用于治疗神经性、神经变性和情绪障碍的水华束丝藻制剂、提取物及其纯化的组分的制作方法

专利名称：：用于治疗神经性、神经变性和情绪障碍的水华束丝藻制剂、提取物及其纯化的组分的制作方法用于治疗神经性、神经变性和情绪障碍的水华束丝藻制剂、提取物及其纯化的组分本申请涉及孩t藻类水华束丝藻(J《M"eRalfsexBorn.&Flah.Var.^wfle)(ATAKlamath)。更准确地，本发明提供了用于神经学的、神经变性的和情绪障碍或疾病的预防或治疗的AFAKlamath提⑩及其纯4W且分。
背景技术：
：苯乙斷EA)是通扭黑质紋状体系统的多巴胺育W申狄中苯丙氨^M^合成的内源'f她，并可作为;^中JL^i^胺神经传递的神经调节剂(1)。PEA最重要的作用是^i^t^^胺类的神经传递。已知PEA刺激乙^^)^^多^的释放(2)。jtb^卜，PEA增加去甲肾JJ^素神经传it(NE)(6)和甚至5-羟色胺的神经传递。最i^i揭示，PEA还与它特异的神狄受体一^作为自发的神经递质；并且它还作为真正的神经调节剂，在需要时还能抑制神经传递。(8)由此带来一系列效应刺激注意力科己忆；具有^^p郁活性的情绪改善；^it移十沐由此的社交，包括感情的和性的行为；抑制々識；减少对物质滥用和药物依赖的需求。PEA和感情性情绪之间的联系已经通过研究被确证，在抑郁个体中发舰PEA测量的或通it^j6i浆或尿中PEA的代谢产物PAA(苯乙酸)测量的PEAK平锁氐下。(9)在帕金森患者中可j^fitii浆直接测量的PEA7jC平M低下(12)。M些患者中神经传递(尤其是多巴胺能)的进行性的减少与黑质多巴胺育W申^L进行性的退姊关。在帕金森患者中PEA水平的斷氐伴随有MAO-B7jc平的平;ftit加，因此用于帕金森患者的药物是MAO-B抑制剂，例如司来吉兰。(14)jtk^卜，一J^i^v的4PEA肯膝易舰*脑屏障，即^^_低剂量也会刺激多Ci^从黑质汰状体组织中释改。这是一个重要的区别特征，由于目前使用的药物司来吉兰抑制MAO-B和多巴胺摄取的同时，对其从繁、质乡丈状体组织中的#^殳有<封可作用，因此它无助于产生更多的多巴胺，这一点在疾病诸如帕金森中是严重的限制，在该病中恰恰是多C^的产生受到了严重的危害。阿尔茨海默病涉及多巴胺产生和重摄^^L制的退化和故状体区翻申经元的进行,I^皮坏，时间过长*来多^f^申^L的^^t妙因此多C^"递的^7K平。(15)尽管关于ADHD(注意缺陷多动症)是神经变性疾病这一事实没有明确的资料，一些研究已经试图证明神^L的破坏是引起孩子和成年人ADHD的主要原因。(19)最重要的是有il^ii明，患有ADHD和学习无能的儿童的PEA水平^JH氐下(21)，并且因jtb^注意力(多巴胺)和镇静状态(血清素)的神经调节作用中有减少。逸tbl^什么选择用于ADHD的药物是苯嗛顿酸甲酯，一种PEA的合成衍生物，^L是通iil'j^t^生较多的PEA起作用(22)，并且因此产生更多的多巴胺和去曱肾JJ^素，两个直接涉^3UADHD的病因的神经逸贫。;0^斤周知^^笨异丙胺控制々;iM并从而控制体重。由于它们的副作用，它们^i^面的^^一:l^有^^义的，所述副作用^:itJ:^^时也会产生，it^f吏用易于变得潜在的非常严重。im过当前用于4I^^体重控制的主要药物的事实而被证实，所述药物是苯异丙胺类多e^能^^郁药，例如文拉法辛和安非他酮。这些分子，如所有的苯异丙胺，是PEA的合成衍生物。只要其通过MAO-B酶的降解净皮抑制，后者作为强效的^^抑制药。单胺氧4^(MAO)A和B催化CNS中和外周组织中作用于神经的和作用于血管的胺降解。MAO-B特别地与多C^能的传递直接和间接相关，它涉及多巴胺原发的神经性障碍，诸如抑郁症和情绪障碍、帕金森和阿尔茨海默病。由于该原因，MAO-B抑制剂4iUI于此类神经性障碍的治疗。(26)
发明内容本发明基于经鉴别的、微藻类水华束丝藻(j《wfleRalfsexBorn.&Flah.Var.yfos，^認e)(AFAKlainath)单独或组合的物质，在多种神经性疾病、病症、机能障碍或障碍，包桐申经退化性疾病诸如阿尔茨海,l^和帕金森病、多发硬4战、机能亢錄注意缺陷障多动症(ADHD)、5W虫症、抑郁症、记忆缺^Ht绪障碍中产生有益的效果。特别地，已经发现AFAKlamath孩緣除含有以多mt沐去曱肾上腺素能活性为特征的神经调节物质苯乙胺外，还含有特殊的衬，它们被4vU泉讶地证明^l单胺氧"l^B(MAO-B)非常有效的抑制剂，即a)特定的AFA-植物色素；b)AFA-'iya蛋白复合物，含有通过C-H^蛋白(C-PC)和藻红青蛋白(PEC，包括其^phycoyiolobilin或PVB)形成的藻胆蛋白W'AFA-^^蛋白")；C)絲菌素样^ll^^或MAA。这一发现非常重要，因为藻中含有PEA，除非通过MAO-B抑制剂得到保护，否则通过MAO-B酶消化^"很快被破坏。作为MAO-B选棒f生抑制剂的这些相同^S还具有强大的神经保护剂的作用，因jtb^增强提稀^ii神经性絲的能力。因ott^发明提供用于预防、控制或治疗上述神经性疾病、病症、才几能障碍或障碍的方法，通ii^需要其的患者施用AFAKlamath制剂，尤其是富集了这样的活性成分的提糊，或选自下述的分离和纯fti且分a)AFA植物色素，b)c-絲蛋白/藻红青蛋白(phycoerithrocyanins)复^/,如在AFA中或4i^可其它孩緣中存在的那样；c)絲菌素样^J^紫菜^l^shinorine,如在AFA中存在的或来源于^f射可其它藻的那样；d)或其混合物。^i^f,本发明的ATAKlamath4C^通it下述步^^制备a)冷冻新鲜采集的AFA藻并解冻，或如果初始材料是干燥的AFA粉末，超声处理7械,AFA粉末以石錄细胞；b)将步骤a)的产品离心以^i^定(含有大多数的细l^碎片)中分离上清'^(含有大多数的细IW部分)；c)收集含有水溶敏分的上清液。所得的产物是富集PEA和其它协同^^如ATA植物色素、AFA-'^jl蛋白、和MAA。例如，而Klamath孩緣PEA的天然舍量为2至4mg/gr，该J^提*将这一^^提高至9-llmg/gr的水平(HPLC分析)。进一步纯化该提取物是可能的，将其通it^滤系统，优选通过截留^量30.000道尔顿的膜。该^>虑保留物(提,A)含有作为主要活'l^且分的AFA蛋白(摩尔重量=121.000)和AFA-植物色素(摩尔重量480.000)。有趣的是，尽管MAA的^^量远小于要截留的M量，该保留物还增加了MAA的泉l。通过步骤a)至c)、即不经舰滤获得的J^^絲通常是伊遞的，狄因为其含有最合适量的PEA、AFA-植物色素、AFA-PC和MAA。jJ^卜，该^J^:,还含有例如叶绿素和胡萝卜素的物质，尽管比例斷氐了，仍有助于它的^Il4沐抗炎'歸。或者，AFAKlamath的活性组份，即复合的c-藻蓝蛋白/藻红青蛋白(C-PC/PEC)、AJA植物色素和MAA可以按以下进一步的描述^^离和纯化，并在##本发明的方法中使用。在^il的实施方案中，AFAKlamathC-PC/PEC复合物、AFA的植物色素和霉抱菌素样*11作组合的制剂同时或*给需要其的患者施用，在另一优选的实施方案中，这类的组^^剂含有苯乙断为附加的活性成分。在辆菌素样絲酸中，特别伊速shinorine和紫菜^t-334,因为它们在AFAKlamath微藻中^Nl对较高。所)C^到的单胺氧4t:^-B的抑制作用与增加多C^能传递和将PEA代#小4沐别相关。重要的是，植物色素和AFA-絲蛋白两者以可逆和';^^的方式抑制MAO-B，然而通过MAA的MAO-B抑制是竟争的和可逆的；因此，三种分子均确保在生理条降下的高度有效'^JL无副作用。