，其中所述组合物还包含佐剂。16.权利要求l的方法，其中所述受试者是人。17.权利要求l的方法，其中所述正痘病毒是痘苗病毒。18.权利要求13的方法，其中保护所述受试者免于显示天花的体征和症状。19.用于刺激免疫反应的组合物，其包含纳米乳剂和被所述纳米乳剂灭活的正痘病毒，其中配制所述组合物以使之在受试者中诱导对所述正痘病毒的免疫。20.权利要求19的组合物，其中所述纳米乳剂包含W2。SEC。21.权利要求19的组合物，其中当对所述受试者施用时，所述组合物为所述受试者提供10-103pfu的所述灭活的病毒。22.权利要求的组合物19，其中对所述受试者施用的所述组合物的剂量包含1%的纳米乳剂溶液。23.权利要求19的组合物，其中所述灭活的正痘病毒在所述纳米乳剂中是热稳定的。24.权利要求23的组合物，其中所述正痘病毒在所述纳米乳剂中稳定超过4周。25.权利要求19的组合物，其中在对受试者施用之前，稀释所述组合物。26.权利要求23的组合物，其中所述受试者是人。27.权利要求19的组合物，其中所述免疫是全身性免疫。28.权利要求19的组合物，其中所述免疫是粘膜免疫。29.权利要求19的组合物，其中所述组合物还包含佐剂。30,权利要求19的组合物，其中所述正痘病毒是痘苗病毒。31.权利要求19的组合物，其中所述正痘病毒选自类天花病毒、牛痘、猴痘、沙鼠痘和骆驼痘。32.包含用于刺激免疫反应的组合物和用于施用所述组合物的说明书的试剂盒，所述组合物包含纳米乳剂和被所述纳米乳剂灭活的正痘病毒，其中配制所述組合物以使之在受试者中诱导针对所述正痘病毒的免疫。33.权利要求32的试剂盒，其中所述正痘病毒是痘苗病毒。34.权利要求32的试剂盒，其中所述正痘病毒选自类天花病毒、牛痘、猴痘、沙鼠痘和骆驼痘。35.在受试者中诱导针对炭疽芽孢杆菌的免疫反应的方法，该方法包括a)提供包含纳米乳剂和免疫原的组合物，其中所述免疫原包括炭疽芽孢杆菌的重组保护性抗原(rPA);和b)在使所述受试者产生针对所述炭疽芽孢杆菌的免疫反应的条件下，对所述受试者施用所述组合物。36.权利要求35的方法，其中所述施用包括将所述受试者的粘膜表面与所述组合物接触。37.权利要求36的方法，其中所述粘膜表面包括鼻粘膜。38.权利要求35的方法，其中所述诱导免疫反应在所述受试者中诱导针对所述炭疽芽孢杆菌的免疫。39.权利要求38的方法，其中所述免疫包括全身性免疫。40.权利要求38的方法，其中所述免疫包括粘膜免疫。41.权利要求35的方法，其中所述免疫反应包括所述受试者中增加的INF-y的表达。42.权利要求35的方法，其中所述免疫反应包括对所述炭疽芽孢杆菌的全身性IgG反应。43.权利要求35的方法，其中所述免疫反应包括针对所迷炭疽芽孢杆菌的粘膜IgA反应。44.权利要求35的方法，其中所述组合物包含25-75jng的所述rPA。45.权利要求35的方法，其中所述述组合物包含10%的纳米乳剂溶液。46.权利要求35的方法，其中所述免疫保护所述受试者免于显示由炭疽芽孢杆菌引起的疾病的体征或症状。47.权利要求35的方法，其中所述免疫保护所述受试者免于随后暴露于活炭疽芽孢杆菌的攻击。48.权利要求35的方法，其中所述组合物还包含佐剂。49.权利要求48的方法，其中所述佐剂包含CpG寡核苷酸。50.权利要求35的方法，其中所述受试者是人。51.权利要求35的方法，其中所述免疫保护所述试者免于显示炭疽的体征和症状。52.用于刺激免疫反应的组合物，其包含纳米乳剂和炭疽芽孢杆菌的重组保护性抗原，其中配制所述组合物以使之在受试者中诱导针对所述炭疽芽孢杆菌的免疫。53.权利要求52的组合物，其中所述纳米乳剂包含W2Q5EC。54.权利要求52的组合物，其中当对所述受试者施用时，所述组合物为所述受试者提供25-75pg的所述重组保护性抗原。55.权利要求52的组合物，其中对所述受试者施用的所述组合物的剂量包含1%的纳米乳剂溶液。56.权利要求52的组合物，其中所述重組保护性抗原在所述纳米乳剂中是热稳定的。57.权利要求56的组合物，其中所述重組保护性抗原在所述纳米乳剂中稳定超过4周。58.权利要求52的组合物，其中在对受试者施用之前，稀释所述组合物。59.权利要求52的组合物，其中所述受试者是人。60.权利要求52的组合物，其中所述免疫是全身性免疫。61.权利要求52的组合物，其中所述免疫是粘膜免疫。