专利名称：：封闭囊泡的分离方法、制剂的制造方法及评价方法
技术领域：
：本发明涉及一种经膜修饰的封闭嚢泡(vesicle)的分离方法、使用该分离方法精制的制剂的制造方法、具有被控制的所期望的亲水性高分子修饰率的封闭嚢泡及制剂的评价方法。
背景技术：
：近年，正在积极研究将药物安全且有效率地送达分布到目标病灶部位的药物传递系统(DrugDeliverySystem,DDS)。作为上述方法之一，研究将脂质体、乳剂、脂微球、纳米微粒等封闭嚢泡用作药物的搬运体(载体)。使用封闭嚢泡的DDS的实用化时存在需要克服的各种问题。其中，为了使药物送达靶部位，重要的是使封闭嚢泡避开生物体侧的异物识别机构及控制体内动态，例如防止与血液中的调理素蛋白质或血浆蛋白质等相互作用(吸附)导致凝集、避免被肝脏、脾脏等网状内皮系统组织(RES)捕捉。即，封闭嚢泡的血中稳定性(血中滞留性)十分重要。所谓血中滞留性，是药物在血液中存在的性质，如果使血中滞留性提高，则可能以较少剂量给与药物。一般认为如果提高封闭嚢泡的血中滞留性，则可能被动蓄积在肿瘤组织或炎症部位等血管透过性亢进的组织内，其结果，一般认为可能使其以高选择性到达靶部位。作为解决此课题的方法，已知将形成封闭嚢泡的膜利用亲水性高分子进行修饰的技术。用亲水性高分子进行表面修饰的封闭嚢泡，可以防止血浆中的调理素蛋白质等吸附在表面，提高其血中稳定性，避免被RES捕捉。特别是，可以确认用由磷脂构成的膜形成的脂质体，通过利用亲水性高分子进行膜修饰可以提高血中滞留性，上述形态的脂质体制剂的实用化正在进展之中(参见专利文献l~3及非专利文献1~3)。采用低毒性、被广泛用于药物稳定化及体内动态改善的聚乙二醇(以下也表示为"PEG")作为亲水性高分子进行膜修饰的脂质体，已对各种药物实现制剂化。在如上所述利用亲水性高分子进行封闭嚢泡膜修饰的技术中，亲水性高分子的修饰量及其膜表面分布状态，是关系到制剂功能即制剂的血中滞留性及物理化学稳定性的重要因子。特别是，即使是确认为低毒性的亲水性高分子，如果考虑到给与生物体内，则也期望为少量，另外，过度的膜修饰易引起膜不稳定化，因此在获得期待的血中滞留性以前，从由制剂次品化导致制造成本增加的观点考虑，也不优选。从上述观点考虑，制剂中利用亲水性高分子进行的修饰优选以必要的最小量实施。目前，上述利用亲水性高分子进行的修饰，通常以投入量为基础进行探讨。一般情况下，在封闭嚢泡的膜修饰处理中亲水性高分子的导入量如下求出，根据其投入量，对修饰处理后采用除去处理而未能除去的量进行定量，取差值，由此求出。还提出了直接分析被组入到实际上导入的微团中的水溶性高分子物质的方法，提出了用含有表面活性剂的水性溶剂等将膜(微团)自身可溶化后，采用凝胶过滤色谱法进行分析的方法(参见专利文献4)。另外，作为纳米粒子的表面状态的理化分析，目前有粒径、Zeta电位的测定等。并且，有报道指出可以通过采用界面电化学方法测定的在脂质体膜表面形成的固定水层厚度(FixedAquaousLayerThickness:FALT)、AquaousTwo-PhaseSystem(水性二相分离)来推测脂质体膜表面的PEG分子的状态，由此探讨PEG修饰和血中滞留性增大的相关性(参见非专利文献57)。专利文献l:特表平5-505173号公报专利文献2:特公平7-20857号公报专利文献3:专利第2667051号公报专利文献4:特开平IO-142214号公报非专利文献1:D.D丄asic著《LIPOSOMESfromPhysicstoApplications》,Elsevier,1993非专利文献2:MartinC.Woodle,GerritStorm编《LongCirculatingLiposomes:OldDrugs,NewTherapeutics》，Springer,1997非专利文献3:D.D丄asic，D.Papahadjopoulos编《MedicalApplicationsofLIPOSOMES》，Elsevier,1998非专利文献4:YasuyukiSadzuka编《EffectsofmixedpolyethleneglycolmodificationonfixedaqueouslayerthicknessandantitumoractivityofDoxorubicincontainingliposome》238，2002,171-180非专利文南史5:GregoryGregoriadis编《LiposomeTechnology2ndEditionVolumeI》，1992非专利文献6:寺田弘编《生命科学中的脂质体》，Springer-Verlag东京，1992非专利文献7:ColinTilcock,PieterCullis,TomasDempsey,B.B.A979(1989),208-21