另一方面，本发明涉及营养或药物组合物，其^"有AFAKlamath制品、其提取物或分离的组分，^W^先选自在AFA中存在的或来源于^f可其它徵藻的C-PC/PEC复合物或分离的C-PC和PEC单一组^;AFA植物色素;存在于AFA藻中或来源于^^其它藻的霉孢菌素样M酸紫菜，和shinorine;或其混合物；和^i^口入的苯乙胺。在舰的实施方案中，该营养组絲以片剂、胶嚢、饮料的形式作为M^卜充剂；^ii一步伊逸的实施方案中，该药物组^为片剂、胶嚢、小药嚢、糖浆、栓剂、小瓶^^软膏剂的形式，且可用于预防或治疗上述神经性或神经变性疾病或病症。才娥本发明的AFAKlama他液^^取物可按J^吏用或通过诸如冷冻干燥、喷雾干駄其类似方法干絲^^。该分离的活4^且分能^JU^^w4页域技^pV员/^口的技#下財法配制。活，^^且分的剂量取决于組^是否作为营养添加剂或作为药物制剂的预期用途。每个组分的有效量通常被包針下述范围之内PEA=0.1-100mg,5-30mg;植物色素=0.1-1000mg，0.8-10mg;MAA=0.1-1000mg,10-100;藻蓝蛋白=1-2500mg，50-1000mg。发明详述Klamath藻特有的植物色素类型"AFA-植物色素"的鉴定植物色素^jt感受器、植物用于探测光的色素并且它对可见光谱区域的红光和i^tL光敏感。它们^Nt物中具有多种不同的功能，包括控制开花(通过昼夜节#)、发芽和叶绿素的^^成。后者与AFA藻特别W目关，因为在AFA中这一特定类型的植物色素的存在可通过它缺乏其它的藻胆蛋白(通常被其它的蓝细菌用^^ft用过程中补足C-'^Ji蛋白(即别'iyi蛋白))而得到解释。而Klamath藻中别^^蛋白的位置^^l红青蛋白或PEC取^(如下所见)，有可能单独的PEC是不够的，尤其鉴于Klamath藻生活于非热带环境，需要高的M收^:率，因此AFA藻似乎用植物色素来#它们的较高的需求。所述的AFA植物色素具有独特的结构，^it匕第一次被描述。多年以来，多种植物色素^f直物中朝L^现，它们不^5L具有不同的植物色素基因(例如在;Mi内为3和在玉米内为6),但多数情况它们具有^^不同的蛋白质组#结构。它们成为藻色素是因为它们^H^！称为植物后胆色素的作为吸收光线的色基的相同胆蛋白，该^J^与絲蛋白的'絲素色基类似，以由4个吡咯环(四p比咯)的开放链组成的单个后胆色素分子为特征。更*^地，在它的Pr常态中，这个胆蛋白在最大650-670nM吸贱，而当^il光活4匕时，它转化成具有730nM的吸4錄大值的Pfr。*^现的第一个蓝细菌光敏色素(#^包藻的)，显示具有与植物色素相比弱的结构相似性。然而，姚藻的胆蛋白在它为红^/i^工色可逆色素蛋白的情况下而^it常认为是植物色素。(48)AFA植物色素的纯4沐鉴定AFA-植物色素具有作为色基的胆蛋白，^^吸4故^/敏色光语中的絲。为了确定它的结构和活性，我们通过下述^案纯化该植物色素-在10ml的pH7.0的磷酸二氩钾緩冲液中混悬lg提*一用一^^p、满旋2次1^4中-用2%TritonX100培养细月包35'-以28000rpm离心16-18h-在蔗糖密度步^#^收^]1清液-用厄平式转头转头在150000g离心梯度12h-在-20。C储存该植物色素对应于正橘黄色溶解产物带，在接近1M蔗糖处可见，而藻胆体为大约0.75M。两个带之间的关系给出了藻中存在的植物色素W量的可靠的证明，它是AFA-PC三聚物的4倍，后者是121Kd，我们能初步确立AFA-植物色素的MW大约480Kd(图22)。测定它的光吸收'l"錄，该植物色素显示在672nM和694nM有两个光吸收峰，其分别对应在平衡状态中的Pr(红光吸收)和Pfr(i^工光吸收)形式(附图23)。对于AFA中含有的植物色素量，我们首次"WK寻出下述初步结果:2mg/gr(或0.2%DW)。对于提取物，该浓度增加^^i^^取物中约为0.5。/。，且在提糊B中接近i0/。。这些是^i^度的，而该^^il^y抗炎效能非常强以至于即使非常小的量却能产生非常相关的作用。抗氧化活性该纯化的AFA-植物色素显示为一种非常有效的抗氡化剂。事实上，按^价值计算，它是到目前为jL^Mamath藻中发现的最有效的分子。用100|iiM的氧化剂CuCl2培育y^类血浆才羊本2小时产生增加水平的丙二^(MDA)，其为脂质itlL化反应的后期副产品,通过与硫代巴比土^应后用分i^tl计在535nm测量(TBA^i^)。当血浆与100jiM的CuCl2^f^有增加^i:的从ATA藻中提取的AFA4直物色素(2-16nM)在37。C培育2小时时，可)E^到MDA7JC平非常强的剂量絲性减少(附图24)。事实上，在仅16nM的AFA植物色素下，获得具有接赠照的MDA7JC平的脂itlL化的/L^完全的抑制。絲地，3.6nM的lCgo低于由PCB获得的45倍。基础提取物的抗氡4沐神经保护作用主要由所述的植物色素引起，其比AFA-PC的那些更强。MAA的提取、纯#定量我们测定Kkmath湖的蓝藻类7jc^^Ji藥(通常称之为Klamath藻)中MAA的存在。据我们所知，仅"^^近的才gil认为MAA存在于^^r种类的丝嚢'M中(47);然而，该^ii仅鉴定了作为MAA存在的紫菜聚瞎，而我们的研究显示存在两种MAA,紫菜^l^shinorine。另一方面，有关藻的所有相关文献，目前为止被^it的多数蓝细菌含有作为它们的初级MAA的shinorine，而我们发现在7j^^藻中除了shinorine，紫菜l^唐-334作为初级MAA极少出现。紫忠架糖-334Shinorine如先前才^1的那样提取MAA。(29)简而言之，AFA粉末20mg或7K^^^勿20mg在2ml的20。/。(v/v)甲Sl(HPLC级)7JC溶液中7JC浴45。C提取2.5小时，^离心(5000g;GS"15R离心机，Beckman，PaloAlto,USA)，将上清液蒸发至干并重新溶于2ml的100%甲醇，涡旋2-3min并在10000g离心10min。蒸^Lh清液并将该提取物重新溶于相同^、的0.2%的用于HPLC分析的醋酸或重新溶于200W用于^A化剂'I"錄"W的^^緩冲溶^(PBS)。将样品通过0,2nm孑Uf圣大小的注射器滤H(VWRInternational,Milan,Italy)进rffi^虑，然后用于HPLC分析或抗氧化剂'歸,见下文)。Klamath藻的MAA具有334nm的最大吸收。##文贼30),^JI装有AlltimaC18柱和保护^(4.6x250mmi.d.，5jimAlltech，Milan,Italy)的HPLC系统10(JascoCorporation,Tokyo,Japan)进一步纯化MAA。^r测波长为330nm;流动相为0.2%醋酸，；^i4^^4中l.Oml。通过与标准品例如Porphyra和Pterocladiasp.(其主^^有紫菜^^唐-334、shinorine和palythine，由DrManfredKlisch,Friedrich-Alexander-Universitat，Eriangen,德国友'If^助)tb^吸收光"if^保留时间鉴别MAA。样品的吸JR^镨用单波分^JL计(DU640，Beckman，PaloAlto，USA)在200nm至800nm之间测定。该初始镨图被传给电脑以对MAA的峰分析进行数学处理。MAA从前述AFA样品和7K提取物中部^fe化。用20%甲醇于45°。提^#品2小时导致在334nm有^的《>#^^^，尽管少量的光合色素(例如在620nm的藻蓝蛋白)通过该方法^U皮提科见附图1，虚线)。MAA样品进一步用100%甲醇处理，以移除蛋白质和盐，并最终用0.2醋酸移除非极性絲色素。所得的部^fe化的MAA在334nm具有最大吸》]^(附图1，实线)。通过HPLC进一步分析和纯化MAA，以发5IL^否在334nm有吸收的该化^7是MAA4^含有不止一种MAA的;^^。