62.权利要求52的组合物，其中所述组合物还包含佐剂。63.权利要求62的组合物，其中所述佐剂包含CpG寡核苷酸。64.包含用于刺激免疫反应的组合物和用于施用所述组合物的说明书的试剂盒，所述组合物包含纳米乳剂和炭疽芽孢杆菌的重组保护性抗原，其中配制所述组合物以使之在受试者中诱导针对所述炭疽芽孢杆菌的免疫。65.权利要求64的试剂盒，其还包括用于施用所述组合物的装置。66.权利要求65的试剂盒，其中所述装置选自鼻敷料器、注射器、鼻吸入器和鼻腔喷雾器。67.在受试者中诱导针对HIV的免疫反应的方法，该方法包括a)提供包含纳米乳剂和免疫原的组合物，其中所述免疫原包括重组gpl20;和b)在使所述受试者产生针对所述HIV的免疫反应的条件下，对所述受试者施用所述组合物。68.权利要求67的方法，其中所述施用包括将所述受试者的粘膜表面与所述组合物接触。69.权利要求68的方法，其中所述粘膜表面包括鼻粘膜。70.权利要求67的方法，其中所述诱导免疫反应在所述受试者中诱导针对所述HIV的免疫。71.权利要求70的方法，其中所述免疫包括全身性免疫。72.权利要求70的方法，其中所述免疫包括粘膜免疫。73.权利要求67的方法，其中所述免疫反应包括所述受试者中增加的INF-y的表达。74.权利要求67的方法，其中所述免疫反应包括针对所述HIV的全身性IgG反应。75.权利要求67的方法，其中所述免疫反应包括针对所述HIV的粘膜IgA反应。76.权利要求67的方法，其中所述组合物包含15-75ng的所述重组gpl20。77.权利要求67的方法，其中所述组合物包含10y。的纳米乳剂溶液。78.权利要求67的方法，其中所述免疫保护所述受试者免于显示由HIV引起的疾病的体征或症状。79.权利要求67的方法，其中所述免疫保护所述受试者免于随后暴露于活HIV的攻击。80.权利要求67的方法，其中所述组合物还包含佐剂。81.权利要求80的方法，其中所述佐剂包含CpG寡核苷酸。82.权利要求80的方法，其中所述佐剂包含单磷酰脂质A。83.权利要求67的方法，其中所述受试者是人。84.权利要求67的方法，其中所述免疫保护所述受试者免于显示AIDS的体征或症状。85.用于刺激免疫反应的组合物，其包含纳米乳剂和重组gp120，其中配制所述组合物以使之在受试者中诱导针对HIV的免疫。86.权利要求85的组合物，其中所述纳米乳剂包含W2。5EC。87.权利要求85的组合物，其中所述纳米乳剂包含X8P。88.权利要求85的组合物，其中当对所述受试者施用时，所述组合物为所述受试者提供15-75jug的所述重组gpl20。89.权利要求85的组合物，其中对所述受试者施用的所述组合物的剂量包含1%的纳米乳剂溶液。90.权利要求85的组合物，其中所述重组gpl20在所述纳米乳剂中是热稳定的。91.权利要求85的组合物，其中在对受试者施用之前，稀释所述组合物。92.权利要求85的组合物，其中所述受试者是人。93.权利要求85的组合物，其中所述免疫是全身性免疫。94.权利要求85的组合物，其中所述免疫是粘膜免疫。95.权利要求85的组合物，其中所述组合物还包含佐剂。96.权利要求95的组合物，其中所述佐剂包含CpG寡核苷酸。97.权利要求95的组合物，其中所述佐剂包含单磷酰脂质A。98.包含用于刺激免疫反应的组合物和用于施用所述组合物的说明书的试剂盒，所述组合物包含纳米乳剂和重组gpl20，其中配制所述组合物以使之在受试者中诱导针对HIV的免疫。99.权利要求98的试剂盒，其还包括用于施用所述组合物的装置。100.权利要求99的试剂盒，其中所述装置选自鼻敷料器、注射器、鼻吸入器和鼻腔喷雾器。全文摘要本发明提供了用于免疫反应的刺激的方法和组合物。特别地，本发明提供了用于将纳米乳剂化合物用作粘膜佐剂以诱导抗环境病原体的免疫的方法和组合物。因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含纳米乳剂和灭活的病原体或来源于所述病原体的蛋白质的纳米乳剂疫苗。因此本发明提供了提高的抗多种环境和人释放的病原体的疫苗。文档编号A61K31/22GK101466370SQ200780021901公开日2009年6月24日申请日期2007年4月13日优先权日2006年4月13日发明者A·比林斯卡,A·麦斯,小J·R·贝克尔申请人:密执安州立大学董事会