发明内容如上所述，对封闭嚢泡外表面的膜修饰优选为用必要最小量的亲水性高分子的修饰，特别优选仅对封闭嚢泡膜外表面用必要最小量亲水性高分子进行的均质的膜修饰。即，在制剂总体不均小、作为亲水性高分子含量分析得到的平均值几乎可以作为各个封闭嚢泡粒子的含量时，可以期待能够最有效地呈现由亲水性高分子产生的效果。特别是，相对于平均值的不均较大的情况下，即使从总体平均来看为所期望的含有率，也很有可能存在不能以所期待的量含有亲水性高分子的封闭嚢泡粒子、或者相反地存在从医药观点考虑以不适当的过剩量含有亲水性高分子的封闭嚢泡粒子。因此，优选能够对各个封闭嚢泡制剂粒子的由亲水性高分子产生的修饰状态进行分析的方法，另外优选由此实际掌控有效的亲水性高分子的修饰率。然而，采用上述现有方法测定的亲水性高分子的修饰量均作为测定样品总体的平均值而获得，采用上述方法不能得到以测定样品中的各个封闭嚢泡为基础的修饰量。鉴于上述情况，本发明人为了得到具有被控制的所期望的亲水性高分子修饰率的封闭囊泡，确立对封闭嚢泡外表面的亲水性高分子修饰状态的差异进行分析的方法，进行探讨，结果发现，通过在离子交换色镨法中使用使洗脱液的离子强度经时地变化的浓度梯度，能够根据亲水性高分子的修饰率，分离封闭嚢泡。此封闭嚢泡也可以为封入了药物的制剂。推测采用此分离方法时可以通过在制造过程中使用此方法能够得到为所期望的亲水性高分子修饰率的均匀性高的封闭嚢泡(或者制剂)。例如，作为将准备的封闭嚢泡(制剂)进行精制的方法，直接实施上述分离方法，或者作为封闭嚢泡(制剂)的分析方法适用上述分离方法，将其分析数据反馈到制造工序、调整制造条件，由此能够制造分布狭窄、以高均匀性具有所期望的亲水性高分子修饰率的封闭嚢泡(制剂)。并且，通过对比采用上述分离方法得到的色语、和与各亲水性高分子修饰率制剂对应的另外求出的血中持续性效果等，可以得知制剂的亲水性高分子修饰率和效果的正确的相关关系。对于用亲水性高分子修饰的封闭嚢泡，直接分析亲水性高分子的修饰状态的方法尚属未知。特别是尚无报道指出将封闭嚢泡直接地即不加破坏地利用由亲水性高分子形成的膜外表面状态差异进行分离或分布。所以作为解决上述课题的方法，提供了如下所述的本发明。(1)一种用亲水性高分子进行膜修饰的封闭嚢泡的分离方法，所述分离方法使用离子交换色i普法分离膜修饰率不同的封闭嚢泡，所述离子交换色谱法应用使洗脱液的离子强度经时地变化的浓度梯度。(2)如上述(1)所述的分离方法，其中，亲水性高分子为聚乙二醇，封闭嚢泡为脂质体。(3)如上述(1)或者(2)所述的分离方法，其中，离子强度为NaCl的离子强度。(4)如上述(1)~(3)中任一项所述的分离方法，其中，离子交换色语法为弱阴离子交换色谱法。(5)如上述(4)所述的分离方法，其中，洗脱液为含有緩冲剂的pH6IO的水性溶剂。(6)如上述(1)~(5)中任一项所述的分离方法，其中，所述封闭嚢泡是该封闭嚢泡内含有药物的制剂。(7)—种封闭嚢泡的制造方法，包括如下工序准备用亲水性高分子进行膜修饰的封闭嚢泡；将所述封闭嚢泡采用权利要求l6中任一项所述的分离方法，相应于所述亲水性高分子的膜修饰率分离所述封闭嚢泡；通过回收具有所期望的亲水性高分子修饰率的封闭嚢泡，得到精制的封闭嚢泡。(8)如上述(7)所述的制造方法，其中，所述膜修饰的封闭嚢泡为用聚乙二醇进行膜修饰的脂质体。(9)一种封闭嚢泡，膜的外表面用亲水性高分子修饰的封闭嚢泡，其中不包含相对于封闭嚢泡的膜脂质的亲水性高分子的修饰率低于0.5mo1%的封闭嚢泡。(10)如上述(9)所述的封闭嚢泡，其中，所述亲水性高分子为聚乙二醇，上述封闭嚢泡为脂质体。(11)如上述(9)或者(10)所述的封闭嚢泡，其中，所述封闭嚢泡为内部含有药物的制剂。(12)—种评价方法，采用上述(l)~(6)中任一项所述的分离方法，基于亲水性高分子修饰率，对用亲水性高分子进行了膜修饰且内部含有药物的封闭嚢泡的制剂进行评价。(13)—种封闭嚢泡的制造方法，包括制造用亲水性高分子进行了膜修饰的封闭嚢泡的工序，采用上述l~6中任一项所述的分离方法对制造的封闭嚢泡进行分析的工序，根据所得的分析数据，调整上述制造工序的制造条件使上述封闭嚢泡为所期望的膜修饰率，得到将亲水性高分子的膜修饰率控制为所期望的膜修饰率的封闭嚢泡。根据本发明，能够分离由亲水性高分子的修饰导致膜表面状态不同的封闭嚢泡(也包括制剂)。能够提供一种在封闭嚢泡的精制工序利用该分离方法、制造具有被控制的所期望的亲水性高分子修饰率的封闭嚢泡的方法。根据此制造方法，能够得到具有在各个封闭嚢泡之间均匀性高的膜修饰率的封闭嚢泡。特别是能够提供一种封闭嚢泡，所述封闭嚢泡被精制成仅为具有有效的膜修饰率的封闭嚢泡，排除了利用亲水性高分子实施的膜修饰不满足体内动力学有效的修饰率的封闭嚢泡。另外，本发明能够得知精确的(分布狭窄的)表面修饰率，因此能够正确地评价表面修饰率和制剂效果的关系。(A)~(C)是表示本发明的方法中的测定条件的图。是表示在本发明方法中的条件1下形成的PEG修饰脂质体制剂的分析例(分离状态)的高效液相色谙。是表示在本发明方法中的条件2下形成的PEG修饰脂质体制剂的分析例(分离状态)的高效液相色语。是表示在本发明方法中的条件3下形成的PEG修饰脂质体制剂的分析例(分离状态)的高效液相色语。是表示利用本发明方法得到的混合物的分离例的高效液相色谱。是表示PEG修饰率不同的各种脂质体制剂注射后的血中滞留性试验中的采血时间和"剂量％"的关系的图。是表示脂质体制剂的PEG修饰率和对应的AUC的关系的是表示高效液相色i普的各PEG修饰率的脂质体制剂的保留时间、和与各PEG修饰率的脂质体制剂对应的AUC的关系的图。具体实施例方式以下，首先具体地说明采用本发明的分离方法分离的用亲水性高分子进行了膜修饰的封闭嚢泡、及其中含有药物的制剂、以及其制造方法。本发明中，所谓修饰或者膜修饰，是指亲水性高分子被化学性、物理性或者电性固定地保持在形成封闭嚢泡的膜的外表面的状态。