该样品的色谱图(附图2)在保留时间4.2(峰l)和7.6min显示了两种MAA的存在，其^fc^别鉴定为shinorine和紫菜^^唐-334。紫菜^t-334似乎是AFA中主要的MAA，因为shinorine仅以少J:存在(峰面积、比1:15)。纯化的MAA的UV光ifii实其最大吸收在334mn(附图3)。考虑剖shinorine和紫菜^lt-334在334nm的摩尔消光系lfc^别为44700和42300M^cm"，我们计算a)对于AFA藻，每克有0.49mgDW的shinorine和7.09mgDW的紫菜^1#-334的M;总MAA的^l^目当于0.76Vo的藻DW;b)对于J^4^C^物，MAA的M^17-21mg(为1.7-2.1%DW)。这些是重要的数据，如总AFA含有相对较高水平的MAA(0.76%DW)，几乎冲妄近UV照射下^JL的最大M,即0.84%。(31)我们ii^现该提^;与整个藻相比具有更高的浓度，达到的水平比最大的潜在j^l还高许多。MAA(shinorine和紫菜^^唐-334)是结构简单的衬，衬量为300。逸就能让这些7JC溶f生衬很容易通it^脑屏障，确保其在大多数需要的区域、脑表达它们的MAO-B抑制潜能。该提取称中存在的藻蓝蛋白舰为8-10%(对于定量，见T)。'蛋白^;斤有蓝细菌或蓝j綠的典型蓝色素，尽管对于每种M的孩緣具有独特的棒性。(32)对于藻蓝蛋白的功能和治疗棒)"生，目前研究多数集中于螺旋^rf緣中的那些。从螺放藻属中纯化的'g蛋白在不同的生理系统例如肝(37)、呼吸系统(38)和脑(39、40)中显示具有^lL化性(33)和抗炎性(34，35,36)。考虑到它们的实质相似性，来自螺it絲的纯化的PC的这类的'^^-"^还可归因于其它藻的的絲蛋白。虽然如此，源自不同孩緣的不同雜蛋白中存在种属特异f生差别，其在上述功能和治疗棒l"生的解释中可导致不同的效能。Klamath藻的藻胆体的结构确定和^#性~"^所，在完整的蓝藻细胞中藻蓝蛋白(PC)存在于、^2体功能形式(a(5)6中(41)。细l^皮碎^，##有才;1^分析，该蛋白育^不同的聚集状态(^^、二聚物、三聚物、六聚物)中^^现。就Klamath藻而言，提，及^4C^的纯化物含有的PC电泳分析，显示该蛋白多数存在于它的三聚体形式中(ap)3，总分子量为121000。一个ap单体^"量接近40000(18500亚单位a+21900亚单位p)。从螺旋藻中纯化FC的多数研究^i斥我们，螺J走藻中发现的该蛋白不是^^形式a卩。而^_其分子量约为37500。因jtM目对于从AFA中纯化的PC，显示了不同的聚集状态。AFA的藻胆体的色镨分析也已显示，正如在其它种蓝藻中，该PC的a亚单4ii^^个辅基而该P亚#^#合两个。该辅M色基被称为g素(PCB)ibl:该蛋白的蓝色和它的拔氡化作用的原因(42)。AFA和螺旋^;之间1^的不同^:在于藻胆体的不同结构。相对于螺旋ATAKkma也的藻胆体不含有别'g蛋白色素，但^"结合于结构组分的c-絲蛋白色素，其在螺it絲中是没有的，即藻红青蛋白(PEC)。FEC为絲色素，至4^X^7^lt量的蓝藻中被鉴定出(43)。PEC具有与FC非常相似的化学结构，由联合为^^三聚物的两个亚"^f立a和p的M^。然而，每个PC单体结合PCB的3个分子，而PEC具有将PCB两个分子和亚单位p结合和1分子的phycoviolobilin(PVB)与《亚^^#合的这一独一无二的特性，这是色素呈紫色的原因。il^t;^一次将Klamath藻的-^^^角定为是通过c--g蛋白和藻红青蛋白结^#定构成的，且AFAKlamath'^S^il—不同的定性结构增加了将AFA与螺v^藻相区别的进一步的决定性因素。附图4通过tb^AFA与其它那些熟知的蓝细菌、M藻PCC6803的菌体Hif组分，证实了已述内容。在蓝藻中，育睹到蓝色带^A该'l^a体，*AFA藻中该藻胆^^^m为低分子量，证实与通常孩煤如螺^L藻不同，AFA中藻胆体仅以-絲蛋白存在，而不"'j絲蛋白。jtM卜，该附图显示在AFA中还存在一个淡紫色带(箭头所示)，其为藻红青蛋白所特有的，这证明在Klamath藻的藻胆体中它们的存在。为加深定义，每个蓝色带通ii^"质^^义的HPLC(RP-HPLC-ESI-MS)进行进一步分析。由于不同的^f呆留时间，^S体的蛋白,^f并^^^^量鉴别。获得的结果如下表所示。首先我们看到在集胞藻中(表1)，藻蓝蛋白(cpcA在28.2min和cpcB在28.9min)和别^jl蛋白(apcA在30.7min和apcB在31.2min)^"在，而在AFA中^"'^J^蛋白(cpcA在28.8min和cpcB在30.0min)存在。其次，AFA中蛋白经鉴定衬量为19469,而在娜藻中不存在，其对应于连有两个后胆色素的藻红青蛋白的(5亚^fi(pecB在25.0min)。表l:存在于iy緣-^S体中的蛋白质<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>30.71786617280apcA(别藻蓝蛋白a亚单位)gi|26676531.21781617215apcB(别藻蓝蛋白(3亚单位)gi|266766表2:存在于AFAKlamath藻^a体中的蛋白质实测分子量预期分子量蛋白质[同源的有机体NCBI访问号15.2903189258895假拟蛋白Avar03000795[多变鱼腥藻ATCC29413]cpcDf备珠藻PCC71201gi|45510540gi|13174025.019469193081828418370pecB:藻红青蛋白p链l念珠条PCC7120]假拟蛋白Avar03000787(pecB)多变鱼腥藻ATCC29413gi|548504gi|4551053226.431044301243207832219312953130429333cpcC[备珠藻PCC7120]假拟蛋白Avar03000794(杆状连接基Mw32000)[多变鱼腥藻ATCC29413]pecC[念珠藻PCC7120假拟蛋白Avar03000789(pecC)[多变鱼腥藻ATCC29413假拟蛋白Avar03000801(cpcG4)[多变鱼腥藻ATCC29413]gi|20141679gi|45510539gi|464511gi|45510534gi|4613543626.82611928637假拟蛋白Avar03000799(cpcG2)f多变鱼腥藻ATCC294131gi|4551054427.81099410986fdxH2:植物性铁氧化还原蛋白『多变鱼腥藻lgi|l16967328.81771417457cpcA备珠藻PCC7120Jgi|995731930.019222183备珠藻PCC71201gi|38894这一独特的结构^^^^整个AFA-PC相对于它的PCB具有更强的抗^IU沐抗炎作用的重要因素。在其产生强神经^Ht用的范围内，^!U沐抗炎特性变得与这一内斜目关；关于神经^^整个PC较它的PCB还^7强大，其清楚表明在藻胆体中除了PCB的其它活'l^i且分，即带有特殊的PVB色基的PEC4睹可育blAFA-PC中具有最有活性的^:改"l^素物质。通ii^L^纯^l寻到的提取物的光ifii明该纯化的AFA-PC事实上不仅含有带有PCB色基的C-PC，还有PEC和它的PVB色勤附图5)。事实上，C-PC的最大吸收为620nm,其在附图5谱图中4^L为峰的最高点。但是PEC的最大吸收已知a-亚^i(phycoviolobilin或PVB)为566nm和两个p-亚单位的PCB分别为593nm和639nm。的确存在于钟形峰的i^^Ki构成PC纯化物的光谱图。鉴于在AFA藻中C-PC和PEC之间的强i^4^,断开，这证明除了C-PC，PEC也是纯化的PC提取物必不可少的-^分。反it^说明从AFA中得到的PC与从其它蓝细菌，包括AU9f究最多的螺旋藻中得到的PC，在结构和功育U^显著不同；并皿些不同在于仅有一部分是共同的，即C-PC，而不是別的；作为结果，虽然C-PC的'M也可归结为AFA-PC的C-PC组分，但源于AFA的整个PC的'l^t，在它的C-PC/PEC复*(包括它的PCB和PVB色基)中，是它(和在其它^f可孩緣中存在的^f可C-PC/PEC复^)专属的。纯化方法(附图5)PC从干燥的AFA提:^中^(口下所ii^化-混悬S00mg的提^4勿于50ml的100mM的pH7.4的4iW^it緩冲溶液中；-在4。C、2500rpm离心10，；剛收^Ji清液并加入固态石l^铵至50%^*;-在4。C^i定蛋白质60min并持续^lf样品；-在4°C、10,000rpm离心30min;-弃去澄清无色的上清液并将蓝色沉淀物再混悬于小^、的5mM、pH7.4的钠-#緩冲溶液中；-在4'c对这一同样的緩沖';^t析过泉"^it析的PC上样于羟基磷灰石柱，用5mM、pH7.4的钠^^UL緩冲溶液平衡-用离子^JLi^^f增力口(从5至150mM)的pH7.0的钠"^^^L緩冲液'皿该样口，P口，画收^^且^^并用^^Ubl计在620nm和280nm读取^Ut率；-收集Abs620/Abs280>4(纯化PC的指数)的部分；-在4。C用賴和度50%的减酸铵iJ^定PC1小时；-在4°C10,000rpm离心30';-弃去上清液并将PC混悬于pH7.4的150mM钠-裤,緩冲溶液中；-在4"C对这一同样的緩冲液透析；-将纯化的PC移至烧瓶内并于暗处+4。C或-20。C保存。蛋白的定量为了测定纯PC的摩尔M,我们^JI在620nm的摩尔消光系数￡，对于(01卩)3三聚物形式其等于770000M^cnT1。这^^未着1M的PC溶液在620nm具有770000的吸收值。我们用在620nm的为70Ig"cnT1比消光系数E测定PC在提取物中的泉复。这意味着含有1%(即为lg/100ml)的PC溶^/jt620nm吸收为70。基于il些计算结果，提取物中PC的平均"^J:等于80-100mg/gDW(8-10%DW)。PCB色基的纯化(附图6).将500mg提#混悬于50ml蒸馏水中。'在4。C2500rpm离心10'。-轻轻倒出深兰色上清液并用1。/。三氯乙酸沉淀PC。-搅拌下在暗处于4。C培养1小时。在4°C10000rpm离心30'。.收集含有PC的片状^i定物并用甲醇洗涤3次。-将该片状^i定物再混悬于含有lmg/mlHgCb的曱醇中。.在暗处于42。C培养20h以从PC中释i文PCB。.2500rpm离心10'除去蛋白质。.祸^"有PCB的上清液中加入p-3tt乙斷ljil/ml)以沉^定HgCl2。-在-20。〇培养2411。.在4。Cl0000rpm离心30'除去白色^D定。.在上清液中加入10ml二氯甲銜丁醇(2:l,v/v)。.用20ml蒸馏7jC洗'絲3000rpm离心10'。餘去J^g，收集含有PCB的下层部分。.洗涤在15ml水中的PCB三次。,氮下干燥^H^存于-20'C。通过AFAKLAMATH提^^勿及其《赋的活性物质植物色素、'^^蛋白和MAAMAO-B的抑制作用我们^^]特殊的底物千斷1mM)，了l-^RM;的MAO-B抑制活性。该i^^用分it^A计在30°C波长250rnn测定，通过由上述步骤a)至c)制备的提取物不同浓度的水溶液和脂溶性组分预培养MAO-B(2照/ml)(初始浓度10mg/ml)。用水再混悬水提取物并离心后收集上清液制备7條1^且分富集的提取物。将提糊再混悬于丙酮中得到脂溶f生成分富集的可溶I^^稀；然后将上清液干燥，并将该片状:^定物再混悬于适合MAO-B的剂量的溶剂DMSO中。如附图7A所示，7Ki^4i且分以剂量絲性方式抑制MAO-B，而脂溶^i且分不4中制该酶。AFA^^^4勿水溶l^且分是强效的选棒l"生MAO-B抑制剂，IC幼为6.9^1。它的MAO-B选棒l"生为4(1CSOMAO-B/ICSOMAO-A>4.05)(附图7B)。附图8的Lineweaver-Burk图显示该抑制与竟争的关系是可逆的和濕合性的，伴随Vmax减少和Michaelis-Menten的Km常数的增加。以AFA提取物水溶性部分的i3iE^l对斜辦图求得lpL抑制常数Ki。对照J^^珊的7jC溶l"生成分，低Kj值表明对MAO-B酶高亲和力。提城的抑制作用是可逆的这一事实，意味着它仿真地实^i理活性却魏了副作用。至于:^^竟争，4贿可f^L由于提糊的^^生，其包含不同功能的衬，一些是竟争性的而一些是非竟争性的。该提糊主要活性成分是这些我们逐"H緣怍为MAO-B抑制剂的AFA-^物色素((K5。/。DW)、'g蛋白(8"10。/。DW)和MAA或B菌素样^J^(1.7-2.1%DW)。-皿蛋白对MAO-B的抑制作用17该试验用分ibt/l计在30°C波长250nm处测量，用节胺作为底物,用从AFA中得到的纯化PC的多种浓度(0.5-4pM)预培养MAO-B。如附图9所示，AFA-PC导致MAO-B活性的剂量絲性减少，ICso为1.44pM。AFA-PC的MAO-B选棒〖生大于3.5(IC50MAO-B/IC50MAO-A>3.5)。附图10的Lineweaver-Burk图显示，对于该提取物，抑制作用是可逆的并为混合1"生(竟#非竟争)，具有变化的Vmax和Km。通过4P1"率对PC^yL作图我们得到抑制常数Ki值，jH^h为1.06^M。该抑制常ltl^量对酶的抑制剂的亲和力'.高的Ki值说明对酶的亲和力低并反之亦然。在该实例中，低KjM示AFAPC对MAO-B的高亲和力。MAA对MAO-B的抑制作用节胺底物的MAO-B活性，被"W与^i^t^4勿中用20%甲醇先前纯化的MAA^^增加(0.5-8pM)有关。附图11显示MAA对MAO-B抑制的剂量，性，ICso为1.98jiM。MAA的MAO-B选棒性大于2(rCsoMAO-B/IC5()MAO-A>2.02)。Lineweaver-Burk图(附图12)显示该抑制是可逆的和竟争性的，伴随Km增力口，但V,没有改变。M示MAA，由于它的化学结构，与底物竟争与酶的活性位点结合。#^率对MAA的浓度作图(附图13)，我们得到抑制常数Ki值为0.585jiM，证明了对酶具有非常高的亲和力。AFA植物色素对MAO-B的抑制作用通过分^Jt^计在30°C波长250nm处测量，用千胺怍为底物,用纯化的ATA植物色素的多种浓度(8.3-66.411]\1)预培养脆0-:8。如附图15所示，AFA植物色素导致MAO-B活性的剂量,性减少，ICSJ^20.2nM。附图16的Lineweaver-Burk图显示，对于该提取物，抑制作用是;^^H生(竟争性和非竟争性的)可逆的具有可变的V,和Km。冊率对AFA植物色素^^作图我们得到抑制常数Ki值，jtb^为10.48nM。该抑制常数:对酶的抑制剂的亲和力高的Kj值说明对酶的亲和力低并反之亦然。在该实例中，非常低的Ki值显示AFA植物色素对MAO-B具有非常高的亲和力。18MAA的竟争I"沐可逆的作用使得这些^"^对MAO-B的抑制非常强效。事实上，对MAO-B抑制的竟^可逆特性同时保证了高效、生理学的和没有副作用的活性。^^it个意:OL，包M提取吻中的MAA，也是由于它们的^J^由it膝易穿it^脑屏障的能力，而构成了一个决定性的组分，甚^^体内，也以便产生衍生于MAO-B抑制的疗效。甚至不仫是MAA，植物色素被证实为^_今已知物质中最强大的MAOB抑制剂。对MAO-B酶有非常高的亲和力，且它在纳摩尔剂量的有效抑制，使得该M不^L^身是完美的治疗剂，并皿一因素似乎为AFA提取称(们)的高度的神经学有效性提供了最重要的贡献。