本发明中的封闭嚢泡，只要是能够内封药物的粒子状膜结构体(载体)即可，没有特殊的限制，一般是指为W/0/w型载体的封闭嚢泡，也可以解释为其含义广泛地包括分类为w/0型载体的微团、微球体等。需要说明的是，w为水相、o为油相。作为封闭嚢泡，具体而言例如可以举出脂质体、微嚢、脂微球、纳米粒子等。上述封闭嚢泡可以形成球状或者与其相近的形态。封闭嚢泡的粒径(粒子外径的直径)根据其种类而有所差异，但通常为0.01~500(im。例如为脂质体时，通常为0.02~lpm，优选为0.05~0.25|am。为微嚢时，通常为l500nm，优选为l150iam。为脂微球时，通常为l500(im，优选为l30(Vm。纳米粒子的粒径，通常为O.Ol~l|im,优选为O.Ol~0.2pm。值而求出的。本发明中的封闭嚢泡，优选具有能够在内部高浓度地封入药剂的潜在功能，其中优选为脂质体。本发明中，将在此封闭嚢泡内部含有药物的物质称为制剂。封闭嚢泡通常以具有疏水性基团和亲水性基团的两性脂质作为膜材而形成。以下，主要以脂质体为例，具体说明。脂质体，一般是由以磷脂为主膜材的脂质双层膜形成的封闭嚢泡。更详细而言，脂质体的结构是，含有疏水性基团和亲水性基团的磷脂基于双方的极性在水性溶剂中生成膜，由该膜形成封闭空间。脂质体通常以间隔此膜、存在封闭空间内的内水相和外水相的悬浮液的状态进行使用。需要说明的是，本说明书中，使用脂质体的用语，其含义包含此脂质体悬浮液。另外，所谓在脂质体内封入或者内封药物，是指作为其内水相、或者使内水相中含有药物，所谓脂质体制剂，是指封入(内封)有药物的脂质体。所谓封入(内封)，是指药物通过在膜上附着等而保持的状态或者于膜中保持的状态，此时，并不限定药物必须存在于内水相中。一般而言，磷脂是分子内具有由长链烷基构成的疏水性基团和由磷酸基团构成的亲水性基团的两亲性物质。作为磷脂，例如可以举出磷脂酰胆碱(=卵磷脂)、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇等甘油磷脂；鞘磷脂等鞘氨醇磷脂；心磷脂等天然或者合成的双磷脂酰基类磷脂及它们的衍生物；上述物质的部分或者完全氢化物(例如，氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC))等。其中，优选使用氢化大豆磷脂酰胆碱等氢化磷脂、鞘磷脂等。脂质体，可以含有一种或者多种上述磷脂作为主膜材。另外，为了使封入的药物在保存时或者在血液等生物体中不易漏出，并且考虑到在制造时暴露在高于生物体温度的温度(典型的为60。C左右)下，脂质体优选使用相转移温度高于生物体内温度(35~37°C)的磷脂作为主膜材。优选方案之一为脂质体的主膜材的相转移温度为50。C以上。脂质体可以含有上述磷脂以及其它膜构成成分。作为其它的膜构成成分，例如可以举出除磷脂以外的脂质及其衍生物(以下，有时也将其称为"其它脂质类，，。)。除磷脂以外的脂质，是指分子内具有由长链烷基等构成的疏水性基团、分子内不含磷酸基的脂质。该脂质没有特殊的限制。例如可以举出甘油糖脂、鞘氨醇糖脂质、胆固醇之类的甾醇类、及它们的氢化物等衍生物。甾醇类只要是具有环戊烷并氢化菲环的物质即可，没有特殊的限定。例如可以举出胆固醇。可以含有一种或多种上述其它脂质类。构成脂质体膜的总脂质中，上述磷脂通常为20lOOmol%,优选为40100mo1。/。。其它脂质类在总脂质中通常为080mol%,优选为0-60mo10/0。其中，由上述磷脂和其它脂质类的混合脂质形成膜的脂质体为优选例。另外，脂质体的脂质双层膜结构可以为单层嚢泡(UnilamellarVesicle)，也可以为多层嚢泡(MultilamellarVesicle,MLV)中的任一种，另外单层嚢泡可以为SUV(SmallUnilamellarVesicle)，也可以为LUV(LargeUnilamellarVesicle)。从脂质体的稳定性方面考虑，优选粒径为0.05~0.25pm的LUV。修饰上述脂质膜的亲水性高分子没有特殊的限制，可以举出公知的亲水性高分子。作为亲水性高分子，具体而言可以举出聚乙二醇类、聚甘油类、聚丙二醇类、聚蔗糖、聚乙烯醇、苯乙烯-马来酸酐交替共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐交替共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基曱基醚、聚乙烯基曱基唑啉、聚乙基唑啉、聚羟丙基唑啉、聚羟丙基曱基丙烯酰胺、聚曱基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚曱基丙烯酸羟丙基酯、聚丙烯酸羟乙基酯、羟曱基纤维素、羟乙基纤维素、聚天冬酰胺、合成聚氨基酸等。进而可以举出葡糖醛酸、唾液酸、葡聚糖、茁霉多糖(pullulan)、直链淀粉、支链淀粉、壳聚糖、甘露聚糖、环糊精、果胶、角叉菜聚糖等水溶性多糖类及其衍生物、例如糖脂质。其中，优选亲水性高分子含有选自由-CH2CH20-、-CH2CH2CH20-、-CH2CH(OH)CH20-、-CH2CH(CH2OH)O-组成组中的至少l个单元。亲水性高分子可以为由上述单元中的l种重复结构构成的均聚物、含有2种以上单元的共聚物。共聚物也可以为无规共聚物、嵌段共聚物、三元共聚物等任意形态。其中，优选均聚物，特别优选确认具有使脂质体制剂的血中滞留性提高的效果的聚乙二醇(PEG)、聚甘油(PG)、聚丙二醇(PPG)。