另外一些关于MAA和植物色素的考虑M用于^^蛋白的体内行为。我们知道PC在体内对脑产生神经保护作用，因此它们能穿iti^脑屏障。(44)这说明它们也^^体内脑部实现它们对MAO-B的抑制活性。色基的分子量实际上仅700，并不大于MAA的分子量。对于植物色素的色基、结构类似于藻蓝素的植物后胆色素同样如此。总之，就提取物的部分和它的活'hii且分、AFA植物色素、AFA-PC和MAA而言，MAO-B的抑制活性是十射目关的，无论A^"W^L提絲^^有高活性7K平、活性水平相当于或高于药理学物质，并^^优于^f可4皮测试的天然^S如下表所示(45):表3来自已知合成和天粉中制剂的MAO-B抑制的tb^动力学^I^C5o和Ki)。MAO-B抑制剂IC50Ki抑制类型得普尼林0.3l岸0.002jiM不可逆表儿茶酸58.9pM21,混合性儿茶酚88.6pM74|nM混合性非p合尔满生物碱6.47|iiM1.12一混合性苯旅丙烷91.3nM79.9|uM竟争性芍药醇42.5jiM38.2,竟争性19大黄素35.4pM15.1pM混合性AFA藻蓝蛋白1.44,1.06,混合性AFAMAA1.98pM0.585|iiM竟争性AFA植物色素0.02jiMO.OlOjuM混合性如^^斤示，^^-絲蛋白和MAA的ICso^^:高于1jlM，这非常接近于得普>^(0.31^11\1)，且10倍量仍低于考虑的其它分子的IC50。另一方面，AFA植物色素15倍量的IC50仍低于##厄沐。对if^"抑制剂亲和力的抑制常数Ki同样如此。AFA--絲蛋白的Ki在lnM附近，类似^4和烟草中的非哈尔满生物^ef旦是当然没有与这两个物质相伴的4射可问题)。另一方面，MAA、AFA植物色素和纟l"f;^木均为具有小于1的Ki的^的分子，所以对MAO-B有非常高的亲和力。事实上，afa植物色素是除了司来吉兰/#^;^木贿的天然衬，它的Ki为纳摩尔数量级。然而，在司来吉兰/^fv^M^AFA提城衬之间存在本质的区别前者为不可逆的抑制剂，因此由潜在的副作用表征；而AFAKlamath的MAOB抑制衬均为可逆的，由生理性活'l"4J^i，^^在与合成的^"相伴的问题。附图14图解显示了与得普;L^目关的AFA的三种分子的MAO-B抑制活性。给出了J^CW(和其它的AFA提糊)中三种衬的协同作用，总体4^R取物的MAO-B抑制活性结果非常高。一些物质;l^^相关的，也是由于其中存在的高含量的PEA。如^/们以它们的PC^f为勤^b^^C^和得普M，我们得到l^^,iiJiJlC50的PC剂量^^0.05nM，ii4明它的效能是4f^M的7.5^(ibl^然物质的10倍之多)。重要的是鉴于^R^;中含有的植物色素的效能事实上7.5倍是PC和MAA抑制效能的平均值，其略低于《ff厄沐，且该植物色素的比15M多(附图17)。il^^明了关于绅/f匕的AFA-PC的提取物的较高效能^^要是由于植物色素。jH^卜，该提*仍##天然物质生理学作用的优点，它们的MAO-B抑制作用^:可逆的JLiJI^^竟争'l"生的，逸，^殳有与不可逆^"例如##;^^其它合成物质伴随的潜在副作用。(46)该提取物进一步的优点是它高衬的苯乙胺，苯乙胺是一种强大的多C^能神经调节剂，其与其它M产生总的协同作用，该协同作用我们可积自口下，后再才聂^M"有双重的多C^能活性；-植物色素、MAA和藻蓝蛋白作为强大的MAO-B抑制剂，在减少MAO-B活性的范围内还增加多巴胺能性传递，这意^M神^^寿命更长，包括多e^。-植物色素、MAA和'絲蛋白作为MAO-B抑制剂，还延长了苯乙胺的寿命和活性，i^它本身MAO-B酶的^l^活性的目的所在，并由此建立了良性循环，进一步支持多巴胺能性传iiA^性^t过PEA产生更广泛的神经调节。-最后，藻蓝蛋白强大的抗氧4沐抗炎活性，和它们或它们色基的能穿过血-脑屏障的能力i;和植物色素非常高的抗氧化性和MAA稍逊的却仍^的抗氧化活性，产生了神经保护作用，保护了不同的活性衬并建立了更广泛的神经学上的良性循环，以远离4射可氧化和炎性损伤。神经保护我们已经试验了ATA提取物、特别的AFA-PC和它的色基PCB以及MAA对谷氨酸的神经毒l"生作用的神经4呆护特性。谷氨^^哺乳动物中才^申经系统的主^^奋f勤申经iM,^f旦^^徊申^ib它的NMDA亚型受体的it^'J激会触发Ca2+的大量细胞内积聚，导致细月^L亡。此外NMDA受体刺'^^^立体内Ca"聚集，暂时增加细月&^质中游离的C,活化了氧化氮械的(NOS)神狄同种型(49),氧化氮^il是形成氧化氮(NO)(主要存在于初船申^it0或它的过氧化物(O2-)反应产物过氧化ilE^g(ONOO-)。经^^欲良的方法暴叙申^L于^i^(50):撤离培养基，用37'C预热的緩冲的Hanks，溶^(5.26mMKC1,0.43mMKH2H2P04，132.4mMNaCl，4.09mMNaHC03,0.33mMNa2HP04，20mM葡萄糖，2mMCaCl2,和20mM孤PES，pH7.4)沖洗神经元一次，随后在不含有或含有AFA提取物(1-50nM)、PC(10-1000nM)、PCB(IO-IOOOnM)和MAA(l-lOfiM)、;^:的37。C预热的緩冲的Hanks，溶液中预培养，预培养30分钟后，将lOOpM^U^液的L^^^船口A^100nM加10nM的甘氨酸终溶液中，神经元于37。C培养15分钟，PI^^L緩冲液，用DMEM培养^^代，使细M无^物存在的情况下37。C培养24小时。通过DAPI的细自染色法^H古细胞的禾I^性死亡(50)，可透iiM的焚光染料与DNA的结合，可以定量凋亡的神经元，即神^^示>^^核。简迷之，接触谷氨酸24小时，用热的PBS(37。C)冲洗神经元的培养基，并且用含有4。/0(wiVol)多聚曱醛的PBS室温下固定30分钟。用PBS沖洗后，将细胞于黑暗中室温下接触3pM的DAPI10分钟，！^再用PBS緩沖液冲洗两次。使用萤光1±>虑#(330-380'毅;30X放大)，通过焚it^樣M^^染^凝糾细^ii行打分，计釓悉数和凋亡的细皿。在所有的情况下，通过计数员盲法的实^i殳计，大约fe^孔600-1,000个细J&ifrH"数，单独培养的测量一式两伤进行，培养制品的lit量的结果以S.E.M值的平均lfc4示，结果的统计分析通过Kruskal-Wallis检验接着通iii:小M差异多范围^r测法进行确定，在所有情况下，".05被认通过谷氨酸损伤实验，我们第一时间得出了AFAJ^4C^、AFA-PC、它的PCB和MAA的神经保护能力，如图18所示，谷氨酸的加入使得被培养的神狄细月&^踏性细亡增加到22.9%±3n=4(p<0.05)的水平；而AFA1^€取物的同时加入则产生了非常高的:^^酸毒性的保护作用，其斷氐了细l^i序性死亡的7jc平，低于对照水平(6.3%±1p>0.05)只^^J了相当于lnM数量的提糊(结果为3至8种不同细月姊养物的平均feSEM，弁与对照組比较具有^差异(p<0.05);*与^^l且比较具錄差^(p,.05)。至于MAA所提供的保护作用，它们也斷氐了细月fef錄性死亡的水平，低于对照水平使用了更高的剂量ljiM(图19),结果为3至8种不同细l&^养物的平均feSEM，弁与对照组HS^具有^J1差麵<0.05);*与^^酸对照1^^具M差麵〈0.05))。关于AFA-PC和PCB，我们发现它们抑制细月&I^性死亡的作用是非常相似的它们的加入制氐了细胞程序性死亡的程度低于对照7jC平，使用大约10nM的剂量(图20和21-结果是3至8种不同细月膽^^的平均feSEM,#与对照组比较具有^1差^(<0.05);*与谷氨酸对照》b^具有^差^(p0.05))。AFA-PC与PCB的抑制程度;J^t相当，这多少有点ihA惊讶，因为PCB被认为A^i要的活性成分，如^ii行纯^i^进一步浓缩，应比作为活')^i且分的整22个衬具有更强的活性，实际上它具有同样的效能的事实奮M整个PC中存在着，可能实际上比PCB自己更强效的，因子。我们知道整个PC分子，除了C-PC和它的PCB色基，还由PEC组成，它含有PCB和PVB(phycoviolobilin)作为它的色基，因此，我们可以推测产生纯化后的PCB与整个PCM之间的效育^^差异的因素，明显是因为PEC组分，特别是它的PVB色基，它被iM是非常强的^IU匕剂。神经保护的方面，MAA似乎^^^弱于PC和PCB的作用，但;ljiL强的神经保护剂明显是整个AFA提絲，它能够在仅仅lnM(纳摩尔)就完全抑制细胞的考誘性死亡，10倍于PC和PCB的效能。这当然可解释为整个AFA提^^l4勿中的许多不同的^lL化因子的协同作用，而我们如上可知AFA植物色素可負暖i!4^为止最强的^lt^:剂，仅仅16纳摩尔几乎完4^^制MDA(后期脂质it^化副产物)的形成，很可能AFA植物色素在解释1^^絲的更高效能时是一个更重要的因素。我们可如此断定AFA植物色素如^M封可所有的植物色素都是重要的神经l呆护剂。参考文献1.ZhouG.等，PlateletmonoamineoxidaseBandplasmaP-phenylethylamineinParkinson'sdisease,inJNeurolNeurosurgPsychiatry,2001;70:229-231，229.2.lspidaK.等，P-phenylethylaminestimulatesstriatalacetylcolinereleasethroughactivationoftheAMPAglutamatergicpathway,inBiolPharmBull2005S印.；28(9):1626-9.3.BarrosoN.,RodriguezM.，Actionofp-phenylethylamineandrelatedaminesonnigrostriataldopamineneurotransmission,inEuropeanJournalofPharmacology,297(1996)，195-203，200.4.DyckLE.，Releaseofmonoaminesfromstriatalslicesbyphenelzineandp-phenylethylamine，inProgNeuropsychopharmacolBiolPsychiatry,1983，7:797-800;PhilipsS.R.，RobsonA.M.,Invivoreleaseofendogenous23dopaminefromratcaudatenucleusbyphenylethylamiiie，inNeuropharmacology1983，22:1297-1301;Raitierim.，等，Effectofsympathomimeticaminesonthesynaptosomaltransportofnoradrenaline,dopamineand5-hydroxytryptamine,inEurJPharmacol1977,41:133-143.5.JanssenP.A.J,等，Doesphenylethylamineactasanendogenousamphetamineinsomepatients,inInternationalJournalofNeuropsychopharmacology1999,2:229-240，232.6.PatersonI.A.等,2-phenylethylamine:amodulatorofcatecholaminetransmissioninthemammaliancentralnervoussystem,inJournalofNeurochemistry(1990)，55:1827-1837.7.SabelliH.C，JavaidI.J.，PhenylethylamineModulationofAffect:TherapeuticandDiagnosticImplications,inJournalofNeuropsychiatry(1995)，7(1):6-14，7.8.MauroFederici等,TraceAminesDepressGababResponseInDopaminergicNeuronsByInhibitingGirkChannels,inMolecularPharmacologyFastForward.PublishedonJanuary11，2005asdoi:10.1124/moU04.007427.9.GusovskyF.等，Ahighpressareliquidchromatographymethodforplasmaphenylaceticacid,aputativemarkerfordepressivedisorders,inAnalBiochem,1985Feb.15;145(1):101-5。在这一研究中，抑郁症患者的血浆PAA水平是327.64+/-45.44ng/ml,而对照组是536.18+/-54.99ng/ml。在另一研究中，观察到抑郁患者的尿平均PAA是66+/-23mg/die，而非抑郁患者是104+/-23mg/die,参见SabelliHC.等，Urinaryphenylaceticacidinpanicdisorderwithandwithoutdepression,inActaPsychiatrScand1990Jul;82(l):14-6.10.SzaboA,等,Phenylethylamine,apossiblelinktotheantidepressanteffectsofexercise,inBrJSportsMed2001Oct;2435(5):342-3.11.SabelliH等，SustainedantidepressanteffectofPEAreplacement,inJNeuropsychiatryClinNeurosci,8(2):168-71.12.MiuraY.,Plasmap-phenylethylamineinParkinson'sdisease,inKurumeMedJ2000;47(4):267-72.13.Ibid"14.EbadiM.等，Neuroprotectiveactionsofselegiline,inJNeurosciRes2002Feb1;67(3):285-289.15.KemppainenN.等,DifferentpatternofreductionofstriataldopaminereuptakesitesinAlzheimer'sdiseaseandageing,inJNeuralTransm2001;108(7):827-36.16.KnollJ.,(-)Deprenyl(Selegiline):past,presentandfuture,inNeurobiology(Bp)2000;8(2):179-99.17.KnollJ.，Thepharmacologicalbasisofthebeneficialeffectsof(-)deprenyl(selegiline)inParkinson'sandAlzheimer'sdiseases,inJNeuralTransmSuppl1993;40:69-91.18.RimbauV.，等，ProtectiveeffectsofC-phycoeyaninagainstkainicacid-inducedneuronaldamageinrathippocampus,inNeurosciLett1999Dec3;276(2):75-8.