上述亲水性高分子，只要具有构成能够呈现提高脂质体制剂的血中滞留性的效果的分子链的分子量即可，没有特别的限定，PEG的分子量通常为500~10,OOO道尔顿，优选为l,000~7,OOO道尔顿，较优选为2，000~5，OOO道尔顿。PG的分子量通常为10010，OOO道尔顿，优选为200~7,OOO道尔顿，较优选为400~5,OOO道尔顿。PPG的分子量通常为10010，OOO道尔顿，优选为200~7,OOO道尔顿，较优选为l，000~5,OOO道尔顿。上述亲水性高分子，通常作为脂质衍生物用于膜修饰。需要说明的是，亲水性高分子的分子末端通常为羟基，从保存稳定性方面考虑，可以将未与脂质衍生物中的脂质键合的亲水性高分子的末端侧烷氧基化(例如，甲氧基化、乙氧基化、丙氧基化)。本发明的分离方法中，亲水性高分子的分子末端即使有烷氧基也可以分离。形成亲水性高分子的脂质衍生物的脂质，只要是在脂质体的膜上具有亲和性的疏水性部分的化合物即可，没有特殊的限制。通常可以举出与该膜成分相同或者类似的磷脂、甾醇等其它脂质类、长链脂肪族醇、聚氧化丙烯烷基、甘油脂肪酸酯等。其中，磷脂为优选方案之作为磷脂，只要可以与上述亲水性高分子键合即可，没有特殊的限制，例如可以举出磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸等。其中，磷脂酰乙醇胺为优选方案之一。磷脂中所含的酰基链通常期望为具有d广C2Q、优选具有d6-Qs链长的饱和脂肪酸。作为酰基链，例如可以举出二棕榈酰基、二硬脂酰基、棕榈酰基硬脂酰基等。亲水性高分子的脂质衍生物中的亲水性高分子和脂质的组合，没有特殊的限定。例如亲水性高分子为PEG时，通常作为优选例可以举出磷脂或者胆固醇衍生物。上述亲水性高分子的脂质衍生物可以采用公知的方法制造，另外也有可作为市售品购入的衍生物。例如PEG的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺衍生物(PEG-DSPE)是易购得的常用化合物。本发明中的脂质体(封闭嚢泡)可以用上述亲水性高分子的脂质衍生物的1种或者2种以上进行膜修饰。利用亲水性高分子进行的脂质体修饰率，作为亲水性高分子量相对于脂质膜(总脂质)的比例，通常为O.l~lOmol%、优选为O.l~5mo1%、较优选为0.23mor/。。需要说明的是，此总脂质中也包含亲水性高分子的脂质衍生物中的脂质。上述亲水性高分子的膜修饰状态主要有在膜内外随机分布的方案，和选择性地分布在膜表面的外侧的方案，本发明优选后者。后者的方案的制造方法如下所述，亲水性高分子选择性地分布在膜表面的外侧的脂质体，与亲水性高分子在膜的内外随机分布的脂质体相比，用一半的亲水性高分子量即能呈现其效果，对存在效率及由其存在而获得的脂质膜的稳定性的影响少，因此较为有利，不仅如此，亲水性高分子不易受内水相的pH影响，脂质体制剂稳定，故优选。从上述亲水性高分子的膜修饰中的修饰效率及制剂的稳定性方面考虑，同时考虑到由本发明的分离方法产生的分离效果，本发明中的脂质体制剂优选前者的用亲水性高分子选择性地修饰膜外侧的方案。本发明中，只要是能够保持由上述膜构成成分形成的膜结构、脂质体能够含有的物质即可，还可以任意含有其它成分。具体而言，可以举出除亲水性高分子衍生物以外的表面修饰剂，例如具有碱性官能基团的化合物；具有酸性官能基团的化合物等电荷物质。电荷物质通常为脂质衍生物的形态。脂质可以举出与亲水性高分子的脂质衍生物相同的物质。碱性官能基团，例如为氨基、脒基、胍基等，作为具有上述官能团的化合物或者其脂质衍生物(阳离子化脂质)，例如可以举出特开昭61-161246号公报中记载的DOTMA、特表平5-508626号公报记载的DOTAP、特开平2-292246号公报记载的Transfectam、特开平4-108391号公报公开的TMAG、国际公开第97/42166号说明书记载的3,5-二(十五烷氧基)苯曱脒盐酸盐、DOSPA、DOTAP、TfxTM-50、DDAB、DC-CHOL、DMRIE等。作为具有酸性官能基团的化合物，例如可以举出磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰基肌醇、磷脂酰甘油、心磷脂等酸性磷脂；油酸、硬脂酸等饱和或不饱和脂肪酸；神经节苦脂GM1(GangliosideGM1)、神经节苷脂GM3等具有唾液酸的神经节苷脂类；N-酰基-L-谷氨酰胺等酸性氨基酸类表面活性剂等。本发明中，上述脂质体(封闭嚢泡)中所含的药物只要是用于治疗及/或者诊断的药物即可，没有特殊的限制。作为药物，例如可以举出核酸、多核苷酸、基因及其类似物、抗癌剂、抗生素、酶制剂、抗氧化剂、脂质摄入抑制剂、激素制剂、抗炎剂、甾族化合物制剂、血管扩张剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂、平滑肌细胞的增殖游走抑制剂、血小板凝集抑制剂、抗凝固剂、化学介质的游离抑制剂、血管内皮细胞的增殖促进或抑制剂、醛糖还原酶抑制剂、肾小球膜细胞增殖抑制剂、脂氧合酶抑制剂、免疫抑制剂、免疫激活剂、抗病毒剂、美拉德反应抑制剂、淀粉样变性病抑制剂、一IU匕氮合成抑制剂、AGEs(Advancedglycationendproducts)#卩制剂、自由基捕获剂、蛋白质、血红蛋白溶液、肽、葡糖胺基葡聚糖及其衍生物、寡糖及多糖及其衍生物等；X射线造影剂、超音波诊断剂、放射性同位素标记核医学诊断药、核磁共振诊断用诊断药等。