在这一研究中，使用了螺旋微藻的藻蓝蛋白，而来自Klamath藻的藻蓝蛋白则与之不同，裙J武予了更高的抗氧化活性。可参见BenedettiS.，ScoglioS.,CanestrariF.，等，Antioxydantpropertiesofanovelphycocyaninextractfromtheblue-greenalgaAphanizomenonFlosAquae,inLifeSciences,75(2004):2353-2362.19.SwansonJ.等，Cognitiveneuroscienceofattentiondeficithyperactivitydisorderandhyperkineticdisorder,inCurrOpinNeurobiol.1998Apr;8(2):263-71.20.CitazionesolodiBenedetti等LifeSeience;omenzionedelparallelobrevettoAttendereI，annoprovisionalinattesadieffettuarestudisullaneuroprotezione21.KusagaA.，Decreasedp-phenylethylamineinurineofchildrenwithattentiondeficithyperactivitydisorderandautisticdisorder,inNoToHattatsu2002May;34(3):243-8;MatsuishiT，YamashitaY.，Neurochemicalandneurotransmitterstudiesinpatientswithlearningdisabilities,inNoToHattatsu1999May;31(3):245-8.22.KusagaA.等,IncreasedurinephenylethylamineaftermethylphenidatetreatmentinchildrenwithADHD，inAnnNeurol2002S印;52(3):372-4.23.JainAK，等,BupropionSRvs.placeboforweightlossinobesepatientswithdepressivesymptoms,inObesRes.2002Oct;10(10):1049-56.24.Rudolph等,Arandomized,placebo-controlled,dose-responsetrialofvenlafaxinehydrochlorideinthetreatmentofmajordepression,inJClinPsychiatry(1998);59(3):116-22.25.PEA是一脂溶性分子，易受热破坏，这意味着高温干燥法较冷冻干燥法，具有较低含量的PEA。发现利用偏流窗⑧方法干燥的藻中PEA含量最高，基a取物是通过这种藻而实现的。26.YamadaM.等，ClinicalPharmacologyofMAOInhibitors:SafetyandFuture,inNeurotoxicology2004;25:215-21;YoudimM.，等，TherapeuticApplicationsofSelectiveandNon-SelectiveInhibitorsofMonoamineOxidaseAandBthatdonotCauseSignificantTyraminePotentiation,inNeurotoxicology2004;25:243-50.27.GronigerA等，Photoprotectivecompoundsincyanobacteria，phytoplanktonandmacroalgae-adatabase,inJPhotochemPhotobiolB.2000Nov;58(2-3):115-22.28.SuhHJ等,Mycosporineglycineprotectsbiologicalsystemsagainstphotodynamicdamagebyquenchingsingletoxygenwithahighefficiency,inPhotochemPhotobiol.2003Aug;78(2):109-13.2629.GronigerA等,Photoprotectivecompoundsincyanobacteria,phytoplanktonandmacroalgae-adatabase,inJPhotochemPhotobiolB.2000Nov;58(2-3):115國22.30.SinhaRP等，Inductionofmycosporine-likeaminoacids(MAAs)incyanobacteriabysolarultraviolet-Bradiation,inJPhotochemPhotobiolB.2001Jul;60(2-3):129-35.31.Garcia-PichelF等,OccurrenceofUV-Absorbing,Mycosporine-LikeCompoundsamongCyanobacterialIsolatesandanEstimateofTheirScreeningCapacity,inApplEnvironMicrobiol.1993Jan;59(l):163-169.32.GlazerA.N.,Phycobiliproteins，inMethodsEnzymol，1988，167:291-303.33.BhatV.B.，等,C-phycocyanin:apotentperoxylradicalscavengerinvivoandinvitro,inBiochemBiophysResCommun.,2000;275(1):20誦25;Romay，C.等，AntioxidantandantinflammatorypropertiesofC-phycocyaninfromblue-greenalgae,inInflammRes,1998，Jan.;47(1》36-41.34.ReddyC.M.,等，SelectiveInhibitionofcyclooxygenase-2byC-phycocyanin,inBiochemBiophysResCommun.2000;277(3):599-603.35.GonzalesR.,等，Anti-inflammatoryactivityofphycocyaninextractinaceticacidinducedcolitisinrats,inPharmacolRes，1999;39(1》55-9.36.GonzalesR.，等,Anti-inflammatoryactivityofphycocyaninextractinaceticacidinducedcolitisinrats,inPharmacolRes,1999;39(1):55-9.37.VadirajaBB.等,HepatoprotectiveeffectofC-phycocyanin:protectionforcarbontetrachlorideandR-(+)-pulegone-mediatedhepatotoxictyinrats,inBiochemBiophysResCommun,1998;249(2):428-31.38.RomayC，等,PhycocyaninextractreducesleukotrieneB4levelsinarachidonicinducedmouse-earinflammationtest,inJPharmPharmacol.1999,51(5):641-42.Comeenoto,illeucotrieneB4eunodeifattoriprincipalmenteresponsabilidipatologierespiratoriequaliasmaeallergie.39.RimbauV.，等，ProtectiveeffectsofC-phycocyaninagainstkainicacid-inducedneuronaldamageinrathippocampus,inNeurosciLett1999，276(2):75-8.40.RimbauV.等,C-phycocyaninprotectscerebellargranulecellsfromlowpotassium/serumdeprivation-inducedapoptosis,inNaunynSchmiedebergsArchPharmacol2001;364(2):96-104.41.GlazerA.N.，Phycobilisomes，inMethodsEnzymol1988，167;304-312.42.HirataT.，等,AntioxidantavtivitiesofphycocyanobilinpreparedfromSpirulinaplatensis,inJApplPhycol2000,12:435-439.43.FuglistallerP.，等，IsolationandcharacterizationofphycoerythrocyaninandchromaticadptationofthethermophiliccyanobacteriumMastigocladuslaminosus，inArchMicrobiol1981，129:268-274.44.RimbauV.，等,ProtectiveeffectsofC-phycocyaninagainstkainicacid-inducedneuronaldamageinrathippocampus,inNeurosciLett1999，276(2):75-8.45.表中的数据取自以下的研究MagyarK.等，Pharmacologicalaspectsof(-)-deprenyl,inCurrMedChem，2004Aug,11(15):2017-31;Hou等,MonoamineoxidaseB(MAO-B)inhibitionbyactiveprinciplesfromUncariarhyncophylla,inJournalofEthnopharmacology100(2005)216-220;HerraizT，ChaparroC，Humanmonoamineoxidaseisinhibitedbytobaccosmoke:|3-carbolinealkaloidsactaspotentandrevesibleinhibitors,inBiochemicalandBiophysicalResearchCommunications326(2005)378-386;KongLD等，InihibitionMAO-AandBbysomeplant-derivedalkaloids,phenolsandanthraquinones，inJournalofEthnopharmacology91(2004)351-355.46.YoshidaS,等，Fluorinatedphenylcyclopropylamines.Part3:InhibitionofmonoamineoxidaseAandB，inBioorganic&MedicinalChemistry12(2004)2645-2652.47.TorresA.等，Porphyra-334,apotentialnaturalsourceforUVAprotectivesunscreens,inPhotochem.Photobiol.Sci.5(2006)432-435.48.HughesJ，LamparterT.，ProkaryotesandPhytochrome.TheConnectiontoChromophoresandSignaling,inPlantPhysiology,December1999,Vol.121，pp.1059-1068.49.Garthwaite等,Endothelium-derivedrelaxingfactorreleaseonactivationofNMDAreceptorssuggestsroleasintercellularmessengerinthebrain,inNature.1988Nov24;336(6197):385-8.50.Delgado-EstebanM.等，D-Glucosepreventsglutathioneoxidationandmitochondrialdamageafterglutamatereceptorstimulationinratcorticalprimaryneurone,inJNeurochem.2000Oct;75(4):1618-24.29权利要求1.微藻水华束丝藻(AquaeRalfsexBorn.&Flah.Var.flosaquae)(AFAKlamath)的制剂、其提取物或其分离的组分用于制备预防、控制或治疗神经性疾病、病症、机能障碍或障碍的组合物的用途，所述的分离的组分选自C-藻蓝蛋白/藻红青蛋白复合物(C-PC/PEC)、它们的独立色基藻青素(PCB)和phycoviolobilin(PVB)、AFA植物色素和霉孢菌素样氨基酸(MAA)或其混合物。2.才N^3U'J要求1的用途，其中所述的神经性疾病、病症、机能障碍或障碍为下述之一阿尔茨海f^、帕金森病、多发'^f更化症、注意缺陷多动症(ADHD)、自闭症、抑郁症、记忆缺失和情绪障碍。3.才Nt权利要求l-2的用途，所述的AFA提糊通过如下步骤制得a)冷冻新鲜采集的AFA藻并解冻，或如果初始材料是干燥的AFA粉末，超声处理树糊AFA粉末以石錄细胞；b)离心步私)的产品，vM^冗淀中分离上清液；c)收集含有水溶雖分的上清液。4根据权利要^3的用途，其中所述的AFAKlamath提,是通过将所述的上清液使用截留M量为30，000道尔顿的超滤膜进行超滤而进一步纯化的。5.根据权利要求l的用途，其中所述的分离的组分是选自shinorine和紫菜聚糖-334的絲菌素样#:紫練糖-334Shinorine6.才权利要求1的用途，其中所述的分离的组分是絲蛋白凍红青蛋白复^^勿(C-PC/PEC)或M—亚成分，即C-PC或PEC。7.才Nt权利要求l的用途，其中所述的分离组分是植物色素。8.才財居权利要求l的用途，所述的分离组分的^^由#^菌素样#、-g蛋白，藻红青蛋白和;ti物色素la^。9.才M^WJ要48的用途，其中所述的^^另夕卜含有苯乙斷EA)。10.#^权利要求1的用途，其中所述的组*适合人类施用。11.4娥权利要求1的用途，其中所述的AFAKlamath的制剂、所述的提絲或其分离组分用药学上可接受的载^M形剂进^i己制。12.在需要其的个本中抑制所述的酶单胺氧化酶B的方法，其包^^所述的个絲用选自植物色素、絲蛋白、藻红青蛋白和辆菌素样^J^的分离的ATAKlamath组分或其^^7。13.才財居权利要求12的方法，其中所述的^N^是患有儿W^胺相关的神经性或神经变性疾病的人类个本。全文摘要本发明提供了用于预防或治疗神经性、神经变性和情绪病症或疾病的微藻水华束丝藻(AquaeRalfsexBorn.&Flah.Var.flosaquae)(AFAKlamath)的提取物及其纯化的组分。文档编号A61K36/02GK101478980SQ200780023485公开日2009年7月8日申请日期2007年6月26日优先权日2006年6月27日发明者F·卡内斯特拉里,M·德尔加多-埃斯特班,S·斯科利奥,S·贝内代蒂,Y·贝内代蒂申请人:营养技术责任有限公司