另外，本发明涉及的脂质体制剂，根据给药途径可以含有药学上允许的稳定化剂及/或者抗氧化剂。作为稳定化剂，没有特殊的限定，例如可以举出甘油、甘露醇、山梨醇、乳糖或蔗糖等糖类。作为抗氧化剂，没有特殊的限定，例如可以举出抗坏血酸、尿酸、a、(3、y或者5生育酚同系物(例如，维生素E)。另外，通常、为悬浮液形态的脂质体制剂的悬浮介质即脂质体的外水相，根据投药途径为药学上允许的介质即可，没有特殊的限制，例如可以举出水、生理盐水、药学上允许的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧曱基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧曱基淀粉钠、果胶、曱基纤维素、乙基纤维素、黄原酸胶、阿拉伯树胶、酪蛋白、明胶、琼脂、双甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、PBS或者生物体内降解性聚合物等的水溶液、无血清培养基等。其中，优选水、生理盐水。另外，上述介质也可以包括作为医药添加物允许的表面活性剂或者生物体内允许的生理pH的緩沖剂。由上述亲水性高分子进行膜修饰的形态的脂质体(封闭嚢泡)及脂质体制剂，可以采用公知的方法进行制造。亲水性高分子选择性地分布在膜表面外侧的状态的脂质体(封闭嚢泡)，可以通过暂时形成脂质体后，添加亲水性高分子的脂质衍生物进行修饰的2步工序获得。脂质体形成方法本身，已知例如乙醇注入法、薄膜法、逆相蒸发法、冻结融化法、超声波法、高压喷出法(参见《生命科学中的脂质体》寺田、吉村等编；Springer-Verlag东京(1992):引用该记载作为本说明书中记载的内容)、挤压成型法等各种技术，可以使用上述作为膜构成成分的脂质，从上述方法中选用适当的方法，制造脂质体。进而，也可以采用/>知的尺寸控制技术(SizingTechnology)、例^口G.Gregoriadis编《LiposomeTechnologyLiposomePreparationandRelatedTechniques》2ndedtion,Vol.I-III、CRCPress(引用该记载作为本说明书中记载的内容)，使脂质体具有理想的尺寸。另外，脂质体的单层化方法也是公知的(例如上述文献《生命科学中的脂质体》等)，可以适当地选择。然后，通过向上述形成的脂质体中添加脂质衍生物等、可修饰脂质体的亲水性高分子，能够使亲水性高分子选择性地分布在脂质体的膜的外侧。可以根据药物的种类，在适当的工序、即脂质体形成工序中、脂质体形成工序后、或者膜修饰工序后，适当地选择公知的导入方法，封入药物。药物导入后、未封入脂质体内的药物通常采用公知的除去方法除去。本发明的分离方法，是用亲水性高分子进行膜修饰的封闭嚢泡的分离方法，特别是能够直接分离本发明中的封闭嚢泡，所述封闭嚢泡以如上所述用亲水性高分子选择性地修饰膜表面的外侧的结构的脂质体为代表。存在于封闭嚢泡内部的亲水性高分子，不能采用本分离方法进行评价，另外不能呈现所期望的功能。另外，本发明的分离方法适用于将用相同种类的亲水性高分子修饰的封闭嚢泡相互分离。具体而言，本发明通过离子交换色谱法(也表示为IEC)分离膜修饰率不同的封闭嚢泡，所述离子交换色谱法利用使洗脱液的离子强度经时地变化的浓度梯度。IEC是一种公知的方法，即，使用化学性结合有在离子交换树脂粒子的表面解离、产生带电表面的分子的离子交换树脂，分离离子对，根据表面带电状态大致分为阳离子交换和阴离子交换。阴离子交换中通常使用导入了季铵、二乙基氨基乙基等阳离子残基的树脂，阳离子交换中通常使用导入了磺丙基等阴离子残基的树脂。本发明中，优选利用阴离子交换的IEC，其中，较优选利用采用二乙基氨基乙基等的弱阴离子交换的IEC。离子交换树脂可以为多孔粒子、非多孔粒子中的任一种。填充有上述离子交换树脂的色语柱可以从市场购买到，用于本发明的分离。作为弱阴离子交换树脂色语柱，有DEAE-5PW(东曹(林)制)、YMC-PackIES-AX((抹)YMC制)等市售品。通过在高效液相色谱(HPLC)中配备上述适当的色语柱，也可以测定IEC。如下所述，也可以将此测定数据用于药物评价。本发明中，考虑到所使用的封闭嚢泡可能因溶剂而变性，优选完全不含有机溶剂的洗脱液。另外，IEC中，根据离子交换树脂的种类不同，最适pH范围有所差异，对带电状态也有影响，因此，优选适当地调整洗脱液(也表示为流动相)的pH。从离子交换树脂的性质方面考虑，洗脱液的pH—般优选为pH2ll的范围，进而从封闭嚢泡、特别是脂质体的稳定性的观点考虑优选pH410。使用阴离子交换树脂的IEC时，洗脱液的pH优选为610,41优选为6~9。洗脱液可以用例如磷酸緩沖剂、Tris盐酸缓冲剂、乙酸緩沖剂緩沖化。緩沖剂的浓度通常为1050mM较适当。本发明在IEC中赋予洗脱液浓度梯度。产生浓度梯度主要有使洗脱液的溶剂组成变化的方法、使离子强度经时地变化的方法，但考虑到封闭嚢泡可能因溶剂而变性，本发明中优选使离子强度经时地变化的方法。本发明中，为了调整离子强度，通常使用NaCl或硫酸铵等，其中，考虑到离子强度的调整容易性，使用NaCl。选择离子强度时，优选不影响封闭嚢泡结构的范围。具体而言，为脂质体的情况下，优选不引起膜透过的离子强度，具体而言，即使为最高浓度，以NaCl计也优选在2mo1/L以下。浓度梯度方法，有离子强度以一定比例变化的直线型、曲线型(凹型■凸型梯度洗脱)及使其阶段性变化的阶梯型等变化方法，没有特殊的限定，但从控制的容易性方面考虑优选直线型。使离子强度呈直线型浓度梯度的方法本身可以采用公知的方法。此直线型浓度梯度的模式图如图l所示。本发明的分离方法中，浓度梯度的速度十分重要，在相同流速下减小梯度时可以提高分离能力。如下述实施例所示。例如，在利用使用基于NaCl的浓度梯度(0—0.5M)的IEC进行PEG修饰的脂质体制剂的分离例中，可以确认即使最终离子强度相同，仍然是浓度梯度越緩，基于PEG修饰率的分离能力越高。特别是经35分钟产生浓度梯度的情况下，确认如果是PEG修饰率约为0.5mor/。、约0.25mol%及无修饰的脂质体制剂，则能够得到各分离峰鲜明分离的色语。即，各PEG修饰率的脂质体制剂，能够分别作为IEC成分分离回收，由此能够从分布广的混合物中精制分离具有所期望PEG修饰率的脂质体制剂。还可以通过在与具有所期望PEG修饰率的脂质体制剂对应的流出时间附近设定分离时间来调整分布范围。所以，浓度梯度与上述例相比更緩和时，即使PEG修饰率为lmol%以上，也可以分离，但考虑到现实的实施效率时，优选分离所需时间较短。另外，如下述实施例及以下说明所示，根据对脂质体制剂中PEG修饰效果的评价中的PEG修饰率的效果的认知，只要能够精制PEG修饰率达到约0.5mor/。的脂质体制剂，就能够实现PEG修饰的主要目的。从上述观点考虑，通常即使较长也能在180分钟左右进行分利用IEC的分离条件，除上述色镨柱的选择及流动相的溶剂种类及使用浓度梯度之外，没有特殊的限制，可以从一般的IEC条件中适当地选择。流动相的流速在使用色语柱直径92.0mm的色语柱时通常为0.05~O.lmL/分钟，但必须考虑装填到色谙柱中的凝胶的最大压力进行设定。本发明中，通过上述分离方法，能够比现有的脂质体制剂(封闭泉2Ct乂wvr》—>'卩干trj'刀—4々>7z-尺乂治》oH"T"4'J丌jai、'i工问勿丁日"少丁闭嚢泡(制剂)的修饰效果。特别是因为采用现有的分析方法测定的封闭嚢泡(制剂)的表面修饰率为测定样品总体的平均值，因此，例如即使表面修饰率为0.25mol%，也不能直接与Omol%和0.5mo1%的混合物相区别。此时，不能严密地评价表面修饰率的血中滞留性效果，另外也难以对其进行验证，但如果采用本发明的分离方法，则能够按各表面修饰率进行分离，因此至少能够知道制造的封闭嚢泡的表面修饰具有何种分布(不均幅度)。另外，通过分离幅度的选择能够得到为所期望表面修饰率的高度精制的制剂，因此，能够严密地评价表面修饰效果。例如能够得知分离精制的脂质体制剂和该制剂的试验(AUC)结果的相关性。进而，通过在IEC的各制剂峰上使相当的AUC对应，也能够评价经表面修饰获得的效果。另外，用亲水性高分子修饰的封闭嚢泡(或者制剂)的制造过程中使用本发明的分离方法，也能够得到以所期望的修饰率高度精制的封闭嚢泡(制剂)。例如作为用亲水性高分子进行膜修饰且在内部含有药物的封闭嚢泡(制剂)的精制工序，适用上述分离方法，根据上述亲水性高分子的膜修饰率分离封闭嚢泡(制剂)，能够从分离的封闭嚢泡(制剂)中回收具有所期望的亲水性高分子修饰率的封闭嚢泡(或者制剂)。采用上述制造方法，能够得到用亲水性高分子修饰膜外表面的封闭嚢泡，不包含体内动态有效性小的亲水性高分子修饰率的封闭嚢泡，具体而言相对于封闭嚢泡的膜脂质、亲水性高分子的修饰率低于0.5mol。/。的封闭嚢泡。本发明中，也可以特别容易地排除修饰率为0mor/t)的封闭嚢泡。所以，采用本发明能够提供高度精制成上述所期望修饰率的封闭嚢泡(制剂)。此膜修饰的封闭嚢泡为用聚乙二醇进行膜修饰的脂质体(或者制剂)的方案为本发明的优选方案。另外，作为用亲水性高分子进行膜修饰的封闭嚢泡(或者制剂)的分析方法，适用上述分离方法，将所得的分析数据反馈到上述封闭嚢泡(或者制剂)的制造工序中，由此调整制造工序的制造条件，对其进行控制使其为所期望的修饰率，采用上述方法，也能够得到高度调整为所期望的亲水性高分子修饰率的封闭嚢泡(或者制剂)。实施例接下来，给出实施例，进一步详细地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例、试验例。(配制例l)(1)脂质体的制作向7.021g氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)(分子量790、Lipoid社制SPC3)及2.927g胆固醇(Choi)(分子量386.65、Solvay社)中加入10mL无水乙醇(和光纯药社制)，升温至68。C,完全溶解后，加入250mM硫酸铵(和光纯药制)水溶液90mL，在68。C的恒温槽中膨润15分钟后，进行涡流搅拌，配制脂质体粗分散液。然后，依次通过装有冲齐出才几(TheExtruderT.lOO,LipexbiomembranesInc.制)的过滤器(孔径0.2jimx5次、O.liumxlO次、Whatman社制)，得到脂质体分散液(以下，也记载为脂质体)。(2)PEG修饰将聚乙二醇(分子量5000)-磷脂酰乙醇胺(PEG50(K)-DSPE)(分子量6075、日本油脂社)用蒸馏水稀释，配制36.74mg/mL的PEG扁-DSPE水溶液。向含有各取8mL的上述脂质体的各个容器中，以对应于作为(PEG画-DSPE/总脂质)xl00算出的PEG修饰率(mol%)为0(下述的脂质体制剂l)、0.25(同制剂2)、0.5(同制剂3)、0.75(同制剂4)、1(同制剂5)或者2(同制剂6)mor/。的规定浓度的理论量(未添加、0.55、1.09、1.64、2.18或者4.37mL)加入此PEG5。0。-DSPE水溶液，在60。C下搅拌30分钟后，冰冷却。(3)外水相置换使用置换为10mMTris(pH9.0)10%蔗糖的柱(Sepharose4FF)，凝胶过滤上述所得的PEG修饰脂质体，置换外水相。(4)药物导入对于凝胶过滤后的样品，使用磷脂定量试剂盒(和光纯药工业抹式会社制磷脂CTestWako(胆碱定量))，对HSPC浓度(mg/mL)定量分析，以此HSPC浓度为基础，算出总脂质量(mM)。此处的总脂质量是指HSPC、Chol及DSPE的总量。使盐酸阿霉素(Dox:分子量579.99)以相对于上述总脂质量、Dox/TotalLipid(mol/mol)=0.16的规定量分别含有在10mMTris(pH9.0)10W蔗糖10mL中，加入到经上述外水相置换的各PEG修饰脂质体中，一边搅拌一边在60。C下加热60分钟，由此导入Dox。(5)后处理将导入药物后的脂质体冰冷却后，用经10mM组氨酸(pH6.5)10%蔗糖置换的凝胶色谱柱(Sepharose4FF)凝胶过滤，除去脂质体未封入的药物。然后，使其通过灭菌过滤器(MINISARTPLUS0.2pm)，由此进行灭菌处理，得到被PEG修饰的内封有阿霉素的脂质体(以下，脂质体制剂)1~6。(6)分析〈PEG修饰率〉对上述所得的各脂质体制剂，采用高效液相色谱(色谱柱化学键合苯基的多孔硅胶，流动相Buffer/MeOH/EtOH混合液)，使用差示折射计作为检测器，对脂质(HSPC、Chol及PEG5。Qo-DSPE)的浓度(mg/mL)进行定量分析。由所得的分析值算出的总脂质浓度(TotalLipid/mM)、PEG修饰率(mol%)与PEG则o-DSPE投入量的理论mo1%—同示于表1。此处求出的PEG修饰率的实测值为测定样品总体的平均值。<药物浓度〉盐酸阿霉素(Dox)浓度(mg/mL)才艮据480nm处的吸光度通过标定法进行定量分析。将按各规定浓度(mg/mL)含有Dox的生理盐水用作标准曲线样品。使40^L样品分散于2mL荧光分析用曱醇中，测定吸光度。对于各脂质体制剂，由Dox浓度(mg/mL)求出mM换算值、相对于总脂质的摩尔比(Dox/TotalLipid)。上述各值如表l所示。<粒径>将20mL脂质体制剂用生理盐水稀释至3mL，用Zetasizer3000HS(MalvernInstruments.制)测定平均粒径(nm)。结果如表l所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>承Pr':G修饰率(mo1。/。)^(PEG画—DSPE/TotalLipid)x100(实施例l)使用装有阴离子交换色镨柱的高效液相色i普(HPLC)，采用流动相的NaCl浓度梯度法，测定配制例l制作的脂质体制剂l~6。测定条件如下所示。流动相使20mMTris(pH9.0)中的NaCl浓度在以下3种条件1~3下在0M~0.5M间变化。即，从流出开始0.5分钟至下述时间内使20mMTris中的NaCl浓度成直线浓度梯度(0—0.5M)后，维持0.5MNaCl浓度5分钟。然后，使不含NaCl浓度的20mMTris(pH9.0)流出20分钟。上述条件如图l(A:条件l,B:条件2，C:条件3)所示。条件l:0.5~15分钟(0—0.5M)+5分钟(0.5M)+20分钟(0M)条件2:0.5~25分钟(0—0.5M)+5分钟(0.5M)+20分钟(0M)条件3:0.5~35分钟(0—0.5M)+5分钟(0.5M)+20分钟(0M)流速lmL/分钟色谱柱将DEAE-5PW(色语柱直径cp2.0mm，长度75cm)(东曹(抹)制阴离子交换HPLC用多孔亲水聚合物凝胶柱)预先用20mMTris(pH9.0)置换，进行使用。色谱柱温度未设定(环境温度28~32°C)注入量10|iL(在上述条件3下，也对5fiL及20fiL进行测定，确认峰位置与10(iL相同(未图示)。)测定吸收波长254nm(条件l)或者280nm(条件2及3)对于配制例1制作的PEG修饰率不同的脂质体制剂1~6，分别在上述各NaC1浓度条件下测定。相同的NaCl浓度条件的各个测定曲线彼此在纸面上重合。将各条件下的各个数据合成得到的曲线如图2(条件l)、图3(条件2)及图4(条件3)所示。由上述图所示可知，通过采用NaCl浓度梯度法，对应于PEG修饰率，脂质体制剂的流出时间不同。即，可知可以根据PEG修饰率的差异，分离PEG修饰脂质体制剂。进而可知通过使NaCl浓度梯度变緩可以提高分离能力。特别是，用PEGs,表面修饰的脂质体制剂，能够高精度地分离至修饰率0.5mo1%。此0.5mor/o如下述试验例所示是脂质体动力学上有效的修饰率，因此表明本发明的方法在PEG修饰脂质体制剂的制造中极其有用。所以，采用易分离修饰率在0.5mo1%以下的脂质体制剂的上述方法，不回收例如不足0.5mor/。的脂质体制剂、回收修饰率在0.5mor/Q以上的脂质体制剂，由此能够只高度地精制脂质体动力学上有效的修饰率的脂质体制剂。另外，考虑到添加的PEGs,-DSPE的理论修饰率和最大修饰率几乎相等，所以例如添加至达到lmor/。的情况下，如果回收修饰率在0.5mo1%以上的脂质体制剂，不包含低于0.5mor/。的脂质体制剂，则能够得到修饰率为0.75士0.25mo1%的脂质体制剂。(实施例2)将配制例1制造的PEG修饰脂质体制剂1~6各取当量、混合。对此混合样品适用上述NaC1浓度梯度条件3,与实施例1相同地测定液相色语，结果如图5所示。如图5所示，可以按PEG修饰率的差异，分离脂质体制剂混合物。另外，各峰位置与图4所示的位置一致。由此可以确认本发明的方法能够从PEG修饰率不同的脂质体制剂的混合物中分离修饰率不同的脂质体制剂。(试验例l)由小鼠尾静脉给与配制例l制作的脂质体制剂l~6(作为总脂质量为10(imol/2mL/kg),调查血中浓度变化(每组3只)。在投药后第l、3、6、24、48小时，使用添加了肝素(IOOO单位/mL，AventisPharma)的25G带翼静脉注射针头(TERUMO)、和结核菌素用lmL注射针筒(TERUMO),从尾静脉采血约0.5mL。血液置于冰浴上，采血结束后，离心处理(BECKMANGS-15R,10000rpm,4°C，10分钟)，分离血浆。血浆中阿霉素浓度在激发波长(Ex)=500nm,荧光波长(Em)=580nm下测定焚光强度。以给药时刻(0)的残存率为100%,粗略求出注射后各采血时相对于投药量的残存率(％)。作为相对于经过时间的"剂量％",示于图6。如图6所示，未导入PEG的脂质体，在投药初期的时刻与其它脂质体相比血中浓度较低，为其它脂质体的2/3以下(经过6h时)。另夕卜，PEG修饰率(mol%)越高，血中滞留性越高，但超过0.5mol。/。时血中浓度的推移几乎无变化，24h的"剂量％"为约30%,48h的"剂量%"为约17%。根据上述结果可以认为PEG修饰的效果在PEG修饰率为约0.5mo1%时是充分的。另外，从AUC(Areaundertheculve,吸收曲线下面积)的观点评价PEG修饰率。相对于各脂质体制剂的PEG修饰率(实测值)的、基于由注射时间后的血中浓度求出的吸收率的AUC示于图7。需要说明的是，AUC^X(吸收率)/Vd(分布容积)xKd(消失速度)分母的因子Vd及Ke,由药物决定，可以认为AUC与吸收率成比例。与图6所示的结果相同，直至PEG修饰率0.5mo1%，PEG修饰率越高AUC越大，PEG修饰率超过0.5mo1%时，AUC不再增加，可知在约0.5mol%时达到饱和。图4中，在各PEG修饰率的峰位置(时间轴)，适用上述求出的AUC(参见图7)相对于各PEG修饰率的值(平均值)，可见AUC和高效液相色谱中的保留时间的关系。如图8所示。由图8所示可知，AUC和高效液相色语中的保留时间之间呈负相关。由上述结果可知，本发明的方法不仅能够以PEG修饰率解析脂质体制剂的表面，而且能够理化学地确认脂质体制剂的血中滞留性。权利要求1、一种用亲水性高分子进行膜修饰的封闭囊泡的分离方法，所述分离方法使用离子交换色谱法分离膜修饰率不同的封闭囊泡，所述离子交换色谱法应用使洗脱液的离子强度经时地变化的浓度梯度。2、如权利要求l所述的分离方法，其中，所述亲水性高分子为聚乙二醇，所述封闭嚢泡为脂质体。3、如权利要求1或者2所述的分离方法，其中，所述离子强度为NaCl的离子强度。4、如权利要求l~3中任一项所述的分离方法，其中，所述离子交换色谱法为弱阴离子交换色谱法。5、如权利要求4所述的分离方法，其中，所述洗脱液为含有緩冲剂的pH6IO的水性溶剂。6、如权利要求l~5中任一项所述的分离方法，其中，所述封闭嚢泡是该封闭嚢泡内含有药物的制剂。7、一种封闭嚢泡的制造方法，包括如下工序，准备用亲水性高分子进行了膜修饰的封闭嚢泡，将所述封闭嚢泡采用权利要求1~6中任一项所述的分离方法，相应于所述亲水性高分子的膜修饰率分离所述封闭嚢泡，通过回收具有所期望的亲水性高分子修饰率的封闭嚢泡，得到精制的封闭嚢泡。8、如权利要求7所述的制造方法，其中，所述进行了膜修饰的封闭嚢泡为用聚乙二醇进行了膜修饰的脂质体。9、一种封闭嚢泡，是膜的外表面被亲水性高分子修饰的封闭嚢泡，其中不包含相对于封闭嚢泡的膜脂质的亲水性高分子的修饰率低于0.5mo1%的封闭嚢泡。10、如权利要求9所述的封闭嚢泡，其中，所述亲水性高分子为聚乙二醇，所述封闭嚢泡为脂质体。11、如权利要求9或者10所述的封闭嚢泡，其中，所述封闭嚢泡是内部含有药物的制剂。12、一种评价方法，所述评价方法采用权利要求16中任一项所述的分离方法，基于亲水性高分子修饰率，对用亲水性高分子进行了膜修饰且内部含有药物的封闭嚢泡的制剂进行评价。全文摘要本发明提供了一种用亲水性高分子(聚乙二醇等)进行膜修饰的封闭囊泡的分离方法，所述分离方法采用离子交换色谱法分离膜修饰率不同的封闭囊泡(脂质体等)，所述离子交换色谱法应用使洗脱液的离子强度经时地变化的浓度梯度。本发明提供一种在封闭囊泡的精制工序中利用该分离方法、以所期望的亲水性高分子修饰率精制的封闭囊泡的制造方法。本发明还提供评价使用该分离方法的内部含有药物的封闭囊泡的制剂的方法。本发明还提供一种封闭囊泡，所述封闭囊泡用亲水性高分子进行了膜修饰，其中不包含膜修饰率低于0.5mol％的封闭囊泡。文档编号A61K9/127GK101472563SQ20078002340公开日2009年7月1日申请日期2007年7月3日优先权日2006年7月3日发明者吉野敬亮申请人:泰尔茂株式会社